WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

Курьянова Назия Хусаиновна

РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ ПО ПОЛУЧЕНИЮ ПРОТЕКТИВНОГО ИНАКТИВИРОВАННОГО АНТИГЕНА ORNITHOBACTERIUM RHINOTRACHEALE

03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Ульяновск – 2012

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А. Столыпина»

Научный руководитель:        Золотухин Сергей Николаевич

доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:  Ежкова Галина Олеговна

доктор биологических наук, профессор 

  кафедры технологии пищевых производств

ФГБОУ ВПО «Казанского национального

исследовательского

технологического университета»

       Щербаков Анатолий Анисимович

доктор биологических наук, профессор кафедры

микробиологии, вирусологии и биотехнологии

ФГБОУ ВПО «Саратовского государственного аграрного университета имени Н.И. Вавилова»

Ведущая организация:        ФГБУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных препаратов для животных и кормов» (ВГНКИ).

Защита диссертации состоится «12» октября 2012 года в 1400 часов на заседании диссертационного совета Д 220.065.01 при ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А. Столыпина» по адресу: 432017, г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1; тел. (8-8422) 44-30-58, факс 44-30-72, e-mail: kormlen@yandex.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А. Столыпина», с авторефератом в сети интернет на официальном сайте Министерства образования и науки РФ www.vak.ed.gov.ru на сайте академии www.ugsha.ru

Автореферат разослан «10» сентября 2012 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета Пыхтина Лидия Андреевна

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последней трети XX века, несмотря на определенные успехи в борьбе с инфекционными болезнями, значение инфекционной патологии, как одного из основных критериев здоровья, признано всем мировым сообществом.

Сегодня можно констатировать, что суммарная распространенность инфекционных (и паразитарных) болезней, несмотря на предпринимаемые усилия, направленные на борьбу с ними, не только не сокращается, но даже возрастает. Так, если в начале девяностых годов в России ежегодно регистриро­валось в среднем 30 млн. случаев инфекционных заболеваний, то в последние годы эта величина превышает 40 млн. (М.Г.Шандала, 2005).

Мировой опыт борьбы с болезнями животных показал, что в системе мероприятий обеспечения здоровья всех видов животных специфическая профилактика занимает важное место. Это связано с тем, что активная иммунизация является наиболее эффективным средством предотвращения многих болезней вирусной и бактериальной этиологии (М.Г. Шандала, 2003; Т.А. Костюкова, М.Н.Ляпин, Т.А.Малюкова, 2005; Л.Г. Пантелеева, 2002).

С начала девяностых годов ХХ века во многих странах мира были зарегистрированы вспышки заболевания респираторного тракта кур и индеек, вызванных Ornithobacterium rhinotracheale. Отмечалось увеличение смертности и снижение продуктивности у бройлеров приблизительно с 28-дневного возраста и длилось до конца периода откорма (Van Beek et al., 1994; De Rosa, 1996). Ornithobacterium rhinotracheale выделен во многих странах мира и инкриминирован, как возможный, дополнительный, причинно-обусловленный агент в комплексе респираторных болезней (Van Veen et al., 2000; Sakai et al., 2000).

Следует отметить, что, не смотря на то, что за последние годы в России расширился ассортимент разрешенных к применению средств воздействия на микроорганизмы и вирусы: в период 2001-2005 гг. в РФ зарегистрировано более 100 инактиваторов (М.Г.Шандала, 2006, 2007; Т.А.Костюкова, М.Н.Ляпин, Т.А.Малюкова, 2005; Пантелеева, 2002), арсенал экологически безопасных препаратов, разлагающихся в природных условиях до продуктов, не загрязняющих окружающую среду, ограничен (М.Р.Саврилов, 2004; Л.Г. Пантелеева, 2005, 2006). Поэтому изучение антибактериальных и антивирусных свойств соединений различных классов, с целью разработки новых нетоксичных, высокоэффективных, экологически безопасных антимикробных препаратов, используемых в качестве бактерицидов для создания инактивированных вакцин, представляет собой весьма актуальную задачу для науки и практики (А.Э.Высоцкий, 2005; В.Н.Аржаков, М.М.Ермакович, П.В.Аржаков, 2003, 2004). Безопасные инактивированные вакцины – это компромисс в настоящее время в создании вакцинных препаратов.

Цель и задачи исследования. Целью исследования является разработка биотехнологических параметров создания инактивированной вакцины против орнитобактериоза.

Поставленная цель решалась следующими задачами:

1. Изучить основные биологические свойства бактерий O. rhinotracheale.

2. Выбрать оптимальную питательную среду накопления для культивирования бактерий O. rhinotracheale.

3. Разработать схему использования теотропина в качестве инактиватора бактерий O. rhinotracheale.

4. Изучить возможность создания вакцинного препарата против орнитобактериоза.

5. Изучить безвредность, аректогенность созданного вакцинного препарата.

Научная новизна. Опираясь на биологические свойства бактерий вида O. rhinotracheale, подобрана питательная среда и параметры культивирования для наработки максимально возможного количества бактериальной массы данного микроорганизма. Разработаны схемы инактивации бактерий различных морфологических форм с помощью препарата теотропина. На основании полученных данных предложена схема инактивации теотропином бактерий O. rhinotracheale с целью создания инактивированного вакцинного препарата. В результате экспериментов доказана сложность в конструировании вакцины против орнитобактериоза с использованием адъювантов и предложена схема создания инактивированной орнитобактериозной вакцины, основанной на новых биотехнологических методах, в частности, ультразвуковой дезинтеграции и инактиватора теотропина.

Практическая значимость. Предложена схема инактивации бактерий с помощью препарата теотропина. Разработано «Временное наставление по применению теотропина для профилактики и лечения инфекционных болезней птиц», рассмотренное на научно-техническом совете и  утвержденное первым проректором – проректором по научной работе ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А. Столыпина» (15.05.2012). Полученные данные позволяют утверждать, что указанный препарат можно использовать в качестве инактиватора для производства инактивированных вакцин.

Разработаны параметры ультразвуковой дезинтеграции бактерий Ornithobacterium rhinotracheale, позволяющие получать протективный антиген для изготовления вакцин.

Доказана возможность создания вакцинного препарата для профилактики орнитобактериоза на основе дезинтеграта бактериальной массы указанных бактерий и инактиватора теотропина.

Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций, для практических занятий студентов, работы аспирантов на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Путем микроскопии под иммерсионной системой мазка суточной культуры, окрашенной по Грамму, установлены тинкториальные свойства бактерий Ornithobacterium rhinotracheale - это небольшие грамотрицательные палочки с круглыми концами, спор и капсул не образуют. Установлены ферментативные свойства, отсутствие способности образовывать индол, сероводород и утилизировать цитрат; не зависимо от вида донора гемолитическая активность (разрушения эритроцитов) не выявлена.

2. Опыты демонстрируют, что наиболее интенсивный рост бактерий изучаемой культуры идёт на обогащённых средах PPLO-агаре и кровяном агаре. Данные среды для наработки бактериальной массы достаточно дороги и экономически невыгодны. По результатам экспериментов пришли к выводу, что в качестве азотно-витаминной основы конструируемой среды нужно использовать дрожжевой экстракт, пептон, в качестве источника углерода – глюкозу. По результатам опытов сконструирована оптимальная питательная среда накопления для культивирования бактерий O. rhinotracheale

3. Результаты исследований свидетельствуют, что из использованных доз (5,0; 7,5 и 10мг/мл) изучаемого препарата теотропина дозы 5,0 и 7,5 мг/мл обладают бактериостатическим, но не бактерицидным действием,  а доза 10 мг/мл после 18 часовой экспозиции с бактериальной культурой концентрацией 1010 микробных тел является бактерицидной для всех изучаемых микроорганизмов и может быть использованы в качестве инактиватора бактерий O. rhinotracheale для производства инактивированных вакцин.

4. Эксперименты позволили сделать однозначный вывод, что дезинтеграционные структуры бактериальных клеток орнитобактерий, инактивированные теотропином, обладают протективными свойствами, но величина их активности различна. Полученные данные убеждают, что дезинтеграт с дозой иммунизации по белку в 2,0 и 2,4 мг обладает более высокими протективными свойствами, чем дезинтеграт с меньшими дозами инъекций.

5. Экспериментальные биопрепараты из бактерий Ornithobacterium rhinotracheale не обладают дермонекротической реакцией, ареактогенены и безвредны для макроорганизма, что дает возможность сконструировать ареактогенный инактивированный вакцинный препарат.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практических конференциях: на Международной научно-практической конференции посвященной 65-летию УГСХА «Актуальные вопросы аграрной науки и образования» (Ульяновск, 2008), Международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути решения» (Ульяновск, 2009). Международной научно-практической конференции «Наука в современных условиях: от идеи до внедрения: материалы международной научно-практической конференции» (Димитровград, 2009, 2010, 2011).

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А. Столыпина».

Публикации.  По теме диссертации опубликовано 10 работ из них 1 в журнале, рекомендованном ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, состоящих из материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, практических предложений, списка использованных литературных источников. Материалы диссертации изложены на 115 страницах, включают 11 таблиц и 27 рисунков. Список использованных литературных источников 171 (в том числе 58 иностранных).

2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнялась в период с 2008-2011 г на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.

В работе использовались референс-штаммы бактерии Ornithobacterium rhinotracheale К 282 и К 33, полученные из ВНИИЗЖ в лиофилизированном виде от 15 февраля 2003 г. и 29 января 2007 г. Помимо этого, при определении специфичности селективных свойств среды использовались штаммы других бактерий – родов: Proteus, Citrobacter, Morganella, Klebsiella, Staphylococcus, Pseudomonas, Bacillus, Yersinia, Enterococcus, Escherichia, Bordetella, Aeromonas, Hafnia, Listeria, Staphylococcus, Providencia. Они обладали типичными для данных культур биологическими свойствами. Все перечисленные штаммы микроорганизмов получены из музея микроорганизмов НИИЦМиБ ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина» и по своим культуральным и морфологическим свойствам были типичными, а по устойчивости к табельным дезинфицирующим средствам (фенолу 1:70 и 0,1 % хлорамину) соответствовали требованиям, регламентируемым инструкцией 739-68 (Инструкция по определению бактерицидных свойств новых дезинфицирующих средств, утверждена начальником Главного санитарно-эпидемиологического Управления Министерства здравоохранения СССР, М., 1968) и другими инструктивно-методическими указаниями по изучению, отбору новых безопасных средств инактивации бактерий и применению их в практике.

В экспериментах были задействованы 4 группы кроликов, по 3 особей в каждой, породы «Шиншилла» со средним весом 3 кг и один интактный кролик для получения контрольной сыворотки и беспородные белые мыши.

Для бактериологического исследования использовали питательные среды: мясо-пептонный бульон (МПБ) (НПО «Питательные среды», г.Махачкала), мясо-пептонный агар (МПА) (НПО «Питательные среды», г.Махачкала), среды: Симмонса (НИИ питательных сред, г.Махачкала), Эндо (ГНЦ прикладной микробиологии, г.Оболенск), Клиглера (НИИ питательных сред, г.Махачкала), Blood agar base (bioMerieux, Франция), Trypcase soy broth (bioMerieux, Франция), PPLO agar ( Difco, USA), Brain Heart infusion (Difco, USA), Purple Broth base (Difco, USA), Tryptose Blood agar base (Difco, USA), Bacto-Peptone (Difco, USA), DNase Test Agar, w/Toluidine Blue (HiMedia, Индия),  Гисса с индикатором Андраде (глюкоза, лактоза, сахароза, манит, арабиноза, дульцит, ксилоза, адонит, инозит, салицин) (НПО «Питательные среды», г.Махачкала), наборы для ускоренного микрообъемного определения уреазы, орнитиндекарбоксилазы, аргининдегидролазы, продукции сероводорода, лизиндекарбоксилазы, ферментации углеводов и спиртов бактериями (сахароза, манноза, арабиноза, глюкоза, лактоза, манит, сорбит, адонит), нитратредуктазы бактерий нетоксичными реактивами, ферментации ацетата натрия, ферментации цитрата натрия (ФГУН НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, г.Санкт-Петербург), реактив Ковача на индол (ФГУН НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, г.Санкт-Петербург), реактив на триптофандезаминазу и фенилаланиндезаминазу (ФГУН НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, г.Санкт-Петербург); гель гидрата окиси алюминия (ГОА) 6 % раствора (при рН 7,2-7,4); раствор 0,1 % алюмокалиевых квасцов и 0,1 % хлористого кальция в виде 10 % раствора с рН 7,2-7,4; полный адьювант Фрейда; очищенный агар фирмы «Difco». Использовали адьювантные препараты: «Декстран Т – 500» и «Конкавалин – А», «Поли-4-винилпиридин» фирмы «Serva».

В работе использовали следующее лабораторное оборудование: весы аналитические, II класс; стандарт мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича 10 ед.; водяная баня; фотоаппарат «Olimpus-OM4Ti» (Япония); ламинарный шкаф фирмы «Bellco Glass, Inc.»; термостаты ТС-80М-2; микроскопы МБИ-3; лабораторные центрифуги CM-6M, ОПн-8УХЛ4,2 и ЦЛС-3; фотоколориметр Anthos (Labtec Instruments, США); Nanoe Ducator SCANNING PROBE MICROSCOPE; холодильники бытовые, колбы мерные, пипетки пастеровские, пипетки мерные на 1,0; 2,0; 5,0; 10,0 см3 , флаконы емкостью 50, 100 см3 , стекла покровные, стекла предметные, чашки Петри, пробирки, универсальные индикаторные бумаги pH 0-12 (Lachema,Чехия), дезинтегратор фирмы MSE (Англия); холодильник бытовой, весы чашечные с разновесами, сушильный шкаф, машина для изготовления ватных пробок; электронный микроскоп (фирмы Hitachi).

В работе пользовались следующие методики: Метод Фортнера, инструкция по применению реактива Ковача на индол; инструкция по применению набора для ускоренного микрообъемного определения аргининдегидролазы бактерий; инструкция по применению набора для ускоренного микрообъемного определения орнитиндекарбоксилазы бактерий; инструкция по применению реактива на триптофандезаминазу и фенилаланиндезаминазу; инструкция по применению набора для ускоренного микрообъемного определения лизиндекарбоксилазы бактерий; инструкция по применению набора для ускоренного микрообъемного определения уреазы бактерий; инструкция по применению набора №1 для ускоренного микрообъемного определения ферментации углеводов и спиртов бактериями (лактоза, манит, сорбит, адонит); инструкция по применению набора №2 для микрообъемного определения ферментации углеводов и спиртов бактериями (сахароза, манноза, арабиноза, глюкоза); инструкция по применению набора для ускоренного микрообъемного определения продукции сероводорода бактериями; методика предварительной оценки эффективности экспериментальной вакцины расчетом показателя ИСВ (Шляхов, 1970); методика постановки реакции иммунодиффузии (РИД) по Оухтерлони в модификации Остермана; методика негативного контрастирования 1,5 % фосфорно-вольфрамовой кислотой (ФВК); пробирочный метод постановки реакции агглютинации; метод криогенной дезинтеграции путем разрушения бактериальных клеток, предложенный Грассе; метод Кербера для расчета величины LD50 штаммов O. rhinotracheale, используемого для контрольного заражения; методика по выявлению оптимальной конструкции создаваемой вакцины (Van der Meer, 1977, 1981); определение величины белка по методу Лоури.

Применение серологических реакций для диагностики инфекционных болезней и идентификации микроорганизмов по Л.Г. Ивановой, К.И. Матвееву, Т.И. Булатову, (1968). Изучение морфологических, культуральных, биохимических свойств определяли по методам, рекомендованным А.С. Лабинской, Л.П. Блинковой, А.С. Ещиной (2004). Бактериостатическую и бактерицидную концентрации теотропина определяли методом их серийных разведений согласно «Методическим указаниям по отбору, испытаниям и оценке антивирусных и антибактериальных химиопрепаратов среди соединений различных химических классов», (Москва, 2004), а также «Методическим указаниям по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. МУК 4.2.1890-04».

Статистическую обработку результатов исследований проводили общепринятыми статистическими методами (Ашмарин, Васильев, Амбросимов, 1974; Урбах, 1975). Расчет результатов осуществляли с применением пакета прикладных программ Statistica 6.0. (for Windows; «Stat Soft Ins.», США), Microsoft Excel 2003 (for Windows XP).

3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Основные культуральные и биологические свойства референс-штаммов бактерии Ornithobacterium rhinotracheale

Для изучения возможности создания инактивированной вакцины против орнитобактериоза птиц необходимо было изучить биологические свойства этого, малоизвестного в нашей стране, инфекционного агента.

Тинкториальные свойства бактерий Ornithobacterium rhinotracheale устанавливали путем микроскопии под иммерсионной системой мазка суточной культуры, окрашенной по Грамму. Увеличение светового микроскопа составляло 10015. Электронную микроскопию проводили методом негативного контрастирования 1,5 % фосфорно-вольфрамовой кислотой (ФВК). Просматривали препараты на электронном микроскопе HV-12A (фирмы Hitachi) при ускоряющем напряжении 75 кВ и увеличении 35103. Фиксировали культуру 2 % раствором OsO4. Результаты электронного микроскопирования морфологических свойств O. rhinotracheale представлены на рис 1. При исследовании тинкториальных свойств бактерий Ornithobacterium rhinotracheale установлено, что это небольшие грамм отрицательные палочки с округлыми концами. Споры и капсулы не образуют.

Для изучения культуральной характеристики использовали тесты, которые наиболее полно характеризуют ферментативные свойства бактерий вида Ornithobacterium rhinotracheale: интенсивное синие окрашивание дисков при исследовании на оксидазу (HiMedia) свидетельствует о положительной их реакции; индол и сероводород они не образуют; на среде Симмонса цитрат не утилизируют; фермент ДНК-аза не деполимеризует ДНК. При ферментации углеводов штаммы Ornithobacterium rhinotracheale производят слабое сбраживание лактозы, глюкозы, сахарозы, мальтозы, маннита, маннозы. Установлено, что при взаимодействии с аргининдекарбоксилазой, лизиндекарбоксилазой, арабинозой, лизином, аргинином, уреазой, адонитом, сорбитом – реакция отрицательная.

Рисунок 1 - Морфологические свойства O. rhinotracheale  К 282 (увеличение 35103 )

Определение тинкториальных и фенотипических факторов на гемолитическую активность проводили на триптозо-соевом агаре (Difko) с добавлением 10 % овечьей и человеческой дефибринированной крови. Для чего культуру предварительно культивировали в течение 48ч при 37 0 С на бульоне Хоттингера. При изучении гемолитической активности не зависимо от вида донора, чья кровь была использована, зона разрушения эритроцитов не обнаружена.

3.2 Проведение сравнительного анализа ростовых характеристик бактерий вида Ornithobacterium rhinotracheale на различных питательных средах

Следующей целью исследований было проведение сравнительного анализа ростовых характеристик орнитобактерий на различных средах, предлагаемых для оптимального культивирования чистой культуры, что обусловлено необходимостью получения больших объёмов бактериальной массы для цели наших исследований. Из плотных питательных сред активный рост предоставлял кровяной агар, содержащий 5-10% дефибринированной овечьей крови, его основу могут составлять Blood agar base (bioMerieux, Франция), Purple Broth base (Difco, USA), Tryptose Blood agar base (Difco, USA). Инкубировали на агаре в чашках Петри при 37 0С в течении 48-72 часов.

Так же микроорганизмы растут на триптозо-соевом агаре фирм: (bio Merieux, Франция), Tryptose agar base (Difco, USA), на PPLO агаре (Difco, USA). Из жидких питательных сред оптимум роста предоставляют бульон Хоттингера, сердечно-мозговой экстракт и пептонная вода различных фирм-производителей.

В наших экспериментах по определению оптимальной среды культивирования установлено, что бактерии вида Ornithobacterium rhinotracheale не растут на агаре Мак Конки, Дригальского, Эндо, Симмонса.

В качестве рабочего материала использовали 48 часовую культуру, культивированную на бульоне Хоттингера. В 10 пробирках со стерильным 0,85% физиологическим раствором в объеме 9 мл производили раститровывание по 1 мл культуры с получением последующих разведений: 1*10-1, 1*10-2 , 1*10-3, 1*10-4 , 1*10-5 , 1*10-6,  1*10-7,  1*10-8, 1*10-9,  1*10-10.

После раститровывания производили посев по 1 мл из каждой пробирки на 10% кровяной агар и PPLO агар по 3 чашки на каждое разведении. Инкубировали 48 часов при 370 С.

Установлено, что показатели КОЕ на кровяном агаре более высокие. Это указывает на возможность его использования для наращивания бактериальной массы для дальнейших исследований. Оптимальное время культивирования микроорганизма на одной из выбранных нами питательных средах - 48 часов, что можно видеть на диаграмме (рис. 2).

сутки

Рисунок 2 - Характеристика роста референс-штамма Ornithobacterium rhinotracheale К 33 на обогащенной питательной среде (PPLO агаре) 

Предыдущие опыты демонстрируют, что наиболее интенсивный рост бактерий изучаемой культуры идёт на обогащённых средах PPLO-агаре и кровяном агаре. Данные среды для наработки бактериальной массы достаточно дороги и экономически невыгодны. Проанализировав результаты своих экспериментов и литературные данные, пришли к выводу, что в качестве азотно-витаминной основы конструируемой среды нужно использовать дрожжевой экстракт, пептон, в качестве источника углерода – глюкозу. Было исследовано четыре образца. Опыт проводился по следующей схеме. Суспензионная бактериальная культура Ornithobacterium rhinotracheale 1 млрд. бактериальных клеток титровали 1:10. Брали пробирку с суспензионным разведением Ornithobacterium rhinotracheale в 100 бактериальных клеток в 1 мл и производили посев на испытуемые прототипы накопительных сред. Посев производили стерильными пастеровскими пипетками, трехкратно в три чашки Петри на плотной среде.

Конструирование основы для накопительной среды:

№1 – дрожжевой экстракт-1,0 г; пептон 5,0г; глюкоза-2,0 г,

№2 – дрожжевой экстракт-2,0 г; пептон 5,0г; глюкоза-2,5 г,

№3 – дрожжевой экстракт-3,0 г; пептон 5,0г; глюкоза-3,0 г,

№4 – дрожжевой экстракт-4,0 г; пептон 5,0г; глюкоза -3,5 г.

Хорошей минеральной базой оптимального состава для бактерий вида Ornithobacterium rhinotracheale является набор солей фосфата калия двузамещенного (2,0 г) и семиводного сульфата магния (5,0 г). Соли калия, магния и фосфора стимулируют синтез микробной клетки бактерий вида Ornithobacterium rhinotracheale, а для образования бактериальных белков необходимы анионы, содержащие серу. Таким образом, данный набор солей целесообразно включить в накопительную среду в применяемых дозах.

Контроль осуществляли на МПА. Чашки Петри культивировали при 370С 48 часа. Затем производили подсчет колониеобразующих единиц (КОЕ). Результаты испытаний приведены в таблице 1.

Таблица 1 - Показатель колониеобразующих единиц на основах

накопительных сред

Основы накопительных сред

Колониеобразующие единицы (КОЕ)

Чашки Петри

1

2

3

1

2

3

1

2

3

1

2

3

№1

51

33

38



Ср 41 КОЕ



№2

54

45

50



Ср 49 КОЕ



№3

62

66

60

Ср 62 КОЕ

№4

65

65

62

Ср 64 КОЕ

Из результатов испытаний следует, что образец №4 имеет лучшие показатели по КОЕ. Таким образом, питательной основой конструируемой среды будет дрожжевой экстракт, пептон, глюкоза.

В результате вышеизложенных исследований, сконструированная нами накопительная среда для бактерий Ornithobacterium rhinotracheale имеет следующий состав: мясопептонный агар – 1000 мл, дрожжевой экстракт – 4,0 г, пептон – 5,0 г, глюкоза – 3,5 г, К2НРО4 – 2,0 г, МgSО4 – 5,0 г.

Способ приготовления: в 1000 мл стерильного и охлажденного до 450 С мясопептонного агара добавляли дрожжевой экстракт и пептон. Затем вносили калий фосфорнокислый двузамещенный, магния сульфат и глюкозу. Кипятили 2-3 минуты, при постоянном помешивании. После этого горячую среду фильтровали через ватно-марлевый фильтр. Стерилизовали при 1000 С 20 минут.

3.3 Расчет оптимального времени культивирования бактерий вида Ornithobacterium rhinotracheale на среде накопления

Опыты проводили по следующей схеме. Суспензионная бактериальная культура Ornithobacterium rhinotracheale 1 млрд. бактериальных клеток подвергалась титрованию 1:10. В результате титрования получали ряд пробирок с бактериальной суспензией Ornithobacterium rhinotracheale на физиологическом растворе.  В накопительную среду 5 мл в пробирке, внесли 1 мл бактериальной суспензии Ornithobacterium rhinotracheale на физиологическом растворе в объеме 10 клеток в 1 мл. Культивировали при 370 С, отбор проб для подсчета КОЕ проводили через 18, 24, 36, 48, 60, 72 часов. Бактериальную суспензию 1 мл брали из пробирки со средой накопления, разбавляли в 9 мл физиологического раствора, затем производили посев по 1 мл бактериальной суспензии на физиологическом растворе в 10 чашек Петри с МПА. Производили подсчет КОЕ в 10 чашках, начиная с 18 часов культивирования с интервалом 12 часов в течение 3 суток. Результаты приведены в таблице 2.

Таблица 2 - Показатель КОЕ в различные временные периоды

культивирования

Штаммы Ornithobacterium rhinotracheale

КОЕ

18 ч

24 ч

36 ч

48 ч

60 ч

72 ч

1

К 33

19

150

276

392

396

399

2

К 282

41

101

231

389

389

382

Примечание: приведены общее количество КОЕ по 10 чашкам Петри.

Полученные результаты указывают, что резкое увеличение количества КОЕ наблюдается к 48 часам. Как вывод - оптимальное время культивирования бактерий вида Ornithobacterium rhinotracheale на накопительной среде составляет 48 часов.

3.4 Изучение бактерицидного и бактериостатического действия теотропина

Результаты исследований свидетельствуют, что дозы изучаемого препарата в 5,0 и 7,5 мг/мл  обладали бактериостатическим, но не бактерицидным действием. Бактериостатическое действие препарата проверяли методом контрольного высева бактериальных культур взаимодействующих с изучаемым препаратом в различные промежутки времени от 1 до 5 часов без освобождения их от буферного раствора, содержащего препарат. Бактерицидную активность теотропина определяли методом контрольного высева бактериальной суспензии, но после освобождения её от буферного раствора, содержащего препарат. Центрифугированием осаждали бактериальные клетки, надосадок с теотропином удаляли, осадок ресуспендировали в свободном от препарата физиологическом растворе и опять центрифугировали. Данную процедуру повторяли двукратно. После последнего ресуспендирования и часовой экспозиции раствора с бактериями высевали на твёрдые питательные среды. В результате проведённых исследований установлено, что препарат теотропин в дозе 5 мг/мл при концентрации бактерий в 1010 м.т. после пяти часовой экспозиции обладает бактериостатическим действием по отношению к бактериальной культуре указанных видов микроорганизмов. Доза препарата в 7,5 мг/мл является бактериостатической при трех часовой экспозиции. Доза в 10 мг/мл после восемнадцати часовой экспозиции с бактериальной культурой концентрацией 1010 микробных тел является бактерицидным для данного вида бактерий и возможна как инактиватор для производства инактивированных вакцин из бактериальной массы Ornithobacterium rhinotracheale.

3.5 Принципиальная технологическая схема изготовления инактивированной вакцинного препарата из бактерий Ornithobacterium rhinotracheale и проверка его антигенной эффективности

Для изготовления инактивированной вакцины были выбраны в качестве адъювантов два отечественных адъюванта - гидрат окиси алюминия и алюмокалиевые квасцы, а так же полный адъюванта Фрейда (Difco). Технология их изготовления была проведена по общепринятым методикам.

Исследование  образца  включал следующие этапы: после инактивации теотропином бактериальной суспензии концентрацией 1010 м. т. в емкость добавляли гель гидрата окиси алюминия (ГОА) 6%  раствора (при рН 7,2-7,4) до концентрации 20 – 30 % к объему. Далее проводили сорбцию в течение 10-12 часов при комнатной температуре при периодическом перемешивании, затем фа­совали в стерильные флаконы по 10 мл, укупоривали стерильными ре­зиновыми пробками и обкатывали алюминиевыми колпачками.

Во вторую часть инактивированной бактериальной суспензии добавля­ли 0,1 % алюмокалиевых квасцов и 0,1 % хлористого кальция в виде 10 % раствора с рН 7,2-7,4 и проводили сорбцию в течение 10-12 часов при комнатной температуре при периодическом перемешивании, а затем также фасовали.

В третью часть инактивированной бактериальной суспензии добавляли полный адъювант Фрейда до 20 % к объему, ресуспендировали с помощью шприца, выдерживали в течение 1-2 часов при комнатной температуре при периодическом перемешивании и фасовали во флаконы.

В опыте были задействованы 4 группы кроликов, по 3 особей в каждой, породы «Шиншилла» со средним весом 3 кг и один интактный кролик для получения контрольной сыворотки. Первой группе кроликов вводили антиген без адъювантов (1), второй – второй антигенный препарат (2), третьей – третий антигенный препарат (3), четвертой – первый антигенный препарат с адъювантом Фрейда (4).

Схема иммунизации кроликов.

Антигенные препараты вводили внутримышечно кроликам через каждые 3 дня по 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25 и 1,5 мл. Искомые сыворотки контролировали на 10, 15 и 20 дни. Получали сыворотки на 26 день гипериммунизации. Для выяснения антигенного действия применяемых суспензий определяли динамику образования агглютининов в ответ на гипериммунизации кроликов с помощью пробирочного метода РА. Через 18 часов инкубации в термостате при 37 0 С учитывали реакцию агглютинации невооруженным глазом по степени прозрачности. Установили, что титр антител, регистрируемых в РА, имеет значительную разницу при гипериммунизации различными антигенными препаратами.

Установлено, что максимальная величина титра антител наблюдается в ответ на введение антигена с адьювантом Фрейда и равна к 10 дню гипериммунизации 1:80. К 20 дню титр антител вырос до 1:320 и оставался самым высоким. Дальнейшее изучение антигенных свойств у полученных препаратов было направлено на выяснение их антигенного состава с целью выбора лучшего препарата. Для этого нами была использована реакция диффузионной преципитации (РДП). В настоящее время разработано несколько методов постановки РДП. Мы для своих исследований использовали реакцию иммунодиффузии (РИД) по Оухтерлони в модификации Остермана. Данную реакцию проводили в агаровом геле на предметных стеклах. Гелевую среду готовили из очищенного агара фирмы «Difco».

Результаты свидетельствуют, что при использовании указанных адъювантов эффективность антигенной активности выявленной данным методом незначительна. В образце, где в качестве антигена выступал вакцинный препарат с адъювантом Фрейда, количество линий преципитации ограничилось двумя. Последующие образцы показали ещё более слабую антигенную активность конструированных вакцинных препаратов.

В связи с полученными результатами, нами были проведены дополнительные эксперименты с целью улучшения антигенные свойства вакцинного препарата. Для этого было необходимо использовать в качестве протективного антигена не только поверхностные антигенные детерминантные структуры, но и внутриклеточные антигенные комплексы.

3.6 Разработка методов дезинтеграции бактериальной клетки Ornithobacterium rhinotracheale

Выше сформулированная задача заключалась в получении разрушенной суспензии бактериальной клетки Ornithobacterium rhinotracheale. Необходимость в этом была обусловлена изучением возможности использования в качестве вакцинного препарата дезинтеграта разрушенной бактерии, учитывая, что в данном препарате  в качестве протективного антигена будут использованы антигенные детерминанты  не только поверхностных, но и внутренних клеточных структур – рибосом, клеточных мембран, цитоплазматической фракции. Согласно литературным данным наиболее оптимальным вариантом для решения поставленной задачи явилось бы применение криогенного метода дезинтеграции, позволяющего получить клеточные компоненты при минимальной потере их биологических свойств. Одним из методов криогенной дезинтеграции является способ разрушения бактериальных клеток, предложенный Грассе.

Проведённая нами проверка данного способа с целью применения его для целей исследований показала, что 24 кратное замораживание и оттаивание бактериальной культуры Ornithobacterium rhinotracheale не обеспечивает высокого процента разрушения бактериальных клеток. Увеличение числа манипуляций по замораживанию-оттаиванию не принесло значительного увеличения процента разрушенных клеток. Результаты титрования исходной бактериальной суспензии и полученного разрушенного препарата свидетельствовали, что показатель дезинтеграции был по-прежнему низок (до 10-15 %) и не мог отвечать требованиям, необходимых для проведения исследований.

Поэтому возникла необходимость перейти к другому способу дезинтеграции, который бы позволил получить больший процент разрушенных клеток. Одним из таких способов явилась дезинтеграция бактерий с помощью ультразвука. Режимы УЗ-дезинтеграции бактерий вида Ornithobacterium rhinotracheale подбирали в экспериментах. В 14 проведённых опытах, варьируя показатели концентрации бактериальной суспензии, время воздействия, амплитуду зонда, способы охлаждения суспензии, был определён оптимальный режим разрушения бактериальной клетки, заключающийся в следующем: бактериальную суспензию концентрацией 10,0 млрд. м. к. в 1 мл дистиллированной воды с рН – 7,2, подвергали ультразвуковой обработке на дезинтеграторе фирмы MSE (Англия) с амплитудой зонда - 6 мк, временем обработки – 10 мин, объём суспензии – 18-20 мл. В качестве охлаждающей смеси стакана дезинтегратора использовали смесь спирта со льдом. Эффективность разрушения бактериальных клеток оценивали по данным световой микроскопии, а также данным подсчёта жизнеспособных клеток в исходной и разрушительной клеточной суспензии, путём титрования и высева их на питательные среды - МПА.

В проведённых экспериментах при вышеуказанных режимах дезинтеграции показатель величины разрушения бактериальной клетки доходил до 90 %.

3.7 Изучение иммуногенных свойств разрушенной бактериальной клетки вида Ornithobacterium rhinotracheale

Полученный дезинтеграт бактериальной клетки был изучен в иммунологических опытах на животных, с целью выбора из экспериментальных групп препарата обладающего наиболее выраженными протективными свойствами.

  Для проведения экспериментов по созданию вакцины необходимо было рассчитать величины LD50 штамма Ornithobacterium rhinotracheale, используемого для контрольного заражения. Опыт провели на 72 мышах, полученные данные обсчитывали по методу Кербера и установили, что при внутрибрюшинном заражении LD50 составил 2,3 млн. м.к. в мл, при подкожном - 6,8 млн. м.к. в мл. После этого приступили к опытам по иммунизации.

Результаты проведённых экспериментов, позволили сделать однозначный вывод, что дезинтеграционные структуры бактериальных клеток орнитобактерий обладают протективными свойствами, но величина их активности различна. Один из опытов представлен в таблице 3.

Таблица 3 - Протективная активность изучаемых препаратов при п/к

иммунизации на белых мышах при подкожном контроль  заражении гомологичным штаммом дозой 4 LD 50.

№ п/п

Иммунизирующий препарат

Доза (мг белка)

Количество животных

Результат

(выжило)

1

Не инактивированный дезинтеграт

1,25

12

10

2

Дезинтеграт инактивированный теотропином

0,7

25

12

3

Целые клетки инактивированные Т-100С

2,8

11

5

4

Целые клетки инактивированные теотропином

2,8

11

4

5

Живая культура

20 млн.м.т.

20

1

Полученные в серии экспериментов данные указывают, что не инактивированный теотропином дезинтеграт обладает более высокими протективными свойствами, чем дезинтеграт инактивированный теотропином. Возможно, это объясняется тем, что препараты из не инактивированного дезинтеграта содержат живые бактерии, что повышает его протективные свойства. Препараты из целых, инактивированных различными способами бактериальных клеток вида Ornithobacterium rhinotracheale, обладают меньшими протективными свойствами. Суммарные показатели экспериментов по конструированию вакцины из обработанного теотропином дезинтеграта свидетельствует, что из 56 белых мышей иммунизированных дезинтегратом, после контрольного заражения выжило 31, т.е. более 50 %. У препарата с целыми инактивированными клетками данное соотношение значительно хуже – 27:11.

3.8 Конструирование вакцинного препарата

Результаты выше описанных опытов дали положительный ответ на вопрос о наличии протективных свойств у изучаемых препаратов. Поэтому в дальнейших исследованиях задача была расширена. В экспериментах применяли различные комбинирования клеточных структур с новыми адьювантными иммуностимулирующими веществами (табл. 4), так как уже использованные ранее адъюванты не показали достаточного эффекта. Это было необходимым для поиска оптимальной конструкции возможного вакцинного препарата.

Интересные данные ожидали получить при использовании таких веществ как «Декстран Т–500», «ПВП» и «Конкавалин – А». Схема опыта была поставлена по методике, предложенной голландской группой C.V.Der Meer (1977, 1980). Указанные препараты использовались в расчёте 50 мг на 1 кг живого веса. Результаты проведённого опыта указывают (табл. 4), что иммунная эффективность данной конструкции практически равна нулю.

Таблица 4 - Протективная активность препаратов из различных комбинаций

изучаемых препаратов при в/б иммунизации белых мышей

№ п/п

Иммунизирующий препарат

Доза

(мг белка)

Количество животных

Доза

контрольного заражения

LD 50

Результат

(выжило)

1

Инактивированный дезинтеграт + ДТ – 500

0,1

10

10

1

2

Инактивированный дезинтеграт + КОН – А

0,1

10

10

0

3

Инактивированный дезинтеграт

0,1

15

10

8

4

Инактивированный дезинтеграт + ПВП

0,1

10

10

0

5

Буферный раствор

0,5

9

10

2

Во всех иммунологических опытах хорошие результаты продемонстрировал препарат, состоящий из дезинтеграта бактериальной клетки, инактивированного теотропином. Данное сочетание в схемах иммунизации свидетельствовало, что конструкция данной вакцины обладает достаточными протективными свойствами, создавая защиту у животных против контрольного заражения дозой 10 LD50 практически у половины иммунизированных животных.

3.9 Проверка создаваемого биопрепарата его на безвредность

Особым вопросом при создании вакцинного препарата является его реактогенность. Как правило, вакцина считается мало реактогенна, если реакция на её введение вызывает повышение температуры тела на 1-1,5 0С в течение 1-2 дня. Средняя реактогенность препарата считается при повышении температуры до 1,8- 2,0 0 С на тот же срок.

Выбранную нами в предыдущих экспериментах питательную среду для культивирования Ornithobacterium rhinotracheale мы использовали для наработки бактериальной массы в режимах указанных выше. После культивирования смывали физиологическим раствором и  центрифугировали в режиме 3000 оборотов в минуту на центрифуге СМ6М. Надосадок удаляли, осадок ресуспендировали в физиологическом растворе и повторяли центрифугирование в аналогичном режиме. Полученную концентрацию бактерий по стандарту мутности с последующим титрованием доводили до величины 1010 микроорганизмов в 1 мл суспензии. Далее для проверки безвредности биопрепарата провели исследования на кроликах. Для этого бактериальную суспензию, инактивированную теотропином, в указанной концентрации, раствор теотропина в исходной концентрации и, для контроля, физиологический раствор вводили внутрикожно кроликам, выщипав предварительно участок кожного покрова от шерсти, в объёме 0,1 мл, определяя тем самым показатели дермонекротической реакции. Результаты анализировали в течение 7 дней.

По нашим данным, введение раствора теотропина и физиологического раствора не вызвало продолжительной дермонекротической реакции. Поверхность кожного покрова была неизменной, как и перед экспериментом.

Третий - же препарат инактивированная суспензия бактерий Ornithobacterium rhinotracheale вызвала покраснение участка кожи на месте введения, припухлость и локальное незначительное повышение температуры, что характерно для воспалительного процесса. Наблюдение в течение 7 дней показало, что данные изменения к началу 4 дня прекратились. Явления некроза кожи не наблюдалось, при пальпации припухлость не прощупывалась, однако гиперемия наблюдалась все 7 дней. При внутримышечном введении дезинтеграта с теотропином в исследуемой дозе отмечалось повышение температуры тела животных в среднем на 1,5 0 С. Установлено, что пирогенное действие изучаемого препарата было кратковременным: к концу двух суток температура тела у подопытных животных понизилась до нормы. Гиперемия кожного покрова продолжалась в течение четырех дней и к началу пятого дня прекратилась. Полученные результаты свидетельствуют, что экспериментальные вакцинные биопрепараты Ornithobacterium  rhinotracheale  не обладают дермонекротической реакцией, ареактогенны и безвредны для макроорганизма в указанных дозах.

ВЫВОДЫ

1. Охарактеризованы основные биологические свойства бактерий O. rhinotracheale (по данным электронной микроскопии  - это короткие палочки с округлыми концами, спор и капсул не образуют; установлено отсутствие способности образовывать индол, сероводород и утилизировать цитрат; гемолитическая активность не выявлена; при взаимодействии с лактозой, сахарозой, глюкозой, маннозой, маннитом, оксидазой – реакция положительная, при взаимодействии с аргининдекарбоксилазой, лизиндекарбоксилазой, арабинозой, лизином, аргинином, уреазой, адонитом, сорбитом – реакция отрицательная).

2. Разработана питательная среда для наработки бактериальной массы O. rhinotracheale с целью получения инактивированного антигена: мясопептонный агар – 1000 мл; дрожжевой экстракт - 4,0 г; пептон - 5,0 г; глюкоза - 3,5 г; К2НРО4 – 2,0 г; МgSО4 – 5,0 г.

3. Определена бактерицидная доза препарата теотропина в 10 мг/мл после восемнадцати часовой экспозиции с бактериальной культурой Ornithobacterium rhinotracheale с концентрацией 1010 микробных тел.

4. Исследована возможность создания вакцинного препарата против орнитобактериоза при сочетании ультразвукового дезинтеграта бактерий и теотропина. Установлено, что дезинтеграционные структуры бактериальных клеток орнитобактерий обладают протективными свойствами, но величина их активности различна.

5. Экспериментальные биопрепараты из бактерий Ornithobacterium  rhinotracheale  не обладают дермонекротической реакцией, ареактогенены и безвредны для макроорганизма, что дает возможность сконструировать ареактогенный вакцинный препарат.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для наработки максимально возможного количества бактериальной массы O. rhinotracheale рекомендуем использовать сконструированную нами накопительную питательную среду.

2. Разработанную схему создания протективного антигена O. rhinotracheale рекомендуем использовать при изготовлении инактивированной вакцины против орнитобактериоза.

3. Материалы научных исследований, полученные в рамках диссертационных исследований, используются в учебном процессе студентов на факультете ветеринарной медицины ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина».

Список работ, опубликованных по теме диссертации

  1. Курьянова Н.Х. Орнитобактериоза – заболевание птицы / А.С. Разорвина, Н.Х.Курьянова, Н.И. Молофеева, Д.А. Васильев // Материалы Международной научно-практической конференции. Технологический институт (филиал) ГОУ ВПО «УГСХА» – Димитровград, 2008.
  2. Курьянова Н.Х. Тинкториальные и биологические свойства Ornithobacterium rhinotracheale, используемые для идентификации / Н.Х Курьянова, А.С. Разорвина, Н.И. Молофеева, Д.А. Васильев // Материалы Международной научно-практической конференции на тему Актуальные вопросы аграрной науки и образования, посвященной 65-летию УГСХА, эпизоотологии, ВСЭ, биотехнологии – Ульяновск, 2008.
  3. Курьянова Н.Х. Проблемы биологической диагностики орнитобактериоза / Н.Х. Курьянова, Н.И. Молофеева, Д.А. Васильев // Научный вестник – Димитровград, 2009.
  4. Курьянова Н.Х. Дезинфектология и ее проблемы // Наука в современных условиях: от идеи до внедрения: материалы международной научно-практической конференции - Димитровград, 2009.
  5. Курьянова Н.Х. Характеристика теотропина как дезинфицирующего средства / Н.Х. Курьянова Н.Х., Н.А. Феоктистова, Д.А. Васильев // Материалы Международной научно-практической конференции «Аграрная и пути их решения» - Ульяновск, 2009.
  6. Курьянова Н.Х. Воздействие теотропина на бактерии видов Bacillus cereus и Bacillus subtilis / Н.Х. Курьянова, А.И. Калдыркаев, А.Х. Мустафин, Н.А. Феоктистова, Д.А. Васильев // Материалы Международной научно-практической конференции «Аграрная и пути их решения» - Ульяновск, 2009.
  7. Курьянова Н.Х. Безопасный дезинфектант нового поколения – препарат «Теотропин» // Наука в современных условиях: от идеи до внедрения: материалы международной научно-практической конференции - Димитровград, 2010.
  8. Курьянова Н.Х. Воздействие теотропина на бактерии видов и родов Esherihia сoli, Staphilococcus аureus, Salmonella / Н.Х. Курьянова, Н.А. Феоктистова, Д.А. Васильев // Наука в современных условиях: от идеи до внедрения: материалы международной научно-практической конференции - Димитровград, 2010.
  9. Курьянова Н.Х. Изучение бактерицидного и бактериостатистического действия теотропина // Наука в современных условиях: от идеи до внедрения: материалы международной научно-практической конференции - Димитровград, 2011.
  10. Курьянова Н.Х. Изучение бактерицидного и бактериостатического действия теотропина на микрооганизмы различной морфологической структуры / Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин, И.Н. Хайруллин, Н.А. Феоктистова, Н.Х. Курьянова // Вестник УГСХА. - № 1. – С.75-79.

Курьянова Назия Хусаиновна

«Разработка биотехнологических параметров по получению

протективного инактивированного антигена

Ornithobacterium rhinotracheale»

Автореферат

03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Диссертации на соискание уче6ной степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 07.09.2012. Формат 60х90/16. Бумага писчая.

Усл. печ.л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ №72.

ДИТИ НИЯУ МИФИ РИО,

433510, Димитровград, ул. Куйбышева, 294.




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.