WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

  на правах рукописи

Марзанова Саида Нурбиевна 

Разработка генодиагностики комплекса аномалий позвоночника [CVM] и иммунодефицита[BLAD]

у животных  черно-пестрого голштинизированного скота

03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

  диссертации на соискание  ученой степени

кандидата биологических  наук

Москва - 2012

Работа выполнена в ФГБОУ «Московская государственная академия­ ветеринарной медицины и биотехнологии ­имени­­ К.И. Скрябина» (ФГБОУ ВПО МГАВМиБ).

Научный руководитель: доктор биологических  наук, профессор,

  член-корреспондент Россельхозакадемии

  Девришов Давудай Абдулсемедович

Официальные оппоненты: Букова Наталья Константиновна - доктор биологических  наук, ФГБУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов», ученый секретарь;

Иолчиев Байлар Садраддин Оглы - доктор биологических наук,

ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства» РАСХН, ведущий научный сотрудник отдела биотехнологии, лаборатории репродуктивной криобиологии.

Ведущая организация: ФГБОУ «Российская академия менеджмента в животноводстве».

Защита  диссертации  состоится  "___"_________  2012 г.  в  "___" часов на заседании диссертационного совета Д.220.042.01  при ФГБОУ ВПО «Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина», по адресу: 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, 23. Телефон: 8 (495) – 377 – 93 – 83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина».

Автореферат разослан "___"________  2012 года и размещен на сайте htt://www.vak.ed.gov.ru

Ученый секретарь

диссертационного совета,

профессор  Грязнева Т.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время у крупного рогатого скота описано около 60 наследственных забо­леваний, которые выявляются на уровне ДНК [ICAR Guidelines, 2011]. Они вызывают морфологические и функциональные аномалии, негативно влияют на здоровье и продуктивность животного. Точность диагностики комплекса аномалий позвоночника [CVM] и дефицита лейкоцитарной адгезии [BLAD] значительно повысилась  благодаря установлению генетической природы данных молекулярных болезней [Agerholm et al., 2001; Яковлев А.Ф. и др., 2004; Eggen A. et al., 2004; Oguni T. et al., 2004; Марзанов Н.С. и др., 2006; Rusc A., Kaminski S., 2007; Калашникова Л.А., 2010]. В развитых странах Европы и Северной Америки созданы специальные про­граммы по элиминации мутантных CV и BL аллелей в популяциях черно-пестрой породы [Czarnik U. et al., 2007; Schutz E. et al., 2008]. В России выдающихся производителей и ре­монтный молодняк также проверяют на носительство мутантных аллелей, а ре­зультаты регулярно публикуют в каталогах по племенным быкам [Попов Н.А. и др., 2004; Савенко Н.А. и др., 2007; Ескин Г.В., 2010].

Для формирования здорового племенного и высокопродуктивного поголовья животных важной задачей ветеринарных врачей и специалистов по племенному делу является своевременная диагностика и искоренение источника, вызывающего генетически обусловленных заболеваний. Знание молекулярной структуры, определение гетерозиготного носителя и мутанта, является основой для эффективной борьбы с наследственным заболеванием в связи, с чем данная работа имеет важное научное и практическое значении.

Цель и задачи исследований. Целью данной работы явилась разработка комплексной диагностики CV и BL мутаций у крупного рогатого скота чёрно-пестрого генеалогического корня и генетическая оценка родословных быков-производителей-носителей по данным аллелям.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести сравнительный анализ и определить оптимальный режим выделения ДНК для  проведения ПЦР на CVM и BLAD.

2. Дать характеристику голштинизированной чёрно-пёстрой популяции крупного рогатого скота по частотам встречаемости мутантных CV и BL аллелей.

3. Дать характеристику генетической генеалогии быков-производителей носителей CV и BL аллелей.

4. Изучить геногеографию CV и BL мутаций у животных из различных регионов Российской Федерации и за рубежом. 

Научная новизна. Впервые методом ПЦР-РВ разработана одновременная генодиагностика комплексной аномалии позвоночника [CVM] и дефицита лейкоцитарной адгезии [BLAD] у черно-пестрого скота с кровностью голштинской породы. Проведен анализ генограммы родословных линий черно-пестрого голштинизированного скота по CV и BL аллелям. Геногеографический анализ показал степень распространения миссенс-мутаций в мире и  России. Носителями CV и BL аллелей в России явились быки-производители и семя, полученное от импортированного из Германии, Канады и США скота. Они являются прямыми потомками  лидеров голштинской породы Осборндейл Айвенго 1189879, П. Айвенго Стар  1441440 и Карлин М. Айвенго Белла 1667366. Все три элитных быка принадлежат к знаменитой линии Монтвик Чифтейн 95679.

В стадах черно-пестрого голштинизированного скота установлены четыре группы животных: первая, носители только BL, вторая – CV, третья - обеих мутаций, четвертая - неносители. Больше всего мутантных аллелей выявлено у племенных коров, чем у быков, это указывает на то, что коровы являются своеобразным резерватом, т.е. хранителями мутантных аллелей в стаде.  Мутации CV и BL аллелей выявлены в 6 из 9 регионов России, (Московская, Кировская, Ленинградская, Смоленская области, Кабардино-Балкарская Республика). Носительство CV/BL редко встречается, оно было установлено только у одного быка.

Практическая значимость работы. Предложены рекомендации по купированию распространения мутаций, вызывающих BLAD и CVM в Российской Федерации. В основу зоотехнического и ветеринарного консультирования специалистов хозяйств положено проведение аттестации быков-производителей, ремонтных бычков, быковоспроизводящих групп коров, закупаемого семя и эмбрионов. Наличие генетического паспорта на закупаемую племенную продукцию позволит эффективно вести селекционную работу в стадах.

Личный вклад соискателя. Автор принимала непосредственное участие в разработке генной технологии по выявлению мутантных аллелей, вызывающих CVM и BLAD. Ей принадлежит осуществление исследований по разработке одновременной генодиагностики CV и BL мутаций, а также анализ и интерпретация полученных результатов.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы обсуждались на заседаниях кафедры иммунологии и Ученого совета ФГБОУ ВПО МГАВМиБ [Москва, 2009-2012]. Часть полученных материалов диссертации была представлена в трудах VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика – 2010» под редакцией академика РАМН В.И. Покровского [Москва, 2010], научно-практической конференции, прошедшей под эгидой ОАО «ГЦВ СЖ» МСХ РФ и ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии [Быково, 2011] и в материалах международной научно-практической конференции на тему: «От теории к практике: вопросы современной ветеринарии, биотехнологии и медицины» [Саратов, 2011].

Публикации. По результатам исследований опубликовано 5 научных работ, в т.ч. 4 – в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки России.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, практического использования полученных научных результатов, рекомендации по использованию научных выводов, библиографии. Материал  изложен на 142 страницах машинописного текста,  содержит 11 таблиц и 22 рисунка. Библиография включает 234 источника, в том числе 163 на иностранных языках.

Основные положения и результаты, выносимые на защиту: 

- Результаты разработки метода комплексного выявления мутантных CV и BL аллелей.

- Генетико-генеалогический анализ выдающихся быков-производителей-носителей мутантных CV и BL аллелей.

- Распространение миссенс-мутаций CV и BL среди высокопродуктивных коров.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводили с 2009 по 2012 годы на кафедре иммунологии  ФГБОУ ВПО МГАВМиБ и ЗАО «Синтол» по схеме, представленной на рис.1. ДНК выделяли из семени быков и крови коров с помощью фенольно-хлороформного и сорбентного (ДНК-сорб-В, ООО «ИнтерЛабСервис») методов. Выделенную ДНК исследовали по аллелям двух наследственных заболеваний: комплекса аномалий позвоночника [CVM] и дефицита лейкоцитарной адгезии [BLAD]. Диагностику мутантного BL аллеля, вызывающую дефицит лейкоцитарной адгезии или BLAD  осуществляли по методике, изложенной в работах Shuster D.E. et al. [1992] и Tammen  I. [1994]. В качестве праймеров для диагностики мутантного BL аллеля использовали следующие последовательности: 

BLAD forward: 5’ – GTC AGG CAG TTG GGT TCA – 3’

BLAD reverse: 5’ –  GAG GTC ATC CAC CAT CGA GT – 3’.

Что касается диагностики мутантного CV аллеля комплекса аномалий позвоночника [CVM], то она осуществлялась по методу, описанному Rusc A., Kaminski S. [2007]. В качестве праймеров использовали следующие последовательности:

CVM forward: 5’ –  TCA GTG GCC CTC AGA TTC TC – 3’ 

CVM reverse: 5’ –  CCA AGT TGA ATG TTT CTT ATC CA –  3’.

Исследовали быков-производителей (n=474) и быковоспроизводящих групп коров (n=127)  черно-пестрой породы с разной кровностью  по голштинской черно-пестрой породе. Аттестация быков и коров на носительство мутантных CV и BL аллелей. Определение частоты встречаемости аллелей и генотипов в локусах SLC 35A3 и CD 18, оценка генетического равновесия по локусам двух наследственных болезней. Генетико-генеалогический  анализ происхождения быков, носителей мутантных CV и BL аллелей. Геногеографический анализ носительства CV и BL в Российской Федерации и за рубежом

Рис. 1. Общая схема исследований

Разработку методики ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) для одновременной диагностики CV и BL проводили на приборе Rotor Gene Q (Corbett Research, Австралия). Изучали генетические параметры: частоты встречаемости аллелей, генотипов, наличие генетического равновесия в изучаемых локусах методом 2.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Сравнительный анализ методов выделения ДНК из различных материалов. Проведённый сравнительный анализ различных методов выделения ДНК показал, что каждый метод имеет как свои преимущества, так и свои недостатки. Фенольно-хлороформовый метод позволяет выделять высоко очищенную ДНК хорошего качества, однако требует больших затрат времени, а также использования вредного для здоровья реагента фенола. Тем не менее, получаемая таким способом ДНК высокого качества и она может храниться длительное время. Данный метод хорош при создании Банков ДНК, требующих их длительного хранения.

Оптимальным для нашей работы является сорбентный метод выделения ДНК (ДНК-сорб-В, ООО «ИнтерЛабСервис»). Он обладает технической простотой и позволяет экономить время, не прибегая к трудоемкой процедуре фенольной экстракции. Однако качество и стабильность препаратов в целом заметно ниже, чем фенольно-хлороформных экстрактов. Сорбентный метод удобен в том случае, если препарат выделенной ДНК не нужно хранить долгие годы. Очищенную ДНК можно хранить в течение одной недели при температуре от 2 до 8°С в обычном бытовом холодильнике, в течение года при температуре не выше минус 16°С. Поэтому для дальнейшей работы был выбран сорбентный метод для выделения ДНК.

Диагностика миссенс-мутаций CV и BL у крупного рогатого скота методом ПЦР-РВ. Исследованиями на CV и BL мутаций был охвачен 601 образец семени и крови, из них 474 - от быков и 127 от коров. ПЦР-РВ проводили на приборе Rotor Gene Q [Corbett Research, Австралия]. Использовали программу термоциклирования, приведенную в табл. 1. В табл.1 представлены стадии проведения ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). Удержание дает команду прибору оставаться при определенной температуре в течение заданного времени (180 сек., повтор 1).

Табл. 1. Характеристика параметров термоциклирования для диагностики мутантных аллелей, вызывающих комплексную аномалию позвоночника (CVM) и дефицит лейкоцитарной адгезии (BLAD)

Шаги

Температура, 0С

Время, сек

Детекции

Повторы

Удерживание температуры

94

180

Нет

1

Циклирование 1

94

20

Нет

10

61

20

Нет

64

30

Нет

Циклирование 2

94

20

Нет

30

61

20

Нет

64

30

по каналам: Green, Yellow, Orange, Red

В процессе циклирования происходит денатурация, отжиг праймеров и синтез новой цепи ДНК. При циклировании 1 повторов 10, они не детектируются, так как данные не репрезентативны. При циклировании 2  - повторов 30, в результате получаемые данные стабильные и являются окончательными в плане диагностики. Реакционная смесь имела следующий состав: 50 мМ KCl, 50 мM TRIS-HCl, 250 нМ dNTP, 2,5 мМ MgCl2, 2,5 ед. ДНК-полимеразы Syntaq. Праймеры использовали в концентрации 200 нМ, флуоресцентные зонды – в концентрации 100нМ.

Следующим этапом являлась разработка системы для выявления мутантных аллелей методом ПЦР-РВ. Мы применили аллельспецифические зонды для детекции BL и CV мутаций. Для локуса с мутацией подбирали пару зондов, так чтобы один из них специфически гибридизовался при температуре проведения синтеза цепей с аллелем нормального типа, а второй зонд – с аллелем мутантного типа. Эти зонды метили разными флуорофорами, а результаты реакции с ними регистрировали на двух различных каналах детекции прибора для ПЦР-РВ. Для определения CT и CV аллелей мы использовали 2 канала – Green и Yellow. Нормальный CT аллель дает рост сигнала по каналу Green, детектируемый флуорофором FAM, а мутантный аллель CV - по каналу Yellow, меченный флуорофором R6G.  Что  касается TL и BL аллелей, то для их определения использовали тоже 2 канала, только Orange и Red. Нормальный TL аллель дает рост сигнала по каналу Orange, детектируемый флуорофором  FAM, а мутантный аллель BL - по каналу Red, меченый флуорофором Cy5.

Результаты интерпретируются на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линии. Переход порога, это характеристика количества копий ДНК отдельного гена. При оптимальном количестве копий ДНК, кривая располагается между двумя пороговыми значениями 10 и 15 циклами амплификации. При перемещении кривой влево по оси абсцисс, это говорит о высокой концентрации ДНК, если вправо, то недостатке ее концентрации в реакции. Все образцы, графики флуоресценции которых, превышают или пересекают эту линию порога, будут считаться положительными по определенному каналу, т.е. содержащими соответствующий каналу флуоресценции  аллель. Эффективность ПЦР-РВ была выше в 2 раза, чем классические методы ПЦР, которые использовались ранее в работе.

Генетическая генеалогия у быков-производителей, носителей CV и BL аллелей. Под генетической генеалогией понимается характеристика родословных на основе использования результатов ДНК-тестов совместно с традиционными методами исследования животных. Вначале был проведен анализ семени быка Пломбира 998. Пломбир 998 принадлежал ОАО «Смоленское» по племенной работе. Он был широко использован среди черно-пестрого скота Смоленской области, а в последующем Кабардино-Балкарии и Ингушетии. Несмотря на его известную родословную и отсутствие анализа на BLAD и CVM, семя быка интенсивно использовалось в 3-х регионах России. Его отцом был Пионер 188. Пионер 188 являлся сыном Карлин М. Айвенго Белла 1667366, который передал своему потомку оба наследственных заболевания, а он в свою очередь Пломбиру 998.  Это редкий случай, когда бык передавал своему потомству сразу два мутантных CV и BL  аллеля.

На рис. 2 приводим генетическую генеалогию быков, потомков Карлин М. Айвенго Белла 1667366, которые получили от своего предка CV аллель. 

Проведенный анализ показал, что отечественные быки Голливуд 64, Бэтман 8694, Спектр 1729, Кубок 1459, Кодек 1452 оказались носителями мутантного CV аллеля. Голливуд 64 получил мутацию от отца-носителя Горацио 78987165, который в свою очередь мутантный аллель получил от матери, поскольку отец Темтор 504924 был неносителем. Что касается Кубока 1459 и Кодека 1452, то они получили CV аллель от отца-носителя Конвинкера 2249055.

Племенные быки Бэтман 8694 и Спектр 1729 оказавшиеся носителями CV мутации, получили ее от своих матерей, поскольку их отцы Баклан 6352 и Сапфир 6985 оказались неносителями. Исходя из анализа полученных материалов, следует, что эти животные были правнуками и  прапраправнуками Карлин М. Айвенго Белла 1667366.

Анализ 601 образца крови и семени от элитных быков и быковоспроизводящих групп коров черно-пестрого голштинизированного скота из различных регионов Российской Федерации на наличие CV аллеля показал, что носителями данной мутации  в гетерозиготной форме являются 23 животных или 3,8%, а число особей с нормальным генотипом соответственно оказалось равным 578 или 96,2%. Причем, число носителей CV аллеля у быковоспроизводящих групп коров (n=17) было почти в 3 раза больше, чем  у быков-производителей (n=6).

Гетерозиготными по BL аллелю оказалось 39 животных, что составило по частоте встречаемости 6,5%, с нормальным генотипом 562 головы или 93,5%.

       

Примечание: красным цветом представлены зарубежные быки, носители CV аллеля, от которых получены российские быки, они обведены, синим цветом

Рис. 2. Генетическая генеалогия носителей CV аллеля в линии Монтвик Чифтейн 95679 из ОАО «ГЦВ СЖ»

Как и с CV носителями, аналогичная ситуация складывается и по BL аллелю, только число  быковоспроизводящих групп коров-носителей (n=25) было почти в 2 раза больше, чем  быков-производителей с данной мутацией (n=14). Тем не менее, встречаемость BL аллеля у племенных быков и коров была выше, чем число животных с CV мутацией  [табл. 2].

У всей исследованной группы животных (n=601), встречаемость CV аллеля составила 0,0191 или 1, 91%,  а BL - 0,0324 или 3,24%.  У быков эти данные составили соответственно 0,0063 (0,63%) и 0,0148 (1,48%). Относительно коров, эти данные выглядели следующим образом: CV - 0,0669 или 6,69%, а BL - 0,0984 или 9,84%.

Как видно из табл. 2, встречаемость CV и BL аллелей у племенных коров выше, чем у быков. Это связано с тем, что племенные коровы, находящиеся в стаде становятся своеобразным резерватом по сохранению мутантных CV и BL аллелей.

Относительно быков-носителей мутаций и созданного от них спермобанка, то они удаляются из племенных станций. Наличие в отечественных популяциях мутантных BL и CV  аллелей связано как с завозом быков - носителей, так и с получением отечественного племенного материала. Карлин М. Айвенго Белл 1617366 оказался основным распространителем источника CVM  и BLAD в мире, России и других странах СНГ.

Проведенный анализ показал, что животные-носители BL и CV  оказались в России в середине 80-х годов, т.е. до разработки метода ДНК-диагностики. В настоящее время главные формы  распространения мутантных CV и BL  аллелей это быковоспроизводящие группы коров, продажа или покупка животных-носителей, эмбрионов, через искусственное осеменение не аттестованным семенем.

Табл. 2. Частота встречаемости генотипов и аллелей

в локусах SLC35A3 и CD 18 у животных черно-пестрой породы

Локус SLC35A3

Иссле-

дуемая

порода

Исследуемые

группы

животных

n

Распре

деление

Генотипы

2*

Встречаемость аллелей

CT/CT

CT / CV

CV/CV

CV

Черно-

пестрая

Всего

исследовано

601

Н

578

23

0

0

0,9809

0,0191

О

578

23

0

Быки-

производители

474

Н

468

6

0

0

0,9937

0,0063

О

468

6

0

Племенные

Коровы

127

Н

110

17

0

1

0,9331

0,0669

О

110

16

1

Локус CD 18

Иссле-

дуемая

порода

Исследуемые

группы

животных

n

Распре

деление

TL/TL

TL/BL

BL/BL

2

Встречаемость аллелей

TL

BL

Черно-

пестрая

Всего

исследовано

601

Н

562

39

0

1

0,9676

0,0324

О

562

38

1

Быки-

производители

474

Н

460

14

0

0

0,9852

0,0148

О

460

14

0

Племенные

коровы

127

Н

102

25

0

0,2

0,9016

0,0984

О

102

23

1

Примечание: CT – нормальный аллель, CV – мутантный аллель. Н – наблюдаемое число животных;

О – ожидаемое число животных; в локусе SLC35A3 - 2=1, при df=1, P > 0,05;

  в локусе CD 18 - 2=1,2, при df=1, P > 0,05

Поток генов и геногеография BL  и CV в Российской Федерации и за рубежом. Мутантные гены, вызывающие ослабление или гибель животного мигрируют из одного стада в другое и даже из одной страны в другую. Так, быка голштинской породы Осборндейл Айвенго 1189870, голландского происхождения, родившегося в 1952 году, считали выдающимся производителем в США. От него была получена масса элитного поголовья быков-производителей и коров, от которых как племенной материал потомки распространились по всему миру. Спустя 40 лет, когда стало известно, что он является носителем BL аллеля, его наследственный материал оказался широко распространенным среди черно-пестрых и красно-пестрых пород крупного рогатого скота во всем мире. Аналогичная ситуация сложилась и с другими знаменитыми американскими быками, отцом и сыном: Пенстейт Айвенго Старом 1441440 и Карлин М. Айвенго Беллом 1667366. Пенстейт Айвенго Стар 1441440 получил от своего отца Осборндейл Айвенго 1189870 мутантный аллель, вызывающий дефицит лейкоцитарной адгезии, а от матери – комплексную аномалию позвоночника (CVM). Оба эти аллеля он передал своему знаменитому сыну, от которого по всему миру распространились BL и CV мутации.

В настоящее время  геногеография BL аллеля наиболее изучена. Он диагностирован в 6 республиках бывшего СССР, по СНГ в трех республиках [Россия, Белоруссия и Украина], а также в странах Балтии (Эстония, Латвия, Литва), не установлен в Казахстане и Молдове. В раз­витых и развивающихся странах мира, где широко используются для скрещивания черно-пестрые и красно-пестрые популяции высокомолочного голштинского скота, данная ситуация выглядит следующим образом. Аллель BL выявлен в 7 частях света, включающих 27 стран мира: Северная Америка [США и Канада], Латинская Америка и Карибия: [Аргентина, Бразилия], Европа [Австрия, Бельгия, Великобритания, Венгрия, Голландия, Дания, Италия, Испания, Польша, Румыния, Франция, ФРГ, Швейцария, Чехия], Юго-Восточная Азия и бассейн Тихого океана  [Китай, Япония, Новая Зеландия и Австралия], Ближний Восток  [Иран,  Турция], Южная Азия  [Индия, Пакистан], Африка [ЮАР]. Животноводческими обществами этих стран решено обязательное тестирование на носи­тельство мутантных аллелей.

Что касается CV аллеля, то его распространение в России менее изучено. Исходя из проведенных исследований, он выявлен в следующих областях: Московская, Брянская, Кировская, Ленинградская, Смоленская, Кабардино-Балкарская Республика. Не выявлен в Рязанской и Тамбовской областях. После аттестации на CV и BL аллелей, вызывающих BLAD и CVM, полученные данные заносятся в периоди­чески издаваемые каталоги по племенным быкам.

В Ы В О Д Ы

1. Впервые в Российской Федерации предложен ПЦР-РВ метод для одновременной диагностики двух мутантных аллелей, вызывающих наследственные болезни: комплексную аномалию позвоночника (CVM) и дефицит лейкоцитарной адгезии (BLAD) у черно-пестрого голштинизированного скота. Принцип основан на использовании технологии аллельспецифических TaqMan или флуоресцентных зондов.

2. Для выявления CT и CV аллелей использовали 2 канала – Green и Yellow. Нормальный CT аллель определялся по росту сигнала по каналу Green, детектируемый флуорофором FAM, а мутантный аллель CV - по каналу Yellow, детектируемый флуорофором R6G.

3. Для определения TL и BL аллелей использовали также 2 канала - Orange и Red. Нормальный TL аллель дает рост сигнала по каналу Orange, детектируемый флуорофором ROX, а мутантный аллель BL - по каналу Red, детектируемый флуорофором Cy5.

4. Сравнительный анализ выделения ДНК показал, что лучшим является фенольно-хлороформный метод, поскольку он давал высокоочищенную ДНК, в то же время он требовал больших затрат времени. Оптимальным для работы представляется сорбентный метод выделения ДНК. Он обладает технической простотой и экономит время, не прибегая к трудоемкой процедуре фенольной экстракции. Сорбентный метод удобен в том случае, если препарат выделенной ДНК не нужно хранить долгие годы. Очищенную ДНК при сорбентном методе можно хранить в течение одной недели при температуре от 2 до 8°С в бытовом холодильнике, в течение года при температуре не выше минус 16°С.

5. Проведен анализ и дана характеристика по 2-м наследственным болезням (BLAD, CVM) у быков-производителей и быковоспроизводящих групп коров разной кровности  по голштинской породе, принадлежащих ведущим племенным предприятиям Российской Федерации. Носителями CV и BL аллелей оказались быки-производи­тели, поступившие в нашу страну из Германии, Канады и США и являются прямыми потомками  лидеров голштинской породы  Осборндейл Айвенго 1189879, П. Айвенго Стар  1441440 и Карлин М. Айвенго Белл 1667366.

6. Из 601 аттестованного животного,  носителями рецессивного аллеля комплексной аномалии позвоночника (CVM) оказалось 1,91% животных. Из 474 быков носительство CV мутации было выявлено у 0,63%, в отношении племенных коров - встречаемость данного аллеля составила 6,69%. Что касается дефицита лейкоцитарной адгезии (BLAD), то его встречаемость у всей исследованной популяции составила 3,24%, у быков – 1,48%, племенных коров – 9,84%. Генеалогический анализ показал, что животные, у которых выявлены генетические аномалии являются прямыми потомками быка Карлин М. Айвенго Белл 1667366.

7. CV и BL аллели диагностированы в Брянской, Московской, Кировской, Ленинградской, Смоленской областях и  Кабардино-Балкарской Республике. BL аллель у племенных коров встречается чаще, это свидетельствует от том, что они являются своеобразным резерватом, мутантных аллелей в стаде. Носительство CV/BL редко встречается, оно было установлено только у одного быка.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ

НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. Одновременная аттес­тация элитных животных черно-пестрой голштинизированной породы по двум миссенс-мутациям (BL и CV) на основе ПЦР-РВ позволит направленно формировать аллелофонд быков-производителей, быковоспроизводящих групп коров, ремонтный молодняк, а также накапливать племенной материал (банк семени и эмбрионов) от здоровых животных.

2. Наличие генетического паспорта на CV и BL мутаций у элитных животных позволит эффективно вести селекционно-племенную работу в племенных стадах черно-пестрого генеалогического корня.

3. Полученные результаты исследований используются при чтении лекций и проведении практических занятий по курсу «Иммунология», «Ветеринарная генетика», «Разведение сельскохозяйственных животных» в ФГБОУ ВПО МГАВМиБ им. К. И. Скрябина, для слушателей системы аграрного дополнительного профессионального образования в ФГБОУ РАМЖ.


РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Полученные материалы рекомендуется использовать в отраслевых генетических лабораториях для одновременной диагностики мутантных CV  и  BL аллелей.

2. На племенных предприятиях для оценки завозимых элитных быков, ремонтных бычков, быковоспроизводящих групп коров, семя и эмбрионов.

ПЕРЕЧЕНЬ  ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

*1. Распространение  миссенс-мутаций  у голштинизированного черно-пестрого скота  /Марзанов Н.С., Марзанова С.Н.,  Турбина И.С.,  Девришов Д.А. // Сборник трудов VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика – 2010», под редакцией академика РАМН В.И.  Покровского.- М.: Изд-во «Киселева Н.В.». – 2010. –  Т. II. –  С. 147-149.

*2. Генетическое маркирование, сохранение биоразнообразия и проблемы разведения животных /Марзанов Н.С., Девришов Д.А., Марзанова С.Н. и др. //Сельскохозяйственная биология. – 2011. – №  2. – С. 3-14.

*3. Генетические особенности молочного скота, разводимого в Кабардино-Балкарской Республике /Марзанов Н.С., Попов Н.А., Марзанова Л.К., Попов А.Н., Петров С.Н.,  Тохов М.Х., Утижев А.З., Саморуков Ю.В., Марзанова С.Н. и др. //Доклады РАСХН. – 2011. – № 3. – С. 37-41.

*4. Разработка метода диагностики комплексной аномалии позвоночника (CVM) методом ПЦР в реальном времени у черно-пестрого скота /Марзанова С.Н., Алексеев Я.И., Коновалова Н.В. и др. // Проблемы биологии продуктивных животных.  – 2011. – №  4. -  Спецвыпуск (научно-практическая конференция: «Практическое использование современных научных разработок в воспроизводстве и селекции крупного рогатого скота».). – С. 79-82.

5. Диагностика аллелей каппа-казеина и BLAD с помощью ПЦР-анализа у пород крупного рогатого скота Республики Казахстан /Канатбаев С.Г., Марзанов Н.С., Марзанова С.Н. и др. //От теории к практике: вопросы современной ветеринарии, биотехнологии и медицины: матер. междунар. научно-практич. конф. – Саратов:  СГАУ.– 2011. – С. 115-119.

* - публикации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.