WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

СКИТОВИЧ Галина Сергеевна

РАЗРАБОТКА ИММУНОФЕРМЕНТНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К  РОТА- И КОРОНАВИРУСАМ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

03.02.02 «Вирусология»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Владимир – 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), г. Владимир

Научный руководитель - кандидат биологических наук, доцент (ФГБУ «ВНИИЗЖ»)

                 Прохватилова Лариса Борисовна

Официальные оппоненты: Диев Вячеслав Иванович, доктор ветеринарных наук, профессор (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), г.Владимир

Виткова Ольга Николаевна, кандидат ветеринарных наук (ФГБУ «ЦНМВЛ»), г. Москва

Ведущая организация – Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко, г. Москва.

Защита диссертации состоится «__»__________2012 г. в ___ часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 220.015.01 при ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, г. Владимир, мкр. Юрьевец.

       

       С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» и на сайте http//www.arriah.ru.

Автореферат разослан 16 ноября 2012 г.

Ученый секретарь совета по защите

докторских и кандидатских диссертаций

ФГБУ «ВНИИЗЖ»

доктор биологических наук А.П. Пономарев

  1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1.

Актуальность темы. На протяжении многих лет животноводство всех стран мира, в том числе и России, несёт значительные экономические потери от желудочно-кишечных болезней новорожденных телят. В основе сложившейся неблагоприятной ситуации лежит целый ряд факторов, из которых наиболее важными являются: содержание большого поголовья скота на ограниченном пространстве, возникновение стрессов, усложнение микробного и вирусного пейзажа в хозяйствах и комплексах, снижение иммунитета. В этих условиях нередко возникают и быстро распространяются инфекционные болезни, проявляющиеся в виде энтеритов животных.

Рота- и коронавирусы (РВ, КВ) – занимают одно из ведущих мест в патологии желудочно-кишечного тракта новорожденных телят [1, 11].

Величина экономического ущерба при этих заболеваниях значительна и складывается из падежа телят, снижения мясной и молочной продуктивности, уменьшения привесов, выбраковки животных. Проведение своевременной и точной лабораторной диагностики является важным фактором в борьбе с этими инфекциями [13, 14].

В настоящее время при лабораторном исследовании рота-, коронавирусных инфекций широко использутся метод иммуноферментного анализа (ИФА). Быстрота получения результатов, воспроизводимость и автоматизированный учет реакции, возможность стандартизации условий постановки анализа делают этот метод наиболее эффективным и выгодным для массовых серологических исследований.

1.2. Степень разработанности проблемы. Вопросам разработки и усовершенствования тест-систем ИФА для выявления антител к РВ и КВ  посвящены работы ряда зарубежных авторов [5, 6]. Широкое распространение получили модификации ИФА на основе ELISA. Losonsky G.A. с сотр. (1990) разработали ELISA для определения уровня IgA и IgG, так как данные иммуноглобулины не передаются от матери, а вырабатываются в ответ на попадание ротавируса в организм, что дает возможность говорить о наличии заболевания у новорожденных телят, обладающих пассивно приобретенным иммунитетом в качестве IgG [8]. Lecce J.G. и сотр. (1982), Agrawal D.K. и сотр. (2002) методом непрямого ИФА (н-ИФА) определяли антиротавирусные антитела в молоке и молозиве коров, а также проводили оценку уровня колостральных антител у новорожденных телят с целью оценки иммунного статуса организма телят и изучения эпизоотической ситуации [4, 7]. В работе Myers L.L. и сотр. (1982) показана зависимость титров молозивных антител и антител в молоке коров от вакцинации живой модифицированной вакциной против рота-, коронавирусной инфекций КРС [9].

Многими зарубежными коммерческими фирмами (INGENAZA, IDEXX, Cypress, Bio X и др.) предложены тест-системы на основе н-ИФА для определения антител к РВ и КВ в сыворотках крови при исследовании их в одном разведении. Поскольку данные наборы не всегда доступны, актуальным является создание отечественных тест-систем.

1.3. Цель и задачи исследований. Цель данной работы состояла в разработке диагностических тест-систем на основе подготовленных штаммов рота-, коронавирусов КРС  для выявления антител к ним при проведении серологических исследований. Для осуществления поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) выделить и адаптировать полевые изоляты РВ КРС, циркулирующие на территории РФ, в культуре клеток;

2) изучить иммунобиологические свойства выделенных изолятов РВ КРС для возможного использования в качестве производственных штаммов;

3) отработать методы получения высокоочищенных концентрированных препаратов антигенов РВ и КВ;

4) разработать тест-системы на основе н-ИФА для определения антител к рота-, коронавирусам в сыворотках крови КРС методом одного разведения;

5) с помощью разработанных тест-систем провести исследования иммунного статуса поголовья КРС в хозяйствах РФ.

1.4. Научная новизна исследований. Выделен и адаптирован к культуре клеток новый штамм РВ КРС «ТЕ87-ДЕП», на который получен патент на изобретение. Разработаны отечественные тест-системы ИФА с применением в качестве антигенов штаммов РВ и КВ, выделенных из хозяйств РФ, для выявления и количественной оценки специфических антител к ним при тестировании сывороток крови в одном разведении.

1.5. Практическая значимость работы. Для практического применения разработаны и утверждены директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» 5 методик и методических рекомендаций, которые используются в лабораторной практике.

1.6. Соответствие диссертации паспорту научной специальности. В диссертации приведены результаты исследований по выделению, изучению биологических свойств штаммов ротавируса КРС, разработке методов выявления антител к рота-, коронавирусной инфекциям КРС, их применению для изучения иммунного статуса поголовья КРС и оценки эпизоотической ситуации в хозяйствах, что соответствует пунктам  2, 3, 6, 7, 10  паспорта специальности 03.02.02. «Вирусология».

       1.7. Апробация результатов работы. Материалы диссертации доложены и опубликованы в материалах Международных научно-практических конференций, посвященных 45-летию ФГБУ «ВНИИЗЖ» (Владимир, 2003 г.), 50-летию ФГБУ «ВНИИЗЖ» (Владимир, 2008 г.), в материалах конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины (исследования молодых учёных)»  (г. Покров Владимирской области, 2009 г., ГНУ ВНИИВВиМ), а также на заседаниях ученого совета ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2008-2010 гг.

       1.8. Публикации научных исследований. По теме диссертационной работы опубликовано 8 научных статей, в том числе 4 работы в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

1.9. Основные положения, выносимые на защиту.

- Выделение РВ КРС из проб патологического материала в перевиваемой культуре клеток;

- получение диагностических препаратов антигенов РВ и КВ КРС;

- использование разработанных тест-систем на основе н-ИФА для выявления и определения уровня антител к РВ и КВ КРС при тестировании сывороток в одном разведении;

- результаты их применения для серологического исследования сывороток крови КРС, поступивших в ФГБУ «ВНИИЗЖ» в период 2007-2011 гг.

       1.10. Структура и объем работы. Диссертация изложена на 133 страницах, проиллюстрирована 22 таблицами и 15 рисунками. Список литературы включает 187 источников, в том числе 159 – иностранных.

       Исследования по диссертационной работе выполнены в 1998-2011 гг. в лаборатории диагностики вирусных болезней КРС и свиней ФГБУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир.

1.11. Личный вклад соискателя. Основной объем исследований проведен автором самостоятельно. Отдельные этапы работы выполнены совместно с к.б.н. Дороненковой Г.Н., к.б.н. Бьядовской О.П., д.б.н. Пономаревым А.П., к.б.н. Чупиным С.А., за что автор выражает им искреннюю благодарность.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы

       Вирусы. Производственный штамм КВ КРС “ВНИИЗЖ-ДЕП”. Депонирован в коллекции «Всероссийского государственного центра качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов», патент № 2268937. Референтный штамм «NCDV» (Nebraska calf diarrheal virus). Получен из Nat. Vet. Services Laboratories, США. Полевые изоляты РВ КРС: «Собинка/10/99/В»; «Меленки»; «Юрьев/03/00». Изоляты были выделены из содержимого кишечников больных телят в 1999-2000 гг.

       Культуры клеток. Были использованы следующие перевиваемые линии культур клеток: МДВК (почки эмбриона коровы); Mark-145 (почки эмбриона макаки-резус, клон клеток МА-104); Vero (почки африканской зеленой мартышки); КГ-91 (гонады козы); ПТ (почки теленка); РК-15 (почки поросенка). Культуры клеток в виде готового монослоя получали из отдела культивирования клеток (ФГБУ «ВНИИЗЖ»).        

Животные. Для получения специфических гипериммунных сывороток в качестве доноров использовали клинически здоровых лабораторных животных:  кроликов, массой 2 – 2,5 кг и морских свинок, массой 0,4 – 0,5 кг.

       Тест-системы на основе ИФА. В работе использовали набор для выявления антител к РВ КРС в н-ИФА INGEZIM ROTAVIRUS (Ingenasa, Испания) и набор для выявления антител к КВ КРС в конкурентном варианте ИФА (Cypress, Бельгия) в соответствии к инструкциями к набору.

2.2. Методы

       Выделение РВ КРС в перевиваемой культуре клеток. Материалом для выделения РВ КРС являлись пробы фекалий и тканей кишечника больных или павших телят, которые взвешивали в чашках Петри и тщательно измельчали в фарфоровых ступках с кварцевым песком. Из измельченного материала готовили 10—20%-ную суспензию на среде Игла (рН 7,5-8,0), которую двукратно замораживали-оттаивали, после чего центрифугировали при 1000 g. Для дальнейшей работы отбирали надосадок. К полученной смеси добавляли гентамицин в концентрации 50 мкг/см3. Затем фильтровали через нитроцеллюлозные фильтры с диаметром пор 45 мкм. Полученную суспензию использовали для заражения культур клеток.

       Определение титра инфекционности РВ КРС. Инфекционную активность РВ КРС определяли методом последовательных десятикратных разведений в монослое клеток Mark-145 в пенициллиновых флаконах. Положительной реакцией считали наличие цитопатогенного действия (ЦПД) вируса. Титр инфекционности (lg ТЦД50/см3) рассчитывали по методу Рида и Менча.

Выделение вирусной РНК. Суммарную РНК из культуральной вируссодержащей суспензии выделяли по методу Грибанова О.Г. [3].

Электрофорез в агарозном геле. 10 мкл пробы, содержащей выделенную РНК, смешивали с 1 мкл буфера для нанесения проб и вносили в лунки 2% агарозного геля. Электрофорез проводили при силе тока 50 мА в течение 15-20 мин.

       Концентрирование РВ КРС. Вирусную суспензию очищали от клеточного детрита низкоскоростным центрифугированием с хлороформом и осаждали вирусные белки ПЭГом с молекулярной массой 6000 Д. Полученный после низкоскоростного центрифугирования осадок растворяли в буферном растворе ТNЕ (50 mM Tris HCl, рН 7,5; 150 mM NaCl, 5 mM ЭДТА, рН 7,4) в соотношении 1:20 и подслаивали 30% сахарозу. Осадок разводили в буферном растворе ТNЕ (в соотношении 1:100 от исходного объема).

       Определение концентрации белка. Количественное определение белка осуществляли на спектрофотометре “Shimadzu” по методу Варбурга и Христиана при длине волны 260 нм и 280 нм [2].

       Электронная микроскопия. Электронно-микроскопические исследования проводили методом негативного контрастирования при увеличении х160000 (исследование проведено совместно с д.б.н. А.П. Пономаревым).

       Получение гипериммунной сыворотки. Очищенный и концентрированный препарат вируса смешивали с масляным неполным адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1, получая водно-масляную эмульсию. Подготовленный препарат вводили кроликам подкожно в область спины в 4 точки в объеме 1-2 мл дважды с интервалом в 28 суток. Морских свинок также иммунизировали подкожно в области спины в объеме 0,3 мл с интервалом 28 суток. Пробы крови у кроликов и морских свинок отбирали до иммунизации и через 28 суток после каждой иммунизации.

       Реакция нейтрализации. Титр вируснейтрализующих антител определяли в реакции нейтрализации (РН), используя культуру клеток Mark-145 по общепринятой методике с разведением исследуемых сывороток и  постоянной дозой вируса (200 ТЦД50/см3).

       Выявление антител к РВ и КВ КРС в н-ИФА. Очищенные и концентрированные антигены РВ и КВ в КББ сорбировали в лунках полистироловых планшетов и инкубировали в течение 18 часов при 4°С. После блокирования 1% раствором лошадиной сыворотки вносили контрольные и исследуемые пробы в рабочем разведении. Связавшиеся антитела определяли добавлением иммунопероксидазных препаратов антибычьих антител. В качестве хромогена использовали субстрат АБТС. Результат учитывали, регистрируя оптическую плотность (ОП) при длине волны 405 нм. Титр антител в испытуемых пробах определяли по уравнению линейной регрессии: lg T = A + B ⋅ lg S/P, а также по формуле расчета процента позитивности (ПП): ПП= ((ИС – КО) / (КП – КО)) х 100% ,        где ИС – оптическая плотность исследуемой сыворотки, КО – оптическая плотность для отрицательного контроля, КП – оптическая плотность для положительного контроля.

       Статистический анализ материалов. Учет результатов непрямого варианта ИФА и анализ полученных данных проводили с использованием компьютерной программы «СИНКО-ИФА» (ФГБУ «ВНИИЗЖ», свидетельство о регистрации № 2000611338). Для статистической обработки данных ИФА использовали компьютерную программу Statistika: Basic Statistics and Tables, версия 4.3 (Stat.Soft, Inc., 1993).        

                       2.3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.3.1. Получение диагностического антигена РВ КРС. При анализе патологического материала, поступившего на исследование в лабораторию из хозяйств Владимирской области, где отмечены вспышки заболеваний с диарейным синдромом, при использовании ПЦР были выявлены три изолята РВ КРС, обозначенные как «Меленки», «Собинка/10/99/В», «Юрьев/03/00», относящиеся к типам G8P7, G10Р11 и G6Р5, соответственно. После проведения трех последовательных пассажей в монослойных культурах клеток выявили, что для изолятов «Меленки» и «Юрьев/03/00» чувствительной культурой клеток является МДВК, а для изолята «Собинка/10/99/В» – Mark-145. Всего на данных культурах было проведено по 10 пассажей (табл. 1).

               Таблица 1

Основные характеристики изолятов РВ КРС в процессе

адаптации к перевиваемым культурам клеток (n=5)

Пас-

сажа

Изоляты РВ КРС

«Меленки»

«Юрьев/03/00»

«Собинка/10/99/В»

Культура клеток МДВК

Культура клеток Mark-145

Время

инкубир.,ч

Титр,

lgТЦД50/см3

Время

инкубир.,ч

Титр,

lgТЦД50/см3

Время

инкубир., ч

Титр,

lgТЦД50/см3

1

-

НТ*

168

НТ

168

НТ

2

-

НТ

168

НТ

168

НТ

3

120

4,50±0,08

168

1,75 ± 0,11

168

2,25 ± 0,09

4

96

5,00±0,07

144

3,75 ± 0,14

120

2,75 ± 0,06

5

96

5,25±0,01

144

2,75 ± 0,07

120

3,25 ± 0,15

6

72

6,25±0,10

120

4,25 ± 0,09

120

3,5 ± 0,16

7

72

6,50±0,07

120

5,00 ± 0,14

96

4,5 ± 0,07

8

48

7,25±0,10

96

5,25 ± 0,09

96

5,0 ± 0,05

9

48

7,50±0,06

96

5,25 ± 0,03

96

6,25 ± 0,09

10

48

6,75±0,09

96

6,00 ± 0,08

96

5,25 ± 0,05

*НТ – не тестировали

        Для идентификации РВ в процессе выделения  в культуре клеток был использован метод электрофореза геномной РНК. Результаты этих исследований на примере изолята «Меленки» РВ КРС представлены на рис. 1.

Под действием электрического поля сегментированная РНК ротавируса мигрирует в соответствии со своей электрофоретической подвижностью и выглядит на электрофореграмме (рис. 1а) в виде 8 полос разной интенсивности. Между тем, картина, получающаяся при электрофорезе РНК из незараженной РВ культуры клеток, существенно отличается от профиля миграции РНК РВ (рис. 1б) (исследования проведены совместно с к.б.н. С.А. Чупиным).

       

Рис. 1 Электрофореграмма РНК

а РНК РВ изолята «Меленки», выделенная из опыта  на культуре клеток МДВК (цифрами обозначены сегменты ротавирусной РНК 1-11);

б клеточная РНК из незараженной РВ культуры клеток МДВК.

Все пробы наносили на стартовую линию в количестве 10 мкл.

        Таким образом, профиль миграции геномных сегментов РНК позволяет безошибочно идентифицировать РВ и тем самым подтверждать специфичность ЦПД. Геномная РНК РВ выявлялась с помощью электрофореза в 5-10 пассажах.

При подборе условий культивирования на примере изолята «Меленки» максимальное накопление вируса (6,5 lg ТЦД50/см3) отмечено через 48 ч инкубирования при заражении 3 – 4-суточного монослоя при множественности заражения 0,01 ТЦД50/клетка, предварительной обработке трипсином в дозе 33 мкг/мл и при содержании трипсина в поддерживающей среде в конечной концентрации 1 мкг/мл.

На выделенные изоляты РВ КРС и референтный штамм «NCDV» РВ КРС

получены гипериммунные специфические сыворотки. Отбор проб проводили до и через 28 суток после каждой иммунизации, сыворотку исследовали в ИФА и РН (табл. 2). На 28 день после иммунизации против всех испытуемых изолятов и штамма «NCDV» в сыворотках крови кроликов образовались специфические вируснейтрализующие антитела. Максимального значения титры антител достигли на 28 день после третьей иммунизации.

Таблица 2

Активность сывороток крови кроликов, иммунизированных изолятами  и штаммом «NCDV» ротавируса КРС (М±м), в РН и ИФА

(n=3)

Изоляты

и штаммы

Средние титры антител к ротавирусу КРС, log2

I иммунизация

II иммунизация

III иммунизация

ИФА

РН

ИФА

РН

ИФА

РН

«Меленки»

9±1

3,25±0,43

17±1

5,43±0,32

19±1

6,48±0,18

«Юрьев»

7±1

2,75±0,38

13±1

4,23±0,46

15±1

5,54±0,42

«Собинка»

7±1

2,58±0,41

11±1

3,86±0,24

13±1

4,26±0,53

«NCDV»

9±1

3,88±0,34

15±1

5,21±0,28

19±1

6,12±0,44

С целью выбора производственного штамма специфические сыворотки крови кроликов были исследованы в перекрестной РН, в которой в качестве меры «расхождения» гомо- и гетерологичных реакций используется индекс Архетти и Хорсфала [10], численно соответствующий величине отношения гетерологичного оценочного показателя к гомологичному r = хhet /xhom. Значение r рассматривается как количественная характеристика антигенного родства исследуемых штаммов вируса. Индекс R = 100%r1 x r2 – является показателем двухсторонней родственности антигенов. Выявляется значительное различие между референтным штаммом «NCDV» и изолятами в титрах между гомо- и гетерологичными сыворотками крови, что подтверждает их принадлежность к различным серотипам (табл. 3).

Таблица 3

Вируснейтрализующая активность гипериммунных сывороток крови кроликов в перекрестной РН

Специфическая сыворотка против изолятов

Титр антител против изолятов

«Меленки»

«Юрьев/03/00»

«Собинка/10/99/В»

«NCDV»

«Меленки» (G8P7)1

14548,92

НИ

НИ

5,1

«Юрьев/03/00» (G6P1)

22,62

3050,3

НИ

255,9

«Собинка/10/99/В» (G10P11)

11,3

НИ

2894,1

15,9

«NCDV» (G6P1)

7,9

2,8

1,4

5379,6

1 – серотипы изолятов ротавируса КРС;

2 - за титр антител в РН принимали величину обратную разведению;

НИ – не исследовалось.

На основании полученных данных вычислили степень антигенного родства (R) исследуемых изолятов РВ КРС с референтным штаммом «NCDV» (таблица 4).

Таблица 4

Степень антигенного родства выделенных изолятов ротавируса КРС с референтным штаммом «NCDV» в РН

Специфическая сыворотка против

изолятов и штамма «NCDV»

Вирусы (R%)

«NCDV»

«Меленки»

«Собинка/10/99/В»

«Юрьев/03/00»

«NCDV»

100

14,4

23,0

52,0

«Меленки»

14,4

100

НИ

НИ

«Собинка/10/99/В»

23,0

НИ

100

НИ

«Юрьев/03/00»

52,0

НИ

НИ

100

Примечание: НИ - не исследовалось.

Все исследуемые изоляты обладали антигенным родством по отношению к референтному штамму «NCDV». Наиболее близок к референтному штамму «NCDV» в антигеном отношении изолят «Юрьев/03/00» (R=52%). Это объясняется тем, что данный изолят и штамм «NCDV» относятся к одному G серотипу (G6). Изоляту «Меленки» присущ самый низкий уровень родства с референтным штаммом «NCDV» - 14,4%, что позволило рекомендовать данный изолят для использования в качестве диагностического антигена и депонировать во Всероссийской государственной коллекции микроорганизмов ФГБУ «ВГНКИ» под названием «ТЕ87 - ДЕП», патент № 2258738.

С целью получения препаратов РВ КРС, пригодных для использования в ИФА, очистке и концентрированию подвергали штамм «ТЕ87-ДЕП» РВ КРС, репродуцированный в культуре клеток МДВК, инфекционная активность которого на уровне 9 пассажа составила 6,75-7,0 lg ТЦД50/см3. Концентрирование вирусных препаратов проводили тремя способами:

       А. Вируссодержащую суспензию шуттелировали с 20% хлороформа в течение 10 мин, и полученную эмульсию осветляли низкоскоростным центрифугированием при 3500 g в течение 30 мин при температуре 4С. К осветленной вирусной суспензии добавляли ПЭГ-6000 и NaCl до конечной концентрации 7% и 0,3 М, соответственно. Инкубировали в течение 16-18 ч при температуре 4С. Вирусный материал центрифугировали при 7000 g в течение 30 мин при 4С. Полученный осадок ресуспендировали буферным раствором TNЕ в 1/20 от исходного объема вирусной суспензии, наслаивали на 30%-ный раствор сахарозы, приготовленном на TNЕ и центрифугировали в течение 80 мин при 70000 g. Полученный осадок ресуспендировали в TNЕ в 1/100 от исходного объема вирусной суспензии.

       В. Приготовление вирусного концентрата проводили аналогичным способом, но вместо буферного раствора TNE использовали буферный раствор TNC (50 mM Tris HCl, рН 7,5; 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2).

       С. Вируссодержащую суспензию шуттелировали с 7% хлороформа, в течение 5 мин, и полученную эмульсию осветляли низкоскоростным центрифугированием при 700 g в течение 10 мин при температуре 4С. К осветленной вирусной суспензии добавляли ПЭГ-6000 и NaCl до конечной концентрации 7% и 0,3 М, соответственно и инкубировали в течение 16-18 ч при температуре 4С. Центрифугировали при 6000 g в течение 30 мин при 4С. Полученный осадок ресуспендировали в буферном растворе ФБР (20 мМ КН2РО4, 20мМ NaHPO4, рН 7,2 – 7,4) (1/20 исходного объема) и наслаивали на 30%-ный раствор сахарозы, на буферном растворе ФБР и центрифугировали при 55000 g в течение 80 мин. Осадок ресуспендировали в буферном растворе ФБР в 1/100 от исходного объема вирусной суспензии.

Инфекционная активность полученных препаратов ротавируса составила 6,25-7,00 lg ТЦД50/см3, 8,00-8,25 lg ТЦД50/см3, 7,00-7,25 lg ТЦД50/см3 – при использовании буферных растворов TNЕ, TNC и ФБР, соответственно.

       Исследования концентрированных препаратов в ИФА показывают, что все препараты обладали практически одинаковой антигенной активностью (9-11 log2). Вероятно, это объясняется тем, что основным антигеном, детектируемым при исследовании в ИФА, является белок внутреннего капсида VP6, который преобладает по массе среди всех белков в вирионе ротавируса.

При трехкратном введении концентрированных антигенов РВ КРС, приготовленных на буферных растворах TNЕ, ТNC и ФБР, были получены гипериммунные сыворотки на кроликах с титром в РН 8–9 log2, 12-13 log2 и 11-12 log2, соответственно. Титры сывороток, полученных на все антигены, при исследовании в н-ИФА составили 17-18 log2.        

Исследования концентратов с помощью электрофореза в ПААГ позволили установить, что посторонние белки в препаратах отсутствуют. Во всех препаратах присутствовали белки с молекулярной массой 125, 94, 88 и 41 кД, что соответствует ротавирусным белкам VP1, VP2, VP3 и VP6, а в препаратах, приготовленных на буферных растворах TNC и ФБР, кроме того, наблюдались белки с молекулярной массой 60, 38 и 28 кД, что соответствует белкам ротавируса VP5, VP7 и VP8.

Концентрация белка в концентрированных препаратах, приготовленных на буферных растворах TNЕ, ТNC и ФБР составила 0,556 мг/мл, 1,74 мг/мл, 0,750 мг/мл, соответственно.

По данным ЭМ клеточных и других примесных компонентов в препаратах практически не содержалось (рис. 2). Концентраты характеризовались высоким содержанием ротавирусных вирионов. В препарате, приготовленном на буферном растворе TNЕ, вирусные скопления практически полностью состояли из однокапсидных вирионов, наряду с которыми в препарате присутствовали «пустые» капсиды. В приготовленном на буферном растворе  TNC препарате превалировали двухкапсидные вирионы с внешним капсидом в виде тонкого ободка, окружающего частицы. Часть вирионов, содержащихся в препаратах, приготовленных с использованием буферного раствора ФБР, также была лишена внешнего капсидного слоя.

       

А Б  В

Рис. 2 Концентрированные препараты ротавируса КРС.

А. Препарат, приготовленный с использованием буферного раствора TNE.

Б. Препарат, приготовленный с использованием буферного раствора TNC.

В. Препарат, приготовленный с использованием буферного раствора ФБР.

       Таким образом, в результате проведенных работ получили очищенные и концентрированные препараты ротавируса КРС, которые могут быть использованы в качестве антигена в ИФА, а также для получения специфических гипериммунных сывороток при диагностике ротавирусной инфекции.                

       3.2. Получение диагностического антигена КВ КРС. Штамм «ВНИИЗЖ-ДЕП» коронавируса КРС, адаптированный к перевиваемой монослойной культуре клеток RBT (почка теленка), для исследовательских работ был любезно предоставлен доктором ветеринарных наук, профессором Мищенко В.А. (Лаборатория болезней КРС, ФГБУ «ВНИИЗЖ»).

       Для получения антигена КВ КРС использовали метод осаждения ПЭГом в присутствии  NaCl с дальнейшим низкоскоростным центрифугированием очисткой через мембрану  «millipor» c диаметром пор 0,45 мкм. Дальнейшее концентрирование осуществляли методом ультрафильтрации на установке типа ФМ-02-1000 с использованием полупроницаемой мембраны УАМ-450 с диаметром пор 50 нм. В результате был получен 200х кратный концентрат КВ КРС, который был использован в дальнейшей работе. Активность полученного антигена в ИФА составила 1:800.

3.3. Разработка н-ИФА для выявления антител к РВ КРС при исследовании сывороток крови в одном разведении. Разработка метода включала в себя определение оптимального разведения сыворотки, допустимых величин оптических плотностей (ОП) контрольных сывороток и позитивно-негативного порога (ПНП).

Для преобразования значения ОП, измеренной в отдельном разведении сыворотки в титр антител применяли метод регрессионного анализа. При определении оптимального разведения сыворотки предварительно в н-ИФА методом последовательных разведений тестировали пробы с различным уровнем антител к РВ (246 сывороток). Для разведений 1:80, 1:160 и 1:320 вычисляли значения S/P по формуле S/P = (ИС – КО) / (КП – КО), где ИС – оптическая плотность исследуемой сыворотки, КО – оптическая плотность для отрицательного контроля, КП – оптическая плотность для положительного контроля. Далее рассчитывали коэффициент корреляции (R) и строили график регрессии для каждого разведения. Наиболее высокий коэффициент корреляции (r=0,9326) получили в разведении 1:160. Найти значение титра можно по калибровочной кривой (рис. 3). Уравнение линейной регрессии числового значения титров, исходя из значений оптической плотности, имело вид: lgT = 2,6453 + 1,8750 lg S/P. При определении допустимых величин оптической плотности контрольных сывороток в разведении 1:160, было показано, что наиболее приемлемыми значениями являются: для положительного контроля - от 0,388 до 0,720 о.е., для отрицательного контроля – от 0,064 до 0,170 о.е.

ПНП реакции рассчитали по методу D.B. Snyder [12]. Сумма среднего значения S/P и двух стандартных отклонений явилась верхней границей отрицательных, а сумма среднего и трех стандартных отклонений – нижней границей положительных значений. Было протестировано 80 заведомо отрицательных сывороток крови, для которых рассчитывали среднее значение S/P сывороток (0,335), и стандартное отклонение (0,045).

Рис. 3. Зависимость lg T (титра) от lg S/P для разведения сыворотки 1:160

Для определения пороговых титров значения S/P, полученные при определении ПНП реакции, подставляем в уравнение линейной регрессии: lgTотр.= 2,6453+1,8750* lg(0,335+0,090); Тотр =88. lgTпол.= 2,6453+1,8750* lg(0,335+0,135); Тпол. =107. С учётом того, что ошибка метода находится в пределах одного разведения, т.е. Т/2<Т<2Т, получили пороговые значения титров антител: если величина Т ≤ 88, то результат отрицательный; если величина 88 < Т < 214, то результат сомнительный; если величина Т ≥ 214, то результат положительный.

В случае, когда качественную сторону результатов реакции определяют по значению величины (S/P), получаем: для отрицательного результата (S/P)≤0,45; для положительного результата (S/P)≥0,60; для сомнительного результата 0,45<(S/P)<0,60.

Результаты, полученные с помощью разработанного нами метода сравнили с результатами, полученные при использовании набора Ingezim rotavirus (INGENASA, Испания, Se=1, Sp=1). Исследовали сыворотки крови КРС с различным уровнем антител к РВ в количестве 61 пробы. Результаты тестирования не совпадали  с набором Ingezim rotavirus в двух случаях. Относительные чувствительность и специфичность разработанного ИФА составили 95,3% и 94,4%, соответственно, совпадаемость результатов 95,1%.

3.4. Разработка непрямого варианта ИФА для выявления антител к КВ КРС при исследовании сывороток крови в одном разведении. Разработку метода проводили аналогично как для РВ КРС. Предварительно в н-ИФА методом последовательных разведений тестировали пробы с различным уровнем антител к КВ КРС(174 сыворотки). Затем для разведений 1:80, 1:160 и 1:320 вычисляли значения S/P по формуле S/P  = (ИС – КО) / (КП – КО). Далее рассчитывали коэффициент корреляции (R) и строили кривую регрессии для каждого разведения.

Наиболее высокий коэффициент корреляции (r=0,9029) получили в разведении 1:160. Значение титра находили по калибровочной кривой (рис. 4). Уравнение линейной регрессии числового значения титров, исходя из значений оптической плотности, имело вид: lgT=2,7311+1,3899*lgS/P.

Рис. 4. Зависимость lg T (титра) от lg S/P для разведения сыворотки 1:160

При определении допустимых величин ОП контрольных сывороток в разведении 1:160, было показано, что наиболее приемлемыми значениями являются: для положительного контроля - от 0,400 до 0,846 о.е., для отрицательного контроля – от 0,076 до 0,194 о.е.

ПНП реакции рассчитали по методу D.B. Snyder [12]. Тестировали 70 сывороток крови, не имеющих антител к КВ КРС. Рассчитывали среднее значение S/P сывороток (0,098), прибавляя удвоенное стандартное отклонение (0,057).  ПНП, полученный в виде прямой, отражал верхнюю границу отрицательных значений (0,220), а S/P, соответствующая наименьшему положительному значению, равна 0,440.

Для определения пороговых титров подставляем значения S/P, полученных при определении ПНП реакции в уравнение линейной регрессии: lgTотр.= 2,7311+1,3899* lg(0,098+0,114); Тотр =62. lgTпол.= 2,7311+1,3899* lg(0.098+0.171); Тпол. =86.

С учётом того, что ошибка метода находится в пределах одного разведения, т.е. Т/2<Т<2Т, пороговые значения титров антител, полученные на основе статистического анализа: если величина Т≤62, то результат отрицательный; если величина 62<Т<72, то результат сомнительный; если величина Т≥172, то результат положительный.

В случае, когда качественную сторону результатов реакции определяют по значению величины (S/P), получаем: для отрицательного результата (S/P)≤0,22; для положительного результата (S/P)≥0,44; для сомнительного результата 0,22<(S/P)<0,44.

Сравнение полученных нами результатов с данными исследования с помощью набора Cypress Coronavirus (Cypress Diagnostics, Belgium, Se=1, Sp=1) показало, что при тестировании 80 сывороток крови КРС с различным уровнем антител к КВ, результаты тестирования совпадали с набором Cypress Coronavirus в 98,7% случаев. Относительные чувствительность и специфичность разработанного ИФА составили 100% и 94,4%, соответственно.

3.5. Исследование сывороток крови КРС, поступивших на анализ в ФГБУ «ВНИИЗЖ» на наличие антител к рота-, коронавирусам КРС. За период 2007-2011 гг. с использованием разработанных диагностических тест-систем проведено исследование 2495 полевых образцов сывороток крови КРС на наличие антител к РВ КРС, из которых 43,1% (1075 животных) были серопозитивными к возбудителю ротавирусной инфекции, а исследования 1344 проб сыворотки крови КРС, поступивших из хозяйств РФ, на наличие антител к КВ КРС показали, что 67,7% (910 животных) были серопозитивными к возбудителю коронавирусной инфекции.

При анализе частоты встречаемости антител к РВ и КВ в сыворотках крови КРС, были исследованы 300 сывороток крови КРС различных половозрастных групп из 14 хозяйств 6 областей, относящихся к 4 федеральным округам РФ, не проводивших вакцинацию против данных заболеваний. Все сыворотки крови были исследованы одновременно на обе инфекции. Результаты представлены на рис. 5.

Рис. 5. Сыворотки крови из хозяйств, не проводивших вакцинацию  против рота- и коронавирусов КРС. 1 пробы, содержащие антитела только к коронавирусу; 2 пробы, содержащие антитела только к ротавирусу; 3 пробы, содержащие антитела к рота- и к коронавирусам; 4 пробы, не содержащие специфических антител к рота- и коронавирусам.

3.6. Изучение гуморального иммунитета к рота- и коронавирусам с применением разработанных тест-систем. Исследованы пробы сывороток крови КРС, присланные в 2007-2011 гг. из 20 хозяйств РФ, относящихся к 4 федеральным округам РФ, не проводящих вакцинацию против рота-, коронавирусной инфекций. Все пробы были разделены по возрастным группам: коровы, нетели, телята различных возрастов и новорожденные телята, не получавшие молозиво (табл. 5).

Полученные данные подтвердили результаты проведенных ранее исследований о том, что к трехнедельному возрасту у телят полностью исчезают материнские антитела к РВ и КВ, уровень которых в суточном возрасте был на максимальном уровне. До пятой недели антитела отсутствуют, затем начинается их постепенный прирост. Анализ результатов выявил наличие общей тенденции к нарастанию титров антител к 90 дням.

Таблица 5

Результаты н-ИФА по выявлению антител к РВ и КВ в сыворотках крови животных КРС разного возраста,  (n=320)

Хар-ка

группы

Ротавирус КРС

Коронавирус КРС

Кол-во

проб

В том числе,

серопозитивных

Среднее значение S/P

Кол-во

проб

В том числе,

серопозитивных

Среднее значение S/P

проб

%

проб

%

Коровы

71

56

78,0

0,93 ± 0,63

65

51

78,5

0,84 ± 0,39

Нетели

78

35

44,8

0,71 ± 0,39

80

35

43,7

0,62 ± 0,45

Телята 3-6 мес.

31

9

29,1

0,64 ± 0,45

51

32

62,7

0,53 ± 0,26

Телята 1-3 мес.

27

3

11,1

0,32 ± 0,15

34

5

14,7

0,29 ± 0,15

Телята 14-30 дн.

23

5

21,7

0,38 ± 0,18

15

2

13,3

0,24 ± 0,18

Телята 5-10 дн.

36

11

30,6

0,62 ± 0,38

26

8

30,7

0,52 ± 0,39

Телята 1-5 дн.

30

14

46,7

0,68 ± 0,33

21

12

42,8

0,62 ± 0,32

Новорожденные

24

0

0

0,16 ± 0,10

28

0

0

0,10 ± 0,05

3.7. Оценка антигенной активности вакцин против РВ производства ФГБУ «ВНИИЗЖ». Изучение иммунобиологических свойств, антигенной активности и проведение технологического контроля на различных этапах производства вакцин,  предполагает определение уровня специфических антител в сыворотках крови лабораторных животных (в частности, кроликов). Наиболее оптимальным методом, который может быть использован для оценки уровня специфических антител в сыворотках крови, является н-ИФА. Разработанная нами тест-система по определению антител к РВ в сыворотках крови КРС была модифицирована и оптимизирована в «Методические рекомендации по выявлению антител к ротавирусу крупного рогатого скота в сыворотках крови лабораторных животных в непрямом варианте иммуноферментного анализа». Результаты контроля различных серий инактивированных вакцин против РВ КРС в период 2010-2011 годов в н-ИФА имеют выраженную специфичность и совпадают с результатами, полученными с помощью коммерческого теста INGEZIM ROTAVIRUS (Ingenasa, Испания) и РН.

4. Выводы

  1. Выделены и адаптированы к перевиваемой культуре клеток  три полевых изолята ротавируса КРС от больных телят, изучены биологические свойства выделенных изолятов, подготовлен производственный штамм ротавируса КРС.
  2. Штамм ротавируса КРС «ТЕ87-ДЕП» депонирован в коллекции штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВГНКИ» и рекомендован для использования при разработке и изготовлении средств диагностики ротавирусной инфекции КРС.
  3. Для получения специфических антигенов отработан способ очистки и концентрирования ротавируса КРС хлороформом и ультрацентрифугированием путем наслаивания на 30%-ный раствор сахарозы.
  4. Разработанная методика определения титра антител к ротавирусу в сыворотках крови КРС в непрямом варианте ИФА при тестировании проб в одной разведении является воспроизводимой, показала достаточно высокий уровень относительной чувствительности (95,3%) и относительной специфичности (94,4%) и может быть использована для проведения серологических исследований в хозяйствах.
  5. Разработанная методика выявления антител к коронавирусу в сыворотках крови КРС в непрямом варианте ИФА при тестировании проб в одном разведении является воспроизводимой. Она показала уровень относительной чувствительности (100%) и относительной специфичности (94,4%) и может использоваться для проведения серологических исследований в хозяйствах.
  6. Исследования 2466 проб сыворотки крови КРС, поступивших из 32 регионов РФ, на наличие антител к ротавирусам показали, что 43,1% были серопозитивными к возбудителю ротавирусной инфекции, а исследования 1344 проб сыворотки крови КРС, поступивших из 27 регионов РФ, на наличие антител к коронавирусам показали, что 67,7% были серопозитивными к возбудителю коронавирусной инфекции. Полученные результаты свидетельствуют о широком распространении этих болезней среди КРС и о необходимости выявления их с помощью разработанных диагностических методов.

5. Практические предложения

       На основании результатов экспериментальных исследований по теме диссертации для практического использования предлагаются:

Производственный штамм ротавируса КРС (Патент 2258738 Российская Федерация, МПК -7 C12N 7/00 Штамм № "ТЕ87" Rotavirus крупного рогатого скота серотипов G8P7 для изготовления диагностических препаратов / 2258738, П. К. Аянот, Г. Н. Дороненкова, Л. Б. Прохватилова, С.А. Чупин, А.П. Пономарев, А.М. Тимина, Г.С. Скитович; ФГБУ "ВНИИЗЖ". - № 2003136945/13; Заявл. 24.12.2003; Опубл. 20.08.2005, Бюл. № 23) для изготовления средств диагностики ротавирусной инфекции КРС;

«Методика концентрирования и очистки ротавируса крупного рогатого скота» (ФГБУ «ВНИИЗЖ», 2002 г.);

«Методика определения титра антител к коронавирусу в сыворотках крови крупного рогатого скота иммуноферментным методом» (ФГБУ «ВНИИЗЖ», 2007 г.);

«Методика выявления антител к ротавирусу крупного рогатого скота в непрямом варианте иммуноферментного анализа при тестировании проб в одном разведении» (ФГБУ «ВНИИЗЖ», 2007 г.);

«Методические рекомендации по выялению антител к коронавирусу КРС в непрямом варианте иммуноферментного анализа при тестировании проб сывороток крови в одном разведении» (ФГБУ «ВНИИЗЖ», 2010 г.);

«Методические рекомендации по выявлению антител к ротавирусу крупного рогатого скота в сыворотках крови лабораторных животных в непрямом варианте иммуноферментного анализа» (ФГБУ «ВНИИЗЖ», 2010 г.).

Разработанные методические рекомендации используются в лабораторной практике при проведении исследований сывороток крови.

6. Список работ, опубликованных по теме диссертации

  1. Оптимизация условий очистки и концентрирования ротавируса крупного рогатого скота / С.А. Чупин, Г.С. Скитович, Г.Н. Дороненкова и др. // Актуальные проблемы инфекционной патологии жив-х : Матер. Междунар. науч. конф., посвященной 45-летию ФГУ «ВНИИЗЖ». – Владимир, 2003. – С. 446-450.
  2. Выделение и характеристика изолятов ротавируса крупного рогатого скота / Г.С. Скитович, Г.Н. Дороненкова, С.А. Чупин, Л.Б. Прохватилова // Ветеринарная патология. – 2006. - №4 – С. 170-172.
  3. Электронно-микроскопические исследования особенностей строения вирионов ротавируса крупного рогатого скота / А.П. Пономарев, Г.С. Скитович, Г.Н. Дороненкова и др. // Вестник РАСХН. – 2005. - №4. – С. 40-42.
  4. Разработка непрямого варианта иммуноферментного анализа для определения антител к ротавирусу в сыворотках крови крупного рогатого скота методом одного разведения / Г.С. Скитович, О.П. Бьядовская, Л.Б. Прохватилова // Ветеринарная патология. – 2007. - №4(23). – С. 45-48.
  5. Методические указания по выявлению антител к ротавирусу крупного рогатого скота в непрямом варианте иммуноферментного анализа при тестировании проб в одном разведении / Г.С. Скитович, О.П. Бьядовская, Л.Б. Прохватилова // Методические указания по диагностике заболеваний с.-х. жив-х и птиц с использованием серологических реакций. Часть 2 (ФГУ «ВНИИЗЖ). – Владимир, 2008. – С. 35-41.
  6. Методические указания по определению титра антител к коронавирусу в сыворотках крови крупного рогатого скота иммуноферментным методом / Г.С. Скитович, О.П. Бьядовская, Л.Б. Прохватилова // Методические указания по диагностике заболеваний с.-х. жив-х и птиц с использованием серологических реакций. Часть 2 (ФГУ «ВНИИЗЖ). – Владимир, 2008. – С. 41-47.
  7. Иммунобиологическая характеристика изолята ротавируса крупного рогатого скота / О.Н. Окулова, С.А.Чупин, Г.С. Скитович, В.А. Мищенко // Рос. вет. журн. с.-х. животных. Спец. вып., посвящ. 50-летию ФГУ «ВНИИЗЖ». – 2008. – Сент. – С. 39-40.
  8. Непрямой вариант иммуноферментного анализа для выявления антител к коронавирусу в сыворотках крови крупного рогатого скота методом одного разведения / Г.С. Скитович, О.Г. Андреева, Л.Б. Прохватилова // Актуал. пробл. инфекц. патологии вет. медицины: материалы Междунар. науч.-практ. конф. – Покров, 2009. – С. 106-110.

7. Список литературы

  1. Вирусные гастроэнтериты смешанной этиологии и их профилактика / А.И. Собко, Ф.С. Вабишевич, В.Н. Ткацкая [и др.] // Вопросы вет. вирусологии, микробиологии и эпизоотологии: материалы науч. конф. - Покров, 1992. - Ч.1. - С.154-155.
  2. Практическая химия белка / под ред. А.Дабре. – М.: Мир, 1989. – 623c.
  3. Простой метод выделения и очистки РНК / О.Г. Грибанов, А.В. Щербаков, Н.А. Перевозчикова [и др.] // Биоорганическая химия. - 1997. - Т.23,№9. – С. 763-765.
  4. Agrawal D.K., Singh N.P., Chauhan R.S.  Colostral antibodies against rotavirus infection in neonatal calves // J. Immunology and Immunopathology. - 2002. – Vol. 4. - P. 107–109.
  5. Development, Characterization, and Diagnostic Applications of  Monoclonal Antibodies against Bovine Rotavirus / Y. Al-Yousif, F. Al-Majhdi, C. Chard-Bergstrom [et al.] // Clin. Diagn. Lab. Immunol. – 2000. – Vol. 7, №2. – P.288-292.
  6. Development of monoclonal antibody ELISA for simultaneous detection of bovine coronavirus, rotavirus serogroup A, and Escherichia coli K99 antigen in feces of calves / C.J. Thorns, M.M. Bell, D. Chasey, J. Chesham // Am. J. Vet. Res. – 1992. – Vol. 53, №1. – P. 36-43.
  7. Lecce J.G., King M.W. Rotavirue antibodies in cow's milk // Canad. J. Соmр. Med. – 1982.  - Vol. 46, № 4. - P. 434 – 436.
  8. Losonsky G.A., Reymann M. The immune response in primary asymptomatic and symptomatic rotavirus infection in newborn infants // J. Infect. Dis. – 1990. – Vol. 161. – P. 330–332.
  9. Myers L.L., Snodgrass D.R. Colostral and milk antibody titres in cows viccinated with a modified live-rotavirus-coronavirus vaccine // J. Am. Vet. Med. Assos. – 1982. – Vol. 181. – P.486-488.
  10. Persistent antigenic variation of influenza A viruses, after incomplete neutralization in vivo with heterologie immune serum / G. Archetti, L. Franc, F.L. Horsfall // J. Exp. Ved. – 1950. - №5. - P. 441-462.
  11. Prevalence of bovine group A rotavirus shedding among dairy calves in Ohio / A. Lucchelli, S.E. Lance, P.B. Bartlett [et al.] // Am. J. Vet. Res. – 1992. – Vol. 53. – P. 169-174.
  12. Rapid serorogical profiling by enzyme-linked immunosorbent assay. 2. Comparison of computation methods for measuring antibody titers in a single serum dilution / D.B. Snyder, W.W. Marquardt, E.T. Mallison [et al.] // Avian Diseases. – 1982. – V.27, №2. – Р. 474-484.
  13. Rotavirus and coronavirus prevalence in healthy calves and calves with diarrhea / S.O. Gumusova, Z. Yazici, H. Albayrak // Medycynica Weterynaryjna. - 2007. – Vol. 63. – P. 6 –64.
  14. Steele A.D., Geyer A. Gerdes G.H. Rotavirus infections // Infectious diseases of Livestock / eds: J.A.W. Coetzer, R.C. Tustin - Oxford University Press, Southern Africa, 2004. – P. 1256–1264.

Список обозначений и сокращений

АБТС – 2,2’-азино-ди[3-этил]бензотиазолинсульфоновая кислота

ИФА – иммуноферментный анализ

КББ – карбонатно-бикарбонатный буфер

КВ – коронавирус

КО – оптическая плотность отрицательной контрольной сыворотки

КП – оптическая плотность положительной контрольной сыворотки

КРС – крупный рогатый скот

МДВК - перевиваемая линия культуры клеток почки эмбриона коровы

Н-ИФА – непрямой вариант иммуноферментного анализа

ОП – оптическая плотность

ПНП – позитивно-негативный порог

ПЦР – полимеразная цепная реакция

ПЭГ – полиэтиленгликоль

РВ – ротавирус

РН – реакция нейтрализации

ЦПД – цитопатическое действие

ЭМ – электронная микроскопия

Mark-145 - перевиваемая линия культуры клеток почки эмбриона макаки-резус

Se – относительная чувствительность тест-системы

Sp– относительная специфичность тест-системы

__________________________________________________________________

Подписано в печать 16 ноября 2012

Формат 60х90/16. Усл. печ. л.1. Тираж 80 экз.

Полиграфическая база ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»







© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.