WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

  На правах рукописи

БУРМАКИНА ГАЛИНА СЕРГЕЕВНА

РАЗРАБОТКА СРЕДСТВ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИРУСА ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ КРОЛИКОВ

03.01.06 Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Покров – 2012

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии)

Научный руководитель

кандидат ветеринарных наук,

старший научный сотрудник

(ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии)

 

Луницин Андрей Владимирович

Официальные оппоненты 

доктор биологических наук,

профессор

(ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии)

Середа Алексей Дмитриевич

доктор ветеринарных наук,

профессор

(ФГБУ «ВГНКИ»)

Уласов Валентин Ильич

 

Ведущая организация - Государственное научное учреждение  Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности Российской академии сельскохозяйственных наук, г. Щелково (ГНУ ВНИТИБП Россельхозакадемии).

Защита диссертации состоится  «30» ноября 2012 г. в «1000» часов на заседании диссертационного совета при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии по адресу: 601120, Владимирская обл., г. Покров, ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. Тел/факс: (49243) 62125.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

Автореферат разослан «25» октября 2012 г. и размещен на официальном сайте ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии www.vniivvim.ru и сайте ВАК России www.vak2.ed.gov.ru.

ученый секретарь

диссертационного совета

ГНУ ВНИИВВИМ

Россельхозакадемии, 

кандидат биологических наук 

 

Е.А. Балашова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1

Актуальность темы

Вирусная геморрагическая болезнь кроликов (ВГБК) - остропротекающая высококонтагиозная бо­лезнь, характеризующаяся явлениями геморрагического диатеза во всех органах, в особенности в легких и печени. За­болеваемость при ВГБК может достигать 70-80 %, а летальность - 90-100 % [2].

Возбудителем заболевания является вирус семейства Caliciviridae рода Lagovirus. Геном вируса геморрагической болезни кроликов (ГБК) представлен линейной одноцепочечной инфекционной плюс-РНК [6].

Большой экономический ущерб от ВГБК обусловлен массовой и внезапной гибелью почти всего поголовья невакцинированных животных. В ряде европейских стран и в Австралии вирус ГБК постоянно циркулирует в популяциях диких кроликов, в связи с чем полная ликвидация болезни в настоящее время невозможна.

На территорию нашей страны ВГБК была занесена в 1987 г. Благодаря разработке отечественными исследователями вакцинных препаратов [4] и проведению массовых профилактических мероприятий, к 2000 г. заболевание удалось практически полностью ликвидировать [2]. Однако за последние несколько лет число вспышек болезни в Российской Федерации резко увеличилось. С 2007 по 2012 гг. вспышки ВГБК были отмечены в 30 регионах России.

Поскольку клинические признаки болезни, как правило, отсутствуют, а патологоанатомическая картина зачастую бывает нечеткой, лабораторные методы играют основную роль при постановке диагноза. Необходимость разработки тест-систем на основе метода ПЦР для диагностики ВГБК связана, прежде всего, с ограниченностью применения серологических тестов при различных формах течения болезни. Несмотря на сложную эпизоотическую обстановку и большой экономический ущерб от данного заболевания, в России не разработано средств генодиагностики ВГБК.

Для определения эффективности диагностических тест-систем и вакцинных препаратов, применяемых на территории России, представляется актуальным изучение генетического разнообразия и биологических свойств изолятов вируса ГБК, выделенных в нашей стране. Определение молекулярно-генетических характеристик полевых изолятов вируса ГБК, выделенных при вспышках болезни в Российской Федерации, является необходимым аспектом в изучении молекулярной эпизоотологии и эволюции вируса.

1.2 Степень разработанности проблемы

Для лабораторной диагностики ВГБК зарубежными исследователями предложены системы ОТ-ПЦР с электрофоретической детекцией, «гнездовой» вариант ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ), а также различные серологические тесты [5, 6]. В России разработаны серологические средства лабораторной диагностики ВГБК на основе ИФА, РГА, РДСК [1], однако средств выявления генома возбудителя болезни в нашей стране не было предложено. Отечественными учеными определены биологические свойства изолятов, циркулировавших в нашей стране до 1998 года [2].

В ходе проведенных исследований разработаны «Тест-система для выявления генома вируса геморрагической болезни кроликов методом ОТ-ПЦР» и «Тест-система для выявления генома вируса геморрагической болезни кроликов (ГБК) методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени». Определена возможность использования данных тест-систем для лабораторной диагностики ВГБК. Изучены биологические свойства и молекулярно-генетические характеристики изолятов вируса ГБК, выделенных на территории России с 2003 по 2012 гг.

1.3 Цели и задачи исследований

Цель настоящего исследования - разработка и валидация эффективных средств идентификации вируса геморрагической болезни кроликов на основе ПЦР, а также изучение биологических и молекулярно-генетических свойств изолятов вируса, выделенных на территории Российской Федерации в период с 2003 по 2012 гг.

В соответствии с целью работы поставлены следующие задачи:

1. Разработать тест-систему на основе  ОТ-ПЦР с электрофоретической детекцией для выявления генома вируса геморрагической болезни кроликов.

2. Разработать тест-систему на основе ОТ-ПЦР в режиме реального времени для выявления генома вируса геморрагической болезни кроликов.

3. Определить характеристики разработанных тест-систем и возможность их использования для лабораторной диагностики вирусной геморрагической болезни кроликов.

4. Изучить биологические и молекулярно-генетические свойства изолятов вируса геморрагической болезни кроликов, выделенных на территории России с 2003 по 2012 гг.

5. Изучить молекулярно-генетические характеристики производственных штаммов Воронежский-87, Белгородский-03 и Манихино-09 вируса геморрагической болезни кроликов.

1.4  Научная новизна исследований

Впервые в России разработаны средства лабораторной диагностики ВГБК на основе ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР-РВ, характеризующиеся высокими показателями чувствительности и специфичности. Научная новизна и приоритетность выполненных исследований подтверждена патентом Российской Федерации  на изобретение № 2416648 «Олигонуклеотидные праймеры, способ и тест-система для выявления генома вирусной геморрагической болезни кроликов методом ОТ-ПЦР». Бюл. № 11 от 20.04.2011 г.

Впервые определены нуклеотидные последовательности генов VP60 и VP10 девяти полевых изолятов вируса ГБК, выделенных в различных регионах России в 2003-2012 гг., а также производственных штаммов Воронежский-87, Белгородский-03, Манихино-09.

Изучены биологические свойства девяти изолятов вируса ГБК,  выделенных на территории России с 2003 по 2012 гг., проведен молекулярно-генетический анализ их родства и установлена  генетическая гетерогенность исследованных изолятов.

1.5  Практическая значимость  работы

Разработаны «Тест-система для выявления генома вируса геморрагической болезни кроликов методом ОТ-ПЦР» и «Тест-система для выявления генома вируса геморрагической болезни кроликов (ГБК) методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени» для лабораторной диагностики ВГБК.

Нуклеотидные и соответствующие им аминокислотные последовательности гена VP60 восьми штаммов и изолятов, выделенных на территории России с 2003 по 2012 гг., депонированы в международный банк данных GenBank (JN851735.1, JN851733.1, JN851731.1, JN851729.1, JN851734.1, JN851732.1, JN851730.1, HQ917923.1).

Разработаны:

- «Методические рекомендации по выявлению РНК возбудителя вирусной геморрагической болезни кроликов методом полимеразной цепной реакции», утвержденные академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины РАСХН Смирновым А.М. 24.12.2009 г.

- «Методические рекомендации по выявлению РНК вируса геморрагической болезни кроликов методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени», утвержденные академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины РАСХН Смирновым А.М. 24.11.2010 г.

Получен патент на изобретение № 2416648 «Олигонуклеотидные праймеры, способ и тест-система для выявления генома вирусной геморрагической болезни кроликов методом ОТ-ПЦР». Бюл. № 11 от 20.04.2011 г.

Получено свидетельство о государственной регистрации «Тест-системы для выявления генома вируса геморрагической болезни кроликов методом ОТ-ПЦР» № ПВР-1-5.0/02617 от  30.08.2010 г.

1.6 Соответствие диссертации паспорту научной специальности

В соответствии с формулой специальности 03.01.06 Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) – область науки об использовании живых организмов, культур клеток и биологических процессов в производстве с целью получения полезных продуктов для народного хозяйства, медицины и ветеринарии, целенаправленно улучшающих воздействие на окружающую среду и формирование экологически доброкачественной среды обитания человека и животных. В диссертационной работе проведены исследования по созданию тест-систем на основе ПЦР и ее модификаций, позволяющие проводить лабораторную диагностику ВГБК. Для данных тест-систем разработаны рекомбинантные конструкции, используемые в качестве положительного и внутреннего контрольных образцов. При создании данных конструкций использованы методы молекулярного клонирования ДНК в прокариотический вектор и in vitro транскрипция РНК.

Проведено нуклеотидное секвенирование генов VP60 и VP10 трех штаммов ВГБК, депонированных в музее микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, и девяти изолятов, выделенных на территории России с 2003 по 2012 гг. На основании нуклеотидной последовательности генов VP60 и VP10 исследованы молекулярно-генетические характеристики данных штаммов и изолятов.

Результаты научного исследования соответствуют пунктам паспорта специальности – 1, 9, 11.

1.7 Апробация результатов работы

Результаты диссертационной работы представлены и обсуждены на Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (г. Щелково, 2009 г.), конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины» (г. Покров, 2009 г.), Международной научно-практической конференции «Задачи ветеринарной науки в реализации доктрины продовольственной безопасности Российской Федерации» (г. Покров, 2011 г.), Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы клеточного пушного звероводства и кролиководства России» (пос. Родники, Московская область, 2012 г.), конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии в ветеринарной медицине» (г. Покров, 2012 г.), а также на заседаниях ученого совета ГНУ ВНИВВиМ Россельхозакадемии в период с 2009 по 2012 гг.

1.8 Публикации научных исследований

По теме диссертационной работы опубликовано 10 научных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки  Российской Федерации, и получен один патент на изобретение.

1.9  Основные положения, выносимые на защиту

1. «Тест-система для выявления генома вируса геморрагической болезни кроликов методом ОТ-ПЦР», характеризующаяся высокой чувствительностью и специфичностью.

2. «Тест-система для выявления генома вируса геморрагической болезни кроликов (ГБК) методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени», характеризующаяся высокой чувствительностью и специфичностью.

3. Результаты изучения генетической гетерогенности девяти изолятов вируса ГБК, выделенных с 2003 по 2012 гг. на территории России, и производственных штаммов Воронежский-87, Белгородский-03, Манихино-09.

4. Результаты изучения биологических и молекулярно-генетических свойств девяти изолятов вируса ГБК, выделенных на территории России с 2003 по 2012 гг.

1.10 Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 150 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение и выводы. Список литературы включает 209 источников, из них 25 отечественных, 181 зарубежный и 3 интернет-ресурса. Работа иллюстрирована 20 таблицами и  27 рисунками.

Исследования по теме диссертационной работы выполнены в 2009-2012 гг. на базе лаборатории Биофизики ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, г. Покров.

1.11  Личный вклад соискателя

Основной объем исследований проведен автором самостоятельно. Автору принадлежит ведущая роль в планировании и выполнении основных экспериментов и обобщении полученных результатов. Консультативную и методическую помощь при выполнении отдельных этапов работы оказывали: к.б.н. Малоголовкин А.С., а также сотрудники Научно-экспериментального отдела ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии Малоголовкина Н.В., к.в.н. Живодеров С.П., Глухарева Е.Н. и Бобровская Н.К.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы

2.1.1 Вирусы

В работе  использовали штаммы  Воронежский-87, Манихино-09, Белгородский-03 вируса ГБК из музея микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

2.1.2 Образцы патологического материала

В работе использовали органы от экспериментально зараженных кроликов. Заражение проводили различными штаммами и изолятами вируса ГБК. Кроме того, использовали патологический материал со вспышек ВГБК из различных регионов России с 2003 по 2012 гг. В качестве отрицательных контролей использовали образцы органов и тканей от здоровых невакцинированных и вакцированых против ВГБК животных, а также образцы патологического материала, содержащего гетерологичные микроорганизмы (вирус миксомы кроликов, калицивирус кошек,  Pasteurella multocida, Pseuomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus).

2.1.3 Кровь и сыворотки крови

Использовали кровь и сыворотки крови от кроликов, экспериментально зараженных различными штаммами и изолятами вируса ГБК, кровь кроликов, инфицированных вирусом миксомы, а также вакцинированных против ВГБК.

2.1.4 Животные

При экспериментальном заражении использовали кроликов различных пород старше 2-х месячного возраста массой свыше 2,5 кг, неиммунных к вирусу ГБК.

2.2 Методы

2.2.1 Подбор праймеров и зондов

Подбор праймеров и зондов проводили с помощью сравнения и анализа полных нуклеотидных последовательностей и фрагментов различных генов штаммов и изолятов вируса ГБК, опубликованных в базе данных GenBank электронного ресурса NCBI с помощью программы BioEdit 7.0.1 и Oligo 6.0.

2.2.2 Выделение нуклеиновых кислот

Для выделения нуклеиновых кислот из проб цельной крови, суспензий органов использовали методику нуклеосорбции на силикагеле, гуанидин тиоционат-фенол-хлороформную экстракцию и коммерческий реагент Trizol LS («Invitrogen», США).

2.2.3 Проведение ОТ-ПЦР с детекцией продуктов амплификации методом электрофореза

Для идентификации генома вируса ГБК использовали олигонуклеотидные праймеры, фланкирующие участок гена VP60 длиной 398 п.о.

Смесь для обратной транскрипции: обратный праймер (10 пмоль) - 1,0 мкл, dNTP (10 mМ) – 0,4 мкл, 5х буфер для ОТ («Амплисенс», Россия) - 5 мкл, ревертаза - 50 ед., РНК (исследуемый образец) - 5 мкл, деионизированная вода - до 20 мкл. Смесь для амплификации: смесь праймеров (10 pM каждого) - 2,0 мкл, dNTPs (10 mМ) – 0,4 мкл, 5Х ПЦР буфер Blue («Амплисенс», Россия) - 5 мкл, Taq ДНК-полимераза - 0,75 ед., кДНК (исследуемый образец) - 5 мкл, деионизированная вода - до 25 мкл.

2.2.4 Анализ ПЦР-продуктов

Результаты исследования учитывали путем анализа продуктов амплификации исследуемых образцов методом электрофореза в 2 % агарозном геле с добавлением бромида этидия.

2.2.5 Проведение ОТ-ПЦР в режиме реального времени

Для проведения ОТ-ПЦР-РВ использовали смесь: 5 мкл 5х ОТ буфера («Амплисенс», Россия); 0,3 мкл dNTPs (10 mM); 1 мкл каждого праймера (10 pM), 0,3 мкл зонда (10 pM), 0,75 ед. Таq-полимеразы, 40 ед. ревертазы, 5 мкл исследуемой нуклеиновой кислоты, объем реакционной смеси доводили до 25 мкл деионизированной водой.

2.2.6 Нуклеотидное секвенирование

Выделение специфических продуктов амплификации из агарозного геля осуществляли коммерческим набором для выделения нуклеиновых кислот «AxyPrep DNA Gel Extraction Kit» («Axygen», США).

Определение нуклеотидной последовательности фрагментов кДНК вируса ГБК осуществляли с помощью набора «BigDye v. 3.1. Terminator» («Applied Biosystems», США) на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems Genetic Analyzer 3130 («Applied Biosystems», США) согласно рекомендациям изготовителя.

2.2.7 Компьютерный анализ и сравнение нуклеотидной последовательности фрагментов генома вируса ГБК 

Для выравнивания и анализа последовательностей использовали программы SeqS BioEdit 7.0.1. Построение филогенетических деревьев проводили с помощью алгоритма NJ (в том числе с добавлением метода численного ресэмплинга «бутстреп») в реализации пакета MEGA, версия 3.1.

2.2.8 Молекулярное клонирование продуктов ПЦР

Клонирование очищенных ПЦР-продуктов осуществляли в соответствии с инструкцией фирмы-изготовителя с использованием наборов «PCR Cloning Kit» («Qiagen», Германия) и «pGEM-T Еasy cloning kit» («Promega», США). Выделение плазмидной ДНК из клеток E.coli  осуществляли с использованием наборов «Plasmid Mini kit» («Qiagen», Германия), «Gene JET Plasmid Miniprep Kit» («Fermentas», Латвия).

2.2.9 In vitro транскрипция

Для проведения in vitro транскрипции использовали набор «RiboMax Large Scale RNA Production System - T7» («Promega», США). Подготовку ДНК для in vitro транскрипции, очистку in vitro транскрибированной РНК от ДНК и анализ полученной РНК проводили согласно инструкции производителя.

2.2.10 Постановка ИФА

Проведение ИФА для выявления специфического антигена вируса ГБК выполняли с использованием «Набора препаратов для лабораторной диагностики вирусной геморрагической болезни кроликов сэндвич-вариантом иммуноферментного анализа»  (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, Россия) согласно инструкции производителя.

2.2.11 Проведение РГА

РГА проводили с использованием 0,8 % суспензии эритроцитов человека 0 (1) группы при комнатной температуре и при +4 °С.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Разработка тест-системы на основе ОТ-ПЦР с электрофоретической детекцией для выявления генома вируса геморрагической болезни кроликов

В связи с недостаточным оснащением ряда региональных лабораторий дорогостоящим оборудованием для проведения ПЦР в режиме реального времени, на первоначальном этапе разработана тест-система для выявления генома вируса ГБК методом ПЦР с электрофоретической детекцией.

Для подбора специфических олигонуклеотидов была выбрана высококонсервативная область гена VP60, кодирующего белок капсида. При электрофоретическом анализе продуктов ПЦР, полученных с помощью данных праймеров, было установлено, что подобранные олигонуклеотиды гибридизировались с РНК всех исследованных штаммов и изолятов вируса ГБК с образованием специфического продукта амплификации размером 398  п.о.  На основе подобранных праймеров разработана «Тест-система для выявления генома вируса геморрагической болезни кроликов методом ОТ-ПЦР».

В связи с невозможностью использования вирусной РНК в качестве положительного контроля ПЦР, для разработанной тест-системы была сконструирована рекомбинантная плазмида, несущая последовательность фрагмента гена VP60 вируса ГБК изолята Михайлов-09 длинной 398 п.о.

Аналитическую чувствительность тест-системы определяли относительно инфекционной активности вируссодержащих материалов, выраженной в инфекционных единицах (ИЕ) по результатам амплификации РНК вируса, выделенной из последовательных десятикратных разведений образцов с известным титром инфекционной активности.

При тестировании десятикратных разведений суспензии печени, содержащей вирус ГБК шт. Воронежский-87 и Манихино-09, были определены минимальные титры вируса, выявляемые с использованием разработанной тест-системы. Аналитическая чувствительность тест-системы - 0,5-1,5 lg LD50/см3, что соответствует 3,16-31,6 ИЕ/см3(рис.1).

Рисунок 1. Электрофореграмма результатов определения аналитической чувствительности «Тест-системы для выявления генома вируса геморрагической болезни кроликов методом ОТ-ПЦР».

Треки: М – маркер молекулярного веса 100 п.о.

Для определения диагностической специфичности и чувствительности разработанной тест-системы проводили исследование проб органов, крови кроликов, инфицированных различными штаммами и изолятами вируса ГБК. Кроме того, в работе использовали пробы органов и кровь интактных животных, а также патологический материал, содержащий гетерологичные микроорганизмы, включая вирусы (вирус миксомы кроликов, калицивирус кошек) и бактерии (Pasteurella multocida, Pseudomonas aeruginosa и др.). Результаты ОТ-ПЦР сопоставляли с результатами ИФА и РГА.

Геном был выявлен в печени и легких всех инфицированных вирусом ГБК кроликов. В крови методом ПЦР геном детектировали на различные сроки после заражения в зависимости от дозы заражения и формы течения болезни. Во всех случаях разработанная тест-система позволяла выявлять инфицированных животных до появления у них клинических признаков (1-3 сутки после заражения).

В ходе проведенных экспериментов установлено, что разработанная тест-система обладает более высокой диагностической чувствительностью по сравнению с ИФА и РГА. При исследовании образцов печени от кроликов с подострой формой течения болезни получены положительные результаты ОТ-ПЦР с электрофоретической детекцией, тогда как результаты РГА и ИФА были отрицательными.

В качестве полевых образцов использовали более 90 проб патологического материала из различных регионов России, в том числе материал со вспышек ВГБК.  Результаты ОТ-ПЦР были сопоставлены с результатами ИФА, РГА и биопробы на кроликах.

Возможность выявления негемагглютинирующих изолятов вируса ГБК и изолятов, выделенных от диких кроликов, была подтверждена при исследовании образцов РНК, изолированной из штаммов, выделенных в Германии и любезно представленых доктором H. Schirrmeier из Ветеринарного  института имени Фридриха Лефлера, (о. Римс, Германия).

Во всех экспериментах не выявлено ложноотрицательных и ложноположительных результатов. В ходе работы установлено, что разработанная тест-система обладает более высокой чувствительностью по сравнению с серологическими методами и позволяет выявлять РНК вируса ГБК из образцов с признаками трупного разложения, не пригодных для исследования в РГА и ИФА. Диагностическая специфичность и чувствительность тест-системы были подтверждены в ходе комиссионных испытаний и составили 100 %. Расчет данных характеристик проводили относительно статуса животного (заражен/не заражен).

Предложенная «Тест-система для выявления генома вируса геморрагической болезни кроликов методом ОТ-ПЦР» зарегистрирована в 2010 году в Российской Федерации (регистрационный номер ПВР-1-5.0/02617). Были подготовлены «Методические рекомендации по выявлению РНК возбудителя вирусной геморрагической болезни кроликов методом полимеразной цепной реакции», которые утверждены 24.12.2009 г. академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины РАСХН Смирновым А.М. Получен патент на изобретение № 2416648 «Олигонуклеотидные праймеры, способ и тест-система для выявления генома вирусной геморрагической болезни кроликов методом ОТ-ПЦР». Бюл. № 11 от 20.04.2011 г.

3.2 Разработка  тест-системы для выявления генома вируса геморрагической болезни кроликов методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени

Разработка  тест-системы  для выявления генома вируса ГБК методом ОТ-ПЦР-РВ была обусловлена необходимостью сокращения трудозатрат и повышением чувствительности системы. Для этого были выбраны праймеры и зонд, фланкирующие высококонсервативный участок гена VP60 вируса ГБК длиной 105 п.о. Для детекции РНК вируса ГБК использовали зонд, несущий флуорофор FAM, а результаты учитывали по каналу Green. ОТ-ПЦР-РВ проводили на основании методики, предложенной Gall A. [6].

Объединение этапов синтеза кДНК и ПЦР в одной пробирке позволило сократить время анализа до 3–3,5 ч, а также снизить стоимость исследования за счет уменьшения расходов на реактивы, при этом чувствительность тест-системы оставалась прежней.

Для определения диагностической специфичности и чувствительности «Тест-системы для выявления генома вируса геморрагической болезни кроликов (ГБК) методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени» исследовали описанные выше образцы, включая пробы интактных, естественно и экспериментально зараженных животных, а также образцы, содержащие гетерологичные микроорганизмы.

Предложенная тест-система позволяла выявлять гемагглютинирующие и негемагглютинирующие изоляты вируса, а также изоляты, выделенные от диких кроликов.  Геном вируса ГБК детектировали в пробах печени, легких и других органах и тканях инфицированных вирусом ГБК кроликов на разных стадиях болезни (начиная с 1 суток). Эксперименты по выявлению генома вируса ГБК в пробах мышечной ткани и шкурах инфицированых животных свидетельствовали о возможности исследования продуктов кролиководства данной тест-системой. Ложноположительных и ложноотрицательных результатов в ходе проведенных исследований не было выявлено.

Разработанная тест-система, так же как и тест-система на основе ОТ-ПЦР с электрофоретической детекцией, позволяла выявлять геном вируса ГБК в пробах печени кроликов с подострым течением болезни и продемонстрировала более высокую чувствительность по сравнению с серологическими  тестами. Тест-система имеет диагностическую специфичность и чувствительность на уровне 100 %. Данные характеристики рассчитаны относительно статуса животного и подтверждены в ходе комиссионных испытаний.

Для того чтобы данная тест-система могла быть использована в диагностических ветеринарных лабораториях, разработаны положительный и внутренний контроли, в качестве которых использовали in vitro транскрибированную РНК, что позволяло отследить не только этап амплификации и выделения РНК, но и этап обратной транскрипции.

Для создания универсального положительного контроля ОТ-ПЦР с электрофоретической детекцией и ОТ-ПЦР-РВ была сконструирована рекомбинантная конструкция, несущая последовательность фрагмента гена VP60 штамма Манихино-09, длинной 810 п.о. Далее рекомбинантную плазмиду использовали для in vitro транскрипции РНК. Наличие РНК определяли путем электрофореза и методом ОТ-ПЦР. Было подтверждено, что РНК, полученная в ходе in vitro транскрипции, содержит фрагмент гена VP60 вируса и может быть использована  в качестве положительного контроля ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР-РВ со стадии обратной транскрипции, а также в качестве РНК-стандарта для количественной ОТ-ПЦР-РВ.

Следующим этапом работы было создание внутреннего контроля (ВК), который мог быть использован для любой тест-системы на основе метода ОТ-ПЦР-РВ. В качестве матрицы для in vitro транскрипции использовали рекомбинантную плазмиду, содержащую фрагмент гена, кодирующего зеленый флуоресцентный белок (EGFP).

Праймеры и зонд, используемые для детекции фрагмента данного гена, фланкировали фрагмент гена EGFP длиной 70 п.о. Учитывая, что для детекции РНК вируса ГБК использовали зонд, несущий флуорофор FAM, детекцию ВК проводили по каналу Yellow c использованием гибридизационного зонда, несущего флуорофор HEX. Это позволило независимо регистрировать накопление фрагментов гена EGFP и гена VP60 вируса ГБК в ходе одной реакции. Подбор флуорофоров осуществляли по принципу минимизации перекрывания их спектров поглощения и испускания.

Для определения возможности использования in vitro транскрибированной РНК в качестве ВК в ОТ-ПЦР тест-системах использовали цельную кровь, суспензии печени, легкого, селезенки, сердца и почек от интактных кроликов и кроликов, инфицированных вирусом ГБК. РНК добавляли к каждой пробе на этапе выделения нуклеиновых кислот. Эмпирически была подобрана оптимальная концентрация ВК для качественного проведения реакции, показывающая средние значения Сt в пределах 20-25, что не влияло на детекцию РНК вируса ГБК.

Одним из важнейших показателей, позволяющим определить качество разработанной тест-системы является аналитическая чувствительность, которая была определена относительно инфекционной активности вирусов, а также, согласно рекомендациям МЭБ, относительно копий рекомбинантных нуклеиновых кислот. Для ее определения использовали штаммы Воронежский-87, Белгородский-03 и Манихино-09 вируса ГБК с известными титрами инфекционной активности и очищенную in vitro транскрибированную РНК, содержащую фрагмент генома вируса ГБК.

Рассчитанное значение аналитической чувствительности тест-системы на основе ОТ-ПЦР-РВ составило минус 0,5 lg LD50/см3, что соответствует 0,32 ИЕ/см3 (рис. 2). «Тест-система для выявления генома вируса геморрагической болезни кроликов (ГБК) методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени» позволяла выявлять (13+5) копий РНК вируса ГБК.

Рисунок 2. Результаты выявления РНК вируса геморрагической болезни кроликов в серии последовательных десятикратных разведений образца вируса ГБК шт. Манихино-09.

Учитывая, что разработанная тест-система может быть использована не только для качественного, но и для количественного анализа, для ее более точной характеристики определены дополнительные показатели, такие как эффективность реакции, коэффициент корреляции, повторяемость и воспроизводимость системы (табл. 1).

Таблица 1

Результаты определения дополнительных характеристик тест-системы на основе ОТ-ПЦР-РВ

n=4

Показатель

Значение

Эффективность реакции

99,6 %

Коэффициент корреляции

0,995

Повторяемость

стандартные отклонения - 0,3-0,8 значения Ct

коэффициент вариации - 1,2-2,3 %

Воспроизводимость

Стандартные отклонения - 0,2-1,2 значения Ct

коэффициент вариации - 1-3,4 %

Все рассчитанные показатели свидетельствовали о возможности использования данной тест-системы как для лабораторной диагностики ВГБК, так и для проведения количественного анализа с целью изучения различных стадий болезни.

    1. Изучение биологических и молекулярно-генетических характеристик изолятов вируса геморрагической болезни кроликов, выделенных на территории Российской Федерации с 2003 по 2012 гг.

В связи с отсутствием данных о молекулярно-генетических свойствах изолятов, циркулирующих на территории России, дальнейшим этапом работы было определения нуклеотидной последовательности фрагментов генома изолятов и штаммов вируса ГБК.

C целью выявления различий в геномах исследованных изолятов вируса была выбрана наиболее информативная область длинной 2200 п.о., соответствующая 3’-концевой области  генома, кодирующие структурные белки VP60 и VP10.

Для определения нуклеотидных последовательностей генов VP60 и VP10 штаммов и изолятов вируса ГБК нами были подобраны 5 пар праймеров, с помощью которых были амплифицированы перекрывающиеся фрагменты данных генов.

Анализ нуклеотидных последовательностей гена VP60 показал, что штамм Воронежский-87, относится к «классическому» подтипу вируса ГБК, а все остальные исследованные изоляты и штаммы, выделенные со вспышек ВГБК с 2003 по 2012, относятся к подтипу «RHDVa» (рис. 3). По данным зарубежной литературы, данные подтипы несколько отличаются по своим антигенным и вирулентным свойствам [6].

Общее число нуклеотидных замен у исследованных изолятов варьирует от 3 до 82. Большинство из них являются синонимическими и не приводят к замещению аминокислот. Наибольшая степень гомологии нуклеотидной последовательности (99,8 %) выявлена между изолятом Нижний Новгород-12  и штаммом Белгородский-03. Кроме того, высокая степень гомологии была отмечена между изолятами, выделенными в Московской области в 2009-2011 гг. Эти данные могут свидетельствовать о постоянной циркуляции вируса ГБК в различных регионах России.

Рисунок 3. Дендрограмма, построенная на основании нуклеотидных последовательностей  полноразмерного гена VP60 изолятов вируса ГБК,  выделенных на территории России с 2003 по 2012 гг. и штаммов вируса ГБК из музея микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии  (отмечены исследуемые штаммы и изоляты).

Степень сходства аминокислотного состава изолятов, выделенных в Российской Федерации с 2003 г. по 2012 г., и производственного штамма Воронежский-87 составляет 95,2-95,8 %. В свою очередь, степень идентичности между отечественными штаммами и изолятами внутри подтипа «RHDVa» варьировала от 98,6 до 100 %.

Нуклеотидные последовательности гена VP60 восьми исследованных штаммов, изолятов и соответствующие им аминокислотные последовательности депонированы в международный банк данных GenBank и в настоящее время являются доступными для других исследователей.

В связи с полученными данными о генетической гетерогенности выделенных изолятов, необходимо было изучить их биологические свойства. В ходе работы определены вирулентные и гемагглютинирующие свойства девяти изолятов вируса ГБК, выделенных на территории Российской Федерации с 2003 по 2012 гг. При оценке вирулентности выделенных изолятов на кроликах  установлено, что все они вызывают гибель животных с признаками  острой формы течения болезни и характерными патологоанатомическими изменениями.

В результате определения гемагглютинирующих свойств было отмечено отсутствие негемагглютинирующих изолятов. Однако некоторые изоляты (Пермь-10, Нижний Новгород-12) имели очень низкие титры в РГА, начиная с первого пассажа на кроликах. Кроме того, было установлено наличие температурозависимых в РГА изолятов (изоляты Пермь-09, Тамбов-10). Результаты представлены в табл. 2.

Таблица 2

Биологические характеристики изолятов, выделенных на территории России с 2003 по 2012 гг.

Название изолята

Место выделения

Год выделения

Вирулентность

Гемагглютинирующие свойства

1

Солнечногорский-03

Московская область

2003

вирулентный

гемагглютинирующий

2

Клязьменский-04

Владимирская область

2004

вирулентный

гемагглютинирующий

3

Михайлов-09

Рязанская область

2009

вирулентный

гемагглютинирующий

4

Пермь-10

Пермский край

2010

вирулентный

гемагглютинирующий, температурозависимый в РГА

5

Раменский-11

Московская область

2011

вирулентный

гемагглютинирующий

6

Балашиха-11

Московская область

2011

вирулентный

гемагглютинирующий

7

Тамбов-10

Тамбовская область

2010

вирулентный

гемагглютинирующий, температурозависимый в РГА

8

Нижний Новгород-11

Нижегородская область

2011

вирулентный

гемагглютинирующий

9

Нижний Новгород-12

Нижегородская область

2012

вирулентный

гемагглютинирующий

Все полученные данные свидетельствуют о некоторых различиях биологических свойств данных изолятов.

Таким образом, установлено, что изоляты вируса ГБК, выделенные на территории России с 2003 по 2012 гг., отличаются по своим генетическим и фенотипическим свойствам.

  1. ВЫВОДЫ
  1. Разработана «Тест-система для выявления генома вируса геморрагической болезни кроликов методом ОТ-ПЦР» с аналитической чувствительностью 3,16-31,62 ИЕ/см3.
  2. Разработан внутренний контроль выделения РНК для диагностических тест-систем на основе ОТ-ПЦР в режиме реального времени.
  3. Создана «Тест-система для выявления генома вируса геморрагической болезни кроликов (ГБК) методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени», позволяющая выявлять 0,32 ИЕ/см3 или (13+5) копий РНК вируса геморрагической болезни кроликов.
  4. Показана возможность использования разработанных тест-систем для лабораторной диагностики вирусной геморрагической болезни кроликов.
  5. Изучены биологические и молекулярно-генетические свойства девяти изолятов вируса геморрагической болезни кроликов, выделенных в Российской Федерации с 2003 по 2012 гг. На основе данных нуклеотидного секвенирования полноразмерного гена VP60 установлена высокая степень гомологии (98,6–100 %) аминокислотных последовательностей исследованных изолятов и определены их филогенетические отношения.
  6. Анализ нуклеотидных последовательностей гена VP60 показал, что производственный штамм Воронежский-87 относится к «классическому» подтипу вируса геморрагической болезни кроликов. Штаммы Белгородский-03, Манихино-09 и все исследованные изоляты относятся к подтипу «RHDVa». Степень гомологии аминокислотных последовательностей штамма Воронежский-87 и штаммов и изолятов, выделенных на территории России с 2003 по 2012 гг., составляет 95,2-95,8 %.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Рекомендуется включить в схему лабораторной диагностики ВГБК «Тест-систему для выявления генома вируса геморрагической болезни кроликов методом ОТ-ПЦР» и «Тест-систему для выявления генома вируса геморрагической болезни кроликов (ГБК) методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени».

Предлагается средство дифференциации изолятов вируса ГБК на основе ПЦР и нуклеотидного секвенирования амплифицированных фрагментов кДНК для  паспортизации штаммов данного вируса.

Нуклеотидные последовательности структурных генов исследованных штаммов и изолятов вируса ГБК, депонированные в международную базу данных GenBank, могут быть использованы для изучения молекулярной эпизоотологии и эволюции вируса ГБК, подробной характеристики его генома и проведения филогенетического анализа.

«Методические рекомендации по выявлению РНК возбудителя вирусной геморрагической болезни кроликов методом полимеразной цепной реакции»,  «Методические рекомендации по выявлению РНК вируса геморрагической болезни кроликов методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени», которые утверждены академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины РАСХН Смирновым А.М., предлагаются для практического использования научно-исследовательскими учреждениями.

Полученные нуклеотидные последовательности гена VP60 использованы для характеристики штаммов вируса ГБК, депонированных в музее микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

На основании данных нуклеотидного секвенирования гена VP60  и результатов ранее проведенных исследований Николаева А.В. по изучению биологических свойств производственных штаммов вируса ГБК [3] рекомендуется использовать штаммы Манихино-09 и Белгородский-03 из музея микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии для производства вакцинных препаратов против ВГБК.

6. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

  1. Вирусная геморрагическая болезнь кроликов / И.А. Бакулов, И.Ф. Вишняков, Т.А. Власова, А.А. Шевченко. М.: Центр научно-технической информации, пропаганды и рекламы, 1994. – 38 с.
  2. Власов, Н.А. Физико-химические свойства и антигенная структура вируса геморрагической болезни кроликов: дис. …д-ра. биол. наук: 03.00.06/ Власов Николай Анатольевич. – Покров, 1998. – 351 с.
  3. Устойчивость вакцинированных кроликов к перекрестному заражению полевым изолятом вируса/ А.В. Николаев, Н.В. Малоголовкина, Н.К. Бобровская, Е.Н. Глухарева, В.И. Уласов, А.В. Луницин // Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Микробиология. Биотехнология. Экология: материалы Всероссийской научно-практической конференции. – Екатеринбург, 2009. – С. 68-70.
  4. Шевченко, А.А. Эффективность термоинактивированной вакцины против вирусной геморрагической болезни кроликов/ А.А. Шевченко // Вестник Российской аакадемии сельскохозяй­ственных наук. - 1994. - № 4. – С. 53-55.
  5. Detection of rabbit haemorrhagic disease virus isolates and sequence comparison of the N-terminus of the capsid protein gene by the polymerase chain reaction/ C. Guittre, I. Baginski, G. Le Gall, M. Prave, C. Trepo, L. Cova // Res. Vet. Sci. – 1995. - № 58. – P. 128-132.
  6. Persistence of viral RNA in rabbits which overcome an experimental RHDV infection detected by a highly sensitive multiplex real-time RT-PCR/ A. Gall, B. Hoffmann, J.P. Teifke, B. Lange, H. Schirrmeier //  Vet. Microbiol. – 2007. - № 120. – P. 17-32.

7. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ

ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Бурмакина, Г.С. Разработка ПЦР для идентификации вируса вирусной геморрагической болезни кроликов / Г.С. Бурмакина, О.Н. Жигалева, А.С. Малоголовкин  // Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины: материалы конференции молодых ученых ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. – Покров, 2009. – С. 91-94.
  2. Бурмакина, Г.С. Идентификация вируса вирусной геморрагической болезни кроликов методом ПЦР в режиме реального времени / Г.С. Бурмакина, О.Н. Жигалева, А.В. Николаев // Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины: материалы конференции молодых ученых/ ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. – Покров, 2009. – С. 95-98.
  3. Бурмакина, Г.С. Выявление РНК вируса ВГБК в пробах органов инфицированных кроликов методами ПЦР и ПЦР в режиме реального времени / Г.С. Бурмакина, О.Н. Жигалева, А.В. Николаев // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: материалы Международной  научно-практической конференции. – Щелково, 2009. - С. 306-310.
  4. Генодиагностика вирусной геморрагической болезни кроликов / Г.С. Бурмакина, О.Н. Жигалева, С.Ж. Цыбанов, А.В. Луницин, Д.В. Колбасов // Молекулярная Диагностика - 2010: материалы VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. – М., 2010. – С. 197-199.
  5. Phylogenetic analysis of RHDV isolates found in the Russian Federation / G. Burmakina, A. Malogolovkin, A. Lunitsin, S. Tsybanov, D. Kolbasov // 4th Annual meeting Epizone «Bridges to the Future». - Saint Malo, 2010. – P. 165.
  6. Новые штаммы вируса геморрагической болезни кроликов в России / Г.С. Бурмакина, А.В. Николаев, С.П. Живодёров, Н.В. Малоголовкина, Н.К. Бобровская, Е.Н. Глухарёва, А.В. Луницин, Л.И. Шевцова //  Ветеринария. - 2011. - № 2. - С. 25-28.
  7. Characterization of  the RHDV causing outbreaks in 2003-2010 in Russia / G. Burmakina, A. Malogolovkin, A. Lunitsin, S. Tsybanov, D. Kolbasov // 5th Annual meeting Epizone. - Arnhem, 2011. – P. 176.
  8. Идентификация генома вируса геморрагической болезни кроликов методом ПЦР/ Г.С. Бурмакина, А.С. Малоголовкин, А.В. Николаев, С.Ж. Цыбанов, А.В. Луницин // Российский ветеринарный журнал. Сельскохозяйственные животные. - 2012. - №1. - С. 36-38.
  9. Разработка и валидация тест-систем для диагностики вирусной геморрагической болезни кроликов (ВГБК)/ Г.С. Бурмакина, Н.В. Малоголовкина, Н.К. Бобровская, Е.Н. Глухарева, С.П. Живодеров, С.Ж. Цыбанов, А.В. Луницин // Актуальные проблемы клеточного пушного звероводства и кролиководства России: материалы Международной научно-практической конференции. – пос. Родники, 2012. – C. 212-216.
  10. Пат. № 2416648. Олигонуклеотидные праймеры, способ и тест-система для выявления генома вирусной геморрагической болезни кроликов методом ОТ-ПЦР / Г.С. Бурмакина, О.Н. Жигалева, А.С. Малоголовкин, С.Ж. Цыбанов, Д.В. Колбасов, А.В. Луницин, А.Г. Гузалова. - Бюл. № 11 от 20.04.2011 г.

8. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВГБК - вирусная геморрагическая болезнь кроликов;

ВК – внутренний контроль;        

ГБК - геморрагическая болезнь кроликов;

ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии – Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук;

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;

ИЕ - инфекционная единица;

ИФА - иммуноферментный анализ;

ОТ-ПЦР – полимеразная цепная реакция со стадией обратной транскрипции;

ОТ-ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в режиме реального времени со стадией обратной транскрипции;

п.о. – пар оснований;

ПЦР – полимеразная цепная реакция;

РГА - реакции гемагглютинации;

РДСК – реакция длительного связывания комплимента;

РНК - рибонуклеиновая кислота;

Шт. – штамм;

dNTPs - дезоксинуклеотид трифосфаты.

Отпечатано в типографии ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии,

г. Покров Владимирской области

Тираж 80 экз.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.