WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

Мещерякова Ольга Леонидовна

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ иммобилизованной

-фруктофуранозидазы, исследование ее физико-химических свойств и практическое применение

Специальность 03.01.06 – «Биотехнология (в том числе

бионанотехнологии)»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата технических наук

Воронеж – 2012

Работа выполнена на кафедре микробиологии и биохимии ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий»

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Корнеева Ольга Сергеевна

Официальные оппоненты: Бирюков Валентин Васильевич

доктор технических наук, профессор,

  ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет инженерной экологии», заведующий кафедрой экологической и инженерной биотехнологии

Кузнецов Вячеслав Алексеевич

доктор химических наук, доцент,

ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет», профессор кафедры высокомолекулярных соединений и коллоидов

Ведущая организация:Федеральное государственное автономное

  образовательное учреждение высшего

профессионального образования «Казанский (Приволжский) федеральный университет»

Защита состоится «20» июня 2012 года в 14 ч 00 мин на заседании диссертационного совета Д 212.035.06 при ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий» по адресу: 394036, г. Воронеж, просп. Революции, 19.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий».

Автореферат разослан «20» мая 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, к.б.н.                                Шуваева Г.П.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ


Актуальность работы. Одной из актуальных задач современной биотехнологии является разработка высокоэффективных препаратов иммобилизованных ферментов. Иммобилизованные ферментные препараты имеют ряд преимуществ перед свободными (нативными) ферментами: более высокую стабильность, возможность создания непрерывных и полунепрерывных автоматизированных процессов, способность к длительному функционированию полиферментных систем без экзогенных кофакторов и многократное их применение.

Среди гидролитических ферментов -фруктофуранозидаза (2,1--D-фруктофуранозид-фруктогидролаза, инвертаза, К.Ф. 3.2.1.26) занимает важное место ввиду возможности ее использования в реакциях гидролиза сахарозы с целью получения инвертного сиропа, широко используемого в пищевой промышленности. Однако ферментативный процесс получения инвертных сиропов имеет ряд недостатков: нестабильность активности фермента, его высокая стоимость, однократность использования. Эти недостатки можно устранить с помощью иммобилизации -фруктофуранозидазы.

На сегодняшний день изучаются различные методы иммобилизации -фруктофуранозидазы, такие как физическая сорбция на гидрофобных адсорбентах, включение в гидрофобные гели, ковалентная иммобилизация на нейлоне и др. Предлагаемые способы иммобилизации, как отечественных, так и зарубежных исследователей, чаще всего основаны на ковалентном присоединении фермента к носителю с использованием дополнительных агентов (глутаровый альдегид, ангидрид и др.), что усложняет процесс, а также имеют достаточно высокую стоимость носителя. При этом свойства иммобилизованного препарата и кинетические характеристики реакции гидролиза сахарозы недостаточно изучены. Большинство работ по выбору наиболее перспективных носителей для иммобилизации -фруктофуранозидазы принадлежат зарубежным исследователям: Huang Chen-ta и Lee Wen-Chien (1994), Basha S.Y., Palanivelu P. (2000),  Belcarz A., Ginalska G. (2002) и другим ученым. В России известные способы получения инвертного сиропа с применением иммобиллизованного фермента инвертазы немногочисленны, предусматривают применение дорогостоящих носителей для иммобилизации, не могут быть рекомендованы к применению в промышленных масштабах из-за малого выхода конечного продукта. Все выше изложенное свидетельствует об актуальности исследований в данном направлении.

Перспективным способом получения инвертного сиропа является гидролиз сахарозы иммобилизованной -фруктофуранозидазой Kluyveromyces marxianus Y-303, каталитическая активность которой в 2-3 раза превышает активность -фруктофуранозидаз известных и описанных в литературе продуцентов.

Настоящая работа выполнялась в соответствии с научным направлением кафедры микробиологии и биохимии Воронежского государственного университета инженерных технологий по проблеме «Научные основы и практическое применение биокаталитических технологий в биоконверсии природных полимеров» и в рамках научно-технической программы «Научные исследования высшей школы по приоритетным направлениям науки и техники».

Цель и задачи исследования.  Целью диссертационной работы явилось получение иммобилизованного ферментного препарата -фрукто-фуранозидазы Kluyveromyces marxianus Y-303 с максимальным сохранением активности и стабильности фермента и разработка битехнологии инвертного сиропа с его применением.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

– получение высокоочищенного ферментного препарата -фруктофуранозидазы Kluyveromyces marxianus Y-303;

– выбор и обоснование применения эффективного носителя для иммобилизации -фруктофуранозидазы;

– оптимизация условий иммобилизации -фруктофуранозидазы;

– сравнительная характеристика физико-химических свойств свободной и иммобилизованной -фруктофуранозидазы, кинетических и термодинамических параметров кислотной и термической инактивации фермента;

– изучение кинетических характеристик реакции гидролиза сахарозы имобилизованным ферментом;

– разработка биотехнологии инвертного сиропа с применением иммобилизованной -фруктофуранозидазы.

Научная новизна. Впервые получен иммобилизованный ферментный препарат -фруктофуранозидазы Kl. marxianus Y-303 на волокнистом ионообменнике марки ФИБАН А-6 и исследованы физико-химические и каталитические свойства иммобилизованного фермента. Выявлены закономерности процесса термической и кислотной инактивации фермента. Изучены кинетические характеристики ферментативного гидролиза сахарозы иммобилизованным ферментным препаратом, установлено увеличение кратности использования фермента в реакции гидролиза сахарозы и сохранение  высокой каталитической активности при длительном его хранении.

Научная новизна технических решений подтверждена патентом РФ «Способ получения иммобилизованной -фруктофуранозидазы» № 2327738 от 27.06.2008 г.

Практическая значимость работы. Получен высокостабильный биокатализатор путем адсорбционной иммобилизации -фруктофуранозидазы на волокнистом ионообменнике марки ФИБАН А-6, отличающийся многократностью использования в нескольких реакционных циклах и стабильностью при длительном хранении. Разработана биотехнология инвертного сиропа с применением иммобилизованной инвертазы, позволяющая удешевить стоимость целевого продукта.

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы были представлены на научных конференциях Воронежского государственного университета инженерных технологий (2004, 2005, 2012 гг.)

Публикации. По результатам проведенных исследований опубликовано 6 работ, в том числе 3 – в изданиях, рекомендованных ВАК, получен патент РФ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка используемой литературы и представлена на 135 страницах машинописного текста. Иллюстративный материал включает 21 рисунок и
15 таблиц. Библиография содержит 202 наименования, в том числе 117 зарубежных авторов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Обзор литературы. Проведен сравнительный анализ методов иммобилизации ферментов, в том числе -фруктофуранозидазы. Представлена характеристика физико-химических и каталитических свойств -фруктофу-ранозидазы различного происхождения. Проанализированы проблемы и перспективы технологии получения инвертных сиропов с применением ферментов микробного происхождения. Обобщен опыт отечественных и зарубежных исследователей в области разработки методов иммобилизации -фруктофуранозидазы и перспективности применения полученных биоктализаторов в биотехнологии инвертных сиропов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 2. Объекты и методы исследований.

Объекты исследований. В качестве объекта исследования использовали дрожжи Kluyveromyces marxianus Y-303, полученные из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ, Москва), синтезирующие активную -фруктофуранозидазу. Глубинное культивирование дрожжей Kl. marxianus проводили в колбах емкостью 500 см3, содержащих по 100 см3 питательной среды, в течение 48 ч при температуре 30 оС. В качестве носителя для адсорбционной иммобилизации использовали волокнистый ионообменник марки ФИБАН А-6 производства НПА Экофил-Деко (Беларусь).

Выделение и очистка фермента. Для выделения и очистки ферментного препарата использовали осаждение различными органическими растворителями, ионообменную хроматографию на DЕАЕ-сефадексе, колонке UltroРас Саlum ТSК, гель-фильтрационную хроматографию на колонке с Sephaсгуl S-200. Гомогенность полученных фракций определяли с помощью электрофореза в ПААГ по модифицированному методу Дэвиса и Орнстейна.

Определение активности свободной -фруктофуранозидазы осуществляли полумикрометодом Бертрана и методом Сомоджи-Нельсона, иммобилизованной -фруктофуранозидазы – спектрофотометрически резорциновым методом. За единицу активности принимали такое количество фермента, которое катализирует
1 мМ редуцирующих веществ за 1 мин в стандартных условиях.

Величину рН определяли на иономере «Анион 7010», определение количества белка в свободном ферменте осуществляли методом Лоури, в иммобилизованном – модифицированным методом Лоури. Сущность модификации заключалась в том, что иммобилизованный ферментный препарат обрабатывали раствором K,Na-тартрата, приготовленном на 1 М NaOH при 50 С в течение 10 мин, что приводило к разрушению связей между матрицей носителя и молекулой фермента. Количество остаточного белка в ферментном растворе определяли спектрофотометрическим методом на СФ-46.

Определение молекулярной массы осуществляли электрофорезом в ПААГ в присутствии додецилсульфата Na (ДСН) согласно методу Лаэммли и гель-фильтрацией на колонке с Sephacryl S-200.

Аминокислотный анализ проводили на автоматическом анализаторе аминокислот ААА-339Т (Чехия). Метод основан на предварительном окислении цистеина и метионина смесью перекиси водорода и муравьиной кислоты с последующим гидролизом соляной кислотой.

Подготовку анионита к испытанию осуществляли по ГОСТ 10896-78.

Адсорбционная иммобилизация -фруктофуранозидазы. Для проведения сорбционной иммобилизации -фруктофуранозидазы 1 г носителя оставляли на ночь при комнатной температуре в 50 см3 ацетатного буфера (рН 4,0), затем сливали избыточную жидкость и добавляли растворы ферментов различных концентраций (от 0,1 до 2,0 мг/см3, рН 4,0) и перемешивали в колбе с помощью электрической мешалки в течение 1 ч при температуре 22 оС.

Статистическая обработка результатов. Опыты проводились в 3-4-кратном повторении. Обсуждаются только те результаты, которые были воспроизведены в каждом опыте.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Глава 3. Иммобилизация -фруктофуранозидазы Kl. marxianus Y-303.

Очистка -фруктофуранозидазы Kl. marxianus Y-303. Известно, что дрожжи Kl. marxianus Y-303 синтезируют внутриклеточную  -фруктофуранозидазу. Для извлечения фермента из дрожжевой клетки существуют различные методы ее разрушения. Классическим методом выделения ферментов из дрожжевых клеток является автолиз.

Исследование влияния температуры и продолжительности процесса автолиза дрожжевых клеток К1. таrхianus на полноту выхода
-фруктофуранозидазы показало, что для дрожжей данной расы оптимальными условиями автолиза являются: температура 40 °С, продолжительность 60 ч; при этом максимальная ферментативная активность составила
345 ед/см3 (60 ед/мг белка). При 30 °С автолиз протекал медленнее, наибольшая активность -фруктофуранозидазы наблюдалась через 84 часа после начала автолиза и составила 60 % от максимальной. При 50 °С автолиз протекал гораздо быстрее (6 часов), однако активность составила всего 42 % от максимальной.

Далее проводили осаждение органическими растворителями – ацетоном, этиловым спиртом, изопропиловым спиртом при концентрации растворителей в автолизате от 50 до 80 %. Было установлено, что максимальной активностью обладал препарат, осажденный 67 % этиловым спиртом, при этом выход фермента по активности составил 95 %. Исследования по влиянию рН на полноту осаждения -фруктофуранозидазы из автолизата дрожжей Кl. таrxianus проводили при данной концентрации растворителей. Результаты показали, что при использовании в качестве осадителя этилового спирта оптимальным является рН 5,0, ацетона – 5,5.

Результаты по очистке  -фруктофуранозидазы представлены в таблице 1. В результате 5 стадий очистки был получен ферментный препарат со степенью очистки 143 и удельной активностью 2720 ед на 1 мг белка. Выход по активности составил 75 %.

Таблица 1 Очистка -фруктофуранозидазы К1. таrхianus Y-303

Стадии

очистки

Объем,

см3

Белок

Активность

Степень

очистки, раз

Выход,

%

мг/см3

Общий, мг

ед/см3

Общая, ед

Удельная, ед/мг белка

Автолиз

1133,0

5,79

6685,7

115

123430

17,8

1,0

100

Осаждение

9,9

17,97

186,5

1350

118160

665,3

34,9

95

DEAE-сефадекс

13,8

9,34

141,2

8472

111790

831,2

42,7

90

TSK-DEAE-5PW

33,1

2,64

74,1

3552

107054

1506,6

79,7

87

Гель-фильтрация

22,0

1,75

34,7

4600

92500

2720,0

143,1

75

Молекулярная масса -фруктофуранозидазы, определенная методом электрофореза в 10 % ПААГ с 0,1 % ДСН, составила 130 кДа, а методом гель-фильтрации – 260 кДа, что дает возможность предположить, что данный фермент имеет субъединичную структуру и является димером.

Исследования по определению аминокислотного состава фермента показали, что преобладающими аминокислотами являются аспарагиновая и глютаминовая кислоты.

Выбор и обоснование применения эффективного носителя для иммобилизации -фруктофуранозидазы. По литературным данным известно, что для иммобилизации -фруктофуранозидазы применяются практически все известные методы иммобилизации ферментов ( табл. 2).

Таблица 2 - Методы иммобилизации -фруктофуранозидазы и их характеристика

Характеристики

метода

Методы фиксирования фермента

на носителе

Поперечное связывание

Включение

Ковалентное связывание

Ионное

связывание

Адсорбция

Получение

Сложное

Легкое

Легкое

Среднее

Среднее

Активность

Высокая

Высокая

Средняя

Низкая

Высокая

Колебание состава смеси

Возможно

Не допустимо

Не допустимо

Допустимо

Не допустимо

Прочность связывания

Высокая

Низкая

Низкая

Высокая

Высокая

Регенерация

Невозможна

Возможна

Возможна

Невозможна

Невозможна

Стоимость получения

Высокая

Низкая

Низкая

Средняя

Средняя

В качестве метода иммобилизации была выбрана адсорбция, так как этот метод очень удобен и имеет ряд преимуществ перед другими методами иммобилизации: 1) техника получения адсорбированных на носителях белков проста: обычно достаточно смешать носитель с концентрированным раствором фермента и дать белку проникнуть в поры носителя и высушить материал; 2) носители для иммобилизации дешевы; 3) их возможно регенерировать; 4) фермент сохраняет высокую стабильность и активность, так как его структура после иммобилизации не изменяется.

При выборе носителя учитывалась безвредность компонентов носителя, его биологическая и химическая стабильность, низкая стоимость и доступные сырьевые источники.

В качестве носителя для иммобилизации фермента -фруктофу-ранозидазы Kluyveromyces marxianus Y-303 использовали волокнистый носитель марки ФИБАН А-6, содержащего сильно- и слабоосновные аминогруппы, который представляет собой полипропиленовое волокно с радиационно привитой полиакриловой кислотой (0,4 поликислоты на 1,0 г волокна); филамент с диаметром в пределах 20-50 микрон (рис. 1). Базовые продукты: нетканое иглопробивное полотно с поверхностной плотностью 250-1000 г/м2, (толщина 2,5-10 мм, рулоны), штапель. Функциональные группы (C3H5O)(CH3)2N+Cl-, -N(CH3 )2. Объемная масса нетканого полотна 0,1 кг/дм3.

Рис. 1 Электронная

микрофотография полотна

ФИБАН А-6. Увеличение 50·109

ФИБАН А-6 выдерживает действие агрессивных сред и температуры в условиях, соответствующих ГОСТам на гранульные ионообменные материалы с аналогичными функциональными группами. Этот материал имеет ряд преимуществ перед гранульными ионитами и сорбентами: исключительно высокую скорость ионообменных, сорбционных и каталитических процессов. Типичное время половинного ионообменного процесса на волокнах ФИБАН А-6 – 2-10 секунд, тогда

как на промышленных ионообменных смолах – 30-200 секунд.  Высокая скорость процесса достигается за счет короткого диффузионного пути поглощаемого иона внутрь ионообменного волокна. При этом сопротивление фильтрующего слоя может контролироваться плотностью его заполнения и поддерживаться на уровне сопротивления слоев такой же толщины из гранульных ионитов с диаметром частиц 0,5-1 мм. Оптимальное набухание,
г H2O/г ионита – 1,6; рабочий интервал pH – 0-12; рабочий интервал температур – до 80 °C включительно. ФИБАН А-6 широко используются в фильтрах очистки воздуха и питьевой или технической воды.

Оптимизация условий иммобилизации -фруктофуранозидазы Kl. marxianus. Важными параметрами для иммобилизации фермента являются масса носителя, рН среды, температура.

При проведении адсорбционной иммобилизации количество не связавшегося с носителем фермента определяли спектрофотометрически на
СФ-46 через разные промежутки времени. Как видно из рис. 2, увеличение массы носителя приводит к заметному снижению эффективности иммобилизации. Установлено, что содержание носителя в растворе 1,0 г обеспечивает максимальную степень иммобилизации.

Исследование влияния исходного значения рН среды на процесс иммобилизации -фруктофуранозидазы, показало, что рН оказывает воздействие не только на стабильность ионообменника, а также на эффективность иммобилизации. Наибольшая эффективность процесса иммобилизации наблюдалась при значении рН 4,0 (рис. 3).

Рис. 2 Эффективность процесса иммобилизации -фруктофу-ранозидазы в зависимости от массы носителя

Рис. 3 Влияние рН среды на эффективность иммобилизации -фруктофуранозидазы

Влияние температуры на процесс иммобилизации -фруктофуранозидазы было исследовано в диапазоне значений от 15 до 40 °С. Установлено, что температура 22 °С является оптимальной для процесса иммобилизации (рис. 4).


Рис. 4 Зависимость эффективности процесса иммобилизации -фрук-тофуранозидазы от температуры

Исследование зависимости сорбции от времени контакта с носителем (рис. 5) показало, что максимальная степень сорбции -фруктофуранозидазы наблюдалась через 40 мин в интервале концентраций 0,1-1,2 мг/см3. При увеличении концентрации фермента оптическая плотность раствора при сорбции не отличалась от свободного фермента, что говорит о том, что иммобилизация фермента идет в интервале низких концентраций. В среднем 1 г сорбента содержал 0,7 мг иммобилизованной -фруктофуранозидазы, выход иммобилизованного фермента составил 68-71 % (рис. 6).

 

Рис. 5 Зависимость сорбции от времени: D – оптическая плотность раствора -фруктофуранозидазы 1– свободной, 2– в контакте с сорбентом через 15 мин; 3 - через 30 мин; 4 – через 40 мин; с – концентрация раствора -фруктофуранозидазы, мг/см3

Рис. 6 Кривая сорбции -фрук-тофуранозидазы на волокнистом носителе ФИБАН А-6: g – масса белка, мг/г носителя; с – концентрация раствора -фруктофура-нозидазы, мг/см3

Известно, что емкость волокнистых ионитов превышает емкость гранульных в среднем в 3 раза. Это наблюдается только при низких концентрациях -фруктофуранозидазы (до 1,0 мг/см3), что подтверждает результаты предыдущих исследований.

Одновременно с опытами по определению сорбционной способности ионообменника по отношению к -фруктофуранозидазе контролировали активность свободного и иммобилизованного биокатализатора. Установлено, что иммобилизованная -фруктофуранозидаза сохраняла до 70 % активности по сравнению со свободным ферментом. Таким образом, оптимальными параметрами иммобилизации -фруктофуранозидазы на полимерном ионообменнике ФИБАН следует считать: масса ФИБАН А-6 1,0 г; рН 4,0; температура 20 °С; концентрация фермента 0,1-1,2 мг/см 3; время контакта фермента с носителем 40 минут.

Сравнительная характеристика физико-химических свойств свободной и иммобилизованной -фруктофуранозидазы. Для определения
оптимального  рН действия иммобилизованного фермента гидролиз сахарозы осуществляли в интервале рН 3,0-7,0. Заданное значение рН субстрата поддерживали с помощью 0,1 М ацетатного буфера. Гидролиз проводили при температуре 50 °С в течение 20 минут, аналогично поступали в случае со свободной -фруктофуранозидазой. Как видно из рис. 7, как свободный, так и иммобилизованный ферменты проявляли максимальную активность при
рН 4,0. 

Влияние температуры на каталитическую активность свободного и иммобилизованного фермента исследовали в интервале температур 30-80 °С (рис. 8). Установлено, что максимальная активность свободного фермента 2720 ед на 1 мг белка наблюдалась при температуре 50 оС и рН 4,0, тогда как для иммобилизованной -фруктофуранозидазы оптимальная температура гидролиза субстрата смещалась в сторону более высоких значений (70 оС), что на 20 оС выше, чем для свободного фермента, и составила
1890 ед/мг белка.

Рис. 7 Зависимость активности
(% от максимальной) от рН при температуре 50 оС: 1-свободной, 2- иммобилизованной -фруктофу-ранозидазы 

Рис. 8 Влияние температуры на активность -фруктофуранози-дазы (% от максимальной) при рН 4,0: 1 свободный фермент, 2 иммобилизованный

Можно предположить, что повышение оптимальной температуры реакции гидролиза сахарозы для иммобилизованной -фруктофуранозидазы обусловлено тем, что при присоединении к носителю происходит повышение жесткости третичной структуры фермента.

Исследование кинетики кислотной и термической инактивации свободной и иммобилизованной -фруктофуранозидазы. Кислотную инактивацию -фруктофуранозидазы исследовали в интервале рН 3,0-7,0 в 0,1 М ацетатном буфере. Растворы ферментов инкубировали при 30 оС и через определенные промежутки времени определяли остаточную активность. Было установлено, что константа инактивации (К ин) как иммобилизованного, так и свободного ферментов по отношению к рН среды изменялись аналогично. Инактивация ферментов была незначительна при рН 4,0 (0,0019 ч-1) и увеличивалась при рН 5,0-6,0 (0,0078 ч-1 и 0,0091 ч-1 соответственно) через 3 ч инкубирования.

Исследование термической инактивации свободной и иммобилизованной -фруктофуранозидазы показало, что повышение температуры до 60 оС приводило к более резкой инактивации свободного фермента (рис. 9а), остаточная активность составляла 48 % от максимальной через 60 мин инкубации, тогда как остаточная активность иммобилизованного фермента при 70 оС после 60 мин инкубации составила 66 % от исходной (рис. 9б). Нагревание -фруктофуранозидазы при 80 оС в течение 45 мин приводит к неполной инактивации иммобилизованного фермента: он сохраняет 2 % каталитической активности через 30 мин инкубации.

а)

б)

Рис. 9 Зависимость каталитической активности свободной (а) и иммобилизованной (б) -фруктофуранозидазы от времени термической инактивации: А – активность (% от максимальной); t – время инкубирования, мин; температура, оС: (а) 1 –  30; 2 – 40; 3 – 50; 4 – 60; (б) 1 – 50; 2 – 60; 3 – 70; 4 – 80

Сравнительный анализ совместного действия рН и температуры на активность иммобилизованной и свободной -фруктофуранозидаз показал, что  иммобилизация приводит к значительному повышению термоустойчивости белковой молекулы и сохранению свойств фермента при кислотной инактивации (табл. 3). Очевидно ионообменное волокно ФИБАН А-6 достаточно прочно связывается с -фруктофуранозидазой, обеспечивая более высокую термостабильность и сохранение рН-стабильности белка.

Таблица 3 Влияние температуры и рН на константы скорости инактивации свободной и иммобилизованной -фруктофуранозидазы

Температура, оС

3,0

4,0

5,0

6,0

Ксв, ч-1

Ким, ч-1

Ксв, ч-1

Ким, ч-1

Ксв, ч-1

Ким, ч-1

Ксв, ч-1

Ким, ч-1

30

0,006

0,005

0,002

0,001

0,007

0,007

0,009

0,008

40

0,013

0,012

0,004

0,005

0,017

0,015

0,026

0,023

50

0,100

0,098

0,068

0,071

0,160

0,085

0,240

0,044

60

1,100

0,099

0,875

0,061

1,800

1,100

2,310

0,150

70

-

0,100

-

0,055

-

1,145

-

0,250

80

-

2,300

-

2,510

-

2,604

-

-

На рис. 10 представлена сравнительная характеристика зависимости ферментативной реакции гидролиза сахарозы свободной и адсорбционно иммобилизованной на носителе ФИБАН А-6 -фруктофуранозидазой от концентрации субстрата. Как видно из рис. 10, кинетика гидролиза сахарозы свободной и иммобилизованной инвертазы подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен, что согласуется с литературными данными для дрожжевых инвертаз.

С помощью преобразования кривых зависимости V от S в координатах Лайнуивера-Берка были определены Km и Vmax реакции гидролиза сахарозы (табл. 4).

Рис. 10 Зависимость каталитической активности 1 свободной и 2 - иммобилизованной -фруктофуранозидазы от концентрации субстрата: V – скорость реакции, % от максимальной; [S] - концентрация субстрата, моль/л·10-4

Таблица 4 Значения Km и Vmax для реакции гидролиза сахарозы
-фруктофуранозидазой

-фруктофуранозидаза

Km, моль/л

Vmax, мкмоль·мг/мин

свободная

2,24·10-4

102±0,9

иммобилизованная

3,3·10-4

35±0,9

Показано, что иммобилизация приводит к увеличению значений константы Михаэлиса и уменьшению максимальной скорости реакции по сравнению со свободным ферментом. 

Характеристика свойств биокатализатора гидролиза сахарозы. Иммобилизация -фруктофуранозидазы заключается в ее физической адсорбции на поверхности носителя. Полученный биокатализатор промывали 10-кратным объемом буферного раствора и использовали в процессе гидролиза раствора сахарозы с массовой долей 5 % до глюкозы и фруктозы. Биокатализатор имеет следующие характеристики: величина адсорбции -фруктофуранозидазы – 0,7 мг белка /г носителя, начальная удельная ферментативная активность – 1890 ед/мг белка.

Процесс гидролиза сахарозы проводили в термостатируемой колонке высотой 40 см и диаметром 1,5 см с использованием неподвижного слоя биокатализатора при температуре 70 oC и рН 4,0.

Полученный биокатализатор сохранял высокую каталитическую активность при использовании в 4-5 реакционных циклах (рис. 11); при хранении фермента в холодильной камере наблюдалось незначительное снижение каталитической активности по истечении 4-6 месяцев (рис. 12), что свидетельствует об эффективности предложенного способа иммобилизации.

Рис. 11 Кратность использования иммобилизованной -фруктофура-нозидазы в реакции гидролиза сахарозы:

А – активность иммобилизованного фермента (% от максимальной);

n – количество реакционных циклов

Рис. 12 Изменение активности (% от максимальной) иммобилизованной -фруктофурано-зидазы при хранении: А – активность иммобилизованной -фруктофуранозидазы, (% от максимальной)


Глава 4. Практическое применение иммобилизованной -фруктофуранозидазы.  Изучение влияния рН реакционной среды на процесс гидролиза сахарозы показало, что данный препарат проявлял максимальную активность при величине рН 4,0 (рис. 13).

Рис. 13 Влияние величины рН на процесс гидролиза сахарозы: 1 – 6,0; 2 – 4,0; 3 – 5,0; 4 – 3,0; СГ – степень гидролиза сахарозы, % от максимальной; t –продолжительность гидролиза, ч

Рис. 14 Динамика гидролиза 5 % раствора сахарозы при дозировке ферментного препарата, ед/г сахарозы: 1 – 4; 2 – 6; 3 – 8; 4 – 10; 5 – 12; РВ – содержание редуцирующих веществ, % от максимального

При исследовании влияния дозировки ферментного препарата иммобилизованной -фруктофуранозидазы на процесс гидролиза 5 % раствора сахарозы фермент вносили в количестве 4, 6, 8, 10 и 12 ед активности на 1 г сахарозы. Гидролиз проводили при температуре 50 оС и рН 4,0 (рис. 14).

Установлено, что для достижения полного гидролиза сахарозы необходимо в реакционную среду вносить иммобилизованную
-фруктофуранозидазу в количестве 6-8 ед  активности на 1 г сахарозы.

Влияние температуры на гидролиз сахарозы. Изучено влияние температуры на гидролиз сахарозы в интервале 50-80 оС, так как ранее было установлено, что активность фермента при температурах 30-45 оС снижалась до 35 % от максимальной. С увеличением температуры гидролиза (рН 4,0 и концентрация сахарозы 10 %) в интервале от 50 до 70 оС константа скорости гидролиза Кг повышалась (табл. 5).

В пределах одного значения температуры величина Кг практически не менялась за весь период гидролиза. Однако, с повышением температуры до 80 оС имело место снижение скорости гидролиза и Кг, что связано с термической инактивацией фермента. Таким образом, рациональные режимы гидролиза сахарозы иммобилизованным ферментным препаратом -фрук-тофуранозидазы дрожжей Kl. marxianus Y-303: температура 70 оС, рН 4,0; дозировка фермента 6-8 ед/г сахарозы, продолжительность гидролиза 3-4 ч.

Таблица 5 Влияние температуры на гидролиз сахарозы иммобилизованной -фруктофуранозидазой

Время гидролиза,

t, мин

Температура, оС

50

60

70

80

СГ, %

Кг, мин-1

СГ, %

Кг, мин-1

СГ, %

Кг, мин-1

СГ, %

Кг,

мин-1

30

25,6

0,008

35,6

0,008

43,1

0,019

9,1

0,0024

60

40,8

0,009

51,2

0,009

75,4

0,020

9,5

0,0017

90

60,4

0,010

70,3

0,009

84,0

0,023

-

-

120

68,3

0,009

81,2

0,010

90,5

0,020

-

-

150

79,0

0,010

85,6

0,011

94,1

0,020

-

-

180

86,5

0,011

88,6

0,012

98,2

0,019

-

-

210

90,4

0,011

94,6

0,015

100

0,022

-

-

Получение инвертного сиропа. Получение инвертного сиропа осуществляли путем пропускания раствора сахарозы через колонку, содержащую слой волокнистого ионообменника ФИБАН А-6 с иммобилизованным ферментным препаратом -фруктофуранозидазы. Расход ферментного препарата обеспечивает его активность в количестве 6-8 ед на г сахарозы.

Известно, что в промышленности используют в основном инвертные сиропы высокой концентрации: от 40 до 80 %. Максимальная скорость гидролиза для сахарных растворов 60-80 % концентрации наблюдается при температуре 70 оС, инверсия же 40 % раствора в данных условиях, наоборот, замедляется. Это говорит о том, что уменьшение температуры гидролиза удлиняет продолжительность инверсии.

Нами разработаны следующие условия получения инвертного сиропа с использованием иммобилизованной -фруктофуранозидазы: концентрация сахарного раствора 80 %, дозировка ферментного препарата 6-8 ед активности на 1 г сахарозы, температура 70±2 оС, продолжительность гидролиза
3,0-4,0 ч. Предлагаемый способ позволяет уменьшить расход ферментного препарата в 3-4 раза и сократить продолжительность инверсии в 1,5-2 раза.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Получен высокоочищенный гомогенный ферментный препарат
-фруктофуранозидазы Kluyveromyces marxianus Y-303 с удельной активностью 2720 ед/мг. Максимальная степень сорбции фермента (70 %) достигается при использовании в качестве носителя волокнистого ионообменника ФИБАН А-6.

2. Установлено, что оптимальные условия иммобилизации инвертазы – масса носителя 1,0 г, рН 4,0, температура (22±3) оС, время контакта с носителем 40 мин, концентрация раствора фермента 1,0 мг/см3.

3. Доказано увеличение термостабильности иммобилизованного фермента по сравнению со свободным. Оптимум действия фермента увеличивается до 70 оС, что на 20 оС больше, чем для свободного фермента. При рН 4,0 и температуре 70 оС иммобилизованная -фруктофуранозидаза сохраняет
66 % активности в течение 60 мин, тогда как свободный фермент при 60 оС за этот промежуток времени сохраняет 48 % активности.

4. Установлено, что иммобилизованный фермент сохраняет 70 % первоначальной активности при 4-5- кратном его использовании. При температуре (4±2) оС фермент сохраняет 80 % активности в течение 4-6 месяцев.

5. Оптимальными параметрами ферментативного способа получения инвертного сиропа с использованием иммобилизованной
-фруктофуранозидазы являются: концентрация сахарного раствора 80 %, дозировка ферментного препарата 6-8 ед/г сахарозы, температура (70±2) оС, продолжительность 3-4 ч.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК

1. Кульнева, Н. Г. Пути повышения эффективности получения и очистки производственных сахарсодержащих растворов [Текст] / Н. Г. Кульнева, В. А. Голыбин, В. А. Федорук, О. Л. Мещерякова // Вестник Воронежского государственного университета инженерных технологий. – 2012. - № 1. – С. 165-171.

2. Мещерякова, О. Л. Сравнительная характеристика свойств свободной и иммобилизованной -фруктофуранозидазы [Текст] / О. Л. Мещерякова, О. С. Корнеева, Г. П. Шуваева [Электронный ресурс] // Современные проблемы науки и образования. – 2012. - № 2. – Режим доступа : http://search.rae.ru

3. Мещерякова, О. Л. Иммобилизация -фруктофуранозидазы на волокнистом носителе [Текст] / О. Л. Мещерякова [и др.] // Биотехнология. – 2012. – № 3. – С. 47-51.

Патенты

1. Пат. № 2327738 Российская Федерация МПК7 C12N11/00, 11/04, 11/12, 11/14. Способ получения иммобилизованной -фруктофуранозидазы [Текст] / О. С. Корнеева, О. Л. Мещерякова, А. В. Калач, А. И. Ситников, Т. В. Свиридова: заявитель и патентообладатель Государственное образовательное учреждение Воронежская государственная технологическая академия (RU) – № 2006141092/13;заявлено 20.11.2006; Опубл. 27.06.2008, Бюл. № 18.

Статьи и материалы конференций

1. Корнеева, О.С. Биосенсоры на основе ферментов и их применение в пищевой промышленности [Текст] / О. С. Корнеева, О. Л. Гавшина // Материалы XLIII отчетной научной конференции за 2004 год. - Воронеж, 2005. – Ч. 1. – С. 92

2. Корнеева, О. С. Использование биосенсоров для анализа углеводсодержащего сырья [Текст] / О. С. Корнеева, А. В. Калач, О. Л. Мещерякова // Материалы XLIV отчетной научной конференции за 2005 год. – Воронеж, 2006. – Ч. 1. – С. 65-66.

3. Мещерякова, О. Л. Гетерогенный биокатализатор для получения инвертного сиропа [Текст] / О. Л. Мещерякова // Материалы XLIII отчетной научной конференции за 2011 год. - Воронеж, 2012. – Ч. 1. – С. 92.


Подписано в печать 24.02. 2012. Формат 60 х 84 1/16

Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 35

ФГБОУВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий»

(ФГБОУВПО «ВГУИТ»)

Отдел полиграфии ФГБОУВПО «ВГУИТ»

Адрес университета и отдела полиграфии:

394036, Воронеж, пр. Революции, 19




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.