WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

ПОДГОРСКИЙ ВИКТОР ВИКТОРОВИЧ

РАЗРАБОТКА ЭКОМОНИТОРИНГА СЛОЖНЫХ ВОДНО-ОРГАНИЧЕСКИХ СИСТЕМ МЕТОДОМ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ СПЕКТРОСКОПИИ ЯМР НА РАЗЛИЧНЫХ ЯДРАХ.

03.02.08 – экология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени
кандидата химических наук

МОСКВА – 2012

Работа выполнена на кафедре системной экологии экологического факультета и в ЦКП (НОЦ) федерального государственного бюджетного учреждения высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов».

Научный руководитель:                                доктор химических наук, профессор                                Калабин Геннадий Александрович

Официальные оппоненты:                        доктор химических наук, профессор                                                                Зволинский Валентин Петрович                                                                                                                                                                                доктор химических наук, профессор                                                                Бодоев Николай Васильевич

Ведущая организация:        Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московский педагогический государственный университет, г. Москва

Защита состоится «31» мая 2012 г. в 15:00 на заседании Диссертационного совета Д 212.155.13 при Московском государственном областном университете по адресу: 141014, г. Мытищи, ул. Веры Волошиной, 24; http://www.mgou.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного областного университета по адресу: 105005, г. Москва, ул. Радио, д. 10 а.

Автореферат разослан «____» _________ 2012 г

Ученый секретарь Диссертационного совета:

доктор биологических наук, профессор                                        Снисаренко Т. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В обширном современном арсенале физико-химических методов выявления экотоксикантов в объектах окружающей среды центральное место занимает хромато-масс-спектрометрия, обладающая уникальной чувствительностью и высокой разрешающей способностью. Не менее информативным, но пока менее востребованным методом является спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) высокого разрешения. Она не требует использования стандартов, длительных процедур пробоподготовки, является абсолютным количественным методом, не разрушает исследуемый образец, позволяя установить строение интересующих загрязнителей в объекте исследования, количественно определить их содержание, выявить сырьевую, географическую и технологическую предысторию. Занимая ведущие позиции в химии и биологии,  особенно в органической химии, спектроскопия ЯМР все шире используется для решения проблем экологической химии и прикладных медико-фармацевтических задач. Спектроскопия ЯМР не менее широко используется и для анализа продукции химических производств за рубежом (в т. ч. масел, алкогольной продукции, продуктов нефтепереработки). Методики анализа различных видов продукции методом спектроскопии ЯМР входят в национальные стандарты США и стран Евросоюза.

Являясь экологически безопасным и недеструктивным методом анализа водно-органических систем, удовлетворяющим самым жестким требованиям «зеленой химии», обладая высокой эффективностью, спектроскопия ЯМР, несомненно, займет важное место в экоанализе и экомониторинге. Для этого необходима с одной стороны адаптация известных и разработка принципиально новых методологий и технологий получения надежных результатов измерений, и, с другой стороны, оптимальных схем и методов статистического анализа данных.

Появление компактных проточных спектрометров ЯМР и современных алгоритмов автоматической обработки массивов спектральных данных делает метод применимым для экологического мониторинга объектов, связанных с переработкой природного органического сырья химической и легкой промышленности, производства пищевой продукции и лекарственных средств. Поскольку природное органическое сырье – как правило, сложные водно-органические системы, наиболее эффективно использование методик спектроскопии ЯМР с подавлением сигнала протонов воды, что позволяет анализировать такие объекты без её удаления, существенно упрощая пробоподготовку и снижая время анализа.

Цель работы - создание новых подходов и методик спектроскопии ЯМР для экологического мониторинга продукции химических производств. Для её достижения решались следующие задачи:

– Идентификация загрязнений в различных видах потребительской продукции;

– Разработка подходов к анализу происхождения сырья;

– Оценка эффективности применения спектроскопии ЯМР для анализа важнейших объектов экологии человека: фармацевтической продукции и биологических жидкостей человека;

Научная новизна. Предложена методика выявления загрязнителей (рост-стимулирующих добавок, инсектицидов и т.п.), сырьевого происхождения, безопасности и свойств гуминовых веществ в с/х препаратах на их основе методом количественной спектроскопии ЯМР 13С.

Показана эффективность спектроскопии ЯМР на ядрах 1Н, 2Н, 13С, 19F как одного из наиболее быстрых методов выявления загрязнителей в широко востребованных фармацевтических препаратах и БАДах (арбидола, ибупрофена, дигидрокверцетина, рисперидона), в некоторых видах пищевой продукции и парфюмерно-косметических средств.

Разработана оригинальная методика определения качественного и количественного состава низкомолекулярных метаболитов амниотической жидкости методом ЯМР 1Н с подавлением воды и последующего статистического анализа полученных данных для мониторинга изменения состояния рожениц и оценки риска осложнений в родах.

Предложен и реализован алгоритм автоматизации предварительной обработки и анализа данных одномерной спектроскопии ЯМР на различных ядрах проекционными методами.

Практическая значимость. Практическая применимость предлагаемых подходов для выявления загрязнений и анализа сырьевого происхождения гуминовых препаратов, парфюмерно-косметической продукции, биофлюидов, ряда фармацевтических препаратов и БАДов (арбидола, дигидрокверцетина, ибупрофена, рисперидона) по данным спектроскопии ЯМР на различных ядрах состоит в возможности их использования для экологического мониторинга продукции химических производств по сырьевому и технологическому происхождению, выявления загрязнений, мониторинга динамических изменений водно-органических систем. В сочетании с предложенными алгоритмами предварительной обработки и статистического анализа данных одномерной спектроскопии ЯМР на различных ядрах, результаты настоящей работы создают научно-методические предпосылки для дальнейших экологических прикладных исследований продукции химических производств с целью разработки методик экологического мониторинга для более широкого круга объектов по данным спектроскопии ЯМР.

Основные положения, выносимые на защиту

  1. Классификация и ряд алгоритмов анализа сложных водно-органических систем методом количественной спектроскопии ЯМР на различных ядрах.
  2. Обоснование эффективности использования спектроскопии ЯМР для экомониторинга и прогнозирования свойств (технологических, функциональных) и выявления поллютантов в реальном масштабе времени.
  3. Адаптация ряда алгоритмов статистической обработки экспериментальных данных для автоматического анализа больших объемов спектральной информации.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, пяти глав, отражающих собственные экспериментальные исследования, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 74 рисунками. Библиографический список включает 10 отечественных и 115 зарубежных источников.

Апробация работы и публикации. Основные положения работы доложены на XIII международной молодежной научной школе "Актуальные проблемы магнитного резонанса и его применений" (Казань 2010), 5-м конгрессе всемирной ассоциации репродуктивной медицины (Москва 2010), 7-й международной конференции «ЯМР в гетерогенных системах» (С-Пб 2010), всероссийской конференции «Актуальные проблемы экологии и природопользования» (Москва 2007, 2008 и 2009), всероссийской конференции с международным участием «Аналитика России» (Краснодар 2009), всероссийской молодежной школе с международным участием «Магнитный резонанс в химической и биологической физике» (Новосибирск 2010).

Основное содержание работы изложено в 13 научных публикациях, в том числе в 3 статьях в центральных рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Работа выполнена при поддержке грантов № 2.1.1/3151, № 2.1.2/4658 министерства образования РФ, государственного контракта министерства образования РФ № 16.552.12.7002.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение. Обоснована актуальность темы диссертации и сформулированы основные цели и задачи исследования. Приведена классификация задач анализа водно-органических систем, методы их решения и объекты, на которых продемонстрировано решение каждого из типов задач в диссертации.

Водно-органические системы (ВОС) и используемые для их анализа методы принципиально различаются для ВОС постоянного и переменного (нестехиометрического) химического состава. С точки зрения анализа ВОС важны также количество входящих в систему компонент и их химическая близость (принадлежность к одному классу соединений или к группе производных одного соединения).

Задачи анализа ВОС можно разделить на несколько типов:

- классификация группы объектов по сырьевой природе, составу и свойствам;

- классификация группы объектов по видовому и географическому происхождению;

- соответствие отдельных образцов эталону;

- идентификация соединений и определение примесей;

- установление взаимосвязи «состав-свойство» без идентификации отдельных компонентов смеси.

Одним из примеров первой задачи является идентификация сырьевого происхождения гуминовых веществ. Гуминовые вещества являются ВОС переменного состава, поэтому для их классификации удобно использовать данные о фрагментном составе, полученные с помощью спектроскопии ЯМР 13С, по которым целесообразно строить статистические модели методами кластерного анализа и методом главных компонент.

Пример второй задачи – классификация растительных масел по видовому и географическому происхождению. Масла являются смесью жирных кислот и их производных, близких по химическому строению, поэтому хорошо классифицируются по фрагментному составу. Для классификации объектов по географическому происхождению удобно использовать также данные изотопного состава, поэтому для анализа растительных масел использовалась спектроскопия ЯМР на трех ядрах, 1Н, 13С и 2Н.

Установление соответствия эталону водно-спиртовых экстрактов природных соединений является примером третьей задачи. Для анализа этого типа ВОС использовалась спектроскопия ЯМР 1Н и 13С. Для автоматизации анализа данных спектроскопии ЯМР водно-спиртовых экстрактов на соответствие эталону целесообразно использовать факторный анализ, в качестве исходных данных для этого типа задач удобно использовать весь спектр ЯМР целиком или совокупность нескольких спектров ЯМР на различных ядрах, как «отпечаток пальца» сравниваемых объектов без идентификации всех компонентов ВОС.

Для решения четвертого типа задач для простых синтетических ВОС, таких как фармпрепараты и биодобавки, целесообразно использование данных спектроскопии ЯМР на различных ядрах, обычно 1Н и 13С.

Самым сложным типом задач является установление взаимосвязи «состав-свойство» для ВОС, содержащих сотни компонентов, концентрации которых различаются на порядки. В этом случае идентифицировать все компоненты смеси невозможно и в качестве данных для анализа используют спектры ЯМР целиком, как «отпечаток пальца» объекта. Для построения моделей по таким данным используют методы факторного анализа и распознавания образов.

Одной из задач такого типа является анализ биологических жидкостей человека с целью установления взаимосвязи между изменениями в их составе и отклонениями в состоянии человека в реальном масштабе времени.

Глава 1. Особенности регистрации и анализа количественных спектров ЯМР сложных водно-органических систем. Литературный обзор по теме диссертации, содержит рассмотрение наиболее важных технических аспектов спектроскопии ЯМР водно-органических систем, такие как подготовка проб, регистрация количественных спектров ЯМР 1Н в условиях подавления сигнала растворителя, методы статистического анализа получаемых спектральных данных. Отдельный подраздел этой главы посвящен спектроскопии ЯМР биологических жидкостей человека.

Глава 2. Идентификация методом спектроскопии ЯМР 13С сырьевого и природного происхождения водных растворов  гуминовых препаратов. Определение сырьевой природы гуминовых препаратов это частный случай задачи классификации группы объектов по составу и свойствам. Гуминовые вещества представляют собой высокомолекулярные органические системы. Они являются продуктом совокупности случайных химических реакций, поэтому имеют нестехиометричный, не определяющийся однозначно состав  и не имеют конкретной общей формулы. По этой причине наилучшим образом гуминовые препараты характеризует фрагментный, а не компонентный состав.

Рис. 1. Результаты статистического анализа данных спектроскопии ЯМР 13С гуминовых препаратов. Слева – образцы в факторном пространстве главных компонент 1-3, полученном методом главных компонент. Справа – распределение образцов в 3-х кластерах, полученных кластерным анализом.

Для анализа фрагментного состава гуминовых препаратов различного сырьевого происхождения были получены их количественные спектры ЯМР 13С в режиме развязки от ядер 1Н без ядерного эффекта Оверхаузера (время накопления – 12 часов). Для регистрации спектров использовались растворы гуминовых препаратов в дейтероводе, твердые препараты растворялись до перенасыщения (выпадения осадка), жидкие перед растворением выпаривались до выпадения осадка. Статистический анализ полученных данных проводился с помощью кластерного анализа и методом главных компонент.

Из рис. 1 видно, что полученные кластеры приблизительно соответствуют гуминовым препаратам, полученным из видов сырья, соответствующих трем стадиям превращения растительных остатков при образовании углей. Гуминовые препараты, полученные из углей и торфов, попали и во второй и в третий кластеры, поскольку угли являются продуктом превращения торфов и гуминовые препараты, полученные из молодых углей и наиболее старых торфов очень близки по составу и свойствам.

На основании полученных результатов можно заключить, что для более надежной дифференциации препаратов целесообразно использовать наравне с данными спектроскопии ЯМР 13С данные спектроскопии ЯМР 1Н и проводить эксперименты с переосажденными образцами гуминовых веществ.

Полученная модель позволяет надежно определять источник природного сырья, из которого изготовлены гуминовые препараты, а также отличать их от аналогов, содержащих рост-стимулирующие и иные добавки.

Глава 3. Выявление географического и сырьевого происхождения пищевой продукции методом спектроскопии ЯМР 1Н, 2H и 13С на примере растительных масел и твердых жиров. Задача выявления видового и географического происхождения пищевой продукции близка к описанной в предыдущей главе задаче анализа сырьевого происхождения. Для ее решения также достаточно описания фрагментного состава объекта. При анализе растительных масел, являющихся смесью жирных кислот и их производных, для этого достаточно спектров ЯМР 1Н и 13С. Однако для более надежной идентификации по географическому происхождению целесообразно использовать также спектры ЯМР 2Н, поскольку изотопный состав масел зависит от места происхождения сырья для них вследствие различного фракционирования изотопов в воде и минералах в разных точках Земли. Поэтому по полученным и литературным данным была разработана методика статистической обработки данных спектроскопии ЯМР 1Н, 2Н и 13С масел (оливковые, подсолнечные, кедровое и какао масла, произведенные в Испании, России, Тунисе и Греции). Для спектров ЯМР 13С статистический анализ проводился по 5 областям спектра, представленным в табл. 4. Для спектров ЯМР 2Н и 1Н – по 4 областям, представленным в табл. 2 и по 9 областям, представленным в табл. 3 соответственно.

Статистический анализ данных показал, что информации, содержащейся в спектрах ЯМР 2Н не достаточно для определения географического происхождения и типа масел. Спектры ЯМР 1Н и 13С, напротив, позволяют эффективно определять тип и географическое происхождение масла.

Таблица 2. Фрагментный состав масел по данным спектроскопии ЯМР 2Н *


Cырье и страна-изготовитель

CH3-

-CH2-

-CH2CO-

=CHO-, -CH-, -CH2O-

Подсолнечник, Россия

Кедр, Россия

Олива, Тунис

Олива, Испания

Какао, Кот Д’ Ивуар

Олива, Греция

0,14

0,12

0,11

0,13

0,11

0,16

0,15

0,10

0,14

0,08

0,13

0,53

0,52

0,48

0,57

0,48

0,55

0,57

0,54

0,56

0,62

0,62

0,22

0,25

0,29

0,19

0,29

0,18

0,18

0,24

0,18

0,10

0,20

0,12

0,11

0,13

0,10

0,13

0,11

0,10

0,09

0,04

0,20

0,05

* - интегральные интенсивности пиков в спектрах, нормированные на полный интеграл спектра.

Таблица 3. Фрагментный состав масел по данным спектроскопии ЯМР 1Н *

Сырье и страна-изготовитель

I

5,2 м.д.

II

4,1 м.д.

III

4,0 м.д.

IV

2,1 м.д.

V

1,9 м.д.

VI

1,8 м.д.

VII

1,4 м.д.

VIII

1,1 м.д.

IX

0,7 м.д.

Подсолнечник, Россия

Кедр, Россия

Олива, Тунис

Олива, Испания

Какао,

Кот Д’ Ивуар

Олива, Греция

0,09

0,09

0,09

0,09

0,09

0,09

0,09

0,09

0,08

0,08

0,09

0,54

0,55

0,48

0,55

0,50

0,60

0,62

0,63

0,65

0,72

0,65

0,15

0,15

0,14

0,10

0,13

0,18

0,20

0,19

0,16

0,16

0,18

0,29

0,30

0,32

0,35

0,21

0,33

0,35

0,36

0,29

0,11

0,28

0,24

0,25

0,24

0,23

0,12

0,30

0,34

0,33

0,22

0,22

0,21

0,21

0,20

0,21

0,19

0,06

0,11

0,06

0,06

0,01

0,01

0,03

0,13

0,12

0,12

0,11

0,04

0,16

0,17

0,16

0,09

0,08

0,08

0,14

0,14

0,13

0,13

0,04

0,18

0,21

0,19

0,10

0,09

0,09

0,85

0,85

0,87

0,87

0,19

0,80

0,76

0,76

0,32

0,41

0,31

* - интегральные интенсивности пиков в спектрах, нормированные на полный интеграл спектра.

Таблица 4. Фрагментный состав масел по данным спектроскопии ЯМР 13С *

Сырье и страна-изготовитель

-C=O

-CH=

-CH2O-, =CHO-

-CH2-

-CH3

Подсолнечник, Россия

Кедр, Россия

Олива, Тунис

Олива, Испания

Какао, Кот Д’ Ивуар

Олива, Греция

0,05

0,05

0,05

0,05

0,05

0,05

0,05

0,05

0,04

0,02

0,03

0,20

0,19

0,21

0,22

0,21

0,14

0,12

0,13

0,12

0,15

0,18

0,07

0,07

0,07

0,07

0,06

0,06

0,06

0,06

0,06

0,03

0,10

0,93

0,93

0,93

0,95

0,90

0,93

0,93

0,93

0,96

0,96

0,96

0,80

0,79

0,80

0,70

0,85

0,80

0,81

0,81

0,74

0,91

0,71

* - интегральные интенсивности пиков в спектрах, нормированные на полный интеграл спектра.

Рис. 2. Образцы масел в факторном пространстве главных компонент 1-3, полученном методом главных компонент по данным спектроскопии ЯМР 13С.

Для решения этой задачи наиболее эффективен статистический анализ данных спектров ЯМР 13С, результаты которого представлены на рис. 2. Однако стоит отметить, что регистрация спектров ЯМР 13С намного более длительна, нежели регистрация спектров ЯМР 1Н, которые также позволяют решить поставленную задачу (около 10 минут для спектров ЯМР 13С, около 1 минуты для спектров ЯМР 1Н). Поэтому для анализа большинства образцов по данным спектроскопии ЯМР статистическими методами целесообразно использовать данные спектров ЯМР 1Н.

В факторном пространстве координаты образцов по каждой из осей коррелируют с такими свойствами масел, как степень ненасыщенности, соотношение цис- и транс- изомеров в смеси и длинна и степень разветвленности «хвостов» триглицеридов. Полученная модель может быть использована для выявления загрязнений в маслах, в том числе добавок для повышения окислительной стабильности и трансизомеров жирных кислот, возникающих при гидрогенизации масла. Наряду с растительными маслами, подобная схема анализа может быть использована и для твердых жиров. Кроме того, спектроскопия ЯМР 1Н позволяет значительно быстрее, нежели стандартными методами, определять такие характеристики смесей жиров, как число омыления, йодное и гидроксильное числа, что показано на примере двух твердых жировых основ, используемых в пищевой промышленности.

Глава 4. Идентификация водно-спиртовых экстрактов природного и синтетического происхождения на примере парфюмерно-косметических средств. Описан подход к анализу парфюмерно-косметической продукции на примере идентификации туалетной воды. Многие парфюмерно-косметические средства, как и

Рис. 3. Спектры ЯМР 13С (JEOL JNM ECA-600, 600 МГц) 3 фальсифицированных и 1 подлинного (третий сверху) образцов парфюмерно-косметического средства «Amor Amor». Наиболее интенсивные сигналы (в т. ч. углеродных атомов этанола) обрезаны.

некоторые продукты пищевой и фармацевтической промышленности представляют собой водные экстракты с высоким содержанием низкомолекулярных спиртов. Для идентификации таких систем и выявления в них загрязнителей (в т. ч. токсичных и канцерогенных органических красителей, как правило, гетероциклических) достаточно регистрации спектров ЯМР 1Н, с подавлением сигнала воды, если ее содержание превышает 90%, и 13С.

Исследованная серия образцов одного и того же парфюмерного препарата (“Amor Amor”, Chacharel Ltd., Франция) состояла из продукции, полученного у фирмы-производителя и от сторонних производителей (была куплена в торговых организациях Москвы разного уровня доверительности), представляет собой водно-этанольный раствор смеси эфиров и небольшого числа ароматических соединений. Идентификацию парфюмерных препаратов целесообразно осуществлять по спектрам ЯМР на ядрах 13С, а не 1Н. Это обусловлено тем, что парфюмерные средства содержат значительное количество родственных эфирных соединений, сигналы которых сильно перекрываются между собой и частично закрыты сигналами воды и спирта, доля которых в образце значительно больше (см. рис. 5).

       В спектрах ЯМР 13С наиболее информативными являются области 40 – 80 м. д., 110-160 м. д., 170-180 м. д. и 210 – 220 м. д. (рис. 3). Затраты времени на получение количественных спектров ЯМР 13С в данном случае не велики и составляют около 10 минут, результаты статистического анализа спектров ЯМР 13С парфюмерного препарата «Amor Amor» представлены на рис. 4.

       Полученная модель позволяет определять наличие загрязнителей в исследованном парфюмерном средстве, таких как не соответствующие требованиям экологической безопасности органические красители.

Глава 5. Оценка эффективности спектроскопии ЯМР 1Н и 13С как метода идентификации примесей в фармацевтических препаратах и оценки их соответствия требованиям экологической безопасности. Для идентификации соединений и определения примесей в смесях небольшого числа нескольких компонент в большинстве случаев достаточно регистрации спектров ЯМР 1Н и 13С, в случае присутствия в смеси большого числа родственных соединений для их идентификации необходима дополнительно регистрация двумерных спектров ЯМР. Эффективность такого подхода к анализу фармацевтических препаратов показана на примерах определения загрязнителей в препаратах на основе дигидрокверцетина в сравнении со стандартным хроматографическим методом, определения содержания действующего вещества и скорости его высвобождения в препаратах пролонгированного действия на основе рисперидона, определения содержания действующих веществ в препаратах арбидола и ко-тримоксазола. В качестве загрязнителей в данном случае могут выступать остаточные количества веществ, использующихся в процессе изготовления препаратов, токсичные и обладающие нежелательными побочными эффектами родственные основным компонентам препаратов соединения.

5.1 Анализ качества фармацевтических препаратов (на примере дигидрокверцетина) На рис.6 представлена структурная формула дигидрокверцетина (ДГК). Сырье производства ДГК всегда содержит большое количество родственных ДГК флавоноидов (кемпферол, дигидрокемпферол, нарингенин, лютеолин и т.п.), максимальные содержания которых регламентированы нормативными документами (ТУ 9325-001-70692152-07, международная фармакопея).

Проведена серия экспериментов по контролю качества образцов дигидрокверцетина различных производителей. В качестве спектров сравнения в серию были включены спектры дигидрокверцетина-сырца и эталонного чистого дигидрокверцетина. Все образцы серии были охарактеризованы с помощью ВЭЖХ (по приведенной выше методике, на хроматографе LC ProStar 325) и с помощью спектроскопии ЯМР на ядрах 1Н и 13С. Для анализа методом спектроскопии ЯМР образцы были предварительно растворены в DMSO-D6, регистрация спектров проводилась при постоянной температуре, общее время накопления протонных спектров — менее минуты,  углеродных — около 12 минут. Регистрация спектров производилась на 600 МГц ЯМР - спектрометре JEOL JNM-ECA 600, троекратно для каждого спектра с целью оценки воспроизводимости результата. Краткое сравнение анализа ДГК методами ВЭЖХ и спектроскопии ЯМР представлено в табл. 5.

Таблица 5. Сравнение спектроскопии ЯМР и ВЭЖХ как методов идентификации лекарственных и парафармацевтических препаратов

ВЭЖХ с фотометрическим детектированием

ЯМР 1Н

Высокочувствительный метод,

предел обнаружения 10-4 – 10-6 г/л.

Низкочувствительный метод,

предел обнаружения 10-2 – 10-3 г/л.

Необходимы стандартные образцы

на каждое вещество.

Не требует стандартных образцов.

Для определения всех примесей

требуется несколько экспериментов.

Для определения всех примесей

достаточно одного эксперимента.

Подготовка образца требует времени.

Нет необходимости в предварительной

подготовке образца.

Один эксперимент занимает

не менее 10 минут.

Один эксперимент занимает не более минуты.

Полное время анализа не менее 50 мин.

Полное время анализа менее 5 мин.

Родственные соединения

трудно различимы.

Возможна однозначная идентификация родственных примесных соединений (нарингенин, лютеолин, дигидрокемпферол и т.д.).

На основе проведенного сравнительного анализа можно рекомендовать применять методики идентификации фармпрепаратов с помощью протонной спектроскопии ЯМР в тех случаях, когда компоненты фармпрепарата имеют близкие времена удерживания, важно содержание определенного оптического изомера в смеси, необходимо качественно идентифицировать все возможные примеси. Протонная спектроскопия ЯМР может также использоваться как дополнительный метод идентификации фармпрепарата для подтверждения результатов ВЭЖХ и получения информации, которую сложно или невозможно получить с помощью хроматографии. Анализ образцов методом спектроскопии ЯМР выявил наличие в образцах следовых количеств растворителей, используемых при экстракции дигидрокверцетина из растительного сырья (ацетон, этилацетат). Кроме того, в образцах были обнаружены дигидрокемпферол, нарингенин, лютеолин, апигенин, кверцетин в различных количествах. Эти флавоноиды не токсичны, но обладают значительно меньшей антиоксидантной активностью, чем дигидрокверцетин.

5.2 Анализ качества фармацевтических препаратов на основе арбидола и ко-тримоксазола. Спектроскопия ЯМР в ряде случаев является практически безальтернативным методом контроля качества лекарственных препаратов. Один из

наглядных примеров - анализ качества ректальных суппозиториев. Исследована серия образцов ректальных свечей, содержащих два действующих начала – арбидол и ко-тримоксазол (рис. 7) (состоит из двух компонент – сульфометоксазола и триметоприма). Применяемые для подобных анализов хроматографические методы не позволяют работать с твердой фазой, а перевод в жидкую фазу для хроматографии требует отделения жиров от действующих веществ. Это усложняет анализ и увеличивает его длительность. Получение количественных спектров ЯМР 1Н данных образцов занимает около 10 минут. Было определено соотношение количеств действующих начал в суппозиториях и их объемное распределение (для чего регистрировались спектры нескольких проб из разных частей суппозитория). В ряде образцов исследованной серии соотношение количеств действующих начал не соответствовало паспортному. Созданы основы соответствующей методики.

5.3 Анализ состава фармацевтических препаратов на основе рисперидона. Рисперидон (рис. 8) – атипичное антипсихотическое средство, производное бензизоксазола, нейролептик. Применяется для лечения психозов в терапии некоторых форм биполярного расстройства, психотической депрессии, при шизофрении. В настоящем исследовании была изучена серия образцов препарата и его дженериков  различного производства в форме порошка для приготовления суспензии пролонгированного действия для внутримышечного введения, все образцы были предоставлены Институтом проблем лазерных и информационных технологий РАН. В ходе исследования решались следующие задачи – идентификация действующего начала препарата по спектрам ЯМР 1Н, 13С и 19F, количественное определение примесей, определение содержания препарата в композиции с биодеградируемым полимером (поли-D,L-лактид-когликолид). Регистрация спектров ЯМР 19F была необходима для подтверждения пространственного строения действующего начала препарата и более точного его количественного определения.

Спектры ЯМР всех образцов регистрировались на спектрометре JEOL JNM ECA-600 с рабочей частотой для ядер Н 600 МГц в ампулах 5 мм в идентичных условиях. В качестве растворителя использовались физиологический раствор (в спектре ЯМР 1Н содержит интенсивный сигнал протонов воды в области 5 м.д.), и дейтерированный хлороформ.

Предложен и использован простой метод определения в растворе (CDCl3) соотношения «рисперидон : полилактид : полигликолид», основанный на сопоставлении интегральных интенсивностей сигналов в выделенных областях спектра ЯМР 1Н. Метод может быть успешно использован для исследования процесса высвобождения препарата из полимерной матрицы в физиологическом растворе в реальном времени и выявления загрязнителей, образующихся при ее разрушении. Единичное измерение может занимать менее 10 минут. В исследованной серии образцов, полученных по различной технологии микронизации, произошло полное разрушение матрицы без образования примесей, но скорость высвобождения препарата в некоторых из них не соответствовала заявленной изготовителем.

Глава 6. Методология анализа биологических жидкостей человека, как наиболее сложных водно-органических систем, методом спектроскопии ЯМР 1Н с подавлением воды на примере амниотической жидкости беременных. Биологические жидкости человека – сложные многокомпонентные водно-органические системы с высоким содержанием воды. Задача идентификации индивидуальных веществ в них очень сложна и трудоемка, поэтому для задач экомониторинга и медицинской диагностики целесообразно сравнивать химический состав таких смесей, используя спектры ЯМР 1Н с подавлением воды целиком в качестве «отпечатка пальца», характеризующего мгновенное состояние образца.

В главе 6 показана применимость такого подхода в задаче анализа амниотической жидкости для ранней оценки риска родовых осложнений и мониторинга состояния рожениц. Исследованы образцы амниотической жидкости 115 пациенток, большинство из которых страдали экстрагенитальными заболеваниями. Отбор всех образцов производился непосредственно при родовом акте, на его заключительной стадии. Образцы хранились и транспортировались в замороженном состоянии, при температуре -25С. От объема образца отбирали 0,8 мл жидкости, которую подвергали центрифугированию с силой 14000g в течение 10 минут, 0,5 мл полученного супернатанта переносили в 5мм ампулу для спектроскопии ЯМР. Образцы были очищены от белковой части с помощью молекулярных фильтров.

Для каждого образца амниотической жидкости были зарегистрированы спектры по двум методикам - NOE-1D (noesypr1d) и CPMG (cmpgpr), в которых подавление сигнала растворителя (воды) осуществлялось его преднасыщением. Регистрация всех спектров проводилась на спектрометре ЯМР Bruker Avance-600 с разрешением 600 МГц для протонов, на инверсном датчике, поскольку чувствительность прямого датчика не достаточна для получения качественных спектров амниотической жидкости.

Для построения модели был осуществлен факторный анализ данных методом главных компонент (рис. 9) и методом проекции на латентные переменные с ортогональной коррекцией сигнала (O-PLS), для повышения точности классификации. Полученная модель позволяет разделить образцы по различиям в химическом составе на 5 групп, соответствующих образцам беременных с осложненным каждой из четырех патологий и с нормальным течением родов. В наибольшей степени риски осложнений в родах коррелируют с содержанием в амниотической жидкости гистидина, уксусной и ацетоуксусной кислот, молочной кислоты, лейцина, изолейцина, лимонной кислоты, креатина и креатинина.

Рис. 9. A - Образцы в факторном пространстве главных компонент 1-3, полученном методом проекции на скрытые переменные с ортогональной коррекцией сигнала (O-PLS). B - типичный спектр ЯМР 1Н 600 МГц амниотической жидкости.

ВЫВОДЫ

  1. Расширены возможности современной спектроскопии ЯМР на различных ядрах с последующим статистическим анализом проекционными методами (PCA, PLS) в сочетании с дискриминантным анализом (LDA) на ядрах 1Н, 2Н и 13С  для экомониторинга, идентификации и установления генетического и географического происхождения сложных водно-органических систем, представляющих значительный интерес с позиции экологии человека.
  2. Выявлена возможность надежного определения загрязненности и сырьевого происхождения экологически-безопасных стимуляторов роста гуминового типа на основе дескрипторов фрагментного состава (содержание фрагментов –COO, CаромO, CаромC,H, CалкO, Cалк), полученных при анализе  спектров ЯМР 13С.
  3. Выявлена возможность надежного определения загрязненности, сырьевого и географического происхождения растительных масел на основе дескрипторов фрагментного состава триглицеридов полученных при анализе спектров ЯМР на ядрах 1Н, 2Н и 13С, надежного определения стандартных показателей жирных смесей (йодного и гидроксильного чисел, числа омыления) по данным спектроскопии ЯМР 1Н.
  4. Выявлена возможность надежной оценки безопасности, качества и идентификации подлинности парфюмерно-косметической продукции методами спектроскопии ЯМР 1Н и 13С.
  5. Выявлена возможность определять содержание основных действующих веществ и примесей в лекарственных и парафармацевтических препаратах методами спектроскопии ЯМР на ядрах 13С, 1Н значительно быстрее, нежели другими методами, без применения стандартов и эталонов.
  6. Выявлены особенности химического состава амниотической жидкости, позволяющие характеризовать риск родовых осложнений при наличии одного или нескольких из четырех самых распространенных заболеваний при беременности по данным спектроскопии ЯМР 1Н. В наибольшей степени риски осложнений в родах коррелируют с содержанием в амниотической жидкости гистидина, уксусной и ацетоуксусной кислот, молочной кислоты, лейцина, изолейцина, лимонной кислоты, креатина и креатинина.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах из перечня ВАК

  1. В.В. Подгорский, Б.Р. Садыков, А.В. Чертков, Л.А. Боронина, Н.Г. Баканова, Л.И. Куркиева, Г.А. Калабин Количественная спектроскопия ЯМР сложных водно-органических объектов: новые направления исследования в РУДН // Вестник РУДН сер. Экология и безопасность жизнедеятельности. – 2010. – № 1. - С. 5-13.
  2. В.В. Подгорский, А.С. Михалев, Г.А. Калабин Количественная спектроскопия ЯМР в контроле качества лекарственных и парафармацевтических препаратов // Химико-фармацевтический журнал. – 2011. – №3. – С. 52-55.
  3. Н.Г. Баканова, Г.А. Калабин, В.В. Подгорский Взаимосвязь молекулярного строения и рост-стимулирующей активности гуминовых веществ из лигнина // Вестник РУДН сер. Экология и безопасность жизнедеятельности. – 2012. – № 2. – С. 16-23.

Материалы конференций

  1. Н.Г. Баканова, Б.Р. Садыков, В.В. Подгорский Новый алгоритм идентификации сырьевой и технологической природы промышленных гуминовых препаратов для с/х методом спектроскопии ЯМР // материалы XIV всеросс. конф. «Докучаевские молодежные чтения», Санкт-Петербург, 2011, С. 193-195.
  2. A. Poltanova, A. Chertkov, E. Simonenko, V. Podgorsky, E. Yutkin, N. Sergeyev, S. Yakovenko Leading innovation: metabolomic profiling of embryo culture media using 1H NMR for selection embryos with higher pregnancy rate // Reproductive BioMedicine Online. Abstracts of 5th WARM congress. – 2010. - Vol. 20(3). – P. S4.
  3. A.V.Chertkov, V.V.Podgorsky, K.F.Sheberstov, A.V.Poltanova, N.M.Sergeyev, G.A.Kalabin High resolution NMR spectroscopy as a new method in medicine diagnostics and biochemical research. Metabonomics study of human amniotic fluid and embryo culture media // материалы XIII Международ. конф. "Актуальные проблемы магнитного резонанса и его применений", Казань, 2010, С. 72-75.
  4. В.В. Подгорский, Г.А. Калабин О применении приборного комплекса Delta V Advantage Plus изотопной масс-спектрометрии // Сб. науч. трудов «Актуальные проблемы экологии и природопользования». – 2009. – Вып. 11. – C. 230-233.
  5. В.В. Подгорский, Г.А. Калабин Идентификация триглицеридов методом спектроскопии ЯМР 1Н // Сб. науч. трудов «Актуальные проблемы экологии и природопользования». – 2008. – вып. 10 (часть 1). – С. 34-36.
  6. В.В. Подгорский, Т.Н. Колоколова, Г.А. Калабин Количественная спектроскопия ЯМР 1Н биофлюидов человека // Сб. науч. трудов «Актуальные проблемы экологии и природопользования». – 2007. - Вып. 9 (часть 1). – С. 5-8.
  7. A.V. Chertkov, V.V. Podgorsky, K. Sheberstov, A. Poltanova, N.M. Sergeyev, G.A.Kalabin High resolution NMR spectroscopy as a new method in medicine diagnostics and biochemical research. Metabonomics study of human amniotic fluid and embryo culture media // Материалы Всеросс. конф. с международ. участием «Магнитный резонанс в химической и биологической физике», Новосибирск, 2010, С. 41.
  8. A.Chertkov, S.Trashin, V.Podgorsky, A.Poltanova, K.Sheberstov, N.M.Sergeyev, G.A.Kalabin High resolution NMR spectroscopy as a new method in medicine diagnostics and biochemical research. Metabonomics study of human amniotic fluid and embryo culture media // материалы 7-й международ. конф. «ЯМР в гетерогенных системах», Санкт-Петербург, 2010, С. 67.
  9. Калабин Г.А., Чертков А.В., Подгорский В.В. Компонентный и фрагментный анализ биофлюидов человека совокупностью методов спектроскопии ЯМР 1Н, 13С и хромато-масс-спектрометрии высокого разрешения // материалы III Всеросс. конф. с международ. участием «Аналитика России-2009», Краснодар, 2009.
  10. Подгорский В.В., Колоколова Т.Н., Сергеев Н.М. Определение уровня дейтерирования дейтерированных растворителей с высокой точностью // Тез. докл. Международ. конф. «Ломоносов - 2007». – 2007. – CD-ROM, ISBN 5-7776-0079-4.







© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.