WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

ПИКОВ

Александр Васильевич

РАЗРАБОТКА ТЕХНОГИИ КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ ГЛУБИННОЙ КУЛЬТУРЫ ВАКЦИННОГО ШТАММА BRUCELLA MELITENSIS REV – 1  ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ЖИВОЙ СУХОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ БРУЦЕЛЛЕЗА ОВЕЦ И КОЗ

Специальность 03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата

биологических  наук

Щелково, 2012

Работа выполнена в  ФГБОУ ВПО  «Вятский государственный университет».

Научный руководитель:

Комоско Геннадий Владимирович - кандидат биологических наук, доцент, лауреат Государственной премии Российской Федерации, полковник медицинской службы.

Официальные оппоненты:

Скичко Николай Данилович – доктор биологических наук, профессор, лауреат Государственной премии СССР, главный научный сотрудник отдела противобактерийных препаратов ГНУ  «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности», г. Щелково.

Колышкин Владимир Михайлович – доктор биологических наук,

генеральный директор ООО «Промоген», г. Москва.

Ведущая организация:

ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им К.И. Скрябина».

Защита состоится 26 октября 2012 г. В 10 часов на заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук

Д 006.069.01 при ГНУ  «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» РАСХН  по адресу: 141142, Московская обл., Щёлковский район, пос. Биокомбината, д. 17,  ВНИТИБП; тел./факс: 8(496)56-732-63; e-mail: vnitibp@mail.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ  «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» Россельхозакадемии.

Автореферат разослан 25 сентября 2012 г.

Ученый секретарь совета:

кандидат биологических наук Фролов Ю.Д.

  1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность темы. Одним из важнейших условий подъёма животноводства и обеспечения населения продуктами питания является снижение, а затем ликвидация инфекционных болезней. Одна из таких болезней, наносящих значительный ущерб экономике страны – бруцеллёз. В инфекционной патологии животных он занимает существенное место.

Бруцеллез относится к зоонозам, передающимся от больных животных человеку, и принадлежит к опасным  заболеваниям, что определяет значение вопроса вакцинопрофилактики этой инфекционной патологии, который за последние годы приобрел особую актуальность. Это связано с рядом факторов:

- снижение уровня производства вакцинных препаратов;

  - нарушение календаря профилактических прививок;

  - рост заболеваемости бруцеллезом среди сельскохозяйственных животных и особенно среди овец и коз;

  - недостаточность финансирования исследований по разработке эффективных средств вакцинопрофилактики бруцеллеза нового поколения;

- ухудшение эпидемиологической и экологической обстановок.

Наиболее значимым элементом в системе предупреждения бруцеллезной инфекции является вакцинопрофилактика.

Биологические особенности вакцинных штаммов бруцелл (повышенные питательные потребности, длительность выращивания, наличие диссоциации и др.) делают производство препаратов на их основе  дорогостоящим из-за высокого процента брака, себестоимости исходного сырья и потерях на стадии концентрирования. В условиях коммерциализации эти причины привели к резкому снижению объемов производства бруцеллезных вакцин. Таким образом, приготовление препарата с необходимым  содержанием количества прививочных доз во флаконе (ампуле) за счет повышения выхода микробных клеток вакцинного штамма при сохранении их свойств на этапах концентрирования и лиофилизации обеспечивает рентабельность производства препаратов и является актуальной задачей.

Цель и задачи исследований. Цель исследований: разработка технологии концентрирования глубинной культуры вакцинного штамма Brucella melitensis  Rev-1 для приготовления живой сухой вакцины против бруцеллеза овец и коз. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. На основании проведенного анализа данных литературы о патогенных свойствах вакцинных штаммов бруцелл, их культурально-морфологических свойств, методах культивирования микроорганизмов обосновать выбор способа концентрирования бруцелл;

  2. Обосновать выбор аппаратуры  для  проведения процесса концентрирования;

  3. Определить режимы подготовки оборудования, параметры ведения процесса, обеспечивающие получение концентрированной бактериальной массы вакцинного штамма Br. melitensis Rev–1 при сохранении регламентированных биологических свойств;

  4. Оценить качество бруцеллезной живой сухой вакцины на основе штамма Br. melitensis Rev–1  и ее полуфабрикатов, полученных с использованием вновь разработанной технологии концентрирования и выдать заключение о ее соответствии нормативным требованиям.

Научная новизна работы.

Впервые при производстве сухой бруцеллезной вакцины разработана  и внедрена в практику технология концентрирования глубинных культур вакцинного штамма Br. melitensis  Rev-1 на пористых мембранах в режиме проточной фильтрации.

Теоретически и экспериментально обоснован материал мембран и  их порог задержания.

Практическая значимость работы.

Разработана технология концентрирования глубинных культур вакцинного штамма Br. melitensis  Rev-1 для приготовления живой сухой вакцины против бруцеллеза овец и коз.

Из полученных микробных концентратов приготовлены партии вакцины живой сухой, проведены исследования на соответствие препаратов требованиям НД. Показано соответствие готовых вакцинных препаратов основным требованиям НД.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Возможность концентрирования глубинных культур вакцинного штамма Brucella melitensis  Rev-1, с использованием установки «Сартокон – 2».

2. Параметры подготовки и стерилизации оборудования.

3. Параметры процесса концентрирования, обеспечивающие получение микробных концентратов бруцелл в промышленных условиях и воспроизведение технологического процесса концентрирования.

4. Возможность получения готового препарата вакцины против бруцеллеза овец и коз, отвечающего требованиям НД,  на основе микробных концентратов, полученных мембранным способом.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всероссийской научной конференции молодых ученых «Наука. Производство. Экология» (г.Киров, 2010).

Публикации научных исследований. По результатам диссертации опубликовано 4 печатных работы, в том числе 3 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 109 страницах компьютерного текста. Диссертационная работа включает: введение, аналитический обзор, выбор направления исследований, теоретические и экспериментальные исследования, обобщение результатов исследований, выводы и заключение. Список использованной литературы включает 123 источника, из них 100 отечественных, 17 – иностранных и 6 – материалы из сети Интернет. Работа иллюстрирована 11 таблицами и 19 рисунками, содержит 2 приложения.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы исследований

Животные. Для оценки безвредности микробных концентратов использовали аутбредных белых мышей обоего пола, 35 – 40 дневного возраста, весом 35 – 40 г.

Питательные среды и растворы. В работе использовали 50%-й раствор глюкозы с витаминами,  МПБ,  МПА, бруцеллагар, сахарозо-желатиновую защитную среду, физраствор. Для глубинного культивирования бруцелл использовали культуральную среду на основе ферментативного гидролизата мяса, 

Штаммы микрорганизмов. Использовали вакцинные штаммы  Br. melitensis Rev–1 и Bacillus anthracis 55-ВНИИВВиМ, полученные из ФГБУ ВГНКИ Ветеринарных препаратов.

Основное оборудование. Глубинные  культуры бруцелл выращивали в бутылях объемом 20 дм3 и в биореакторах БИОР-0,25 м3 (ОКБ ТБМ, г. Кириши Ленинградской обл.), оснащенных перемешивающим устройством магнитного типа.

Для концентрирования глубинных культур вакцинного штамма  Br. melitensis Rev–1 использовали установки микрофильтрации "Сартокон-мини" и "Сартокон-2" (производства предприятия "Владисарт", г.Владимир, Россия), мембранные модули "Ультрасарт" на основе полисульфона с порогом задержания 300 кДа, мембранные модули «Микросарт» на основе ацетата целлюлозы с размером пор 0,2 мкм, мембранные модули на основе полипропилена с размером пор 0,2 мкм, мембранные модули на основе полипропилена с размером пор 0,45 мкм (производства  предприятия "Владисарт", г.Владимир).

Замораживание препарата для лиофилизации осуществлялась в низкотемпературной морозильной камере производства фирмы «Frigera» (Чехословакия). Лиофилизация препарата осуществлялась в сублимационной установке LZ – 45.27 производства фирмы «Frigera» (Чехословакия).

Методы оценки качества препаратов. Для изучения свойств микробных суспен­зий и приготовленной на их основе вакцины применяли методы оценки качества по следую­щим показателям:

- содержание живых микроорганизмов в 1 см3 микробной суспензии  (биологическая концентрация, БК)определяли методом высева на плотную пита­тельную среду;

- оптическая концентрация (ОК) бруцелл в 1 см3 микробной суспензии по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича;

- наличие и степень диссоциации бруцелл определялась в пробах с акрифлавином и по Уайт – Вилсону;

- реакцию среды рН определяли потенциометрическим методом;

- безвредность препаратов определялась введением белым мышам препаратов бруцелл подкожно в соответствии с рекомендациями Стандарта организации «Вакцина против бруцеллеза овец и коз и инфекционного эпидидимита баранов из штамма B.melitensis Rev – 1  живая сухая» СТО 00494189-0001-2004. 

- остаточная влажность  готовой формы препарата определяли гравиметрическим методом;

- наличие посторонней микрофлоры определяли микроскопией окрашенных по Граму мазков и методом выращивания на плотной питательной среде;

- определение остаточной концентрации формалина в промывных водах установки «Сартокон-2» проводили сульфитным методом.

Обработка результатов. Результаты экспериментальных исследований представлены в виде среднего арифметического значения с определением довери­тельного интервала при уровне вероятности, равном 95%. Дос­товерность различий определялась согласно рекомендациям ГОСТа 15895-77 и в соответствии с рекомендациями И.П. Ашмарина и А.А. Воробьева.





2.2. Результаты собственных исследований

2.2.1. Изучение  возможности  применения мембранной техники  для  концентрирования  нативных  культур Brucella melitensis Rev 1 

Концентрирование осуществлялось на лабораторной установке «Сартокон-мини» путем циркуляции нативной культуры с отводом фильтрата в промежуточную емкость (стерильная стеклянная бу­тыль вместимостью 20,0 дм3). Концентраты получены из экспериментально приготовленных глубинных культур, выращенных в бутылях объемом 20 дм3. Концентрация бруцелл в бутылях составляла 15 - 20 млрд.м.к.*см-3, объем нативной культуры в бутыле 15 – 17 дм3 (1 бутыль – 1 концентрат).

В экспериментах использовались следующие типы мембранных модулей:

  1. мембрана «Ультрасарт» на основе полисульфона с порогом задержания 300 кДа;
  2. мембрана «Микросарт» на основе полипропилена с размером пор 0,2 мкм;
  3. мембрана «Микросарт» на основе ацетата целлюлозы с размером пор 0,2 мкм;
  4. мембрана «Микросарт» на основе ацетата целлюлозы с размером пор 0,45 мкм.

Использование мембраны с диаметром пор 0,45 мкм показало свою нецелесообразность ввиду уноса бруцелл с фугатом, что приводит не только к потерям целевого продукта, но и к быстрому забиванию мембраны дисперсной фазой и невозможности длительного использования ее в производстве.

Результаты проведенных исследований представлены в таб­лице 1. Среднее время концентрирования  представлено, как среднее арифметическое времени концентрирования бутыли после отмывки мембран рекомендуемыми средствами. G – производительность мембраны по дистиллированной воде от номинала после 5 циклов концентрирования с отмывкой мембраны рекомендуемыми средствами после каждого цикла концентрирования.

Таблица 1

Характеристика концентрированных культур Br.melitensis Rev – 1, полученных мембранным способом на установке "Сартокон-мини", (n=5)

Концентрат, полученный с использо-ванием мембраны

Наименование показателя

ОК, млрд. м.к.*см-3

БК, млрд. м.к.*см-3

рН концентрата, ед. рН

Среднее время концен-трирова-ния, мин

G,%

Полисульфон,3300 кДа

125± 12

120±10

6,95±0,10

70

90

Полипропилен,

0,2 мкм

122± 10

118±9

6,99±0,11

95

75

Ацетат целлюлозы 0,2 мкм

122±5

120±7

6,87±0,04

120

65

Экспериментальные данные, приведенные в таблице 1, сви­детельствуют о  принципиальной возможности концентрирования мембран­ным способом глубинных культур Br. melitensis Rev – 1 и целесообразности проведения дальнейших исследований в экспериментально-производственных условиях с использованием мембран «Ультрасарт» на основе полисульфона с диаметром пор 300 кДа.

2.2.2.  Разработка промышленной технологии мембранного концентрирования глубинных культур Br. melitensis Rev 1 

При выборе конкретного микрофильтрационного оборудования учитывали воспроизводимость технологии и ее способность адекватно отвечать требованиям, которые предъявляются условиями изготовления тех или иных препаратов. Вместе с тем, технология должна быть универсальной, мобильной, отличаться относительно низкой стоимостью капитальных затрат и применяемого оборудования,  а  также  обеспечивать удобство в эксплуатации.

С учетом вышеизложенного выбор был сделан в пользу установки микрофильтра­ции "Сартокон-2", снаряженную кассетными модулями.

Кассетный (мембранный) модуль «Ультрасарт» на основе полисульфона с порогом задержания 300 кДа выбран в качестве разделяющей мембраны вследствие его биологической инертности и на основе проведенных ранее исследований по концентрированию нативных глубинных культур  Br.melitensis Rev – 1 на лабораторной установке «Сартокон – мини».

Теоретическая и практическая ценность использования ус­тановки основаны на исключительно важных для производства критериях, а именно:

- высокой удельной производительности;

- практическом отсутствии концентрационной поляризации;

- высоких значениях фильтрационного потока при низкой ре­циркуляции;

- возможности стерилизации химическим и другими способами;

- биологической инертности материалов и соответствии их международным требованиям ВОЗ;

- герметичности исполнения;

- простоте обслуживания и аппаратурного оформления.

Таким образом, анализ конструкции установки и кассетных мембранных модулей  позволяет сделать заключение о том, что наиболее при­емлемым из доступного оборудованием для концентрирования вакцинного штамма Br. melitensis Rev–1  на современ­ном этапе развития мембранной техники может служить установка микрофильтрации "Сартокон-2".

2.2.2.1. Выбор метода и отработка режима стерилизации установки микрофильтрации "Сартокон-2"

Способность мембран к стерилизации служит важным показателем их эксплуатационных свойств. Устойчивость материала мембраны к действию тепловой и химической стерили­зации оказывается существенно различной. При стерилизации  паром возможно возникновение повреждений поверхности ма­териала мембран. Большинство мембран под­вергаются химической стерилизации.  Эффективность, простота и экономичность были взяты за основу при выборе способа стерилизации. Исходя из этого, выбор был сделан в пользу химического способа стерилизации.

Из анализа данных литературы и технических характеристик мембранных модулей "Ультрасарт" на основе полисульфона опреде­лили наиболее эффективные, доступные и дешевые химические ве­щества. К их числу относятся дезинфицирующие композиции на основе формальдегида, с раствором которого проводили эксперименты.

Предварительно установка с коммуникационными узлами и смонтированной мембраной подвергалась контаминации спорами сибиреязвенного микроба вакцинного штамма Bacillus anthracis 55 ВНИИВВиМ. Контаминация осуществлялась путем циркуляции через установку суспензии спор концентрацией 200±10 млн.спор*см-3 объемом 10 дм3  в течение 20 минут. По окончании контаминации установка разбиралась для взятия проб на контаминированность спорами Bacillus anthracis 55 ВНИИВВиМ. Пробы отбирались стерильными ватными тампонами путем смыва со следующих поверхностей: входной штуцер линии концентрата; выходной штуцер линии концентрата; отверстия ввода и вывода микробной культуры мембранного фильтра. Затем смывы высевались на скошенный мясопептонный агар в пробирках и инкубировались в течение суток. Во всех случаях на скошенном агаре наблюдался типичный рост культуры Bacillus anthracis 55 ВНИИВВиМ, при микроскопии приготовленных и окрашенных препаратов обнаружены типичные для данной культуры вегетативные клетки. Установка после контаминации монтировалась и подвергалась обработке растворами формалина с концентрацией 2% при температуре 20-25 °С, путем циркуляции раствора через установку. Удаление остатков стерилизующего раствора из уста­новки, мембранных модулей и коммуникаций проводили стерильной дистиллированной водой.  Для этого очистку проводили кратными объемами стерильной дистиллированной воды (5,0;10,0; 15,0; 20,0 дм3). По результатам исследований промывных вод установили зависимость концентрации остаточного формаль­дегида от расхода воды. Результаты исследований представлены на рисунке 1.

Рис.1. Зависимость остаточной концентрации формальдегида (С, %) от расхода промывных вод (Q, л)

Как видно из представленной на рисунке 1 графической зависимости, с увели­чением расхода воды (Q) остаточная концентрация формальдегида (С) уменьшалась. При использовании объемов воды 15,0 и 20,0 л остаточная концентрация формальдегида, определенная сульфитным методом составляет менее 0,01%, что  свиде­тельствует о достаточной полноте отмывки от остатков формаль­дегида. Был сделан вывод, что минимально необходимый объем стерильной дистиллированной воды, необходимый для отмывки установки от остатков формальдегида составляет 20 л. 

Конечные порции воды с линии выхода концентрата были высеяны на скошенный мясопептонный агар. Об эффективности стерилизации судили по наличию выросших колоний микроорганизмов на скошенном агаре. Результаты исследований по эффективности стерилизации представлены в таблице 2.

Таблица 2

Эффективность стерилизации установки микрофильтрации "Сартокон-2" растворами формальдегида

Концен­трация раство­ра, %

Время циркуляции, мин

Наличие

микрофлоры

2

20

есть

2

40

нет

Из представленных в таблице 2 данных следует, что приме­нение 2%-ного  раствора  формальдегида  при  температуре 20–25 °С и времени циркуляции раствора через установку не менее 40 минут обеспечивает достижение необходимых асептических условий для ведения про­цесса получения концентрированной микробной суспензии.

Однако следует отметить, что в процессе переработки промышленных объемов нативных культур наблюдался эффект спрессовывания накопившейся биомассы в местах установки манометров. В этой связи целесообразно химический способ стерилизации сочетать с периодической (не реже, чем через 4 рабочих цикла) механической очисткой и последующей термической обработкой всех съемных элементов фильтрационного аппарата.

На основании результатов исследований выбраны и предлагаются технологические значения параметров режима сте­рилизации установки "Сартокон-2", которые приведены в таблице 3.

Таблица 3

Технологические параметры режима стерилизации  установки "Сартокон-2"

Наименование  параметра

Значение  пара­метра

Раствор формальдегида  (содержание основного  вещества), %

2

Объем дезинфектанта, л

не менее  15, 0

Время циркуляции раствора, мин

не менее  40

Температура  дезинфектанта, °С

20...25

Расход воды для промывки, дм3

не менее  15, 0

Давление  при  циркуляции на линии  входа  в  установку/на линии выхода из  установки, МПа /МПа

0,15–0,2/0–0,05

Периодичность механической и термической обработ­ки  съемных  элементов  установки, цикл

4

Параметры, представленные в таблице 3, подобраны экспериментально в производственных условиях и обеспечивают надежную стерилизацию установки и ее узлов для возможности проведения процесса концентрирования, исключающего контаминацию посторонней микрофлорой.

2.2.2.2. Отработка режима и параметров мембранного концентри­рования глубинных культур Br. melitensis Rev1 в производственных условиях

Исходя из анализа литературных данных, основное внимание было сосредоточено на режимах концентрирования, которые определяют производитель­ность процесса.

При проведении зкспериментальных исследований по обоснованию возможности использования мембранного способа концентрирования глубинных  культур Br. melitensis Rev–1 представлялось целесообразным решить следующие задачи:

- определить площадь фильтрующей поверхности, позволяющей переработать  заданный объем нативной  культуры; 

- определить  зависимость  производительности фильтрации от величины перепада давления.

Концентрированию на установке «Сартокон – 2» подвергались глубинные культуры  Br. melitensis Rev–1, выращенные в фер­ментерах "Биор-0,25". Основные характеристики глубинных  культур представлены в таблице 4. Культивирование проводилось до выхода культуры бруцелл в стационарную фазу роста, определяемую как отсутствие прироста оптической концентрации микробов в пробах, отличающихся по времени культивирования на 1 час.

Таблица 4

Характеристики глубинных культур Br. melitensis Rev – 1, выращенных в ферментерах «Биор-0,25», (n=7)

Определяемые показатели

ОК, млрд. м.к.*см-3

БК, млрд. м.к.*см-3

рН, ед. рН

Наличие ПМФ

глубинные культуры

30±4

27±4

7,0±0,1

не содержат

Контроль (требования НД)

не ниже 25

не ниже 22

6,8–7,2

не допуска­ется

Как видно из данных, представленных в таблице 4, нативные глубинные культуры Br. melitensis Rev–1, выращенные в ферментерах «Биор-0,25», полностью соответствуют по основным биологическим и физико-химическим характеристикам нормируемым уровням.

Для решения поставленных задач в экспериментах по кон­центрированию культур Br. melitensis Rev–1 приме­няли от одного до трех мембранных модулей «Ультрасарт» на основе полисульфона с размером пор 300 кДа и площадью фильтрующей поверхности  0,6 – 1,8 м2.

В результате проведенных экспериментов бы­ли получены концентрированные микробные культуры, основные ха­рактеристики которых представлены в таблице 5.

Таблица 5

Характеристики концентрированных культур Br. melitensis Rev – 1, полученных на установке микрофильтрации "Сартокон-2", (n=7)

Наименование показателя

Значения пока­зателя концентрата

Контроль (требования

НД)

Оптическая концентрация, млрд.м.к.*см-3

160±10

не ниже 150

Биологическая концентрация, млрд.ж.м.к.*см-

150±10

не ниже 140

Степень концентрирования по объему, разы

5 – 6

не нормируется

Степень концентрирования по биологической концентрации, разы

5 – 6

не нормируется

Реакция среды, ед.рН

6,9±0,1

6,8–7,2

Наличие ПМФ, КОЕ

не содержат

не допуска­ется

Как видно из данных, представленных в таблице 5, глубинные культуры концентрируются в 5–6 раз с высоким уровнем содержания  жизнеспособных клеток. Результаты исследований свидетельствуют о том, что концентрированные микробные культуры, полученные мембран­ным способом, по основным показателям соответствуют требова­ниям НД.

Движение потоков микробных куль­тур при концентрировании осуществля­ется следующим образом: глубинная культура по линии выхода из ферментера через предфильтр под давлением 0,04 – 0,06 МПа  поступает в промежуточную нержавеющую емкость, далее через ротационный насос  установки культура по­ступает в кассетный модуль, затем по линии выхода че­рез мембранный вентиль  возвращается обратно в емкость, тем самым об­разует замкнутую систему, в которой и происходит концентриро­вание нативной культуры. Фильтрат по линии выхода поступает в бутыль.

Требуемая площадь рабочей поверхности мембраны выбиралась исходя из заданной производительности процесса концентрирования нативных культур. Задача решалась путем деления объема исходной нативной культуры в ферментере "Биор-0,25" - 115,0 дм3 на принятое нами  время процесса, равное 8 часам.

По условию задачи через мембрану с размером пор 300 кДа требовалось профильтровать 115,0 дм3 нативной культуры, при этом процесс следовало провести не более, чем за 8 ча­сов при давлении 0,2 МПа.

На рисунке 2 показана зависимость времени фильтрации от площади фильтрующей поверхности, построенная по средним зна­чениям двух опытов для каждой точки.

Рисунок 2 - Зависимость времени фильтрации - тф от площа­ди фильтрующей поверхности - Sф.

Как следует из зависимости, представленной на рисунке 2, для концентрирования нативной культуры в объеме 115,0 дм3 в течение 8 часов потребуется площадь фильтрующей поверхности не менее 18*103 см2.

Была проведе­на экспериментальная оценка производительности процесса в за­висимости от величины значения перепада давления. Результаты представлены в таблице 6.

Таблица 6

Показатели производительности мембранного концентрирования нативных культур Br. melitensis Rev – 1, (n=7)

Величина  показателя давления, МПа

Производи­тельность, дм3*ч-1

Рвх

Рвых

Рперепад

0,10

0

0,10

10,5±1,0

0,10

0,05

0,05

12,0±1,0

0,20

0

0,2

12,5±1,5

0,20

0, 05

0,15

14,0±1,5

0,20

0,120

0,08

16, 0±1,0

0,25

0,170

0,08

15,0±2,0

0,30

0,200

0,1

15,0±1,0

Из данных, приведенных в таблице 6, следует, что произ­водительность микрофильтрационного концентрирования нативных культур Br. melitensis Rev–1 достигала наибольшей величины (16,0±1,0) дм3*ч-1 при значении перепада давления 0,08 МПа при давлении на входе в установку 0,20 МПа, на выходе из установки – 0,12 МПа. При этом отмечалось, что увеличение значения показателя давления на входе в фильтрующий элемент до 0,3 МПа приводило к пропорциональному росту величины давления на выходе фильтрующего модуля,  тем самым повышая перепад давления, но не приводило к какому-либо заметному увеличению скорости фильт­рации.

На основании полученных результатов предложены граничные значения параметров процесса концен­трирования нативных культур Br. melitensis Rev – 1 на установке микрофильтрации "Сартокон-2", которые представлены в таблице 7.

Таблица 7

Технологические параметры процесса концентри­рования нативных культур Br. melitensis Rev – 1 на установке микрофильтрации "Сартокон-2"

Наименование параметра

Значение параметра

Производительность фильтра­ции, дм3*ч-1

14,0±2,0

Площадь фильтрующей поверх­ности, см2

не менее 18*103

Количество мембранных моду­лей

«Ультрасарт», шт.

не менее 3

Давление: на входе фильтрующего модуля/ на выходе фильтрующего модуля, МПа

0,1–0,2/0,05–0,12

Кратность концентрирования (по объему), разы

не менее 6

Температура процесса, С

15–21

Таким образом, проведенные экспериментальные исследова­ния подтверждают возможность создания технологии концентриро­вания нативных культур Br. melitensis Rev – 1 на основе мем­бранного способа разделения жидких биологических дисперсных систем.

В качестве сравнения были выполнены исследования по кон­центрированию нативных культур регламентным способом осаждения с использованием 0,2% раствора натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы и микрофильтрацией, на уста­новке "Сартокон-мини".

Результаты сравнительной оценки свойств концентрирован­ных микробных культур, полученные вышеуказанными способами концентрирования, представлены в таблице 8.

Таблица 8

Сравнительная оценка свойств концентрированных микробных культур, полученных осаждением и мембранным способами разделения, (n=5)

Наименование  показа­теля

характеристики  куль­тур, полученных  способом ...

  осаждения

мембранным

Оптическая концентрация, млрд.м.к.*см-3

35±5

125±12

Биологическая концентрация (чашечным методом), млрд.ж.м.к.*см-3

30±2

120±10

Диссоциация культуры, %

отсутствует

отсутствует

Степень концентрирования по БК, разы

2

7

Концентрация водород­ных ионов, ед.рН

6,80±0,15

6,80±0,10

Потери  при концентри­ровании, %

30

отсутствуют

Наличие  ПМФ, КОЕ

не

содержит

не

содержит

Из приведенных в таблице 8 данных следует, что концен­трированные микробные культуры, полученные мембранным способом, не только не уступают по показателям качества концентратам, приготов­ленным способом осаждения, но и превосходят их. При этом отмечается значитель­ное снижение потерь содержания бруцелл на стадии концентрирова­ния. Кроме того, время приготовления микробного концентрата с использованием мембран сократилось в 30 – 40 раз по сравнению с регламентным методом осаждением КМЦ, что является предпочтительным, особенно в условиях реального производства.

Были проведены теоретические расчеты экономической целесообразности использования мембранной технологии концентрирования в сравнении со способом седиментации с использованием КМЦ. На основе полученных расчетов был сделан вывод о снижении затрат на 30 % при изготовлении концентрата, достаточного для приготовления 10 млн. доз вакцины методом микрофильтрации по сравнению с использованием КМЦ.

Для внедрения предложенной технологии концентрирования в производство вакцины против бруцеллеза овец и коз из штамма Br. melitensis Rev – 1 живой сухой с применением мембранного концентрирования необходимо было установить безвредность, полученных концентратов, приготовить из полученных концентрированных микробных культур вакцинные препараты и оценить их соответствие требованиям научной документации.

2.2.3.  Определение безвредности микробных концентратов культур Brucella melitensis Rev 1, полученных мембранным способом

В соответствии с требованиями, предъявляемыми к ВИБП, безвредность является одним из наиболее важных показателей, определяющих возможность использования препарата в качестве иммуно-биологического.

Безвредность глубинных культур и  концентратов определяли на белых мышах.

На безвредность оценивались 7 глубинных нативных культур штамма  Br. melitensis Rev–1, выращенных в ферментерах «Биор-0,25» и 7 микробных концентратов, полученных на установке «Сартокон – 2». Каждую глубинную культуру и  концентрат проверяли на 5-ти белых мышах. Пробы глубинных культур и концентратов разводили стерильным физиологическим раствором до концентрации 1 млрд. живых бруцелл в 1 см3 и вводили подкожно мышам в дозе 250 млн. в объеме 0,25 см3.

Одновременно с этим выполнены исследования, в которых пробы глубинных культур и концентратов разводили стерильным физиологическим раствором до концентрации 2 млрд. живых бруцелл в 1 см3 и вводили подкожно мышам в дозе 500 млн. в объеме 0,25 см3. За мышами наблюдали в течение 10 суток.

В ходе проведения исследований установлено что, при заражении опытных животных рекомендуемыми для проверки безвредности препарата Стандартом организации СТО 00494189-0001-2004  дозами бруцелл глубинные культуры и микробные концентраты  выдерживают испытание на безвредность.

При увеличении инфицирующей дозы в 2 раза на введение нативной культуры у некоторых животных наблюдался отказ от пищи и снижение двигательной активности. Это говорит о том, что испытание выдержали только микробные концентраты, полученные с применением установки «Сартокон-2».

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о целесообразности выбранного способа концентрирования бруцелл и его использования с целью получения концентрированного препарата микробной биомассы.

2.2.4. Оценка качества вакцин, приготовленных на основе концентратов, полученных мембранным способом

На данном этапе экспериментальных исследований были изу­чены биологические и физико-химические свойства вакцин, приготовленных с использованием концентратов, полученных мембранным способом.

Для того, чтобы оценить качество вакцины бруцеллезной живой сухой, приготовленных на основе концентратов, полученных мембранным способом, необходимо было провести высушивание полуфабриката вакцины на оборудовании и по режимам, соответствующим требованиям регламента.

Эксперимент по получению готовой формы препарата проводился на оборудовании ООО «Агровет» и Вятского государственного университета.

Технология высушивания соответствовала регламенту производства. В результате проведенных работ были получены три серии вакцины бруцеллезной живой сухой с показателями качества, представ­ленными в таблице 7, которые полностью отвечают требованиям НД.

Таблица 9

Оценка качества живых сухих вакцин, приготовленных с использованием микробных концентратов, полученных мембранным методом, (n=3)

Наименование показателя

Значение показателя в вакцине

Контроль (требования НД)

Внешний вид

Кристаллическая сухая масса

Аморфная или кристаллическая сухая масса

Цвет

Светло-серый

Cветло-серый с коричневатым оттенком

Наличие плесени,

посторонней примеси, следов оттаивания

Отсутствуют

Не допускается

Ресуспендируемость

Испытание выдерживает

Должна ресуспендироваться в физиологическом растворе или специальном

разбавителе в течение 1 - 2 мин с образованием однородной взвеси светло-серого цвета без неразбивающихся хлопьев и осадка

Массовая доля влаги, %,

в пределах

2,4±0,5

1,2 - 3,0

Бактериальная чистота

ПМФ отсутствует

Не должна содержать ПМФ

Выживаемость бруцелл при выпуске, %

75±10

не ниже 50,0

Выживаемость бруцелл в течение срока годности, %

60±10

не ниже 50,0

Количество диссоциированных колоний, %,

не более

отсутствуют

5,0

Безвредность

безвредна

Должна быть безвредной

Из вышеизложенного можно сделать вывод, что с использованием разработанной технологии концентрирования, возможно получать кондиционные препараты вакцины бруцеллезной живой сухой.

На основе полученных данных были составлены ведомости изменения к регламенту производства на вакцину бруцеллезную живую сухую и «Инструкция по подготовке установки «Сартокон – 2» и проведению процесса концентрирования нативной культуры штамма Brucella melitensis  Rev-1 на установке «Сартокон – 2». 

3. ВЫВОДЫ

1. Выбран и обоснован мембранный способ концентрирования бруцелл.

2. Выбран способ и отработаны режимы стерилизации установки «Сартокон-2».

3. Отработаны режимы концентрирования глубинных культур Br. melitensis  Rev-1 на установке мембранной фильтрации «Сартокон-2».

4. Разработана технология концентрирования глубинных культур вакцинного штамма Br. melitensis  Rev-1, с использованием установки мембранной фильтрации «Сартокон-2».

5. Приготовленные вакцинные препараты на основе микробных концентратов, полученных с использованием разработанной технологии концентрирования, отвечают требованиям НД.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРИЛОЖЕНИЯ

Результаты проведения исследовательских работ реализованы составлением: ведомости изменения № 1 к регламенту производства  РП №938420-017-46392258 «Вакцина бруцеллезная живая сухая для подкожного применения» и «Инструкции по подготовке установки «Сартокон – 2» и проведению процесса концентрирования нативной культуры штамма Brucella melitensis  Rev-1 на установке «Сартокон – 2», утвержденными заместителем генерального директора ООО «Агровет»  по производству 19.03.2011 г.

Полученные научные результаты используются в учебном процессе производственной практики в ФГБОУ ВПО «Вятский государственный университет» при подготовке  специалистов по специальности 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии).

5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Комоско Г.В., Пиков А.В., Коржавина С.П.  Обоснование состава жидкой питательной среды для глубинного культивирования вакцинного штамма Brucella melitensis Rev-1. Ветеринарная медицина. – 2008. - №  1.- С. 8-9.

2. Пиков А.В. Оценка методов концентрирования клеток Brucella melitensis Rev-1для получения полуфабриката противобруцеллезной вакцины. Ветеринарная медицина. – 2009. - №  1-2. – С. 14-16.

3. Пиков А.В. Оценка различных  фильтрующих модулей в технологии мембранного концентрирования нативных культур клеток Brucella melitensis Rev-1 для получения полуфабриката противобруцеллезной вакцины.  Ветеринарная медицина. – 2009. - № 4. – С. 4-6.

4. Комоско Г.В., Пиков А.В., Коржавина С.П. Мембранные методы концентрирования в биотехнологии. // Тезисы докладов Всероссийской научной конференции молодых ученых «Наука. Производство. Экология» - Киров.- 2010.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.