WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

 

КОВНЕР

АННА ВЛАДИМИРОВНА

РОЛЬ АЛЬВЕОЛОЦИТОВ, МАКРОФАГОВ И ЭНДОТЕЛИОЦИТОВ СОСУДОВ В ПАТОГЕНЕЗЕ ПОРАЖЕНИЯ ЛЕГКИХ МЫШЕЙ ЛИНИИ С57Bl/6 ПОСЛЕ ИНФИЦИРОВАНИЯ ВИРУСОМ ГРИППА А/H5N1 A/GOOSE/KRASNOOZERSKOYE/627/05

14.03.03 – патологическая физиология

03.03.04 – клеточная биология, гистология, цитология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Новосибирск – 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении "Научный центр клинической и экспериментальной медицины" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научные руководители:

Заслуженный деятель науки РФ,

академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор       Шкурупий Вячеслав Алексеевич

кандидат медицинских наук                       Потапова Оксана Валентиновна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

«кафедры физиологии»,

факультет естественных наук,

ФГБОУ ВПО НГУ  Шестопалова Лидия Владимировна

доктор биологических наук,

гл. н. с., руководитель

лаборатории цитологии и

клеточных структур,

ФГБУ "НЦКЭМ" СО РАМН  Архипов Сергей Алексеевич

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (Новосибирск)

Защита состоится «23» октября 2012 г. в «10-00» часов на заседании диссертационного совета Д.001.048.01. при ФГБУ "НЦКЭМ" СО РАМН по адресу: ул. Тимакова, 2; г. Новосибирск, 630117; тел./факс (383) 333-64-56.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке "НЦКЭМ" СО РАМН

Автореферат разослан «___»  ________ 2012 г

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук  Пальчикова Н.А.

Общая характеристика работы



Актуальность темы. В настоящее время инфекции, передающиеся воздушно-капельным путем занимают лидирующие позиции среди всех инфекционных заболеваний человека. Вирус гриппа (ВГ) А/H5N1 наиболее патогенный среди других вирусов гриппа. По данным ВОЗ уже за 2010-2011 гг, в эпизоотию, вызванную ВГ А/H5N1, были вовлечены страны Африки, Азии и Европы и летальность среди людей остается по-прежнему высокой – от 60 до 73%; среди детей – до 15 лет – до 89% (www.who.int/ru/, 2010-2011).

Постоянная «эволюция» вирусов гриппа А/H5N1, возможность их реассортации с адаптировавшимися в человеческой популяции штаммами вируса гриппа А и лекарственная полирезистентность к имеющимся противовирусным препаратам являются факторами, обусловливающими опасность появления нового высокопатогенного и высококонтагиозного  антропозоонозного вируса гриппа А/H5N1 и его распространения как пандемичного (ВОЗ, 2010; Shortridge K.F. et al., 2000; Ilyushina N.A. et al., 2010). Несмотря на высокую актуальность проблемы гриппа ряд аспектов патогенеза данного заболевания у млекопитающих и человека остается малоизученным.

Наиболее выраженные патологические изменения при вирусе гриппа А/H5N1 проявляются в дыхательных путях млекопитающих и человека, что связано с пневмотропностью вируса (Свирщевская Е.В. и др., 2005; van Riel D. et al., 2006). Поэтому ведущее значение в иммунопатогенезе гриппа А/H5N1 принадлежит альвеолоцитам, эндотелиоцитам сосудов легких и клеткам системы мононуклеарных фагоцитов (СМФ) – легочным макрофагам, как первой линии защиты, которые имеют свои функциональные особенности. Благодаря своей фагоцитозной и секреторной активности, макрофаги выполняют функцию барьера на пути проникновения в организм возбудителя, способствуя ограничению распространения вируса в организме, и играют ключевую роль в инициации и регуляции иммунного ответа при гриппе. Количественная и функциональная недостаточность исследуемых клеток является основой возникновения ряда тяжелых осложнений при инфекционных заболеваниях, в том числе и при вирусных инфекциях (Шкурупий В.А. и др., 1999; Li N. et al., 2008).

Комплексная иммуноморфологическая оценка структурно-функциональных особенностей исследуемых клеток при гриппе А/H5N1 позволит не только улучшить диагностику вирусных инфекций, научно обоснованно осуществить прогнозирование развития болезни и её осложнений, но и одновременно осуществить принципиально новые подходы к профилактике и лечению гриппа, направленные на снижение риска заболеваемости гриппом людей и уменьшение частоты и тяжести его осложнений.

Цель исследования: изучить морфофункциональные и количественные изменения клеток легких (альвеолоцитов, эндотелиоцитов сосудов и макрофагов) мышей линии С57Bl/6 в процессе формирования  противовирусного ответа на инфицирование вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05.

Задачи исследования:

1.        Изучить морфофункциональные особенности клеток легких у интактных мышей линии С57Bl/6.

2.        Методами иммуногистохимии и флуоресцентной микроскопии исследовать топологию вируса в клетках легких мышей линии С57Bl/6, инфицированных штаммом вируса гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 на разных сроках заболевания.

3.        Изучить структурно-функциональные изменения легких мышей линии С57Bl/6 в динамике развития вирусной инфекции.

4.        Изучить морфофункциональные особенности клеток легких мышей линии С57Bl/6 после инфицировании вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 и их вероятную регуляторную роль в развитии вирусной инфекции.

Научная новизна. Впервые на интактных мышах-самцах линии С57В1/6  методами морфометрии и иммуногистохимии было показано, что альвеолоциты, эндотелиоциты и макрофаги легких вне зависимости от  специализированных функций клеток первых двух типов представляют собою единую структурно-функциональную систему поэлементно способную  дополнять друг друга в выполнении функции поддержания гомеостаза в организме своими развитыми системами лизосомальных протеаз, NO-синтаз, экспрессией полипотентных провоспалительных цитокинов TNF- и IL-6.

Впервые методами иммунофлуоресцентной микроскопии было показано персистирование вируса гриппа А/H5N1 штамма A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 в альвеолоцитах, эндотелиоцитах сосудов легких и макрофагах мышей линии C57Bl/6. Было установлено, что первыми в противовирусную «борьбу» включаются и инфицируются альвеолоциты в связи с анатомическим расположением и наличием у них на клеточной поверхности сиаловых кислот, затем эндотелиальные клетки сосудов, что свидетельствует о диссеминации вируса и легочные макрофаги.

Вирус индуцирует в этих клетках процессы деструкции апоптозом, их пролиферацию, активацию экспрессии внутриклеточных энзимов (лизосомальные гидролазы – lysozyme, cathepsin D и myeloperoxidase, NO-синтазы – eNOS и iNOS), а также цитокинов. Показано, что кроме цитопатического действия вирусов на эти клетки после интернирования в них, на увеличение масштаба  деструктивных процессов в легких оказывают влияние развивающаяся  патогенетически поэтапно – системная гипоксия и ишемия  вследствие:  деструкции  сосудов с развитием геморрагических и тромбоэмболических осложнений, повышения  проницаемости и развития отечного синдрома в интерстиции и альвеолах, деструкции альвеолярного эпителия и острой диффузной эмфиземы, активации синтеза оксида азота и  создания условий для лабилизации мембран лизосом с последующей стимуляцией репаративной регенерации по типу substitucio, усугубляющей  нарушение процессов газообмена. Впервые показано, что инфицирование этих клеток кроме деструкции сопряжено с выраженной активацией процессов пролиферации, восстанавливающей нарушенный структурный гомеостаз в легких, но  расширяющих трофическую базу для вируса. Показано, что инфицирование вирусом гриппа А/Н5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 сопряжено с существенной активацией клеточного звена иммунитета, резкого увеличения экспрессии провоспалительных полипотентных цитокинов  TNF-  и IL-6, способных также усилить как процессы пролиферации и деструкции так и фиброзирования органа. Изучены масштабы и динамика экспрессии каждого из этих цитокинов  клетками трех вышеупомянутых типов.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные дополняют известные сведения о патогенезе гриппа А H5N1 в легких млекопитающих (Шаркова Т.В. и др., 2008; Шестопалов A.M. и др., 2008; Uiprasertkul M.P. et al., 2007; Zeng H. Et al., 2012).

Масштабы, характер и динамика исследованных деструктивных последствий в легких после инфицирования вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 свидетельствуют о необходимости максимально ранних профилактики и лечения данного заболевания. Полученные результаты о роли альвеолоцитов, макрофагов и эндотелиоцитов сосудов легких в патогенезе деструкции легких после инфицирования вирусом гриппа А могут быть использованы для разработки средств профилактики заболевания и лечения осложнений.

Полученные данные существенно дополняют плохо изученный патогенез вирусной инфекции, вызываемой новым штаммом  вируса гриппа А/Н5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, что может быть внедрено в процесс преподавания, патологической физиологии, патологической анатомии, клеточной биологии, курса «инфекционные болезни», послужить основой для разработки средств и способов патогенетической профилактики и терапии в соответствии с формирующимися синдромами заболевания.

Работа выполнена в рамках Федеральной целевой научно-технической программы

«Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 гг.», госконтракт № 02.740.11.0709.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. ВГ АН5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 способен инфицировать альвеолоциты, эндотелиоциты сосудов и макрофаги легких, что сопряжено с их гибелью и персистенцией вируса в них на протяжении всего эксперимента. Инфицирование этим вирусом гриппа индуцирует развитие каскада патологических процессов, итогом, которых является создание условий для развития острой системной гипоксии и ишемии, следствием которых являются масштабные процессы деструкции, доминирующие в проявлениях ответной реакции организма (в частности легких) на вирус.

2. Инфицирование мышей ВГ А/H5N1 сопряжено с активацией репаративных процессов, проявляющихся пролиферацией альвеолоцитов, эдотелиоцитов сосудов и макрофагов легких, способствующих восстановлению утраченных структур, но расширяющих трофическую базу для вируса. Они проявляются заместительным, и постгипоксическим фиброзированием легких, ухудшающим условия для газообмена в интерстиции.

3. Альвеолоциты и эндотелиоциты вне связи с их специализированными функциями вместе с макрофагами легких формируют единую систему сохранения внутренней среды организма за счет высокой экспрессии ими протеаз и NO-синтаз, способности резко усиливать экспрессию TNF- и IL-6. Вместе с тем, в условиях острой гипоксии, эти проявления защитной функии вышеуказанных клеток могут усугубить деструкцию легких в связи с возможной пермеабилизацией лизосом, усилением образования активированных метаболитов кислорода.  Инфицирование мышей вирусом гриппа А/Н5N1  сопряжено с активацией клеточного звена иммунитета, однако недостаточной для его эффективной элиминации.

Внедрение результатов работы в практику. Основные положения работы внедрены в практику преподавания на кафедре патологической анатомии ГБОУ ВПО НГМУ Минздрав России в раздел «Иммунопатологические процессы и «Инфекционные болезни».

Апробация работы. Материалы исследований доложены на XLIX Международной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс" (Новосибирск, 2011); IV Международной научно-практической конференции молодых ученых "Клинические и теоретические аспекты современной медицины" (Москва, 2012).

Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 5 работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ для публикации материалов диссертационных исследований.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста, включает введение, обзор литературы, описание материала и методов исследования, результаты собственных исследований и их обсуждения, заключение, выводы, список цитированной литературы и приложение. Диссертация иллюстрирована 13 таблицами и 30 рисунками. Список литературы включает 321 источник, в том числе 267 работ зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В качестве инфекционного агента был выбран вирус гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, выделенный из легкого гуся, погибшего во время вспышки гриппа птиц в селе Кразноозерское Новосибирской области в сентябре 2005 года. Экспериментальные работы с вирусами гриппа А/H5N1 были проведены на базе лаборатории отдела зоонозных инфекций и гриппа, ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" (Новосибирск) в соответствии с санитарными правилами безопасности работы с микроорганизмами III – IV групп патогенности и гельминтами (СП 1.2.731 от 25.01.05).

Работа выполнена на 90 мышах-самцах линии С57Bl/6, в возрасте 2 месяцев с массой тела 20-25 г (питомник лабораторных животных НИИ Клинической Иммунологии СО РАМН). Животных содержали в стандартных условиях со свободным доступом к воде и пище. Перед проведением эксперимента их адаптировали к условиям содержания. Исследование проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. № 755), с соблюдением международных принципов Хельсинской декларации.

Для проведения эксперимента было сформировано 3 подопытных группы животных:

Первая группа – контрольная – была представлена интактными животными (20 мышей).

Вторая группа состояла из 50 мышей, которых инфицировали вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, для изучения патогенеза инфекции данного процесса.

Третья группа состояла из 20 мышей, которых инфицировали ВГ А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, у которых изучали патогенность штамма по показателю летальности животных, выраженного в процентах.

Для морфологического исследования животных первой и второй групп выводили из эксперимента путем дислокации позвонков в шейном отделе. Сбор материала проводили на 1, 3, 6, 10 и 14 сутки после инфицирования. Объектом исследования служили легкие.

Исследование выполнено с использованием оборудования ЦКП ФГБУ "НЦКЭМ" СО РАМН «Современные оптические системы».

Для светооптического исследования, полученный материал, после фиксации в 10% растворе нейтрального формалина, обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации и ксилолов и заключали в синтетическую парафиновую смесь «HISTOMIX» (BioVitrum). Срезы изготавливали на микротоме ("MICROM", Германия) толщиной 3,5 мкм. Окраску проводили по стандартной методике гематоксилином и эозином (обзорная), пикрофуксином по методу ван Гизон (выявление волокон соединительной ткани).

Проводили ИГХ-анализ с использованием непрямого AEC (стрептавидин-пероксидазного) метода для оценки: пролиферативной (PCNA ("Novocastra")), функциональной и профибротической активности легочных макрофагов, альвеолоцитов и эндотелиоцитов (Cathepsin D ("DBS"), Myeloperoxidase ("DBS"), Lysozyme ("DBS"), iNOS ("Spring BioScience"), eNOS ("Abcam"), TNF- ("DBS"), IL-6 ("Novocastra")); степени выраженности неоангиогенеза (CD-31 ("BioCare Medicine"), CD-34 ("Spring BioScience")); фенотипирования клеточного состава интерстициальных инфильтратов (CD-1 ("Spring BioScience"), CD-4 ("Spring BioScience"), CD-8 ("Abcam"), CD-68 ("DBS"), Fibroblast ("DBS")); механизмов клеточной смерти (Сaspase-3 ("Abcam")).

Для проведения ИГХ-исследования срезы легких толщиной в 3 мкм подвергали депарафинизации, регидратации, демаскировке антигенов в микроволновой печи мощностью 700W, в течение 20-25 минут. Затем, после однократного промывания в дистиллированной воде и фосфатном буфере (PBS), производили блокирование эндогенной пероксидазы в течение 5 минут. Время экспозиции с первичными антителами составляло 30–45 минут при температуре 37°С. Затем срезы инкубировали со стрептавидин-пероксидазным комплексом, DAB-субстратом и дополнительно докрашивали гематоксилином Майера. Затем проводили по спиртам возрастающей концентрации и ксилолам, покрывали синтетической покровной средой «Bio Mount» (Bio Vitrum) и заключали под покровное стекло.

Для исследования топологии вируса гриппа А/H5N1 использовали непрямой метод иммунофлуоресценции, который основан на связывании антитела Inf A ("Abcam"), меченных флуорохромом (FITС), с антигеном на поверхности или внутри микроорганизмов. Связавшиеся антитела выявляли в люминесцентном микроскопе (флуорохром поглощает ультрафиолетовые лучи и излучает волны видимого диапазона). В качестве контроля использовали нативную ткань, которую предварительно депарафинизировали стандартным методом. Исследование проводили на конфокальном лазерно-сканирующем микроскопе LSM 710 (Carl Zeiss).

Анализ гистологических препаратов проводили на микроскопе AxioImager A1 c фотокамерой AxioCam MRc (Carl Zeiss). Морфометрию структурных элементов тканей осуществляли с помощью окулярной сетки на 100 точек площадью 3,64х105 мкм2 (при определении численной (Nai) и/или объемной (Vv) плотности структур) (Автандилов, 2000) и инструментов программы AxioVision (rel. 4.7.).

В ходе данной работы определяли численную плотность (Nai) исследуемых клеток легких в тестовой площади. Оценивали объемную плотность инфильтратов и их клеточный состав, объемную плотность кровоизлияний, зон отека в органе и деструктивных изменений; численную и объемную плотности сосудов, их просвета и толщину стенок сосудов, долю тромбированных сосудов, кроме того объемную плотность фиброзной ткани. Изучали численную плотность (Nai) клеток легких, экспрессирующих исследуемые маркеры, в закрытой тестовой системе - 3,64x105 мкм2.

Статистический анализ результатов выполняли с использованием стандартного пакета программ STATISTICA v.6. Определяли средние арифметические величины (M), стандартную ошибку средней (m). Вероятность достоверности различий между средними величинами определяли с помощью  t-критерия Стьюдента, а также проводили корреляционный анализ по Пирсону. Статистически значимыми считали различия при 5% уровне значимости (р<0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Морфологические и количественные параметры эндотелиоцитов, альвеолоцитов и макрофагов легких интактных мышей линии С57Bl/6

Известно, что мыши линии С57Bl/6 существенно отличаются от мышей других линий по ряду структурно-функциональных параметров органов и регуляторных систем. Можно полагать, что и альвеолоциты, эндотелиоциты и легочный компартмент СМФ у интактных мышей этой линии будут иметь особенности, что представляет интерес для исследователей, изучающих данные о линейных мышах для дальнейшего использования их, как специфических моделей.

Методом обзорной световой микроскопии изучали топологию легочных макрофагов у мышей линии C57Bl/6. При этом отмечали, что большая часть из них – 68% – были представлены альвеолярными макрофагами, расположенными на поверхности альвеол, другие – макрофаги интерстиция – были распределены в межальвеолярных перегородках перибронхиально и периваскулярно.

Популяция легочных макрофагов интактных мышей линии С57Bl/6, как интерстиция, так и альвеол обладает высокой функциональной активностью. Из общей численной плотности более 40% экспрессируют: эндотелиальную NO-синтазу: eNOS – 45,7%, cathepsin D – 48,1%, Il-6 – 43,8%, TNF- – 48,9% и caspase–3 – 40% (табл. 1).

Согласно полученным данным 20% эндотелиоцитов сосудов легких экспрессируют: PCNA – 20%, cathepsin D – 20,2%, TNF- – 21%, сaspase–3 – 21, 6% (табл. 1). Таким образом, у взрослых интактных мышей линии С57Bl/6 во всей сосудистой системе эндотелиальные клетки очевидно сохраняли способность к делению и передвижению, демонстрируя экспрессию ядерного фактора пролиферации PCNA, маркера новообразованных сосудов CD–34 и триггерной каспазы.

Таблица 1

Результаты ИГХ-исследования клеток легких интактных мышей линии  С57Bl/6 (M±m)

Объекты и параметры исследования

Типы клеток

Альвеолоциты

Макрофаги

Эндотелиоциты

Численная плотность клеток легких (Nai)

79,4 ± 0,15

10,1 ± 0,96

13,2 ± 0,75

Содержание от общей численности этих клеток:

PCNA+- клетки (Nai)

5,2 ± 0,36

(6,5%)

1,2 ± 0,54

(12,3%)

2,7 ± 0,62

(20%)

iNOS+ клетки (Nai)

6,1 ± 0,21

(7,7%)

3,6 ± 0,39

(36%)

2,1 ± 0,31

(16%)

eNOS+ клетки (Nai)

6,7 ± 0,33

(8,4%)

5,1 ± 0,21

(45,7%)

2,1 ± 0,32

(15%)

Cathepsin D+ клетки (Nai)

9,2 ± 0,31 (11,5%)

4,9 ± 0,84

(48,1%)

2,7 ± 0,33

(20,2%)

Myeloperoxidase+ клетки (Nai)

10,1 ± 0,30 (12,8%)

3,6 ± 0,63

(35,1%)

2,6 ± 0,38

(19,9%)

Lysozyme+ клетки (Nai)

9,8 ± 0,25 (12,3%)

3,7 ± 0,55

(36,5%)

1,8 ± 0,48

(13,2%)

Il-6+ клетки (Nai)

7,8 ± 0,63

(9,8%)

4,4 ± 0,26

(43,8%)

2,3 ± 0,25

(17,6%)

TNF-α+ клетки (Nai)

8,1 ± 0,48 (10,2%)

4,9 ± 0,39

(48,9%)

2,8 ± 0,32

(21%)

Caspase-3+ клетки (Nai)

4,1 ± 0,48

(5,2%)

4,1 ± 0,17

(40%)

2,9 ± 0,26

(21,6%)





Примечание: % – процентное содержание клеток от общего числа.

Кроме этого примечательно, что по численной плотности макрофаги и эндотелиоциты сосудов были достаточно близки.

Более чем в 10% популяции альвеолоцитов регистрировали цитоплазматическую экспрессию: cathepsin D – 11,5%, myeloperoxidase – 12,8%, lysozyme – 12,3% и TNF- – 10,2% (см. табл. 1). Поскольку легкие являются наиболее открытой системой организма, видимо, поэтому все три типа клеток демонстрируют достаточно высокий уровень секреции факторов, которые можно отнести к элементам системы защиты внутренней среды организма.

Все три типа клеток, кроме специальных функций, формируют защитный барьер, прежде всего, от бактерий, грибов и вирусов.

Летальность и средняя продолжительность жизни мышей линии С57Bl/6, инфицированных ВГ А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05

При совместной работе с нашими коллегами из лаборатории «Зоонозных инфекций и гриппа» под руководством д.б.н. Шестопалова А.М. были проведены исследования патогенности вируса гриппа А/Н5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 для мышей линии С57Bl/6 при дозе в 5 МЛД50. В результате, наблюдали гибель животных, начиная с 10 суток после инфицирования. По окончании срока наблюдения летальность инфицированных животных составила 70% при показателе средней продолжительности жизни животных – 12,3 суток. Гибели интактных мышей не наблюдали. Полученные данные указывают на высокую патогенность вируса гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 для мышей, показанную также в ранее проведенных исследованиях на белых беспородных лабораторных мышах (Шестопалов А.M. и др., 2008).

Особенности топологии вируса гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 в клетках легких мышей линии С57Bl/6

При исследовании образцов легких мышей методом флуоресцентной микроскопии и с помощью ИГХ-анализа с использованием Inf A – антитела к антигену вируса гриппа А/H5N1, меченного FITC, уже через сутки после инфицирования выявляли вирусы в альвеолярном эпителии, эндотелиоцитах микроциркуляторного русла и макрофагах  легких.

Поскольку адгезия вирусов гриппа А и их проникновение в клетки макроорганизма связаны с наличием на их поверхности определенного типа рецепторов сиаловых кислот (Russella L. et al., 2008), первичными клетками-мишенями для вируса гриппа А/Н5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 являются альвеолоциты, располагающие этими рецепторами, и расположенными на путях проникновения вируса.

Однако, уже через сутки после инфицирования, количество эндотелиальных клеток иммунопозитивных к Inf A было достаточно велико, что свидетельствует об успешной репликации вирусов в альвеолоцитах и выходе их в кровеносное русло с развитием виремии, приводящей к генерализации инфекционного процесса, на что указывает инфицированность сосудов легких.

Максимальным количество эндотелиоцитов сосудов легких, экспрессирующих маркер на антиген вируса гриппа (Inf A) было в 1 сутки эксперимента с дальнейшим уменьшением к 14 суткам в 5,2 раза. Максимальное количество Inf A+альвеолоцитов было в 3 сутки эксперимента с уменьшением к 10 суткам в 2,6 раза с увеличением к 14 суткам эксперимента на 50%, что может свидетельствовать о новой «волне» репликации вируса в этих клетках. Количество инфицированных макрофагов также было максимальным на 3 сутки эксперимента и в дальнейшем уменьшалось к 14 суткам в 3,3 раза (табл. 2).

Таким образом, при иммуногистохимическом исследовании особенностей топологии ВГ А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 в легких инфицированных мышей линии C57Bl/6, вирусный антиген Inf A наблюдали в клетках различного гистогенеза (альвеолоцитах, макрофагах, эндотелиоцитах) респираторного отдела легких. Численная плотность иммунопозитивных к Inf A+ клеток всех изученных типов была наибольшей на ранние сроки после инфицирования (1 и 3 сутки). 

Таблица 2

Численная плотность клеток легких мышей линии  С57Bl/6, экспрессирующих маркер на антиген вируса А/H5N1(M±m)

Сроки эксперимента, (сутки)

Типы клеток

Inf A+ Эндотелиоциты (Nai)

Inf A+ Альвеолоциты (Nai)

Inf A+ Макрофаги (Nai)

1

26,5±1,26с

17,2±0,91

19,7±1,44

3

22,1±0,39b

21,5±0,57b

23,2±0,42b

6

14,5±0,36b

13,2±1,01b

11,2±0,5bс

10

11,2±1,02b

8,2±0,48bс

10,6±0,9

14

5,1±0,49bс

12,3±1,21 bс

6,9±0,62bс

Примечания: «b» – достоверность отличия средних величин рассматриваемых параметров по сравнению с величинами предыдущего срока исследования у мышей линии C57Bl/6 «с» - достоверность отличия средних величин рассматриваемых параметров между группами

*  Inf A – антитело на антиген вируса гриппа А/H5N1.

В период с 3 по 10 сутки эксперимента наблюдали уменьшение численной плотности содержащих вирусный антиген клеток всех типов в 2 и более раза, что свидетельствует о частичной элиминации вируса, возможно, за счет апоптоза. При этом наименьшую скорость снижения величины данного показателя отмечали для эндотелиальных клеток, что, по-видимому, связано с продолжающейся циркуляцией вируса в крови экспериментальных животных. Следует также принимать во внимание, что персистенция вируса, хотя и в существенно меньшем количестве клеток сохранялась вплоть до 14 суток эксперимента.

Структурно-функциональные изменения легких мышей линии С57Bl/6 в динамике развития вирусной инфекции

1. Структурная организация сосудов легких мышей в динамике развития вирусной инфекции А/Н5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05

При инфицировании мышей вирусом гриппа А/Н5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 наблюдали полнокровие сосудов, а также тромбоз мелких сосудов. Количество тромбированных сосудов было максимальным на 14 сутки эксперимента (увеличение с 1 по 14 сутки составило 2,4 раза).

При морфометрическом анализе образцов легких животных, в динамике развития гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, к 3 суткам инфекционного процесса отмечали увеличение показателя численной плотности сосудов по сравнению с контрольной группой на 23,6% (табл. 3). В последующем с 6 по 10 сутки после инфицирования у мышей экспериментальной группы регистрировали уменьшение численной плотности сосудов в 1,3 раза, выявленные с помощью эндотелиального маркера СD-31 с одновременным повышением величины показателя их объемной плотности на 30% (см. табл. 3), что указывает на застойные процессы, способствующие развитию отеков. Объемная плотность сосудов уменьшалась от 10 суток к 14 суткам эксперимента в 1,6 раза, тогда как численная плотность оставалась неизменной (см. табл. 3), что указывает на процесс начала восстановления микроциркуляции.

Таблица 3

Результаты исследования структурных изменений сосудов легких мышей линии С57Bl/6 после инфицирования вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 (M±m)

Объекты и параметры исследования

Сроки эксперимента, (сутки)

Экспериментальные группы

Интактные

Инфицированные

Численная плотность сосудов легких СD31, (Nai)

1

10,9 ± 0,86

12,1 ± 0,71

3

13,5 ± 0,51аb

6

11,5 ± 0,64b

10

10,4 ± 0,49

14

10,3 ± 0,64

- из них доля тромбированных сосудов, %

1

0,8 ± 0,13

14,1 ± 0,52а

3

20,1 ± 0,61аb

6

24,7 ± 0,84аb

10

18,9 ± 1,03аb

14

34,7 ± 4,10аb

Численная плотность сосудов легких СD34, (Nai)

1

4,1 ± 0,15

5,4 ± 0,51а

3

6,7 ± 0,74а

6

7,6 ± 0,68а

10

7,9 ± 0,79а

14

7,8 ± 0,37а

Объемная плотность сосудов легких (Vv), %

1

10,9 ± 0,56

13,1 ± 0,66a

3

16,2 ± 0,71ab

6

19,9 ± 0,72ab

10

21,1 ± 0,52a

14

13,3 ± 1,07ab

Толщина стенки сосудов, мкм

1

12,5 ± 1,46

13,8 ± 1,26

3

15,5 ± 0,98a

6

18,2 ± 1,16ab

10

21,4 ± 1,04ab

14

18,1 ± 1,25ab

Примечания: «а» - достоверность отличия средних величин рассматриваемых параметров по сравнению с таковыми в контроле; «b» - достоверность отличия средних величин рассматриваемых параметров по сравнению с таковыми в  предыдущем сроке исследования у мышей линии C57Bl/6.

Наблюдали фибриноидное набухание и зоны фибриноидного некроза стенок сосудов с одновременной активацией неоангиогенеза - . толщина стенки сосудов с 1 по 10 сутки заболевания увеличилась в 1,5 раза, превышая значение аналогичного параметра у интактных животных на 71%. К 14 суткам наблюдали уменьшение толщины стенки сосудов в 1,5 раза (см. табл. 3). Начиная с 6 суток после инфицирования часть визуализируемых сосудов была представлена новообразованными CD34+ сосудами, с увеличением данного параметра к 14 суткам в 1,31 раза (см. табл. 3). Однако, по–видимому, их доля была недостаточной для эффективного восстановления трофики органов (об этом свидетельствовали деструктивные процессы в органах макроорганизма).

2. Процессы деструкции клеток легких мышей при вирусной инфекции А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05

В ходе исследования было установлено, что после инфицирования мышей линии C57Bl/6 вирусом гриппа А Н5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 развивались деструктивные изменения в легких, которые были представлены очагами некроза и апоптоза. Для исследования масштабов апоптоза, изучали численную плотность клеток легких, позитивных на маркер caspase-3.

Максимальное количество альвеолоцитов, в цитоплазме которых регистрировали экспрессию caspase-3 было на 6 сутки эксперимента – увеличение составило 20%, максимальное количество сaspase-3 позитивных легочных макрофагов у мышей линии C57Bl/6 было также на 6 сутки – увеличение составило 30%, Количество эндотелиоцитов сосудов легких, в цитоплазме которых экспрессировалась сaspase-3, было максимальным на 6 и 10 сутки эксперимента (увеличение составило 20%) (табл. 4).

Таблица 4

Численная плотность клеток легких мышей линии С57Bl/6 в состоянии апоптоза при инфицировании вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 (M±m)

Объекты и параметры исследования

Срок после инфицирования, сутки

Типы клеток

Альвеолоциты

Макрофаги

Эндотелиоциты

Численная плотность

клеток, в состоятнии деструкции, (Nai)

1

42,9 ± 3,75

16,8 ± 0,85

8,9 ± 0,47

3

47,8 ± 2,44b

19,8 ± 0,83b

12,3 ± 0,86b

6

63,5 ± 6,72b

26,4 ± 1,83b

17 ± 0,91b

10

51,4 ± 2,76b

17,4 ± 1,45b

10,6 ± 0,75b

14

43,9 ± 3,17b

15,8 ± 0,65b

6,9 ± 0,87b

Процентное содержание

Сaspase3+ клеток, %

1

61,9 ± 2,64

52,4 ± 1,53

48,9 ± 0,98

3

64,6 ± 1,86

62,8 ± 2,25b

53,1 ± 1,74b

6

72,6 ± 2,75b

68,4 ± 1,73b

59 ± 2,18b

10

66,1 ± 1,74b

59,2 ± 2,02b

58,6 ± 2,37

14

59,4 ± 1,61b

59,3 ± 1,84

53,8 ± 1,86b

Примечание: «b» - достоверность отличия величин рассматриваемых параметров по сравнению с предыдущим срокам исследования.

Следует отметить, что у всех трех типов клеток на всех сроках исследования клеточная гибель путем апоптоза преобладала над некрозом (см. табл. 4).

В структуре деструктивных изменений в легких превалировали апоптотически–измененные альвеолоциты, что связано с повреждением альвеолярного эпителия за счет прямого цитолитического эффекта вирусной инфекции (см. табл. 2).

3 Структурная организация легких мышей в динамике развития вирусной инфекции А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05

Структурные изменения сосудистого русла в легких мышей, инфицированных вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, сопровождались обширными кровоизлияниями. Величина показателя объемной плотности зон кровоизлияний увеличивалась с 1 по 6 сутки эксперимента в 1,8 раза с последующим уменьшением к 14 суткам после инфицирования (табл. 5).

Уже в 1 сутки эксперимента наблюдали масштабные деструктивные изменения в паренхиме легких мышей, инфицированных вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 (см. табл. 5). С 3 по 6 сутки эксперимента их объемная плотность составляла около 60% паренхимы легких (см. табл. 5).

Таблица 5

Результаты исследования патологических изменений в легких мышей линии С57Bl/6 после инфицирования вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 (M±m)

Объекты и параметры исследования

Срок эксперимента, сутки

Мыши линии C57Bl/6

Интактные

Инфицированные

Объемная плотность деструктивных изменений (Vv), %

1

0,3 ± 0,12

16,6 ± 1,44a

3

20,3 ± 2,03ab

6

59,2 ± 2,54ab

10

59,9 ± 1,58a

14

27,7 ± 1,39ab

Объемная плотность кровоизлияний (Vv), %

1

5,6 ± 0,8

17,4 ± 1,59a

3

24,3 ± 2,05ab

6

31,7 ± 2,52ab

10

20,2 ± 2,59ab

14

10,5 ± 0,67ab

Объемная плотность зон отека (Vv), %

1

0,3 ± 0,09

15,4 ± 1,15a

3

24,8 ±1,61a

6

39,2 ± 1,44ab

10

63,5 ± 0,85ab

14

29,4 ± 1,21ab

Примечания: «а» - достоверность отличия средних величин рассматриваемых параметров по сравнению с таковыми в контроле; «b» - достоверность отличия средних величин рассматриваемых параметров по сравнению с таковыми в предыдущем сроке исследования.

По мере развития инфекционного процесса с 1 по 10 сутки после инфицирования в легких мышей регистрировали увеличение объемной плотности зон отека в 4,1 раза, с дальнейшим уменьшением к 14 суткам заболевания в 2,2 раза (см. табл. 5), за счет процессов восстановления сосудистого русла.

Таким образом, повреждение обоих типов альвеолоцитов способствует образованию и накапливанию отечной жидкости внутри альвеол, что, вместе со всеми деструктивными осложнениями, может иметь серьезные последствия для функции газообмена в респираторном тракте в виде нарастающей гипоксии.

В интерстиции легких мышей, инфицированных вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, в процессе заболевания наблюдали распространенные инфильтративные изменения: показатель объемной плотности инфильтратов был максимален на 6 сутки эксперимента (табл. 6).

Таблица 6

Объемная плотность и клеточный состав инфильтратов в легких мышей после инфицирования вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 (M±m)

Объекты и параметры исследования

Срок после инфицирования, сутки

Мыши линии C57Bl/6

Интактные

Инфицированные

Объемная плотность инфильтратов (Vv), %

1

4,1 ± 0,06

22 ± 2,16a

3

29,6 ± 3,46ab

6

33,8 ± 3,24a

10

21,4 ± 3,31ab

14

16,5 ± 1,21ab

Клеточный состав инфильтратов (*):

CD-68+ макрофаги,

%

- из них многоядерных клеток, %

1

6,6 ± 0,53

43,2 ± 1,56a

3

46,9 ± 0,86ab

6

33,5 ± 1,08ab

10

41,9 ± 3,34ab

14

36,1 ± 0,52ab

1

---

---

3

3,5 ± 0,28

6

8,2 ± 0,33b

10

7,5 ± 0,25b

14

6,1 ± 0,16b

СD-8+ Т-лимфоциты, %

1

3,7 ± 0,25

34,6 ± 0,73a

3

35,5 ± 0,69a

6

40,9 ± 1,33ab

10

34,4 ± 0,89ab

14

29,4 ± 0,77ab

СD-4+ Т-лимфоциты, %

1

3,3 ± 0,37

15,6 ± 0,93a

3

12,2 ± 1,63ab

6

17,6 ± 2,08ab

10

13,4 ± 0,59ab

14

13,4 ± 1,02a

СD-1α+ дендритные клетки, %

1

1 ± 0,18

2,5 ± 0,35a

3

3,2 ± 0,42a

6

4,3 ± 0,37ab

10

5,4 ± 0,26ab

14

7,3 ± 0,39ab

Фибробласты, %

1

1,4 ± 0,10

2,9 ± 0,57a

3

2,2 ± 0,48a

6

3,4 ± 0,45ab

10

5 ± 0,37ab

14

6,8 ± 0,42ab

Примечания: «а» - достоверность отличия средних величин рассматриваемых параметров по сравнению с таковыми в контроле; «b» - достоверность отличия средних величин рассматриваемых параметров по сравнению с таковыми в предыдущем сроке исследования.

(*) – содержание относительно всех клеток, входящих в состав инфильтратов.

В клеточном составе инфильтратов с 1 по 3 сутки эксперимента преобладали макрофаги с признаками гипертрофии. К 6 суткам после инфицирования количество макрофагов уменьшилось в 1,4 раза, что, вероятно, было обусловлено их гибелью в результате цитопатического действия вируса гриппа. К 10 суткам эксперимента происходило увеличение численности клеток СМФ на 25%, с дальнейшим уменьшением к 14 суткам на 20% (см. табл. 6).

На всех сроках исследования у мышей С57Bl/6 СD-8+ цитотоксические лимфоциты преобладали над СD-4+ лимфоцитами (Т-хелперами), видимо, потому, что инфицирование  вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 мобилизует, в первую очередь, СD-8+ цитотоксические лимфоциты (Brincks E.L. et al., 2008) (см. табл. 6).

Так, с 1 по 14 сутки эксперимента количество СD8+ Т-лимфоцитов уменьшилось на 20% и на 6 сутки заболевания в инфильтратах легких инфицированных мышей СD8+ Т-лимфоциты количественно преобладали над СD68+ макрофагами на 20%. Это, вероятно, свидетельствует об их причастности к элиминации вирусов.

Количество СD4+ Т-лимфоцитов уменьшалось к 3 суткам эксперимента с максимумом на 6 сутки эксперимента (увеличение составило 40%) (см. табл. 6).

Во все сроки эксперимента в легких наблюдали CD-1+ дендритные клетки – источника IFN 1 типа. Их количество увеличивалось с 1 по 14 сутки эксперимента в 2,9 раза (см. табл. 6).

С 1 по 14 сутки инфекционного процесса в инфильтратах легких инфицированных мышей в 2,3 раза нарастало количество фибробластов (табл. 6), увеличение количества этих клеток коррелировало с увеличением показателя объемной плотности волокнистой соединительной ткани у мышей линии С57Bl/6, инфицированных вирусом гриппа А/H5N1, уже с 1 суток эксперимента, r = +0,93. Этот показатель увеличивался по сравнению с таковым у интактных животных в 5 раз и далее к 14 суткам эксперимента более чем в 16 раз (см. табл. 6).

2.4.4 Исследование клеток легких мышей при развитии вирусной инфекции А/H5N1

При исследовании методом световой микроскопии численной плотности легочных макрофагов, инфицированных мышей отмечали, что величина исследуемого параметра увеличивалась с 1 по 6 сутки эксперимента в 1,4 раза с последующим уменьшением к 14 суткам, оставаясь по-прежнему высокой (табл. 7). Накопление большого количества моноцитов/макрофагов в легочном интерстиции, перибронхиально и интра-альвеолярно, наряду с раннее приведенными данными о клеточном составе инфильтратов, а также увеличении количества дендритных клеток в них (табл. 7), свидетельствует об активации клеточного звена иммунитета на ранних стадиях вирусной инфекции (Hofmann P. et al., 1997; Jiang M. et al., 2011), в частности и у мышей линии С57Bl/6.

Численная плотность альвеолоцитов с 1 по 6 сутки эксперимента увеличивалась в 1,2 раза с дальнейшим уменьшением к 14 суткам в 1,2 раза, оставаясь достаточно высокой по сравнению с интактными животными – превышая таковое значение на 26,2% (см. табл. 7).

Численная плотность эндотелиоцитов сосудов легких с 1 по 6 сутки эксперимента увеличивалась в 1,2 раза с дальнейшим уменьшением к 14 суткам (см. табл. 7).

Активность пролиферации альвеолоцитов, макрофагов и эндотелиоцитов легких оценивали по экспрессии ядерного маркера пролиферации и репарации клеток – PCNA.

Увеличение экспрессии этого фактора в легочных макрофагов наблюдали  с 1 по 6 сутки эксперимента – увеличение составило 2,6 раза и в последующем уменьшилась к 14 суткам эксперимента (см. табл. 7). Это может быть связанно с недостаточным поступлением макрофагальных предшественников из костного мозга, а также их гибелью в связи с персистенцией в них вирусов.

Таблица 7

Результаты исследования клеток легких мышей линии C57Bl/6 после инфицирования вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 (M±m)

Объекты и параметры исследования

Срок после инфицирования, сутки

Мыши линии C57Bl/6

Интактные

Инфицированные

Численная плотность макрофагов (Nai)

1

10,1 ± 0,96

32 ± 3,17a

3

35,2 ± 2,41ab

6

44,2 ± 2,52ab

10

28,1 ± 3,2ab

14

24,9  ± 1,69

Численная плотность альвеолоцитов (Nai)

1

79,4 ± 0,15

111,5  ± 3,63a

3

116, 6  ± 3,19a

6

131,3  ± 4,24ab

10

113,5  ± 2,74ab

14

107,7  ± 3,71a

Численная плотность эндотелиоцитов (Nai)

1

13,2 ± 0,75

22,5 ± 0,73a

3

24,9 ± 0,79ab

6

27,8 ± 1,45ab

10

16,7 ± 0,78ab

14

11,9 ± 0,85ab

PCNA+ макрофаги

1

1,2 ± 0,54

11,3 ± 0,47a

3

23,3 ± 1,88ab

6

29 ± 2,18ab

10

17,4 ± 2,5ab

14

13,4 ± 1,32ab

PCNA+ альвеолоциты

1

5,2 ± 0,36

10,5 ± 0,48a

3

15,6 ± 1,15ab

6

13,8 ± 1,07b

10

9,7 ± 1,38ab

14

10,2  ± 0,93a

PCNA+ эндотелиоциты сосудов

1

2,7  ± 0,62

7  ± 0,59a

3

8,4  ± 026ab

6

9,5  ± 0,69ab

10

6,5  ± 0,51ab

14

6,3  ± 0,73a

Примечания: «а» - достоверность отличия средних величин рассматриваемых параметров по сравнению с таковыми в контроле; «b» - достоверность отличия средних величин рассматриваемых параметров по сравнению c таковыми в предыдущем сроке эксперимента.

Относительно такую же тенденцию можно проследить и у  эндотелиоцитов: максимальное количество этих клеток, экспрессирующих PCNA, было на 6 сутки исследования – увеличение составило 35%, и в дальнейшим их количество уменьшалось к 14 суткам. На основе проведенного корреляционного анализа между общей численностью эндотелиоцитов и PCNA+ эндотелиоцитов, можно сделать предположение, что в поддержании численности этих клеток вносят вклад в процессы пролиферации этих клеток – r = +0,89 (см. табл. 7).

В отличие от эндотелиоцитов и макрофагов максимальное количество клеток с экспрессией этого фактора у альвеолоцитов было на 3 сутки эксперимента (см. табл. 7), что можно объяснить их более ранним контактом с вирусами (см. табл. 3).

Полученные данные свидетельствуют о том, что инфицирование ВГ А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 в клетках различного гистогенеза легких мышей инициируют в них процессы пролиферации. С позиции представлений о биологическом феномене симбиоза в форме паразитирования, это «выгодно» обоим организмам. Вирусу – для расширения трофической базы, макроорганизму – для усиленной репарации поврежденных клеток и тканей, в целом. Однако остается открытым вопрос достаточности и «качества» вновь образованных клеток.

Результаты исследования кислород-независимых и кислород-зависимых клеток легких мышей линии C57Bl/6 при инфицировании ВГ А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05

1. Исследование кислород-независимых факторов защиты клеток легких мышей линии C57Bl/6  после инфицирования ВГ А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05

Фагоцитоз и последующая деградация микроорганизмов происходят в фаголизосомах клеток легких с помощью специализированных ферментных систем (Шкурупий В.А. и др., 1999), наиболее значимыми из которых при вирусных инфекциях являются протеолитические ферменты из группы эндопептидаз – lysozyme, cathepsin D и myeloperoxidase, осуществляющие внутриклеточное расщепление белковых структур вирусов (Burster T. et al., 2007). 

В легочных макрофагах, цитоплазматическая экспрессия lysozyme была максимальной в 1 сутки эксперимента и превышала таковую в контрольной группе в 6,6 раза (табл. 8) и к 10 суткам она уменьшалась в 3,6 раза (табл. 8).

Таблица 8

Результаты исследования численных плотностей легочных макрофагов, экспрессирующих внутриклеточные лизосомальные энзимы после инфицирования вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 (M±m)

Объекты и параметры исследования

Срок после инфицирования, сутки

Мыши линии C57Bl/6

Интактные

Инфицированные

Численная плотность (Nai) Lyz+ макрофагов

1

3,7 ± 0,55

24,2 ± 1,42a

3

16,3 ± 0,73ab

6

6,7 ± 0,71ab

10

3,9 ± 0,35b

14

5,8 ± 0,83ab

Численная плотность (Nai) Сath D+ макрофагов

1

4,9 ± 0,84

14,6 ± 1,02a

3

6,7 ± 0,92ab

6

17,6 ± 1,89ab

10

14,1 ± 0,42ab

14

8,5 ± 1,02ab

Численная плотность (Nai) Myel+ макрофагов

1

3,6 ± 0,63

20,8 ± 2,00a

3

25,6 ± 0,63ab

6

18,8 ± 0,52ab

10

9,2 ± 0,7ab

14

9,5 ± 0,63a

Примечания: «а» - достоверность отличия средних величин рассматриваемых параметров по сравнению с таковыми в контроле; «b» - достоверность отличия средних величин рассматриваемых параметров по сравнению с таковыми в  предыдущем сроке исследования.

К 14 суткам после инфицирования количество позитивных по данному маркеру макрофагов было увеличено на 49%, что может быть связано с продолжающейся циркуляцией вируса в легких и их клиринговой функцией в отношении продуктов некроза и апоптоза клеток легких (см. табл. 2).

Экспрессия cathepsin D в цитоплазме легочных макрофагов была максимальной в 1 и 6 сутки после инфицирования и превышала таковую в  контрольной группе в 3 и 3,6 раза соответственно. Величина данного параметра уменьшалась с 1 по 3 сутки эксперимента в 2,2 раза, затем увеличивалась  к 6 суткам эксперимента в 2,6 раза и уменьшалась к 14 суткам в 2 раза (см. табл. 8).

Экспрессия myeloperoxidase в цитоплазме легочных макрофагов была максимальной на 3 сутки эксперимента – увеличение величины параметра составило 25%, в дальнейшем величина этого параметра уменьшилась к 14 суткам после инфицирования в 2 раза. Но в 1 сутки заболевания она превышала контрольное значение  почти в 6 раз (см. табл. 8).

Активную роль в неспецифическом противовирусном иммунитете играют альвеолоциты и эндотелиоциты сосудов легких за счет их внутриклеточных эндопептидаз.

Максимальная концентрация альвеолоцитов, в которых регистрировали экспрессию lysozyme, была в 1 сутки эксперимента (превышая аналогичный параметр в контроле в 10 раз). В дальнейшем она уменьшилась к 6 суткам более чем в 2 раза (табл. 9). Однако, к 14 суткам после инфицирования, вновь возросла на 50% и превышала аналогичную величину в контроле в 6,7 раза (см. табл. 9).

Максимальное количество эндотелиоцитов, в которых регистрировали цитоплазматическую экспрессию lysozyme была также на 3 сутки эксперимента (увеличение составило 1,7 раза) с дальнейшим уменьшением к 14 суткам после инфицирования в 2,1 раза (см. табл. 9).

Количество альвеолоцитов, положительных на маркер myeloperoxidase было максимальным в 1 сутки эксперимента, оно превышало таковое у интактных животных в 5,6 раза и оставалось высоким до 14 суток эксперимента. Исключение составили 6 сутки эксперимента, где экспрессия в целом снижалась в 2,2 раза относительно максимальной (см. табл. 9).

Максимальное количество эндотелиоцитов сосудов легких мышей линии C57Bl/6, инфицированных ВГ А/H5N1,  в цитоплазме которых регистрировали экспрессию myeloperoxidase, было в 6 и 10 сутки эксперимента (увеличение экспрессии с 1 по 10 сутки составило 70%) с дальнейшим уменьшением к 14 суткам эксперимента  на 30% (см. табл. 9).

Концентрация альвеолоцитов, в которых регистрировали экспрессию cathepsin D, была существенно повышена во все периоды исследования по сравнению с таковой у интактных животных (см. табл. 9). В эндотелиоцитах цитоплазматическая экспрессия Cathepsin D была максимальной на 3 сутки эксперимента (увеличение составило 86%) с дальнейшим уменьшением к 14 суткам на 47% (см. табл. 9).

Несмотря на то, что через сутки после инфицирования большинство визуализируемых клеток на антиген вируса гриппа А/H5N1 были эндотелиоцитами (см. табл. 2), максимальная концентрация клеток, экспрессирующих факторы неспецифической защиты – лизосомальные гидролазы, отвечающих за уничтожение вирусных частиц была в популяциях макрофагов и альвеолоцитов. Анатомическое положение трех исследуемых типов клеток на границе внешней и внутренней сред организма, видимо, определяло их сходство в «оснащенности» внутриклеточной системой протеолиза, несмотря на существенные различия в их специализированных функциях.

Таблица 9

Результаты исследования численных плотностей альвеолоцитов и эндотелиоцитов сосудов легких, экспрессирующих внутриклеточные энзимы при инфицировании вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 (M±m)

Объекты и параметры исследования

Срок после инфицирования, сутки

Мыши линии C57Bl/6g

Интактные

Инфицированные ВГ А/H5N1

Численная плотность (Nai) Lyz+ альвеолоцитов

1

1,8 ± 0,25

17,7 ± 1,27a

3

10,1 ± 1,15ab

6

7,7 ± 0,57ab

10

11,3 ± 1,67ab

14

11,7 ± 1,19a

Численная плотность (Nai) Сath D+ альвеолоцитов

1

2,2 ± 0,31

11,5 ± 0,76a

3

9,9 ± 1,18ab

6

8,4 ± 0,92a

10

9,3 ± 1,18a

14

11,5 ± 1,21ab

Численная плотность (Nai) Myel+  альвеолоцитов

1

2,1 ± 0,30

11,9 ± 0,81a

3

11,4 ± 0,94a

6

5,3 ± 0,21ab

10

11,6 ± 1,01ab

14

11,4 ± 0,72a

Численная плотность (Nai) Lyz+ эндотелиоцитов

1

1,8 ± 0,48

6,7 ± 0,67a

3

11,4 ± 0,75ab

6

5,6 ± 0,93ab

10

6,3 ± 0,88a

14

5,4 ± 0,45a

Численная плотность (Nai) Сath D+ эндотелиоцитов

1

2,7 ± 0,33

5,8 ± 0,36a

3

10,8 ± 1,78ab

6

7,7 ± 1,15ab

10

7,2 ± 0,55a

14

7,4 ± 0,58a

Численная плотность (Nai) Myel+  эндотелиоцитов

1

2,6 ± 0,38

5,7 ± 0,42a

3

7 ± 1,65a

6

9,5 ± 1,74ab

10

9,4 ± 1,19a

14

7,4 ± 0,49ab

Примечания: «а» - достоверность отличия средних величин рассматриваемых параметров по сравнению с таковыми в контроле; «b» - достоверность отличия средних величин рассматриваемых параметров по сравнению с таковыми в предыдущем сроке исследования.

2. Исследование кислород-зависимых факторов защиты клеток легких мышей линии C57Bl/6  после инфицирования ВГ А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05

Важную роль  в противовирусной защите отводят системе оксида азота, которая через активацию индуцибельной и эндотелиальной NO–синтаз (iNOS и eNOS) ингибирует электрон-транспортные группы ферментов вирусов, участвующих в цикле Кребса и синтезе ДНК (Gutierrez G. et al., 1995; Львова А.В. и др., 2010).

Количество макрофагов, в которых регистрировали экспрессию eNOS было максимальным в 1 сутки эксперимента и по сравнению с контролем оно было большим в 4,1 раза. К 10 и 14 суткам эксперимента концентрация eNOS+ клеток уменьшилась, но все еще превышала таковую в группе интактных животных на 44% и 92% соответственно (табл. 10). Это, возможно, может быть связано с «переключением» на продукцию iNOS, как более сильного индуктора оксида азота.

Таблица 10

Результаты исследования численных плотностей клеток легких, экспрессирующих NO-синтазы после инфицирования вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 (M±m)

Объекты и параметры исследования

Срок после инфицирования, сутки

Мыши линии C57Bl/6

Интактные

Инфицированные

Численная плотность (Nai)  iNOS+ макрофагов

1

3,6 ± 0,39

4,1 ± 0,59

3

9,4 ± 0,81ab

6

15,7 ± 1,22ab

10

27,9 ± 2,78ab

14

8,1 ± 0,67ab

Численная плотность (Nai)  eNOS+ макрофагов

1

5 ± 0,21

20,7 ± 2,66a

3

15,4 ± 2,78ab

6

10,4 ± 0,42ab

10

7,3 ± 0,31ab

14

9,6 ± 0,76ab

Численная плотность (Nai)  iNOS+ альвеолоцитов

1

2,1 ± 0,21

5,7 ± 0,79a

3

9 ± 0,76ab

6

8,8 ± 0,91a

10

5,4 ± 0,63ab

14

11,8 ± 1,66ab

Численная плотность (Nai)  eNOS+ альвеолоцитов

1

1,7 ± 0,33

10,4 ± 0,76a

3

7,2 ± 0,72ab

6

6,2 ± 0,54a

10

6 ± 0,54a

14

7,1 ± 0,59ab

Численная плотность (Nai)  iNOS+ эндотелиоцитов

1

2,1 ± 0,31

6,7 ± 0,80a

3

7,6 ± 0,78a

6

6,1 ± 0,64a

10

5,8 ± 0,58a

14

6,3 ± 0,48a

Численная плотность (Nai)  eNOS+ эндотелиоциты

1

2 ± 0,32

10,9 ± 0,79a

3

8,3 ± 0,56ab

6

4,4 ± 0,22ab

10

5,2 ± 0,28ab

14

6,2 ± 1,01a

Примечания: «а» - достоверность отличия средних величин рассматриваемых параметров по сравнению с таковыми в контроле; «b» - достоверность отличия средних величин рассматриваемых параметров по сравнению с таковыми в предыдущем сроке исследования.

Активация экспрессии eNOS альвеолоцитами – проявление неспецифичной кислород-зависимой защитной реакции. Максимальное количество альвеолоцитов, в которых регистрировали экспрессию eNOS было в 1 сутки эксперимента. К 3 суткам заболевания количество этих клеток уменьшилось на 44% и на протяжении всех оставшихся сроков оставалось одинаковым (см. табл. 10).

Количество эндотелиоцитов с цитоплазматической экспрессией eNOS было максимальным в 1 сутки эксперимента, с уменьшением к 6 суткам эксперимента в 2,5 раза с дальнейшим, незначительным повышением величины данного параметра к 14 суткам заболевания на 42% (см. табл. 10). Изменения величин этих параметров характеризовалось сильной прямой корреляционной связью с динамикой клиренса вируса в этих клетках (r= +0,95). Эти данные свидетельствуют о том, что поддержание на постоянном уровне количества клеток, экспрессирующих eNOS, сопряжено либо с элиминацией клеток с вирусом, либо с элиминацией вируса из клеток.

В проявлениях экспрессии eNOS и iNOS исследованными клетками проявлялась закономерность. Экспрессия eNOS была максимальной на первых этапах формирования ответной реакции на инфицирование и была большей, чем iNOS, экспрессия последней у макрофагов и альвеолоцитов усиливалась по мере снижения экспрессии eNOS (см. табл. 10).

Количество легочных макрофагов, в которых регистрировали экспрессию iNOS, увеличивалось с 1 по 10 сутки эксперимента в 6,9 раза с дальнейшим уменьшением к 14 суткам эксперимента в 3,4 раза (см. табл. 10).

С 1 по 3 сутки эксперимента количество альвеолоцитов, «положительных» на маркер iNOS, увеличивалось на 58% с дальнейшим уменьшением к 10 суткам на 68% и вновь увеличивается к 14 суткам в 2,2 раза (см. табл. 10). Это может быть связано с изменением динамики персистенции вируса в альвеолоцитах легких, когда в поздние периоды после инфицирования происходит повторное увеличение количества клеток, позитивных на маркер ВГ А/H5N1. Это вероятнее всего является следствием повторного цикла репродукции и персистенции вируса (см. табл. 2).

Экспрессия iNOS в цитоплазме эндотелиоцитов сосудов легких на протяжении всего эксперимента остается примерно одинаковой и в среднем превышает как таковую величину у интактных мышей в 3 раза (см. табл. 10). Видимо, это сопряжено с постоянным и более частым контактом эндотелиоцитов с циркулирующими в крови вирусами. При этом наблюдается средняя сила корреляционной связи с количеством инфицированных эндотелиоцитов (r = +0,64) и с эндотелиоцитами, в которых регистрировали экспрессию iNOS (r = + 0,62).

3. Исследование цитокинового статуса легочных макрофагов, альвеолоцитов и эндотелиоцитов сосудов легких мышей линии C57Bl/6  после инфицирования ВГ А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05

Иммунопатогенез гриппа, вызываемого ВГ A/H5N1 проявляется, в первую очередь, гиперпродукцией и гиперсекрецией, а также гиперцитокинемией провоспалительных цитокинов, среди которых важную роль отводят IL-6 и TNF-. Максимальное количество легочных макрофагов экспрессирующих IL-6  было на 3 сутки исследования – увеличение составило 44% (табл. 11). Максимальное количество альвеолоцитов, экспрессирующих IL-6 было на 14 сутки исследования, что указывает на продолжающееся усиление воспаления (см. табл. 11).

Количество эндотелиоцитов сосудов легких, в которых регистрировали экспрессию IL-6 через сутки после инфицирования превышало величину таковой в контроле в 4,7 раза (см. табл. 11). На 3 сутки после инфицирования – увеличение данных клеток составило 38% и в  дальнейшем оно уменьшалось к 14 суткам эксперимента в 2,2 раза (см. табл. 11).

Таблица 11

Результаты исследования клеток легких, экспрессирующих провоспалительные цитокины, мышей линии С57Bl/6, инфицированные вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 (M±m)

Объекты и параметры исследования

Срок после инфицирования, сутки

Мыши линии C57Bl/6

Интактные

Инфицированные

Численная плотность (Nai)

IL-6+

макрофагов

1

4,4 ± 0,26

18,2 ± 2,96a

3

26,3 ± 2,11ab

6

21,1 ± 2,35ab

10

15,4 ± 1,86ab

14

14,3 ± 1,55

Численная плотность (Nai)  TNF-α+

макрофагов

1

4,9 ± 0,39

13,9 ± 1,2a

3

18,9 ± 1,62ab

6

25,3 ± 1,5ab

10

20,5 ± 1,44ab

14

12 ± 1,45ab

Численная плотность (Nai)

IL-6+

альвеолоцитов

1

7,8 ± 0,63

9,5 ± 0,64

3

10,6 ± 0,94

6

6,2 ± 0,92b

10

11,6 ± 0,96b

14

13,5 ± 1,29

Численная плотность (Nai)  TNF-α+

альвеолоцитов

1

4,1 ± 0,48

7,7 ± 0,41a

3

14,2 ± 0,65ab

6

17,9 ± 0,94ab

10

15,3 ± 1,02ab

14

10,5 ± 0,93ab

Численная плотность (Nai)

IL-6+

эндотелиоцитов

1

2,3 ± 0,25

10,9 ± 0,73a

3

15,2 ± 1,03ab

6

8,7 ± 0,39ab

10

7,3 ± 0,42ab

14

7,7 ± 0,63

Численная плотность (Nai)  TNF-α+

Эндотелиоцитов

1

2,8 ± 0,32

4,3 ± 0,18a

3

7,6 ± 0,38ab

6

13,5 ± 0, 52ab

10

7,8 ± 0,43ab

14

7,4 ± 0,64a

Примечания: «а» - достоверность отличия величин рассматриваемых параметров контроля с таковыми у инфицированных мышей; «b» - достоверность отличия величин рассматриваемых параметров с предыдущим сроком исследования.

Максимальное количество клеток, с цитоплазматической экспрессией второго рассматриваемого «противовирусного» цитокина – фактора некроза опухоли – TNF- было на 6 сутки эксперимента. Это наблюдали во всех трех типах исследованных клеток – альвеолоцитах, макрофагах и эндотелиоцитах сосудов легких. В среднем увеличение данного параметра у мышей линии С57Bl/6 по сравнению с таковыми у мышей в контрольной группе было в 4 – 5 раза. (см. табл. 11). Эти данные свидетельствуют о том, что TNF- начинает медиировать процессы воспаления несколько раньше, нежели IL-6.

Выявленные уровни провоспалительных цитокинов и каскадные кислород-зависимые и кислород-независимые защитные реакции у всех трех типов рассматриваемых клеток являются одновременно и факторами риска деструктивных осложнений «подстегивающих» воспаление.

ВЫВОДЫ

1. Альвеолоциты и эндотелиоциты сосудов интактных мышей линии С57В1/6 вне связи со специфичностью выполняемых ими функций, совместно с макрофагами легких представляют собой единую поэлементно взаимодополняемую систему защиты  внутренней среды организма в связи с особенностями их топологии в легких и определенного цитофизиологического сходства, проявляющегося высоким уровнем экспрессии ими лизосомальных протеаз (lysozyme, cathepsin D и myeloperoxidase); NO-синтаз (eNOS и iNOS), а также провоспалительных цитокинов -  TNF-  И IL-6.

2. Высокая вирулентность вируса гриппа А/Н5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 связана с его способностью инфицировать и персистировать в альвеолоцитах, эндотелиоцитах сосудов и макрофагах легких мышей, поскольку его экспрессия отмечена в этих клетках и достигает пика к 3 суткам после инфицирования и затем, после резкого ее снижения, он остается в них на постоянном, существенно более низком,  уровне. Наибольший уровень экспрессии антигена вируса гриппа А альвеолоцитами, очевидно, связан с аэрогенным способом и более ранним, чем у других клеток, контактом с вирусом, обусловленным  их анатомическим положением  в легких.

3. Высокая тропность  вируса гриппа А/Н5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05  к альвеолоцитам и эндотелиоцитам легких мышей линии С57Bl/6, его цитотоксичность детерминируют цепь последовательно развивающихся патологических структурных изменений: деструкцию сосудов, увеличение их проницаемости, тромбоэмболические и геморрагические осложнения, масштабные интерстициальный и внутриальвеолярный отек, десквамацию альвеолярного эпителия с развитием очагов ателектазов и диффузной острой эмфиземы, создающих патогенетические условия для острой гипоксии – фактора риска усиления процессов деструкции вне прямой связи с цитопатичностью вируса.

4. ВГ А/Н5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 индуцировал масштабную гибель альвеолоцитов, эндотелиоцитов и макрофагов легких механизмами некроза и апоптоза, с доминированием последнего, индуцированного вирусом. Можно полагать, что к индукции апоптоза причастно и состояние острой гипоксии, с последующей ишемией, обусловливающими развитие некроза.  Апоптоз как вероятный, но катастрофичный для организма способ элиминации вируса, очевидно, «предпочтителен» для обоих участников инфекционного процесса, поскольку в меньшей степени индуцирует воспаление с его рисками деструкции клеток.

5. Для вирусной инфекции  А/Н5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 характерна картина раннего развития высокой активности и масштабных репаративных процессов в легких, проявляющаяся пролиферативной активностью альвеолоцитов и эндотелиоцитов, новообразованием капилляров, заместительной репаративной регенераций  в системе соединительной волокнистой ткани, образованием многоядерных (полиплоидных) макрофагов. высокий уровень пролиферации в рассматриваемых экспериментальных условиях носит двойственный характер – способствует восстановлению утраченных структур, но как классическое проявление паразитизма в симбиозе – расширяет трофическую базу вируса, способствуя прогрессированию инфекции.

6. Инфицирование вирусом гриппа А/Н5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 ведет к активации  кислород-независимых  (протеазы) и кислород-зависимых (eNOS  и iNOS-синтазы) факторов защиты в альвеолоцитах, эндотелиоцитах сосудов и макрофагов легких, вне зависимости от выполняемых ими специфических функций, что характеризует их как единую систему противовирусной защиты легких организма. Отсроченный характер активации экспрессии iNOS после максимума проявления еNOS, видимо, носит компенсационный характер, тогда как экспрессия индуцибельной синтазы  эндотелиоцитами сосудов была ранней и сохранялась на высоком уровне в течение всего эксперимента, возможно, в связи с постоянным контактом этих клеток с циркулирующим вирусом.

7. Инфицирование мышей вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 сопряжено с активацией иммунного ответа в легких, о чем свидетельствуют массивные инфильтраты в легких, представленные CD-68+ легочными макрофагами, CD-1+ дендритными клетками, CD-8+ цитотоксическими лимфоцитами, но очевидно недостаточной для элиминации вируса.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

  1. Морфофункциональные особенности легочных макрофагов у мышей оппозитных линий CBA и C57Bl/6g / О.В. Потапова, Л.А. Черданцева, Т.В. Шаркова, В.А. Шкурупий, Н.Г. Лузгина, А.В. Ковнер // Фундаментальные исследования. – 2010. – № 10. – С. 34–39. (Из списка ВАК)
  2. Ковнер А.В. Функциональная активность легочных макрофагов мышей, инфицированных вирусом гриппа А/ H5N1 / А.В. Ковнер, О.В. Потапова //Студент и научно-технический прогресс: Материалы XLIX Международной научная студенческой конференции – 2011, Новосибирск.  – С. 28.
  3. Структурно-функциональные изменения легочных макрофагов и легких мышей, инфицированных вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/krasnoozerskoye/627/05 / А.В. Ковнер, А.Г. Аникина, О.В. Потапова, Т.В. Шаркова, Л.А. Черданцева, В.А. Шкурупий, А.М. Шестопалов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2012. – № 2. – С. 196–199. (Из списка ВАК)
  4. Ковнер А.В. Морфофункциональные изменения эндотелиоцитов сосудов легких при гриппе А/H5N1 у млекопитающих / А.В. Ковнер, А.Г. Аникина, О.В. Потапова // Клинические и теоретические аспекты современной медицины: Материалы IV Международной студенческой научной конференции с участием молодых ученых. -  2012, Москва. – С. 49–50.
  5. Ковнер А.В. Морфофункциональные изменения эндотелиоцитов сосудов легких при гриппе А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 у мышей / А.В. Ковнер, О.В.Потапова, В.А.Шкурупий // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2012. – № 10. – С. 472–475. (Из списка ВАК)

Автор благодарит сотрудников лаборатории отдела зоонозных инфекций и гриппа под руководством Шестопалова А.М., ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" (Новосибирск) за ведение совместного эксперимента.

 





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.