WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

На правах рукописи

Большунова Елена Анатольевна

РАЗРАБОТКА ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ФОРМЫ ФИТОЭКСТРАКТА И ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРИ ФОРМИРОВАНИИ АДАПТАЦИОННОГО ПОТЕНЦИАЛА ОРГАНИЗМА

Специальность 03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Улан-Удэ – 2012

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления» (ВСГУТУ) Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Жамсаранова Сэсэгма Дашиевна

Официальные оппоненты: Николаева Галина Григорьевна, доктор фармацевтических наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории химико-фармацевтических исследований Института общей и экспериментальной биологии СО РАН Бодиев Ринчин-Доржи Дашинимаевич, кандидат биологических наук, доцент кафедры «Терапия и клиническая диагностика» Бурятской государственной сельскохозяйственной академии им. В.Р.

Филиппова Ведущая организация ФГБОУ ВПО «Бурятский государственный университет» (г. Улан-Удэ)

Защита состоится «17» мая 2012 года в 16 часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.039.02 при ФГБОУ ВПО «ВосточноСибирский государственный университет технологий и управления» по адресу: 670013, г. Улан-Удэ, ул. Ключевская, 40в, ауд. 8-124.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВСГУТУ.

Автореферат разослан « 16 » апреля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Хамнаева Нина Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Настоящий период развития российской медицины и фармации характеризуется отчетливой тенденцией к более интенсивному использованию лекарственных средств растительного происхождения. Изыскание новых растительных источников биологически активных веществ и создание на их основе эффективных лекарственных препаратов является актуальной проблемой (Маслов, Гузарова, 2007).

Представители семейства Камнеломковые, такие как бадан толстолистный, широко известны как ценные лекарственные растения.

Особенное значение придают черным листьям бадана. В состав черных листьев бадана входят вещества, обладающие адаптогенными, антистрессорными и иммуномодулирующими свойствами (Лубсандоржиева, 2002).

Известно, что наноструктуры являются высоко эффективными переносчиками лекарственных веществ (Назаров, Галан, Назарова, 2009). Разработка липосомальных структур, содержащих природные полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК), которые усиливают функциональный потенциал транспортных средств, является весьма перспективным направлением. Создание липосомальных форм биологически активных соединений необходимо как для повышения биологической активности, так и для адресной доставки средств.

Целью настоящей работы явилась разработка способа получения липосомальной формы экстракта из черных листьев бадана толстолистного, содержащего полиненасыщенные жирные кислоты, и оценка его эффективности на модели холодового стресса.

Для достижения указанной цели были сформулированы следующие задачи:

разработать технологическую схему получения экстракта из черных листьев бадана толстолистного в липосомальной форме, содержащей ПНЖК;

оценить качественные характеристики и мембраностабилизирующую активность при хранении включенного в липосомы экстракта из черных листьев бадана толстолистного;

исследовать влияние липосомальной формы исследуемого фитоэкстракта на показатели иммунного статуса животных при холодовом воздействии;

оценить активность ферментов монооксигеназной системы печени крыс, подвергавшихся холодовому стрессу, при введении им экс тракта из черных листьев бадана толстолистного, включенного в липосомальные структуры;

изучить нейропротекторную активность липосомальной формы фитоэкстракта у экспериментальных животных на фоне холодового стресса;

оценить эффективность действия включенного в липосомы экстракта из черных листьев бадана толстолистного на физическую работоспособность лабораторных животных в условиях холодового стресса;

исследовать молекулярно-клеточный механизм адаптогенного действия исследуемого средства.

Научная новизна. Разработана технологическая схема получения липосомальной формы экстракта из черных листьев бадана толстолистного. Впервые установлено, что включенный в липосомы экстракт из черных листьев бадана толстолистного обладает выраженным иммуномодулирующим действием, индуцирует активность микросомальных ферментов, ответственных за детоксикацию ксенобиотиков, обладает выраженной нейропротекторной активностью и повышает физическую выносливость при воздействии холодового стресса. При введении исследуемого средства животным на фоне холодового воздействия снижается интенсивность свободнорадикального окисления липидов, восстанавливается функциональная активность эндогенной антиоксидантной системы организма и индуцируются восстановительные процессы в биологических мембранах, которые способствуют повышению защитнокомпенсаторных реакций организма. Показано, что при включении экстракта из черных листьев бадана толстолистного в липосомальные структуры, содержащие ПНЖК, усиливается его биологическая эффективность.

Практическая ценность работы. На липосомальную форму экстракта из черных листьев бадана толстолистного разработаны ТУ 9214083-0206947311. Разработанная форма фитоэкстракта может быть использована как БАД к пище в качестве профилактического средства, снижающего выраженность стресс-синдрома и повышающего устойчивость организма к воздействию холода.

Теоретические и прикладные результаты работы используются в учебном процессе при проведении занятий по биологической и пищевой химии при подготовке студентов специальности «Биотехнология», бакалавров и магистров направления «Технология продуктов питания».

Основные положения, выносимые на защиту:

способ получения липосомальной формы экстракта из черных листьев бадана толстолистного;

экстракт сухой из черных листьев бадана толстолистного, включенный в липосомальные структуры, оказывает иммуномодулирующее, нейропротекторное, адаптогенное действие на фоне холодового стресса;

в основе молекулярно-клеточного механизма действия липосомальной формы экстракта из черных листьев бадана толстолистного лежит ингибирование свободнорадикального окисления липидов, восстановление функций эндогенной антиоксидантной системы и стабилизация биологических мембран;

включение фитоэкстракта в липосомальные структуры, содержащие ПНЖК, способствует усилению его биологической эффективности.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены: на ежегодных научных конференциях преподавателей, научных работников и аспирантов Восточно-Сибирского государственного технологического университета на секции «Химия биологически активных веществ» (Улан-Удэ, 2008, 2009, 2010); на международной научно-практической конференции «Пищевая промышленность: состояние, проблемы, перспективы» (Оренбург, 2009); на III Международной научно-технической конференции молодых ученых: «Актуальные проблемы технологии живых систем» (Владивосток, 2009); на международной школе-семинаре «Current Problems of Food Engineering and Biotechnology» (Ulan-Ude, 2010).

Публикации. По результатам проведенных исследований опубликовано 8 работ, в том числе 2 статьи в журналах из перечня, рекомендуемого ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 114 страницах, состоит из введения, главы обзора литературы, главы, посвященной материалам и методам исследований, главы собственных исследований, выводов, списка литературы, приложения, содержит рисунков и 18 таблиц. Список использованной литературы (173 наименования), включает наименования публикаций российских и иностранных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В работе были использованы липосомы (ЛС) на основе фосфолипидов печени нерпы, содержащие в своем составе триацилглицерины жира байкальской нерпы в концентрации 200 мкг/мл (в пересчете на жир нерпы) и липосомы, нагруженные сухим экстрактом из черных листьев бадана толстолистного (ЛС+ЭБТ); водный раствор сухого экстракта из черных листьев бадана толстолистного (ЭБТ).

ЭБТ был получен в Проблемной научно-исследовательской лаборатории по методике П.-Н. Б. Лубсандоржиевой (2002) из черных листьев бадана толстолистного, собранных в Прибайкальском районе Республики Бурятия в весенний период 2009-2010 гг.

Мембраностабилизирующую активность средств определяли in vitro по выраженности перекисного гемолиза эритроцитов, вызываемого реактивом Фентона (Ковалев с соавт., 1986). Содержание малонового диальдегида (МДА) в образцах с ЛС и ЛС+ЭБТ определяли по методике с тиобарбитуровой кислотой (Сорокоумова, Селищева, Каплун, 2000).

Экспериментальные исследования проводились на белых беспородных крысах обоего пола массой 150-200 г в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приказ МЗ СССР № 755 от 12.08.77г.).

Показатели иммунного статуса экспериментальных животных оценивали по количеству клеток крови и популяций лимфоцитов при постановке непрямой реакции поверхностной иммунофлюоресценции (Иммунологические методы, 1987). Определение относительной массы и клеточности органов иммунной системы проводили по общепринятым методикам (Методические рекомендации, 1992).

Состояние монооксигеназной системы оценивали по продолжительности мединалового сна при однократном внутрибрюшинном введении крысам мединала в дозе 60 мг/кг (Мамыкова, 2009).

Исследование адаптогенной активности исследуемых средств включало определение физической выносливости лабораторных животных в тесте «Плавание до полного утомления» (Dawson, Horvath, 1970), нейропротекторной активности в тестах «Открытое поле» (Калуев, 1998) и «Т-образный лабиринт» (Буреш, Бурешова, Хьюстон, 1991).

Изучение холодовых адаптационных реакций животных проводили на модели длительного холодового воздействия (Коршунова, 2001;

Бабий, 2009). Фосфолипиды экстрагировали из печени нерпы по методу, предложенному М. Кейтс (1975). Липосомы готовили из смеси фосфолипидов с добавлением жира нерпы по методу, предложенному A.D.

Bangham (1965).

О состоянии антиоксидантной системы организма судили по активности супероксиддисмутазы (Чевари, 1985), каталазы (Королюк, 1988) и содержанию восстановленного и окисленного глутатиона (Anderson, 1977). Определяли активность глутатионпероксидазы (Stults et al., 1977) и глутатионредуктазы (Racker, 1955), а также концентрацию МДА в гомогенате печени (Стальная, Гаришвили, 1977) в модификации Строева Е.А. и Макаровой В.Г. (1986) и сыворотке крови (Клебанов, Бабенкова, Теселкин, 1988).

Полученные результаты исследований обработаны статистически с использованием непараметрических (U-критерия Уилкоксона-МаннаУитни) (Гублер, Генкин, 1973), параметрических (критерия Стьюдента) критериев и пакета программ Microsoft Exel 2003. Различия считали достоверными при вероятности 95% (p0,05).

В соответствии с задачами диссертационной работы были проведены исследования по схеме, представленной на рис. 1.

Рис.1 - Схема исследований РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Получение липосомальных структур с включением экстракта из черных листьев бадана толстолистного. Фосфолипиды экстрагировали по классическому методу, предложенному М. Кейтс (1975). С помощью пипетки вносили смесь фосфолипидов в толстостенную круглодонную колбу, растворяли в хлороформе, одновременно добавляя жир нерпы и антиоксидант - -токоферол. Соотношение фосфолипидов, жира нерпы и -токоферола составляло 4:6:0,1. После полного растворения липидов проводили выпаривание на роторном испарителе в течение 10 мин так, чтобы дать возможность фосфолипидам распределиться по стенке колбы в виде тонкой пленки. В колбу с пленкой добавляли ЭБТ, растворенный в буферном растворе, содержащем 0,25М сахарозу, 0,01М трис-буфер, 0,001М ЭДТА с pH 7,4.

Ранее установлено, что ЭБТ в опытах in vivo оказывал максимальный иммуномодулирующий эффект в дозе 300 мг/кг (2000). Исходя из этого, соотношение липидов жира нерпы и ЭБТ рассчитывали таким образом, чтобы конечная концентрация ЭБТ в липосомальной суспензии составляла 0,3 мг/мл, которая достигалась при соотношении 1:200.

Концентрацию ЭБТ в липосомах и степень его включения рассчитывали по изменениям оптической плотности при 310 нм после разрушения липосом 5% раствором дезоксихолата натрия. Невключившееся вещество предварительно отделялось гель-хроматографией.

Встряхивание на механической качалке проводилось при температуре 20±2С. В ходе экспериментов нами установлено, что максимальное включение ЭБТ в липосомы происходило при продолжительности встряхивания 30 мин и составляло 56,3% (табл. 1).

Таблица 1 - Зависимость степени включения ЭБТ в липосомы от продолжительности встряхивания Время, мин 20 25 30 35 Степень включения 22,0±2,8 45,0±3,5 56,3±4,0* 47,2±2,5 51,1±4,ЭБТ в липосомы, % Примечание (к табл. 1 и 2): * - достоверное отклонение значения от значения других показателей.

При диспергировании путем «замораживания-оттаивания» липосомальной суспензии получаются наиболее крупные липосомы (1501500 нм (Таран, 2004)), при этом в процессе многократно повторяющихся циклов замораживания фосфолипидных дисперсий с последующим оттаиванием происходит формирование липосом с высоким процентом включения инкапсулируемых веществ. Как видно из таблицы 2, максимальная эффективность инкапсулирования при 3 кратном диспергировании составила 76%.

Таблица 2 - Зависимость степени включения ЭБТ в липосомы от количества циклов диспергирования Количество циклов 1 2 3 диспергирования Степень включения 56,08±2,6 68,04±3,8 76,05±4,3* 66,02±3,ЭБТ в липосомы, % На основе экспериментальных данных нами была разработана технологическая схема получения липосомальной формы экстракта из черных листьев бадана толстолистного, в 1 мл которой содержалось мг жира нерпы и 120 мг ЭБТ (рис. 2).

Рис. 2 - Схема получения липосомальной формы экстракта из черных листьев бадана толстолистного Мембраностабилизирующая активность полученного средства была исследована в эксперименте на модели гемолиза эритроцитов, вызванного реактивом Фентона. В результате проведенных исследований было установлено, что липосомальная форма ЭБТ обладает выраженным мембраностабилизирующим действием, которое сохранялось на высоком уровне до 5 месяцев хранения (табл. 3).

Таблица 3 - Влияние липосомальной формы экстракта из черных листьев бадана толстолистного на показатели перекисного гемолиза эритроцитов in vitro Перекисный гемолиз, D Сроки хра0 1 2 3 4 5 нения, мес.

Контроль 0,391±0,00,137 0,154 0,224 0,243 0,334 0,378 0,4ЛС+ЭБТ ±0,012* ±0,011* ±0,015* ±0,014* ±0,021* ±0,018* ±0,0Примечание: * - достоверное отклонение значения от контроля.

Об этом свидетельствовало уменьшение степени перекисного гемолиза эритроцитов на 60,62; 42,72; 37,86; 14,58 и 3,33% при сроках хранения 1, 2, 3, 4, 5 месяцев, соответственно, по сравнению с контро лем. Учитывая, что свободные радикалы, образующиеся в реакции Фентона приводят к гемолизу эритроцитов, можно полагать, что в основе механизма мембраностабилизирующего действия ЛС+ЭБТ лежит ингибирование процессов свободнорадикального окисления биологических мембран.

Одним из показателей интенсивности ПОЛ является оценка уровня МДА как одного из продуктов ПОЛ. Так, нами было исследовано содержание МДА в ЛС и ЛС+ЭБТ, которое показало, что содержание МДА в ЛС было выше на 57,5%, чем в ЛС+ЭБТ (табл. 4).

Таблица 4 - Сравнительная оценка степени окисления липидов в липосомальных структурах при различных сроках хранения Содержание Содержание МДА, нмоль/мл Сроки храМДА, нмоль/мл (липосомальная форма экстракта из чернения, мес.

(липосомы) ных листьев бадана толстолистного) 0 0,098±0,015 0,057±0,005** 1 0,124±0,081 0,061±0,02 0,185±0,038 0,074±0,03 0,193±0,035 0,093±0,017* 4 0,480±0,040* 0,276±0,025* 5 0,599±0,042* 0,335±0,033* 6 0,636±0,049* 0,469±0,035* Примечание: * - достоверное отклонение значения в исследуемый срок хранения от значения показателя свежеприготовленных липосом; ** - достоверное отклонение значения относительно ЛС.

При сроке хранения 5 месяцев содержание МДА в ЛС+ЭБТ было на 55,9% меньше, чем соответствующий показатель в ЛС. По-видимому, это связано с тем, что экстракт из черных листьев бадана толстолистного содержит соединения, препятствующие окислительным процессам в липидах липосомальных структур.

Нами были исследованы санитарно-микробиологические показатели безопасности исследуемого средства. Результаты показали, что количество КМАФАнМ, БГКП, Sallmonella, B. cereus, дрожжи, плесень соответствовало требованиям действующих СанПиН 2.3.2.1078-01 (индекс 1.10.2).

Исследование влияния липосомальной формы экстракта из черных листьев бадана толстолистного на показатели иммунного статуса животных при холодовом воздействии. Нами исследовались иммунограмма, масса и клеточность органов иммунной системы экспериментальных животных. Как следует из табл. 5, в опытных группах ЛС и ЛС+ЭБТ наблюдалось достоверное повышение относительного количества лимфоцитов по сравнению с интактными животными соответственно на 23% и 12,3%. Абсолютное значение CD3-клеток во всех опыт ных группах было на уровне интактных животных. Введение исследуемых средств приводило к восстановлению этого показателя до уровня интактных животных.

Таблица 5 - Показатели иммунного статуса животных при введении липосомальной формы экстракта бадана толстолистного на фоне холодового стресса (n=10) Интакт- Контроль Показатели ные жи- (холодовой ЭБТ ЛС ЛС+ЭБТ вотные стресс) Лейкоциты, абс.ч. 9,7±0,5 7,7±1,2* 6,4±2,3* 7,5±1,1* 6,6±2,1* Лимфоциты, % 78,6±3,7 85,7±5,6 84,5±5,6 96,7±3,4* 88,3±4,7* Лимфоциты, абс.ч. 3,6±0,6 4,0±0,2 3,8±1,2 4,0±0,3 4,4±0,CD3, % 70,2±4,3 65,7±1,2* 75,0±2,3** 77,6±1,2*/** 76,0±1,6** CD3, абс.ч. 3,2±0,2 3,1±0,3 3,0±0,3 3,6±0,4 3,1±0,CD4, % 49,8±2,6 38,3±4,2* 44,5±2,9 46,8±3,7 46,6±1,9** CD4, абс.ч. 2,3±0,2 1,2±0,3* 2,1±0,3** 2,2±0,4** 2,2±0,4** CD8, % 19,5±2,5 31,7±2,2* 25,0±2,1*,** 28,6±1,8* 23,0±2,4** CD8, абс.ч. 0,9±0,1 1,7±0,4* 1,0±0,2** 1,4±0,3* 1,0±0,2** CD16, % 6,5±1,2 12,3±2,3* 10,9±1,6* 16,3±2,9* 11,0±1,9* CD16, абс.ч. 0,3±0,1 0,7±0,4 0,8±0,2* 0,9±0,3* 0,4±0,ИРИ (CD4:CD8) 2,6±0,3 1,0±0,2* 1,5±0,6* 1,8±0,4** 1,8±0,4** * Примечание (к табл. 5-7): – достоверное отклонение значения в экспериментальной группе по отношению к интактным животным (p0,05); ** – достоверное отклонение значения в экспериментальной группе по отношению к контрольной группе животных (p0,05); 1 – контрольная группа – животные, находившиеся в условиях холодового воздействия без применения средств (здесь и далее).

Данные иммунограммы показали, что у животных при холодовом воздействии достоверно снижалось абсолютное количество Тхелперной популяции лимфоцитов (CD4), тогда как в группах крыс, получавших исследуемые средства, этот показатель достигал значения интактных животных. В ходе эксперимента выявлено, что в крови контрольных животных возрастала Т-супрессорная активность, что выражалось в достоверном повышении значений как абсолютного, так и относительного количества CD8-клеток. Введение животным ЭБТ и ЛС+ЭБТ приводило к понижению этого показателя.

Иммунорегуляторный индекс (CD4/CD8) у крыс при холодовом стрессе был достоверно ниже таковых в интактной группе. В результате введения ЛС и ЛС+ЭБТ значения иммунорегуляторного индекса возрастали до значений достоверно более высоких, чем в контроле, что, повидимому, связано с корпускулярной формой исследуемых средств.

Активность монооксигеназной системы ферментов печени крыс в условиях холодового воздействия. Одним из факторов, поддер живающих постоянство внутренней среды организма, является монооксигеназная система ферментов печени.

При холодовом стрессе было отмечено увеличение продолжительности мединалового сна в 2,6 раза по сравнению с группой интактных животных (рис. 3). Введение ЛС приводило к уменьшению продолжительности мединалового сна в 1,4 раза по сравнению с контролем.

А введение животным ЛС+ЭБТ приводило к уменьшению данного показателя в 2 раза по сравнению с контролем.

2211Интактные животные Контроль ЭБТ ЛС ЛС+ЭБТ Рис. 3 - Показатели продолжительности мединалового сна крыс в условиях холодового стресса и введения изучаемых средств Проведенные исследования позволяют нам сделать вывод о том, что эффект корригирующего действия ЛС+ЭБТ более выражен, чем при введении ЭБТ и ЛС.

Исследование нейротропной активности липосомальной формы экстракта из черных листьев бадана толстолистного на модели холодового стресса. Как видно из табл. 6, в тесте «открытое поле» установлено, что на фоне холодового стресса акты груминга наблюдались у 60% животных. Для животных этой группы были характерны повышенная возбудимость, суетливость и на 5-й минуте эксперимента движения становились вялыми, наступала быстрая утомляемость.

Таблица 6 - Нейротропная активность липосомальной формы фитоэкстракта при введении животным на фоне холодового стресса Посещение Посещение Группы Груминг, Эмоции, периферической центральной животных у.е. у.е.

части поля, у.е. части поля, у.е.

Интактные 95,20±0,8 3,56±0,2 27,49±0,3 1,96±0,Контроль (хо85,70±3,1* 2,34±0,2* 24,45±0,1* 1,85±0,лодовой стресс) ЛС 86,45±8,7 2,96±0,3*/** 24,78±0,2* 2,00±0,ЭБТ 87,34±3,4* 2,98±0,5 25,00±0,1*/** 1,90±0,ЛС + ЭБТ 89,73±4,2 3,00±0,1*/** 25,24±0,7* 2,12±0, сна, мин ь мединалового Продолжительност Как показали результаты, под влиянием исследуемых средств наступала нормализация реакций нервной системы, животные становились более спокойными и уравновешенными, улучшались мотивационные характеристики поведения, повышался уровень ориентировочноисследовательского поведения, снижался уровень тревоги, страха, неуверенности (табл. 6). Причем показатели в группе животных, получавших ЭБТ в составе липосом, были более высокими, чем в двух других подопытных группах.

Функции памяти оценивали в Т-образном лабиринте. Как следует из рис. 4, в условиях холодового воздействия животные были наиболее медлительными.

Интактные Контроль ЭБТ ЛС ЛС+ЭБТ животные Рис. 4 - Влияние липосомальных средств на показатели крыс, находившихся под воздействием холода, в тесте Т-образный лабиринт Животные, которым вводили ЛС+ЭБТ, быстрее находили поилку, были менее тревожными, чем животные, получавшие ЛС. И при введении ЛС+ЭБТ было отмечено достоверное уменьшение времени добегания до поилки в 2,3 раза по сравнению с контролем и в 1,5 раза по сравнению с ЛС.

Липосомальная форма ЭБТ оказывала выраженное стресспротекторное действие, что проявлялось в поддержании нормальной двигательной активности и мнестической функции крыс.

Влияние липосомальной формы экстракта черных листьев бадана толстолистного на общую физическую выносливость лабораторных животных при длительном холодовом стрессе. Холодовое воздействие достоверно снижало устойчивость к плаванию крыс во все сроки эксперимента. Так, на 7-й день эксперимента продолжительность плавания интактных крыс составила 47,70±5,89 мин, тогда как у крыс, подвергнутых холодовому воздействию, - 37,81±2,95 мин. Аналогичные данные наблюдались на 14-е и 21-е сутки эксперимента. Введение животным исследуемых средств (как липосом, ЭБТ, так и ЛС+ЭБТ) приводило к повышению устойчивости к физическому утомлению, выражающемуся увеличением исследуемого показателя. Увеличение работоспособности животных, адаптирующихся к холоду, при введении им ЛС было отмечено, начиная с 14-ти суток эксперимента, а при введении лабиринту, сек Время прохождения животных по Т-образному ЭБТ – только на 21-е сутки. Тогда как при введении ЛС+ЭБТ исследуемый показатель достоверно увеличился по сравнению с контрольной группой на 32% уже на 7-е сутки опыта и составил 49,88±6,49 мин.

Таким образом, результаты проведенного эксперимента показали, что липосомальная форма ЭБТ в наибольшей степени повышала физическую работоспособность экспериментальных животных на модели холодового стресса.

Исследование антиоксидантной активности липосомальной формы экстракта из черных листьев бадана толстолистного на модели холодового стресса. Как следует из табл. 7, холодовой стресс вызывал у крыс значительное снижение показателей активности ферментов антиоксидантной защиты, что выражалось в уменьшении активности каталазы на 24%, супероксиддисмутазы - на 72% в контрольной группе животных по сравнению с аналогичными данными интактных животных.

В группах животных, получавших растительный экстракт и липосомы, было отмечено незначительное повышение активности каталазы на 6% (ЭБТ) и 13% (ЛС) по сравнению с показателем в группе животных, подвергавшимся холодовому стрессу. Тогда как активность каталазы у крыс, которым вводили липосомальную форму фитоэкстракта, достоверно повышалась на 18% по сравнению с контролем.

Таблица 7 - Влияние липосомальной формы ЭБТ на показатели активности ферментов антиоксидантной системы животных на фоне холодового воздействия Интакт- Контроль Показатели ные жи- (холодо- ЛС ЭБТ ЛС+ЭБТ вотные вой стресс) Каталаза, (мкат/л) 2,1±0,25 1,6±0,12* 1,8±0,05*/** 1,7±0,04* 1,9±0,05** СОД, (мкмоль/мл) 20,6±1 5,8±0,52* 11,5±0,6*/** 11±0,72*/** 10±0,82*/** Также нами были исследованы показатели активности ГП и ГР в сыворотке крови. Так, у животных на фоне холодового воздействия активность данных ферментов уменьшалась в 3 и 2 раза, соответственно, по сравнению с интактными животными.

При введении ЛС+ЭБТ показатели активности ГП и ГР повышались в 2,8 и 1,6 раза по сравнению с животными контрольной группы, а также в 1,5 и 1,2 раза соответственно по сравнению с животными, получавшими ЭБТ.

Таким образом, на фоне холодового воздействия при введении липосомальной формы экстракта из черных листьев бадана толстолистного у экспериментальных животных отмечалась тенденция восстанов ления активности ГП и ГР.

Нами изучалось влияние липосомальных средств на содержание восстановленного (GSH) и окисленного (GSSG) глутатиона в сыворотке крови крыс. При холодовом стрессе было отмечено понижение GSH в 0,9 раза и повышение GSSG в 2,8 раза по сравнению с группой интактных животных (рис. 5).

54321Интактные Контроль ЭБТ ЛС ЛС+ЭБТ животные Глутатион восстановленный (GSH) Глутатион окисленный (GSSG) Рис. 5 - Содержание восстановленного и окисленного глутатиона в сыворотке крови крыс, получавших исследуемые средства на фоне холодового стресса В группе животных, которым вводили ЛС+ЭБТ, уровень GSH повышался в 1,5 раза по сравнению с контролем, GSSG понижался в 2,раза по сравнению с контролем и в 1,5 раза по сравнению с ЭБТ.

Уровень малонового диальдегида (МДА) в крови и тканях экспериментальных крыс позволяет судить о степени активности окислительных процессов в липидах. У животных на фоне холодового стресса уровень МДА в сыворотке крови повышался в 4,3 раза, а в печени - в 2,раза по сравнению с группой интактных животных.

В группе животных, получавших ЭБТ, уровень МДА в сыворотке крови понижался в 1,9 раза и в 1,4 раза в печени по сравнению с контролем. В группе животных, которым вводили ЛС, данные показатели понижались в 2,9 раза и в 1,5 раза, соответственно, по сравнению с контролем. Введение ЛС+ЭБТ животным на фоне холодового стресса приводило к понижению уровня МДА в сыворотке крови в 2,6 раза, а в печени в 1,7 раза по сравнению с контролем.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о выраженном антиоксидантном действии липосомальной формы ЭБТ на фоне холодового стресса, что обеспечивает структурную и функциональную целостность биологических мембран. По-видимому, такое действие объясняется непосредственным радикал-перехватывающим действием фенольных соединений фитоэкстракта и экранирующим эффектом ПНЖК жира нерпы в отношении продуктов свободнорадикального окисления и сопровождающимся повышением активности эндогенных систем антиоксидантной защиты.

мкмоль/мл ВЫВОДЫ 1. Разработана технологическая схема получения липосомальной формы экстракта из черных листьев бадана толстолистного. В 1 мл полученного средства содержалось 5 мг жира и 120 мг экстракта из черных листьев бадана толстолистного.

2. Установлена выраженная мембраностабилизирующая активность липосомальной формы ЭБТ. Показатели безопасности соответствовали требованиям, предъявляемым СанПиН. Рекомендуемый срок хранения липосомальной формы ЭБТ составил 5 месяцев.

3. Липосомальная форма ЭБТ оказывала иммуномодулирующее действие, введение которого на фоне холодового стресса вызывало увеличение популяции Тхелперов и снижение популяции Т-супрессоров иммунного ответа;

восстанавливала активность ферментов монооксигеназной системы, что проявлялось в уменьшении мединалового сна у животных в раза по сравнению с таковыми у животных, подвергнувшихся воздействию холодового стресса;

активировала мотивационные характеристики поведения, повышала уровень ориентировочно-исследовательского поведения при одновременном снижении уровня тревоги, страха и неуверенности животных на фоне холодового воздействия;

повышала устойчивость животных к физическому утомлению, при этом продолжительность плавания животных достоверно увеличивалась на 32% по сравнению с таковыми в группе животных, находившихся в состоянии холодового стресса.

4. Молекулярно-клеточным механизмом действия комплексного липосомального средства явилась его способность принимать участие в базисных реакциях стабилизации биологических мембран, блокируя при этом процессы перекисного окисления, снижая уровень гидроксильных радикалов и восстанавливая активность эндогенной антиоксидантной защиты клетки.

5. Установлено, что включение экстракта из черных листьев бадана толстолистного в липосомальные структуры, полученные с добавлением жира нерпы, способствовало усилению его биологического эффекта.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

Статьи в рецензируемых журналах 1. Большунова Е.А. Исследование влияния липосомальной формы экстракта бадана толстолистного на формирование адаптационного потен циала организма/ Е.А. Большунова, Г.П. Ламажапова, С.Д. Жамсаранова // Вестник ВСГТУ, 2010, №4, Улан-Удэ, С. 83-88.

2. Большунова Е.А. Исследование мембраностабилизирующей активности липосомальной формы экстракта бадана толстолистного и его влияния на монооксигеназную систему микросом печени животных на фоне холодового стресса / Е.А. Большунова, Г.П. Ламажапова, С.Д. Жамсаранова // Современные проблемы науки и образования. – 2012. – № 2; URL: www.science-education.ru/102-5941.

Статьи в научных изданиях 3. Большунова Е.А. Влияние липосомальной формы экстракта черных листьев бадана толстолистного на физическую выносливость лабораторных животных в условиях холодового воздействия/ Е.А. Большунова, Г.П. Ламажапова, С.Д. Жамсаранова // Матер. междунар. науч.-практ. конф.

«Пищевая промышленность: состояние, проблемы, перспективы». - Оренбург: ИПК ГОУ ОГУ, 2009. – С. 133-136.

4. Ламажапова Г.П. Экспериментальное исследование адаптогенных свойств липосомальной формы экстракта бадана толстолистного/ Г.П. Ламажапова, Е.А. Большунова, С.Д. Жамсаранова // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2009.Вып. № 2(66): – С. 268–269.

5. Большунова Е.А. Влияние липосомальной формы экстракта черных листьев бадана толстолистного на ориентировочно-исследовательское поведение лабораторных животных в условиях холодового воздействия / Е.А. Большунова, Г.П. Ламажапова, С.Д. Жамсаранова // Сб. матер. III Междунар. науч.-техн. конф. молодых ученых «Актуальные проблемы технологии живых систем». – Владивосток: Изд-во ТГЭУ, 2009. – С. 192–194.

6. Большунова Е.А. Исследование влияния липосомальной формы экстракта из черных листьев бадана толстолистного на иммунный статус лабораторных животных при холодовом стрессе/ Е.А. Большунова, Г.П.

Ламажапова, С.Д. Жамсаранова // Тез. докл. междунар. конф.: Изд-во Москва-Пущино, 2009. – С. 141-142.

7. Большунова Е.А. Анализ гематологических показателей экспериментальных животных в условиях холодового воздействия и введения липосомальной формы экстракта черных листьев бадана толстолистного/ Е.А. Большунова, Г.П. Ламажапова, С.Д. Жамсаранова // Сб. науч. тр. с междунар. участием. Серия: Химия и биологически активные вещества природного происхождения. – Вып. 15, Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ, 2010, С.

59-64.

8. Bolschunova E.A. Die effektivitt der Nutzung der Liposomen form des extraktes aus schwarzen blttern des dickblttrigen badans (Bergenia crassifolia (L) fritsch) bei der Kltebebirkung / E.A. Bolschunova, G.P. Lamaschapova, S.D. Schamsaranova // Current Problems of Food Engineering and Biotechnology Proceedings of the International Workshop, July 4-7, 2009, Ulan-Ude (Russia) - Ulan-Ude: The Publishing House of East Siberian State University of Technology, 2010. – S. 72-77.

Список используемых сокращений АФК – активные формы кислорода, ГР – глутатионредуктаза, ГП – глутатионпероксидаза, ЛС – липосомы, МДА – малоновый диальдегид, ПНЖК – полиненасыщенные жирные кислоты, ПОЛ – перекисное окисление липидов, СОД – супероксиддисмутаза, ЭБТ – экстракт из черных листьев бадана толстолистного GSH – восстановленный глутатион, GSSG – окисленный глутатион






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.