WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


На правах рукописи

Хлынцева Анна Евгеньевна

РАЗРАБОТКА КОМПЛЕКСА ИММУНОДИАГНОСТИЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ

03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Оболенск – 2012

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека РФ Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Шемякин Игорь Георгиевич;

кандидат биологических наук Козырь Арина Владимировна

Официальные оппоненты:

Афанасьев Станислав Степанович, заслуженный деятель науки, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное бюджетное учреждение науки “Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им Г. Н. Габричевского” Роспотребнадзора, заместитель директора по биотехнологии Степанов Алексей Вячеславович, доктор медицинских наук, профессор, ЗАО «Национальные биотехнологии» (Оболенск), генеральный директор

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научноисследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова»

Защита состоится «15» мая 2012 г. в 14 ч на заседании диссертационного совета Д 350.002.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации по адресу: 142279, Московская обл., Серпуховский р-н, п. Оболенск, ФБУН ГНЦ ПМБ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Автореферат разослан «___» апреля 2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета ________________ Фурсова Надежда Константиновна

Общая характеристика работы



Актуальность проблемы. Разработка современных диагностических систем для детекции возбудителя сибирской язвы представляет собой одну из наиболее актуальных задач борьбы с сибиреязвенной инфекцией. Сибирская язва является острым инфекционным заболеванием людей и животных, вызываемым аэробным спорообразующим грамположительным микроорганизмом Bacillus anthracis.

По классификации ВОЗ Россия относится к зоне спорадического проявления инфекции. Однако, в последние годы в стране отмечается неуклонный рост территорий, неблагополучных по сибирской язве, таким образом, службы надзора Российской Федерации оценивают санитарно-эпидемиологическую обстановку по этому заболеванию как напряженную [Лукьянова и др., 2011].

Возбудитель – B. anthracis представляет собой грамположительную палочку длиной 6-10 мкм и шириной 1-2 мкм. Она неподвижная, образует споры и капсулу.

Хорошо растет на различных питательных средах. Споры сибирской язвы весьма устойчивы во внешней среде, они могут сохраняться в почве несколько десятков, а, возможно, и сотни лет, формируя устойчивые природные очаги инфекции.

Источником B. anthracis считают больных домашних и диких животных, организм которых предоставляет естественные условия для развития и размножения этого патогена [Ипатенко и др., 1987]. При этом источником могут быть и животные-бациллоносители, с атипичным или бессимптомным течением заболевания [Онищенко и др., 1999]. Заражение может наступать при уходе за больными животными, убое скота, обработке мяса, а также при контакте с продуктами животноводства (шкуры, кожи, меховые изделия, шерсть, щетина), обсемененными спорами сибиреязвенного микроба. Основным резервуаром B. anthracis считается почва [Ипатенко и др., 1987]. К тому же, почва может быть и непосредственным источником инфекции сибирской язвы – известны случаи заболевания людей и животных, возникшие в результате контакта с заражённой почвой [Маринин и др. 2008].

Основными факторами патогенности возбудителя сибирской язвы являются капсула и бинарный экзотоксин. Однако, в конечном итоге, вирулентность бактерии определяется суммой факторов, которая до конца не изучена [Okinaka et al, 2006]. Капсульные антигены кодируются генами, расположенными на плазмиде pX02, а токсинный комплекс и некоторые ферменты, необходимые для синтеза капсулы - на плазмиде pX01. Действие сибиреязвенного токсина не ограничивается блокировкой иммунного ответа и реакции макрофагов и нейтрофилов. При развитии лёгочной, кишечной и септической форм инфекции действие токсинов становится системным и приводит к гибели организма. Механизм интоксикации до конца не ясен [Chauncey et al, 2011], однако, очевидно, что при определённой концентрации токсина в крови наступает так называемое «состояние невозврата», при котором любая терапия существующими в настоящее время методами оказывается неэффективной [Barr et al, 2010].

Важнейшую роль играет ранняя диагностика инфекции и необходимость детекции низких концентраций возбудителя сибирской язвы в окружающей среде и продуктах питания. К настоящему времени в нашей стране и за рубежом разработан целый ряд экспериментальных иммунодиагностических тест-систем, предназначенных для выявления возбудителя сибирской язвы и его антигенов [Терешкина и Девдариани, 2008]. Однако экспериментальные разработки зачастую не завершаются внедрением результатов в практику на уровне сертифицированных препаратов, как правило, из-за несоответствия принятым параметрам специфичности (неспецифическое взаимодействие с близкородственными видами, такими как Bacillus cereus и др.).

Таким образом, для разработки эффективных средств иммунодиагностики сибирской язвы необходимы дополнительные фундаментальные и прикладные исследования. Помимо создания собственно диагностических систем, существенную роль в разработке новых диагностических средств играет идентификация антигенов или их фрагментов, специфичных исключительно для B. аnthracis. В качестве основы для быстрой разработки различных типов современных диагностикумов наиболее перспективными и универсальными являются панели моноклональных антител (МКА), на основе которых можно создавать широкий спектр диагностических средств, учитывающих как особенности патогенеза сибирской язвы, так и современные форматы высокочувствительных систем детекции микроорганизмов и их факторов вирулентности.

В настоящее время в России существуют четыре коммерческих препарата для иммунологического определения сибирской язвы: «Иммуноглобулины диагностические сибиреязвенные соматические люминесцирующие сухие» (СтавНИПЧИ), «Иммуноглобулины диагностические сибиреязвенные антиспоровые (адсорбированные) люминесцирующие сухие» (СтавНИПЧИ), «Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие сибиреязвенные неадсорбированные сухие» (НИИ эпидемиологии и микробиологии им.

Н.Ф. Гамалеи) и «ИХ тест-система B. аnthracis» (ГНЦ ПМБ). Чувствительность первых двух препаратов не превышает 105 микробных клеток/мл пробы и чаще всего недостаточна для обнаружения возбудителя в почве. Кроме того, даже адсорбированные люминесцирующие иммуноглобулины не дают 100% специфичности и могут давать ложноположительные результаты со спорами B. cereus и Bacillus thuringiensis. Чувствительность «ИХ тест-системы B. аnthracis» не превышает 108 - 109 спор/мл. В связи с этим, необходимость в создании новых методов и средств индикации возбудителя сибирской язвы не вызывает сомнений.

Цель исследования - создание комплекса высокоэффективных и чувствительных иммунодиагностических тест-систем для определения возбудителя сибирской язвы, основанных на специфичных МКА, анализ их эффективности и идентификация антигенной мишени МКА.

Задачи исследования:

1. Получить и охарактеризовать панель моноклональных мышиных антител к B. anthracis. Провести изучение полученных МКА на наличие внутри- и межвидовой перекрестной активности при помощи коллекции патогенных и сапрофитных бацилл.

2. Разработать на основе полученных МКА диагностические тестсистемы в формате ИФА и латекс-агглютинации.

3. Сконструировать систему для селективного концентрирования возбудителя сибирской язвы на основе магнитных частиц с иммобилизованными МКА.

4. Идентифицировать антигенную мишень полученных МКА, использованных при разработке диагностических тест-систем.

Научная новизна:

1. Получена и охарактеризована панель МКА к спорам B. anthracis.

Определены изотипы антител, константы аффинности, подобраны диагностически значимые пары антител, не конкурирующих за связывание антигена. Показана специфичность взаимодействия антител с возбудителем сибирской язвы и отсутствие перекрестных реакций с близкородственными микроорганизмами.

2. Идентифицирована антигенная мишень МКА, использованных при разработке тест-систем, представляющая собой белок EA1, поверхностный антиген B. anthracis. Показано взаимодействие МКА, примененных при разработке тестсистем, с рекомбинантным белком EA1, полученным в гетерологичной системе экспрессии в E. coli.

Практическая ценность диссертации:

1. С применением МКА разработаны диагностические тест-системы на основе ИФА, латексных частиц и магноиммуносорбентов, проведено определение чувствительности и специфичности разработанных тест-систем. Тест-системы успешно прошли комиссионные испытания.

2. Высоко экспрессная тест-система «Набор реагентов для определения спор Bacillus anthracis в реакции латекс-агглютинации» получила государственную регистрацию (Регистрационное удостоверение № ФСР 2011/12159 от 20 октября 2011года Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития).

3. Тест-система на основе магноиммуносорбентов способна специфически детектировать споры штаммов сибирской язвы в концентрациях - 1х103 спор/мл. Данная система позволяет проводить селективное концентрирование спор возбудителя сибирской язвы из проб окружающей среды и рекомендована к внедрению в практику работы учреждений Санэпиднадзора.

4. Получен Патент на изобретение №2439148 С1 РФ «Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 1E6 –продуцент моноклональных антител для специфичного обнаружения спор Bacillus anthracis».

5. Разработаны и внедрены на Федеральном уровне методические указания «Порядок организации и проведения лабораторной диагностики сибирской язвы для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней» МУ 4.2.2941-11, 2011 г.

Положения, выносимые на защиту:

1. Полученная панель из шести МКА, являющихся специфичными к белку EA1 S-слоя возбудителя сибирской язвы и не дающих перекрестных реакций с близкородственными микроорганизмами, может быть использована для создания иммунодиагностикумов для определения B. anthracis.

2. «Набор реагентов для определения спор Bacillus anthracis в реакции латекс-агглютинации» обладает чувствительностью от 1х105 спор/мл до 2х106 спор/мл и выше, а также высокой специфичностью. Данный латексный диагностикум может быть использован в лабораторной диагностике для детекции как споровой, так вегетативной форм возбудителя сибирской язвы.

3. «Набор реагентов. Тест-система иммуноферментная магноиммуносорбентная для выявления возбудителя сибирской язвы в споровой форме моноклональная» обеспечивает выявление спор возбудителя сибирской язвы с высокой чувствительностью (1х103 спор/мл) и специфичностью. Концентрация спор возбудителя сибирской язвы на поверхности МИС позволяет максимально освобождаться от посторонней микрофлоры при исследовании проб окружающей среды (вода, почва).

Личный вклад соискателя. Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором в сотрудничестве, главным образом, с к.б.н. Е.В. Беловой (ГНЦ ПМБ), к.б.н. А.М. Барановым (ГНЦ ПМБ), к.б.н. А.В. Козырь (ГНЦ ПМБ), к.б.н. А.В. Колесниковым (ГНЦ ПМБ), к.м.н. С.С. Ветчининым (ГНЦ ПМБ), к.м.н. Е.В. Барановой (ГНЦ ПМБ), д.б.н.

И.В. Жарниковой (СтавНИПЧИ) и д.б.н., проф. И.Г. Шемякиным. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль автора была определяющей. В исследованиях также принимали участие сотрудники ГНЦ ПМБ Р.И. Миронова и Н.М. Лунева.





Апробация работы. Материалы диссертации доложены и представлены на:

IX Межгосударственной научно-практической конференции государствучастников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников содружества независимых государств» (Волгоград, 2008); Всероссийской научной конференции «Диагностика, лечение и профилактика опасных и особо опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология» посвященная 80-летию со дня основания ФГУ «48 ЦНИИ МИНОБОРОНЫ РОССИИ», (Киров, 2008); Научнопрактической конференции СМУиС РОСПОТРЕБНАДЗОРА, ФГУН ГНЦ ПМБ, «Биологическая безопасность в современном мире» (Оболенск, 2009); Научнопрактической конференции СМУиС РОСПОТРЕБНАДЗОРА, ФГУН ГНЦ ПМБ, «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 2010); Юбилейной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины», (СПбМАПО, Санкт-Петербург, 2010); VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010» (Москва, 2010); III Научнопрактической школе-конференции СМУиС РОСПОТРЕБНАДЗОРА, ФГУН ГНЦ ПМБ, «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 2011).

План и аннотация диссертации обсуждены и одобрены на заседании Ученого совета ГНЦ ПМБ 24 декабря 2008 г., протокол № 8. Результаты исследований доложены на заседании межлабораторного семинара ГНЦ ПМБ (протокол № 22 от 28 декабря 2011г).

Публикации. Основное содержание работы

отражено в 10 научных публикациях, в том числе в трех статьях, опубликованных в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, в одном патенте на изобретение №2439148 СРФ. и в МУ 4.2.2941-11, 2011 г.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований с их обсуждением, заключение, выводы и указатель литературы, включающий 38 работ отечественных и 119 – зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 9 рисунками и 16 таблицами. Приложения состоят из трех статей, опубликованных по теме диссертации.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования Штаммы микроорганизмов. В работе использованы 29 штаммов возбудителя сибирской язвы и 57 штаммов близкородственных споровых сапрофитов рода Bacillus, полученных из лаборатории микробиологии сибирской язвы ФБУН ГНЦ ПМБ, из коллекции патогенных микроорганизмов ФГУЗ СтавНИПЧИ, из коллекции микроорганизмов ФКУЗ ИркутскНИПЧИ Сибири и ДВ и из коллекционного центра живых культур ФГУЗ ВолгоградНИПЧИ.

Споры использованных в работе штаммов микроорганизмов получали при выращивании микроорганизмов на голодном L-агаре/по Луриа (Луриа-Бертани), вегетативные клетки микроорганизмов получали при выращивании микроорганизмов на агаре Хоттингера (Оболенск, РФ).

Получение гибридом. Для иммунизации использовали мышей линии BALB/c. Мышей иммунизировали путем двукратного, с тридцатидневной экспозицией, подкожного введения спор штамма В. anthracis СТИ-1, эмульгированных с полным (первая иммунизация) и неполным (вторая иммунизация) адъювантом Фрейнда (Sigma, США). Бустер-дозы препарата (107спор) вводили внутривенно в физиологическом растворе. Проверку титра специфичных антител у иммунизированных мышей проводили непрямым твердофазным ИФА по методу A.M. Егорова [Егоров и др., 1991]. Интенсивность окрашивания анализировали при длине волны 492 нм (фотометр Пикон, РФ). В качестве отрицательного контроля использовали сыворотку крови интактной мыши. Для гибридизации брали мышей с титром специфичности 1:32000.

Гибридизацию проводили по стандартному протоколу [Kohler & Milstein, 1975], в качестве партнера для слияния использовали мышиную миеломную клеточную линию Х63-Ag8.653. Полученные гибридомные клоны были первично проскринированы в ИФА. Гибридомы, проявляющие иммунореактивность в отношении спор B. аnthracis в ИФА, клонировали и переклонировали методом лимитирующих разведений на 96-луночных планшетах с макрофагальным фидерным слоем. После повторной проверки специфической активности в ИФА отобрали гибридные клоны, продуцирующие антитела к спорам B. аnthracis.

Полученные клоны гибридом продуцентов МКА масштабировали, заложили на хранение в жидком азоте и использовали для наработки специфичных антител in vivo и in vitro.

Выделение и очистка МКА. Выделение МКА из асцитической жидкости проводили путем аффинной хроматографии на колонке с белком G-сефарозой (Protein G Sepharose 4 Fast Flow), согласно рекомендации производителя (GE Healthcare, Швеция). Чистоту полученных иммуноглобулиновых фракций оценивали методом SDS-PAGE-электрофореза в денатурирующих условиях.

Концентрацию иммуноглобулинов определяли спектрофотометрически при длине волны 280 нм на спектрофотометре Smart Spec Plus (BIO RAD, США).

Определение подклассовой принадлежности. Подклассы полученных МКА определяли с помощью набора для определения изотипов мышиных моноклональных антител (Roche Diagnostic Corporation, США).

Определение аффинности МКА. Константу аффинности МКА определяли в неконкурентном иммуноферментном анализе по методу Beatty [Beatty et al., 1987].

Определение специфической и перекрестной активности полученных МКА в отношении спор B. anthracis и спор близкородственных спорообразующих бацилл проводили методом дот-блот анализа.

Подбор пар МКА проводили в двухсайтовом дот-блот анализе.

Приготовление биотинилирующего реагента проводили по методу Duk [Duk, 1994].

Рабочий титр конъюгированных МКА определяли в ИФА.

Получение иммунопероксидазных конъюгатов сибиреязвенных.

Коньюгаты получали методом перйодатного окисления по Nakane [Nakane & Kawaoi, 1974]. Рабочий титр и специфическую активность конъюгатов определяли по методике Clark [Clark & Adams, 1977] в «сэндвич» - варианте ИФА.

Для конструирования латексного диагностикума использовали латексные частицы А-63-21 (Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва). Иммобилизацию МКА на латексных частицах проводили согласно протоколу производителя. Лиофильное высушивание латексных суспензий с иммобилизованными МКА проводили с использованием лиофильной сушки Epsilon 2-4 LSC, («Christ», Германия). Реакцию латексагглютинации (РЛА) проводили в круглодонных 96-луночных планшетах (Медполимер, Россия). В качестве отрицательного контроля использовали 0,1 М боратный буфер, pH 8,2.

Для разработки тест-системы иммуноферментной магноиммуносорбентой были использованы магноиммуносорбенты (МИС), полученные по методике, описанной в изобретении [Пат. РФ. №2138813, G-01, №33/543]. Чувствительность и специфичность МИС проверяли путем постановки ИФА со штаммами B. anthracis и штаммами близкородственных бацилл в споровой форме. В качестве отрицательного контроля использовали фосфатно-солевой буфер с альбумин-твином (USB, США). Учет результатов проводили на фотометре (Пикон, РФ) для ИФА при длине волны 492 нм. Положительными считали результаты, если оптическая плотность образцов в два и более раз превышала оптическую плотность отрицательного контроля.

Получение рекомбинантных белков B. аnthracis ЕА1 и BclA. ДНК штамма В. anthracis СТИ-1 была амплифицировали с использованием пары праймеров, специфичных к 5’ и 3’- концам кодирующих областей генов ea1 и bclA. Гены был клонировали в экспрессионный вектор на основе pET-MASMT [Патент РФ №2355769], содержащий последовательности для N-концевых пептидов MASMT, His6 и с-myc, используемые для аффинной очистки, детекции, и оптимизации трансляционного контекста белков. Рекомбинантные антигены EA1 и BclA продуцировали в E. coli BL21(DE3) и очищали металл-хелатной хроматографией.

Очищенный препарат проверяли на взаимодействие с полученными МКА методом иммуноблоттинга.

Результаты исследований и обсуждение Отбор высокоаффинных и специфичных МКА Одним из важных этапов работы по конструированию иммунодиагностических тест-систем с использованием МКА является отбор стабильных клеточных линий (гибридом), продуцирующих высокоаффинные, специфичные МКА.

В ходе работ получили и охарактеризовали панель из 20 гибридных клонов, продуцирующих МКА к спорам возбудителя сибирской язвы B. anthracis. Следует отметить, что антигенные различия между спорами представителей рода Bacillus минимальны [Quinlant & Foegeding, 1997], и отсутствие перекрестного взаимодействия антител, полученных к спорам B. anthracis, со спорами близкородственных спорообразующих бацилл является одним из важнейших факторов, обеспечивающих возможность применения полученных антител для разработки специфичных диагностических тест-систем.

Исследование специфической активности полученных МКА показало, что шесть из исследованных МКА – 4Е6, 2B8, 3G3, 2C8, 6B6 и 1Е6 - специфически взаимодействовали со спорами 16 штаммов возбудителя сибирской язвы в концентрации 105 спор/мл и не давали перекрестных реакций со спорами близкородственных бацилл. Результаты по определению специфической активности МКА представлены в таблице 1.

В качестве кандидатов для конструирования иммунодиагностических тестсистем было отобрано шесть МКА (4E6, 2B8, 3G3, 2C8, 6B6 и 1E6), специфически взаимодействовавших со спорами B. anthracis и не связывавших споры близкородственных микроорганизмов.

Отобранные МКА охарактеризовали (рис. 1), показали, что МКА, 2B8, 3G3, 2C8, 6B6, 1E6 относятся к иммуноглобулинам изотипа G1, а МКА 4E6 – изотипа G2a. Чистоту выделенных препаратов иммуноглобулинов и молекулярные массы легкой и тяжелой цепей полученных МКА определяли методом белкового SDSПААГ электрофореза. Результаты по определению констант аффинности МКА показали, что наибольшей аффинностью обладают три антитела: 1E6, 6В6 и 3G3.

Во многих случаях для конструирования иммунодиагностичесих тест систем используют диагностически значимые пары антител, что позволяет снизить неспецифическое взаимодействие и проводить выделение возбудителя из больших объемов проб. Для формирования диагностических пар было необходимо выбрать из имеющейся панели антитела, не только не конкурирующие за общие сайты связывания, но и не теряющие специфической активности при конъюгировании с ферментной или иной меткой. Подбор пар МКА осуществляли методом двухсайтового дот-блот анализа. В результате установили, что наибольшая чувствительность анализа (до 106 спор/мл) достигалась при использовании в качестве первого антитела МКА 1E6, 3G3, и в качестве второго антитела - МКА 6B6. При использовании других комбинаций антител реакция была менее интенсивна (рис. 2).

Подобранные пары МКА использовали при конструировании ИФА-тестсистемы и МИС для выявления возбудителя сибирской язвы в споровой форме.

Таблица 1 - Перекрестная активность МКА с бактериальными спорами Рисунок 1 – Характеристика полученных МКА 4 1 4 1 4 1 4 1 4 1 4 1 4 1 4 4 1 4 5 2 5 2 5 5 2 5 2 5 5 2 5 2 5 2 5 2 3 6 3 6 3 6 3 6 3 6 3 6 6 3 6 6 3 6 1- МКА 3G3 4- МКА 1Е1- МКА 3G3 4- МКА 1Е2- МКА 2C8 5- МКА 4E2- МКА 2C8 5- МКА 4E3- МКА 6В6 6- МКА 2В3- МКА 6В6 6- МКА 2ВРисунок 2 – Подбор диагностически значимых пар МКА Разработка иммунодиагностических тест-систем В данной работе основное внимание сосредоточили на разработке современных высокоспецифичных тест-систем на основе иммуноферментного анализа, латекс-агглютинации и тест-системы для селективного концентрирования возбудителя сибирской язвы с использованием магноиммуносорбентов.

Разработка тест-системы для выявления и идентификации спор методом иммуноферментного анализа На основании проведенной работы по конструированию иммуноферментной тест-системы разработали и утрердили комплект нормативной документации, включающий в себя инструкцию по применению и технические условия (ТУ 9388 103-78095326-2009, ОКП 938890). Для оценки эффективности сконструированной иммуноферментной тест-системы были провели комиссионные испытания на базе Иркутского научно-исследовательского противочумного института Роспотребнадзора. Подлинность, чувствительность и специфичность иммуноферментной тест-системы проверяли путем постановки «сэндвич-ИФА» с 10 штаммами B. anthracis и с 10 штаммами близкородственных бацилл в споровой форме. В качестве положительного контроля использовали взвесь B. anthracis СТИ-1 (положительный контроль), входящая в комплект набора реагентов (табл.2).

В ходе проведенных испытаний установили, что иммуноферментная тестсистема выявляла споры штаммов возбудителя сибирской язвы в концентрации 1x106 спор/мл и не обладала перекрестной активностью со штаммами близкородственных микроорганизмов в концентрации 1x106 спор/мл и выше, за исключением двух штаммов B. cereus 412 и B. thuringiensis 2002, с которыми наблюдалась положительная реакция в концентрации 1x107 спор/мл. Таким образом, диагностическое применение тест-системы возможно только при использовании серийных разведений образца.

Таблица 2 - Результаты исследования чувствительности и специфичности ИФА тест-системы в «сэндвич-ИФА» со спорами штаммов микроорганизмов рода Bacillus Конструирование сибиреязвенного латексного диагностикума Для конструирования сибиреязвенного латексного диагностикума использовали МКА 1Е6. Оптимальная нагрузка на латексных частицах моноклональных антител составила 20 мкг на 50 мкл исходной латексной суспензии. Чувствительность и специфичность сибиреязвенной латексной суспензии оценивали в РЛА с инактивированными культурами трех штаммов B. anthracis и с пятью гетерологичными штаммами рода Bacillus.

В результате проведенного анализа установили, что полученная латексная сибиреязвенная суспензия с иммобилизованными МКА 1Е6 выявляет исследованные штаммы возбудителя сибирской язвы в концентрации до 2,0x106 спор/мл и не имеет перекрестной активности с гетерологичными штаммами рода Bacillus.

Для увеличения срока годности латексные суспензии лиофильно высушили.

Чувствительность и специфичность лиофильно высушенных латексных суспензий определяли в РЛА (рис 3).

В результате проведенного анализа установили, что по чувствительности и специфичности лиофильно высушенный латексный препарат не уступает исходной жидкой латексной суспензии с иммобилизованными МКА и может быть использован в качестве компонента латексного сибиреязвенного диагностикума для определения спор B. аnthracis.

Рисунок 3 - Оценка чувствительности и специфичности латексной суспензии после лиофильного высушивания со спорами штаммов рода Bacillus На основании проведенной работы по конструированию латексного диагностикума разработали и утвердили комплект нормативной документации, включающий в себя инструкцию по применению и технические условия (ТУ 9388112-78095326-2010), код ОКП 938890), а также изготовили экспериментальнопроизводственные серии сибиреязвенного латексного диагностикума.

Для оценки эффективности сконструированного диагностикума провели комиссионные испытания экспериментальных образцов латексного диагностикума на базе Иркутского, Ставропольского и Волгоградского научно-исследовательских противочумных институтов Роспотребнадзора. Чувствительность и специфичность латексного диагностикума проверяли путем постановки РЛА с 17 штаммами B. anthracis и с 36 штаммами близкородственных бацилл в споровой форме. В результате проведенных испытаний установили, что «Набор реагентов для определения спор Bacillus anthracis в реакции латекс-агглютинации» обнаруживал споры возбудителя сибирской язвы в концентрации от 1х105 спор/мл до 2х106 спор/мл и выше. Реакции со спорами различных видов спорообразующих бацилл в концентрации 1х108 спор/мл и ниже не выявили. Исключение составляет Bacillus cereus VRRL 569, споры которого обнаружили в концентрации 1х108 спор/мл. В виду наличия перекрестно–реагирующих антигенов у представителей рода Bacillus, допускается при проведении РЛА положительный результат с гетерологичными штаммами не более, чем у 10 % от числа исследуемых штаммов. В нашем случае этот показатель составил 2,7 %.

Экспериментально-производственные серии латексного диагностикума прошли приемочно-технические испытания в аккредитованном Росздравнадзором испытательном центре. На данный набор «Набор реагентов для определения спор Bacillus anthracis в реакции латекс-агглютинации» получено Регистрационное удостоверение Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития № ФСР 2011/12159 от 20 октября 2011года.

Конструирование тест-системы для селективного концентрирования спор B. anthracis на основе магнитных частиц с иммобилизованными МКА Для дальнейшего совершенствования методов индикации возбудителя сибирской язвы объединили метод предварительного концентрирования искомого инфекционного агента на магноиммуносорбентах с последующей детекцией в ИФА. Для разработки иммуноферментной магноиммуносорбентой тест-системы требуется пара антител. Первое антитело, иммобилизованное на магнитных частицах, связывается с исследуемым антигеном, образуя комплекс «антигенантитело». Второе антитело, коньюгированное с пероксидазой хрена, обеспечивает визуализацию реакции, катализируя расщепление орто-фенилендиамина.

Для разработки иммуноферментной магноиммуносорбентой тест-системы использовали: МИС, полученные по методике, описанной в изобретении (Пат. РФ.

№2138813, G-01, №33/543) в сотрудничестве со специалистами СтавНИПЧИ Роспотребнадзора; пара МКА 1Е6-6В6. МКА 1Е6 иммобилизовали на магнитных частицах, а МКА 6В6 конъюгировали с пероксидазой хрена для обеспечения визуализации реакции в ИФА.

На основе полученных магноиммуносорбентов скомпоновали диагностические иммуноглобулиновые сибиреязвенные моноклональные тестсистемы для иммуноферментного анализа.

Для оценки эффективности сконструированных диагностикумов были проведены комиссионные испытания на базе Иркутского и Волгоградского научноисследовательских противочумных институтов Роспотребнадзора.

Чувствительность и специфичность тест-системы проверяли путем постановки ИФА с 8 штаммами B. anthracis и с 19 штаммами близкородственных бацилл в споровой форме, а также с образцами объектов окружающей среды (почва и вода), искусственно контаминироваными данными микроорганизмами (табл. 4 и 5).

Таблица 4 - Чувствительность и специфичность тест-системы иммуноферментной магноиммуносорбентной В результате установили, что тест-система выявляет споры штаммов сибирской язвы в концентрациях до 103 спор/мл и не выявляет гетерологичные культуры рода Bacillus в споровой форме в концентрации 105 спор/мл и ниже.

Результаты исследований проб почвы и воды, искусственно зараженных спорами микроорганизмов показали, что тест-система выявляет споры возбудителя сибирской язвы в концентрации не менее 103 спор/мл и не выявляет спорообразующие бациллы в концентрации 105 спор/мл.

Таблица 5 - Эффективность обнаружения сибиреязвенного микроба в пробах из объектов окружающей среды, искусственно контаминированных спорами B.

anthracis и других бацилл Идентификация мишени для МКА, использованных при разработке тест-систем Для получения МКА, специфичных к поверхностным антигенам бактерий могут быть использованы целые клетки, либо специфические фракции клеток, например компоненты мембран и клеточных стенок, а также компоненты спор (если таковые образуются данными микроорганизмами). Поверхностные антигены - компоненты мембран и спор – экспонированы в окружающую среду и могут быть эффективными мишенями, как для диагностики, так и для разработки вакцин.

Вместе с тем, следует отметить, что при выделении сложных компонентов, таких как мембраны или компоненты спор, возможна их контаминация другими компонентами клеток, поскольку критерии чистоты выделения для сложных клеточных структур, равно как и методики, обеспечивающие такое выделение, разработать и воспроизвести весьма сложно. В силу этого, а также в силу особенностей иммунного ответа, интенсивность которого обусловлена в первую очередь не количеством антигена, а эффективностью индукции, основными мишенями для антител могут быть минорные компоненты целевых структур, или даже контаминирующие препарат антигены, принадлежащие к другим структурам микроорганизма. Индукция специфического иммунного ответа в случае комплексных антигенов является сложной задачей, однако, её решение позволяет не только определить мишень для избранного антитела и определить её диагностическую ценность, но и внести вклад в изучение характера ответа иммунной системы на данный микроорганизм. Идентификация иммунодоминантных антигенов бактерий и их локализации может оказать существенную помощь при разработке как специфических диагностикумов, так и эффективных вакцин.

Исследование взаимодействия моноклональных антител с поверхностью спор В сотрудничестве с заведующим сектором гибридом отдела иммунобиохимии Ветчининым С.С. приготовили ФИТЦ – меченые антитела (ФИТЦ-МКА 1Е6, ФИТЦ-МКА-3G3 и ФИТЦ-МКА 6В6). Взаимодействие данных ФИТЦ-МКА со спорами штамма B. anthracis СТИ-1 и со спорами 4 штаммов близкородственных бацилл (B. cereus В-160, B. anthracoides B-217, B. thuringiensis B-214, B. subtilis B-1405) изучили методом прямой иммунофлуоресценции. В качестве отрицательного контроля использовали препараты спор без обработки ФИТЦ-МКА (рис. 3).

Согласно данным флуоресцентной микроскопии, в препарате спор B.

anthracis СТИ-1 ФИТЦ-меченные МКА связывались не только со спорами, но и с так называемым клеточным дебрисом, формируемым при споруляции.

Взаимодействие со спорами исследованных контрольных видов бацилл отсутствовало. Споры имели собственное желтовато-белое свечение при исследовании мазков на флуоресцентном микроскопе при длине волны облучения 495 нм.

1 2 3 4 1 2 3 4 1а 2а 3а 4а 5а 1а 2а 3а 4а 5а Рисунок 4 - Взаимодействие ФИТЦ-МКА 1Е6 со спорами штаммов рода Bacillus. 15 – препараты спор, обработанных ФИТЦ-меченными МКА 1Е6 к спорам возбудителя сибирской язвы: 1– B. anthracis СТИ-1, 2 – B.cereus В-160, 3 – B. anthracoides B-217, 4 – B. thuringiensis B-214, 5 – B. subtilis B-1405. 1а-5а – препараты спор без обработки ФИТЦ-меченными МКА 1Е6 к спорам возбудителя сибирской язвы Предварительные данные по иммуноблоттингу препаратов разрушенных спор с использованием полученных МКА в качестве зондов показали, что антитела реагируют с высокомолекулярным (70-100 кДА) материалом. Вместе с тем, МКА окрашивали различные наборы мультимерных полос, что затрудняло идентификацию молекулярного веса потенциальной мишени.

Предприняли попытки анализа ранее полученных различными исследователями данных о потенциальных иммунодоминантных мишенях при иммунизции животных различными высокомолекулярными поверхностными анигенами B. аnthracis. Предполагалось получить наиболее перспективные антигены в рекомбинантной форме и провести анализ полученных МКА на предмет взаимодействия с этими белками.

BclА и EAОдним из наиболее подробно описанных поверхностных антигенов B. anthracis, проявляющих иммунодоминантность, является коллагеноподобный гликопротеин экзоспориума патогена, BclA. Этот белок может формировать олигомеры, и является одним из основных иммунодоминантных компонентов экзоспориума [Steichen et al, 2003]. Также известно, что дегликозилированный белок эффективно узнаётся антителами, что указывает на то, что гликозилирование не защищает иммунодоминантные эпитопы белка, и что олигосахаридный компонент BclA не является иммунодоминантной частью антигена. В силу этого по меньшей мере большинство антител, специфичных к BclA, должны узнавать рекомбинантный негликозилированный белок. Белок получили в рекомбинантной форме.

В рамках разработки диагностикумов для специфической детекции возбудителя сибирской язвы, а также в работах по исследованию иммунодоминантных антигенов, пригодных для создания субъединичной противосибиреязвенной вакцины, исследователи охарактеризовали целый ряд антигенов, например, sapA, CapA, EA1 [Zhang et al, 2008] и ряд других.

Антиген EA1 обнаружили достаточно давно и показали, что он является главным компонентом S-слоя [Zhang et al, 2008]. В более ранних исследованиях доказали, что этот антиген не индуцирует протективный эффект при иммунизации [Mesnage et al, 1997]. Вместе с тем, данный антиген является потенциальной мишенью для высокоспецифической диагностики B. аnthracis.

В наших исследованиях антиген EA1 получили нами аналогично способу получения антигена BclA. Полученные рекомбинантные белки EA1 и BclА анализировали иммуноблоттингом на предмет взаимодействия с полученными МКА. В качестве положительного контроля использовали Anti-His antibody, в а качестве отрицательного – сыворотку крови интактной мыши (рис. 5).

Иммуноблотинг Иммуноблотинг МКА 1Е6 с МКА 1Е6 с BclA BclA BclA BclA BclA BclA BclA рекомбинантным рекомбинантным гликопротеином BclA гликопротеином BclA экзоспориума штамма экзоспориума штамма В. anthracis СТИ-В. anthracis СТИ-Anti-His antibody (К+) МКА 1Е6 КAnti-His antibody (К+) МКА 1Е6 КИммуноблотинг Иммуноблотинг ЕА1 ЕАЕА1 ЕАЕА1 ЕАМКА 1Е6 с МКА 1Е6 с рекомбинантным рекомбинантным ЕА1 штамма ЕА1 штамма В. anthracis СТИ-В. anthracis СТИ-К- Anti-His antibody (К+) МКА 1ЕК- Anti-His antibody (К+) МКА 1ЕК- Anti-His antibody (К+) МКА 1ЕРисунок 5 – Определение антигенных мишеней МКА 1ЕНа основании данных иммуноблоттинга можно утверждать, что шесть специфичных МКА, которые были отобраны в качестве кандидатов для разработки диагностических тест-систем, связывались с рекомбинантным EA1.

Контрольные препараты белка, содержащие BclA, не взаимодействовали с указанными МКА.

Оценка диагностической значимости разработанных диагностикумов для детекции вегетативной формы возбудителя сибирской язвы Несмотря на противоречивую информацию о локализации белка EA1, его ассоциация со спорами и наличие эпитопов, уникальных для B. anthracis, делает данный белок интересной мишенью для дальнейшей разработки диагностикумов, детектирующих как споровую, так и вегетативную форму патогена.

Провели оценку диагностической значимости сконструированного латексного диагностикума для детекции вегетативной формы B. anthracis.

С этой целью поставили РЛА с вегетативными клетками пяти штаммов возбудителя сибирской язвы. В качестве положительного контроля использовали споры штамма B. anthracis 71/12. Для контроля специфичности детекции применялись три близкородственных штамма рода Bacillus как в вегетативной, так и в споровой форме (рис 6).

В результате проведенной РЛА установили, что сибиреязвенный латексный диагностикум выявляет споры и вегетативные клетки штаммов сибирской язвы в концентрации до 2,0х106 спор(кл.)/мл и не выявляет гетерологичные культуры рода Bacillus в концентрации 1,0х108 спор(кл.)/мл и ниже. Таким образом, он может быть использован в лабораторной диагностике для детекции как споровой, так вегетативной формы возбудителя сибирской язвы.

AB. anthracis 71/12 споры AB. anthracis 71/12 споры BB. anthracis 71/12 клетки BB. anthracis 71/12 клетки CB. anthracis М-71 клетки CB. anthracis М-71 клетки DB. anthracis СТИ-1клетки DB. anthracis СТИ-1клетки EB. anthracis 220 клетки EB. anthracis 220 клетки FB. anthracis 228/8 клетки FB. anthracis 228/8 клетки G1,Н1 B.megaterium В-1435 споры G1,Н1 B.megaterium В-1435 споры G2,Н2 B.thuringiensis В-214 споры G2,Н2 B.thuringiensis В-214 споры G3,Н3 B.cereus 160 споры G3,Н3 B.cereus 160 споры G4,Н4 B.megaterium В-1435 клетки G4,Н4 B.megaterium В-1435 клетки 1x108м.к./мл 1x108м.к./мл G5,Н5 B.thuringiensis В-214 клетки G5,Н5 B.thuringiensis В-214 клетки 5x107м.к./мл 5x107м.к./мл G6,Н6 B.cereus 160 клетки G6,Н6 B.cereus 160 клетки G12,Н12 отрицательный контроль G12,Н12 отрицательный контроль Рисунок 6 - Результаты РЛА со спорами и вегетативными клетками штаммов возбудителя сибирской язвы и близкородственных микроорганизмов Несмотря на наличие в EA1 участков, антитела к которым крос-реактивны с гомологичными белками из родственных микроорганизмов (B. cereus, B. thuringenis), методом конкурентного фагового дисплея в EA1 исследователи обнаружили эпитопы, присущие только B. anthracis [Ezzell et al, 1988]. Это означает, что не только в антителах, селектированных методом фагового дисплея из животных иммунизированных EA1, но и в достаточно широкой панели МКА к данному белку, полученных стандартным способом, высока вероятность обнаружения таких антител. Поскольку полученные в этой работе данные свидетельствуют об уникальности эпитопов, распознаваемых описанной панелью МКА, данные антитела могут быть использованы для эпитопного картирования EA1 с целью локализации антигенных детерминант, уникальных для B. anthracis и анализа их уникальности на уровне различий в аминокислотной последовательности близкородственных вариантов EA1.

2,5x10 м.к./мл 2,5x10 м.к./мл 1, 10 м.к./мл 1, 10 м.к./мл 6,3x10 м.к./мл 6,3x10 м.к./мл 3,1x10 м.к./мл 3,1x10 м.к./мл 1,6x10 м.к./мл 1,6x10 м.к./мл 7,8x10 м.к./мл 7,8x10 м.к./мл 3,9x10 м.к./мл 3,9x10 м.к./мл 2,0x10 м.к./мл 2,0x10 м.к./мл 9,8x10 м.к./мл 9,8x10 м.к./мл 4,9x10 м.к./мл 4,9x10 м.к./мл ВЫВОДЫ 1. Получена и охарактеризована панель МКА к спорам B. anthracis.

Определены изотипы антител, константы аффинности, подобраны диагностически значимые пары антител, не конкурирующих за связывание антигена. Показана специфичность взаимодействия МКА с возбудителем сибирской язвы и отсутствие перекрестных реакций с близкородственными микроорганизмами.

2. С применением МКА разработаны диагностические тест-системы на основе ИФА, латексных частиц и магноиммуносорбентов, проведено определение чувствительности и специфичности разработанных тест-систем. Тест-системы успешно прошли комиссионные испытания. Высокоэкспрессная тест-система «Набор реагентов для определения спор Bacillus anthracis в реакции латексагглютинации» получила государственную регистрацию.

3. Было показано, что наибольшей эффективностью и чувствительностью обладает тест-система на основе магноиммуносорбентов, способная специфически детектировать споры штаммов сибирской язвы в концентрациях - 1х103 спор/мл.

Данная система позволяет проводить селективное концентрирование спор возбудителя сибирской язвы из проб окружающей среды и рекомендована к внедрению в практику работы учреждений санэпиднадзора.

4. Идентифицирована мишень для моноклональных антител, использованных при разработке тест-систем, представляющая собой белок EA1, поверхностный антиген B. anthracis. Показано взаимодействие моноклональных антител, примененных при разработке тест-систем, с рекомбинантным белком EA1, полученным в гетерологичной системе экспрессии в E. coli.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

а) статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК 1. Хлынцева А.Е., Белова Е.В., Жарникова И.В., Тюменцева И.С., Куличенко А.Н., Дятлов И.А., Шемякин И.Г. Конструирование тест-системы для селективного концентрирования спор Bacillus anthracis на основе магнитных частиц с иммобилизованными моноклональными антителами // Биотехнология. - 2010. - №4. – С. 81 – 88.

2. Кравец Е.В., Дугаржапова З.Ф., Родзиковский А.В., Хлынцева А.Е., Лунева Н.М., Белова Е.В., Колосова Н.В., Рудницкий С.Ю., Соловьев П.В., Баранова Е.В., Бикетов С.Ф. Применение методов латекс-агглютинации и иммунохроматографии для ускоренной идентификации культур Bacillus anthracis при эпидемиологических расследованиях вспышек // Проблемы особо опасных инфекций 2011. - №1 (107). – С. 81 – 82.

3. Хлынцева А.Е., Лунева Н.М., Белова Е.В., Дятлов И.А., Шемякин И.Г.

Разработка и испытания диагностикума на основе моноклональных антител для определения спор возбудителя сибирской язвы в реакции латекс-агглютинации // Проблемы особо опасных инфекций 2011. - №4 (110).- C. 71-75.

б) патенты 4. Пат. № 2439148 С1 РФ МПК С12N 5/18, C12P 21/08, C07K 16/12. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 1E6 - продуцент моноклональных антител, специфичных к спорам Bacillus anthracis / Белова Е.В., Хлынцева А.Е., Дятлов И.А., Шемякин И.Г. – заявлено 21.05.2010; опубликовано 10.01.2012.

в) методические указания 5. Порядок организации и проведения лабораторной диагностики сибирской язвы для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней:

Методические указания МУ 4.2.2941-11 / А.Н. Куличенко, Е.И. Еременко, А.Г. Рязанова, О.В. Малецкая, Н.П. Буравцева, О.И. Цыганкова, Т.В. Таран, Е.А. Цыганкова, Т.М. Головинская, В.В. Кутырев, С.А. Щербакова, Ю.А. Попов, Н.А. Осина, И.Н. Шарова, Е.С. Казакова, ЕЕ.А. Плотникова, В.Е. Куклев, С.А. Портенко, С.В. Балахонов, Т.И. Иннокентьева, З.Ф. Дугаржапова, А.В. Родзиковский, Е.В. Кравец, Ю.М. Ломов, Н.Р. Телесманич, В.И. Прометной, С.Ю. Водяницкая, Н.Л. Пичурина, О.С. Бурлакова, В.Е. Безсмертный, С.М. Иванова, А.И. Верещагин, М.В. Зароченцев, В.В. Мордвинова, И.А. Дятлов, Л.И. Маринин, С.Ф. Бикетов, А.Е. Хлынцева, М.В. Храмов, А.И. Борзилов, Борисевич, Саяпина –М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора,2011. – С.1-55.

г) тезисы научных конференций 6. Хлынцева А.Е., Баранов А. М., Белова Е.В., Шемякин И.Г., Маринин Л.И., Дятлов И.А. Изучение свойств моноклональных антител для разработки иммунохроматографического стрип-теста с целью определения спор возбудителя сибирской язвы // Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников содружества независимых государств: Материалы IX Межгосударственной научнопрактической конференции государств-участников СНГ: (30 сентября – 2 октября, 2008 г., Волгоград) / Под ред. Г.Г. Онищенко, В.В. Кутырева, В.В. Алексеева. – Волгоград, 2008. – С. 140-141.

7. Хлынцева А.Е., Баранов А. М., Баранова Е.В., Белова Е.В., Миронова Р.И., Маринин Л.И., Шемякин И.Г., Дятлов И.А. Моноклональные антитела к спорам возбудителя сибирской язвы, перспективные для создания иммунохроматографической тест-системы // Диагностика, лечение и профилактика опасных и особо опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология: Материалы Всероссийской научной конференции, посвященная 80-летию со дня основания ФГУ «48 ЦНИИ МИНОБОРОНЫ РОССИИ» – Киров, 2008. – С. 147-149.

8. Хлынцева А.Е., Баранов А. М., Белова Е.В., Шемякин И.Г., Дятлов И.А.

Получение моноклональных антител для иммунохроматографического определения спор Bacillus anthracis // Биологическая безопасность в современном мире: Материалы научно-практической школы-конференции научноисследовательских учреждений Роспотребнадзора (21-22 апреля 2009 г., Оболенск, Московская обл.)/ Под ред. Г.Г. Онищенко, И.А. Дятлова. – С. 148-149.

9. Хлынцева А.Е., Белова Е.В., Дятлов И.А., Шемякин И.Г. Разработка латекс-агглютинационной тест-системы для детекции спор Bacillus anthracis // Современные технологии обеспечения биологической безопасности: Материалы научно-практической школы-конференции научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора (25- 27 мая 2010 г., Оболенск, Московская обл.)/ Под ред. Г.Г.

Онищенко, И.А. Дятлова. – С. 219-221.

10. Хлынцева А.Е., Белова Е.В., Шемякин И.Г. Усовершенствование методов индикации спор Bacillus anthracis с применением магнитных частиц с иммобилизованными моноклональными антителами // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины: Материалы Юбилейной конференции молодых ученых (СПбМАПО, Санкт-Петербург, 2010. – С. 100-101.

11. Хлынцева А.Е., Белова Е.В., Дятлов И.А., Шемякин И.Г. Разработка латекс-диагностикума на основе моноклональных антител для идентификации спор Bacillus anthracis// Молекулярная диагностика – 2010: Материалы VII Всероссийской научно-практическая конференции с международным участием (Москва, 2010 г.)/ Под ред. В.И. Покровского. – С. 448-451.

12. Хлынцева А.Е., Белова Е.В., Козырь А.В., Шемякин И.Г. Оценка диагностической значимости сконструированного сибиреязвенного латексного диагностикума для детекции вегетативной формы возбудителя сибирской язвы // Современные технологии обеспечения биологической безопасности: Материалы III Научно-практическаой школы-конференции СМУиС Роспотребнадзора (31 мая – июня 2011 г., Оболенск, Московская обл.)/ Под ред. Г.Г. Онищенко, И.А. Дятлова.

– С. 242-244.

Благодарности Приношу искреннюю благодарность научным руководителям моей кандидатской диссертации д.б.н., проф. И.Г. Шемякину (ГНЦ ПМБ) и к.б.н.

А.В. Козырь (ГНЦ ПМБ), осуществлявшим научное руководство и оказывавшим методическую помощь на всех этапах работы.

Считаю своим долгом выразить искреннюю благодарность моим соавторам, принимавшим участие в планировании и проведении экспериментов и обсуждении их результатов.

Выражаю благодарность за помощь в проведении испытаний сконструированных тест-систем сотрудникам ФГУН ГНЦ ПМБ: зав. лабораторией микробиологии сибирской язвы к.м.н. Маринину Л.И., н.с. Мироновой Р.И.;

сотрудникам ФГУЗ ВолгоградНИПЧИ зав. лабораторией иммунодиагностики и биотехнологии д.м.н., проф. Храповой Н.П., с.н.с. лаборатории сибирской язвы к.м.н. Баркову А.М., с.н.с. к.м.н. Барковой И.А.; сотрудникам ФГУЗ СтавНИПЧИ зав. научно-производственной лабораторией препаратов для диагностики особо опасных и других инфекций д.м.н., проф. Тюменцевой И.С., в.н.с. д.б.н.

Жарниковой И.В., с.н.с. к.б.н. Ждановой Е.В.; сотрудникам ФКУЗ ИркутскНИПЧИ Сибири и ДВ н.с. отдела зоонозных инфекций к.б.н. Кравец Е.В и н.с. отдела зоонозных инфекций к.б.н. Дугаржаповой З.Ф.

Приношу искреннюю признательность ведущей организации, официальным оппонентам и всем рецензентам настоящей работы за высказанные замечания, заданные вопросы и сделанные поправки, которые, по возможности были учтены.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.