WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

       

Попова Светлана Валентиновна

ПРИМЕНЕНИЕ НАТИВНЫХ И ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ

АНТИГЕНОВ В КАЧЕСТВЕ БИОЛИГАНДОВ В ГИДРОЗОЛЬНЫХ ПРЕПАРАТАХ ДЛЯ ЭКСПРЕССНОЙ ИММУНОДИАГНОСТИКИ

03.01.06 – биотехнология

(в том числе и бионанотехнологии)

 

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2012

Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Кировская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития РФ (ГБОУ ВПО КГМА).

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор

  Мешандин Алексей Гаврилович

Официальные оппоненты:

Гаврилов Владимир Андреевич - доктор ветеринарных наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина»,  профессор  кафедры биотехнологии.

Виха Галина Васильевна - доктор биологических наук, некоммерческая организация учреждение (НОУ) «Институт диагностики и профилактики социально значимых заболеваний, заместитель директора по науке.

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Удмуртский государственный университет», г. Ижевск.

Защита состоится «____»  2012 г. в часов на заседании Диссертационного Совета Д 220.042.01 при ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И.Скрябина» по адресу: 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, 23 (ФГБОУ ВПО МГАВМиБ); тел. (495) 377-93-83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО МГАВМиБ

 

Автореферат разослан « » _____________ 2012 года

Ученый секретарь диссертационного

совета, профессор Грязнева Т. Н.

 

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность темы. Наметившиеся новые тенденции в медицине XI века ориентированы на профилактику и выявление ранних нарушений показателей здоровья, поэтому в настоящее время требуется новая тактика лабораторных исследований и необходима диагностика, позволяющая выявлять контингенты повышенного риска патологий, методические приемы, в том числе упрощенные для массовых исследований и контроля реабилитации. Наиболее перспективной является разработка новых высокоинформативных чувствительных и специфичных способов диагностики. При этом особое место должно отводиться методам профилактического обследования населения с целью раннего выявления заболевания, что диктует необходимость повышения требований к показателям диагностической эффективности скрининговых тестов (Дмитриев Г.А., Фриго Н.В., 2004; Лосева О. К., Ловенецкий А.Н., 2002).

Следовательно, актуальны простые по исполнению методы, позволяющие обнаружить причинные антигены и маркеры в минимальных и следовых количествах в большом объеме анализируемых образцов в различных стадиях течения заболевания. В сфере первичной помощи пациентам экспресс-диагностика может существенно улучшить исходы заболеваний за счет более широкого скрининга с целью выявления пациентов, которые нуждаются в применении специального обследования, а также за счет систематического мониторинга (включая самомониторинг) эффекта лечебных мер у амбулаторных больных.

Таким образом, основным предметом нашего исследования стали изучение применения нативных и рекомбинантных антигенов, в качестве биолигандов в гидрозольных препаратах для экспрессной иммунодиагностики.

Цель работы. Разработка и апробация нового оригинального экспресс метода с применением нативных и генно-инженерных антигенов в реакции гидрозольной агглютинации для выявления антител к вирусам гепатита псовых, птичьего гриппа, к микобактериям туберкулёза, детекции хорионического гонадотропина человека в тесте на беременность.

Задачи исследования:

  1. Разработать гидрозольные антигенные диагностикумы для выявления антител к вирусу гепатита псовых, птичьего гриппа, M.tuberculosis.
  2. Изучить возможность применения гидрозольных диагностикумов с нативными и генно-инженерными антигенами с целью обнаружения антител в исследуемом материале.
  3. Разработать гидрозольный антительный диагностикум для выявления антигена хорионического гонадотропина человека (ХГЧ).
  4. Определить диагностическую ценность реакции гидрозольной агглютинации для диагностики ряда заболеваний.

       Научная новизна работы. Впервые разработана технология получения гидрозольных препаратов на основе коллоидных растворов оксида железа (Fе3O4) и гексацианферрата (II) железа (III), проведена их сравнительная характеристика. Доказана целесообразность и эффективность их применения для детекции в исследуемом материале:

  1. Антител к вирусу гепатита псовых.
  2. Антител к вирусу птичьего гриппа.
  3. Антител к M. tuberculosis.
  4. Антигена хорионического гонадотропина человека (ХГЧ).

Научно-практическая значимость работы. На основании полученных результатов исследования осуществлён синтез основных реагентов для экспресс-тестов, показана простота и экономичность постановки анализа, достаточная чувствительность и специфичность реакции гидрозольной агглютинации в выявлении антител к вирусам гепатита псовых, птичьего гриппа, M. tuberculosis, антигена хорионического гонадотропина человека, что позволяет рекомендовать разработанные нами экспресс-тесты для использования в ветеринарии и медицинской практике.

Апробация работы. Результаты работы и основные положения диссертации доложены и обсуждены на научных и научно – практических конференциях: V съезде общества биотехнологов России им. Ю.А.Овчинникова (Москва, 2008); XI межрегиональной научно-практической конференции молодых учёных и студентов с международным участием «Молодёжь и медицинская наука в XXI веке» (Киров, 2009); IV Всероссийской итоговой студенческой научной конференции (Самара, 2010); V Международной (XIV Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции (Москва, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, из которых 4 – в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждений, выводов, практических предложений, списка использованной литературы (105 источников, из них 27 - иностранных авторов), приложений. Работа изложена на 119 страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц, 8 рисунков.

Основные положения, выносимые на защиту:

  1. Реакция  гидрозоля, нагруженного соответствующим антигеном, может быть использована для обнаружения антител к вирусу гепатита у собак, вирусу H5N1 птичьего гриппа, M. Tuberculosis.
  2. Реакция гидрозоля, нагруженного мышиными моноклональными антителами к бета-субъединице ХГЧ, может быть использована для обнаружения антигена хорионического гонадотропина человека в тесте на беременность.
  3. Реакция гидрозольной агглютинации при выявлении в сыворотке крови и капиллярной крови антител к M. Tuberculosis по своим основным характеристикам не уступает традиционным микробиологическим методам.
  4. Гидрозоль на основе гексацианферрат (II) железа (III) обеспечивает наиболее оптимальный комплекс иммунохимических свойств разработанных тестов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена на кафедре общей химии ГБОУ ВПО КГМА в период с 2007 по 2012 г.г. Ряд исследований проведены на базах ОАО НПП «АВИВАК» (С.-Петербург); НИИ Гриппа РАМН (С.-Петербург); клинических лабораторий больниц: ФГУ ЛИУ – 12 по Кировской области и КОГБУЗ Кировской областной клинической больницы.

Объектами исследований являлись гидрозольные реагенты, используемые в реакции гидрозольной агглютинации (РГЗА).

Для исследования нами были изготовлены гидрозоли, нагруженные нативными и генно-инженерными антигенами (с целью выявления антител в сыворотке крови) и мышиными моноклональными антителами к бета-субъединице ХГЧ (с целью обнаружения антигена), состав которых был следующим:

I. Твёрдофазные носители (табл. 1):

Таблица 1- Твердофазные носители в качестве основы для гидрозольных диагностикумов

Тип пигмента, формула

Плотность,

г/см3

Размер частиц, нм

Цвет

1.

Гексацианоферрат (II) железа (III) или «берлинская» лазурь

Fe4[Fe(CN)6] 3

1,92

80-200

Синий

2.

Оксид железа Fe3O4

4,73

200-500

Коричневый

II. Модификатор для твердой фазы гидрозольных диагностикумов HgCl2.

III. Биолиганды (табл. 2):

Таблица 2- Биолиганды, использованные в РГЗА

Тип биолиганда

Область применения

1.

Лизат антигенов гепатита псовых (Киров, ГСХА)

Для диагностики инфекционного гепатита у животных.

2.

Антигены вирусов гриппа (H5N1) (вируса птичьего гриппа), производства НИИ гриппа РАМН, Санкт -  Петербурга

Для диагностики птичьего гриппа

3.

Рекомбинантные  антигены туберкулёза, полученные с помощью генно-инженерных технологий (BL(DT3)/pCFP-ESAT), Покровский завод биопрепаратов, Владимирская область

Для диагностики

туберкулёза

4.

Комплексный туберкулезный антиген – диагностикум ППД производства Санкт - Петербургского НИИ вакцин и сывороток им. Мечникова

Для диагностики

туберкулёза

5.

Моноклональные антитела к бета-субъединице хорионического гонадотропина, ООО «Прогрес-сивные биомедицинские технологии», Москва

Для диагностики беременности у женщин





Методика по изготовлению гидрозолей для исследования состояла из нескольких этапов. Сначала выполняли синтез твёрдых фаз: Fe4 [Fe(CN)6]3 и Fe3O4. Далее твёрдые фазы модифицировали 2% НgСl2, после чего осуществляли хемосорбцию исследуемых биолигандов.

Объекты исследований. Для исследования в качестве биологических материалов использовали гепаринизированную кровь подопытных привитых и непривитых животных, сыворотки крови больных людей с верифицированным диагнозом, сыворотки крови и мочу беременных женщин, сыворотки крови и мочу здоровых доноров в объёме 8 - 20 мкл. Сыворотку получали путём центрифугирования крови,  допускалось взятие крови капиллярным способом.

       Принцип реакции гидрозольной агглютинации (РГЗА) заключался в следующем: протекающая на молекулярном уровне реакция взаимодействия антигена с антителами должна приводить к развитию явлений, доступных наблюдению невооружённым глазом. Эту задачу удаётся решить, опираясь на факты множественности антигенных детерминант, а также на наличие двух областей связывания антигена у каждой молекулы антитела. Если частицы нагрузить антителами, то в силу бивалентности антител происходит их связывание или агглютинация. Образование даже небольших агрегатов приводит к их быстрому и хорошо заметному осаждению из суспензии. При смешивании разбавленных сывороток или крови с взвесью таких поливалентных частиц даже ничтожная концентрация антигена достаточна для возникновения заметной агглютинации. Она обнаруживает себя тем, что частицы не оседают на сферическое дно лунки планшета в виде маленького сгустка, а выстилает ровным слоем всю поверхность твёрдой фазы (лунок планшета). При визуализации реакции на фильтровальной бумаге «красная лента» мы получали следующую картину: при положительной реакции – плотный, компактный комплекс с чёткой границей; при отрицательной реакции – распределение частиц реагирующих веществ без чёткой границы в виде пятна.

Для постановки РГЗА использовали U-образные иммунологические планшеты, в лунках которых разводили и титровали сыворотки крови, капиллярную кровь, мочу брали без разведения. Затем вносили равные аликвоты гидрозоля, перемешивали с помощью пипеточного дозатора. Через 5-10 минут осуществляли регистрацию результатов в планшете и на пористом носителе - фильтровальной бумаге (рис. 1, 2).

  U-образный планшет

  1:25

  1:50

  1:100

  1:200

  1:400

  1:800

1:1600

А Б

       

 

  А Б

Рис. 2. Визуализация результатов на фильтровальной бумаге

А – отрицательная сыворотка, Б – положительная сыворотка

       Для сравнения мы применяли следующие референс-методы: микробиологические методы (микроскопия мазка и культуральный метод); хемилюминисцентный метод (анализатор CENTAUR); иммунохроматографический экспресс - метод (ИМХР) (тест-полоски с коллоидным золотом в качестве метки).

       Полученные результаты обработаны статистическими методами. При сравнении качественных признаков применялся критерий Мак-Нимара, при помощи метода распределения 2 (хи-квадрат) определяли теоретическую частоту положительных результатов эксперимента при равномерном распределении. Для выявления вида зависимости титра от концентрации применялся регрессионный анализ. Для определения диагностической ценности тестов использованных в работе, рассчитаны операционные характеристики: диагностическая чувствительность (Se), диагностическая специфичность (Sp). Для расчета использованы следующие формулы: Se =а/(а+с)100%,  Sp =d/(d+b)100%, где а –  истинноположительный результат, b – ложноположительный результат, с –  ложноотрицательный результат, d –  истинноотрицательный результат (J. Geerling, 1998).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследование гидрозольных препаратов в задачах выявления

антител к вирусу гепатита псовых в сыворотке крови

Для определения эффективности РГЗА при диагностике вирусного гепатита у собак с применением двух гидрозолей нами была изучена частота обнаружения сывороточных антител и их уровень у 5 непривитых и 6 привитых собаках спустя 3-9 месяцев после прививки (образцы крови были предоставлены ветеринарной клиникой г. Кирова). Первый антигенный гидрозольный диагностикум взят на основе гексацианферрата II железа III (Fe 4 [Fe(CN) 6] 3), или «берлинская лазурь», второй - оксида железа (Fe3O4), на поверхности которых адсорбировали антиген вируса гепатита псовых в соотношении 10 мкг антигена по белку (1мг/мл) на 1 мл исходного гидрозоля (по выше указанной методике). Таким образом получали гидрозоли, с которыми проводили реакцию гидрозольной агглютинации. Подлежащую тестированию гепаринизированную кпиллярную кровь собак (8 мкл) титровали с двойным шагом в лунках U-образных полистирольных планшетов. Далее в лунки вносили по 20 мкл гидрозоля, содержимое перемешивали с помощью пипеточного дозатора. Затем учитывали результат: в лунках самого планшета в интервале от 0,5 до 5 минут и на фильтровальной бумаге, путем переноса по 5 мкл смеси кровь+гидрозоль на фильтровальную целлюлозную бумагу с подложкой. Для эксперимента брали разведения: 1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600. Данные полученных серопозитивных и серонегативных результатов в РГЗА представлены в табл. 3.

Таблица 3- Выявляемость антител к вирусу гепатита псовых в сыворотке

крови привитых собак с гидрозольными препаратами

Объекты исследования

Гидрозольные препараты на основе:

Гексацианферрата II железа III («берлинской лазури»)

(Fe 4 [Fe(CN) 6] 3)

Оксида железа (Fе3O4)

Привитые собаки от гепатита псовых: 6 проб крови

«+» - результаты в реакции гидрозольной агглютинации в титре от 1:25 до 1:400

«+» - результаты в реакции гидрозольной агглютинации в титре от 1:25 до 1:200

Контрольная группа непривитых собак: 5 проб крови

«-» - результаты в реакции гидрозольной агглютинации

«-» - результаты в реакции гидрозольной агглютинации

Время реакции 1-10 минут

Цвет реакции – синий

Цвет реакции - коричневый

Диагностические титры специфических антител определялись в 6 пробах у всех привитых собак с обоими гидрозолями. При этом установлено, что определяемый максимальный титр специфических антител к вирусу гепатита псовых с гидрозолем на основе «берлинской лазури» достигал величины 1:400, а с оксидом железа (Fe3O4) – 1:200. Так, титр антител с помощью первого гидрозоля выявлялся в 2 раза выше (р<0,01), чем со вторым. Достоверность отличий между группами в РГЗА по критерию хи-квадрат составил p=0,007.

Таким образом, сравнивая полученные из такой небольшой выборки данные РГЗА с помощью вышеперечисленных объектов, установлены условно - диагностические титры для суммарных антител к вирусу гепатита псовых у вакцинированных собак (от 1:25 до 1:400). Кроме того, было установлено, что результативность реакции с гидрозолем «берлинской лазури» выше в сравнении с реакцией с гидрозолем оксида железа (Fe3O4).

Исследование гидрозольных препаратов в задачах выявления антител к вирусу H5N1 (птичьего гриппа) в сыворотке крови

       Для обнаружения антител в сыворотке крови проводили РГЗА только на основе «берлинской лазури», модифицированной катионами Hg2+,на поверхности которого адсорбировали специфические, в нашем случае гриппозные антигены. Готовили три гидрозоля с различным содержанием антигена H5N1: 1-й - 5 мкг, 2-й - 50 мкг, 3-й - 100 мкг по белку (10мг/мл) на 1 мл исходного гидрозоля. Подлежащие тестированию сыворотки (10 мкл) с двойным шагом в лунках U-образных полистирольных планшетов титровали от 1:20 до 1:1280. Далее вносили в лунки по 20 мкл гидрозоля и через 2-10 минут производили учет результатов. Его осуществляли путем переноса по 5 мкл смеси сыворотка+гидрозоль на фильтровальную бумагу. Результаты представлены на рис. 3.

Рис. 3. Зависимость обратного титра от соотношения биолиганда (H5N1) и  коллоидного раствора «берлинской лазури»

На основании полученных результатов было установлено, что чем выше концентрация биолиганда в гидрозоле, 5 мкл - 50- мкл - 100 мкл, тем титр обнаруживаемых антител ниже (1:1280 – 1:80 – 1:40 соответственно) и чаще наблюдалось ухудшение иммунохимических свойств препарата. Это можно объяснить наличием стерических факторов. При этом необходимо отметить, что отрицательные сыворотки, изучаемые в настоящей работе, не проявляли каких-либо тенденций агглютинации с изучаемым гидрозольным препаратом.

Таким образом, нами было найдено оптимальное соотношение биолиганда и гидрозоля на основе «берлинской лазури» 5 мкг антигена (H5N1) и 1 мл гидрозоля. Также нами определён максимальный титр специфических антител к вирусу птичьего гриппа в РГЗА - 1:1280, при этом наблюдалось чёткое различие между положительной и отрицательной реакциями.

Исследование гидрозольных препаратов в задачах выявления  специфических антител к M. tuberculosis

Работа проводилась в 3 этапа. На первом этапе формировали панели сывороток крови, взятых от 16 пациентов с установленным диагнозом - туберкулёз, подтверждённый клинико-лабораторными методами. Из них 90,0% от бациллярных больных с активной формой легочного туберкулёзного процесса и 10,0% от пациентов с внелегочной формой туберкулёза (туберкулёз среднего уха, мочевого пузыря, лимфаденит).

В качестве контрольной группы взяли 48 образцов сывороток здоровых доноров, возраст которых составлял от 25 до 55 лет.

РГЗА проводилась как на основе «берлинской лазури», так и оксида железа (Fе3O4). В каждом случае синтезировали гидрозоли с нативными антигенами ППД и рекомбинантными антигенами туберкулёза  (BL(DT3)/pCFP-ESAT) по вышеуказанной методике.

Получали четыре вида гидрозолей: гексацианфератт железа с адсорбированным рекомбинантным антигеном туберкулёза (BL(DT3)/pCFP-ESAT), гексацианферрат железа с ППД антигеном, оксид железа (Fе3O4) с рекомбинантным антигеном туберкулёза  (BL(DT3)/pCFP-ESAT), оксид железа (Fе3O4) с ППД антигеном.

Предварительно исследуемые сыворотки крови больных и здоровых доноров титровали от 1:20 до 1:2560.

Данные, полученные при изучении серопозитивных и серонегативных результатов к M. tuberculosis, представлены на рис. 4.

Рис. 4. Сравнение гидрозольных диагностикумов для детекции антител

к возбудителю туберкулёза с различными биолигандами в РГЗА

Результаты постановок на первой панели показали, что все 4 гидрозоля фиксируют наличие специфических антител к M. Tuberculosis в 16 пробах. Наиболее высокие титры в серопозитивных пробах были выявлены с гидрозолями на основе «берлинской лазури» и оксида железа (Fе3O4) с адсорбированными рекомбинантными антигенами (1:2560 и 1:1280 соответственно, р<0,001). В сравнении с гидрозолями на основе «берлинской лазури» и оксида железа (Fе3O4) с адсорбированным нативным антигеном титры антител были ниже (1:640 и 1:160 соответственно, р<0,05). При анализе показателей выявления титров специфических антител к M. Tuberculosis установлены наиболее выраженные отличия в РГЗА с гидрозолем на основе «берлинской лазури» с адсорбированными рекомбинантными антигенами.

На втором этапе, учитывая данные первых испытаний для реакции гидрозольной агглютинации, использовали только два гидрозоля с рекомбинантными антигенами (BL(DT3)/pCFP-ESAT), которые адсорбировали и на «берлинскую лазурь», и на оксид железа (Fе3O4). Мы исследовали панели сывороток от 20 больных с верифицированным диагнозом «туберкулёз», 20 здоровых доноров. Параллельно у 10 из них была исследована капиллярная кровь. Сравнивая показатели, полученные в РГЗА, мы обнаружили наиболее выраженные достоверные отличия между двумя гидрозолями. Гидрозоль на основе оксида железа (Fе3O4) с адсорбированными рекомбинантными антигенами (BL(DT3)/pCFP-ESAT) в данном испытании в капиллярной крови не сработал, а в сыворотке крови проявил слабую агглютинабельность – 10,0% от общего количества обследуемых. По результатам этой серии испытаний высокую чувствительность и специфичность показал гидрозольный препарат на основе «берлинской лазури» с рекомбинантными антигенами (BL(DT3)/pCFP-ESAT) как в сыворотке, так и в капиллярной крови. Реакцию агглютинации наблюдали со всеми сыворотками от 20 пациентов в разведении 1:1000 и с капиллярной кровью от 10 больных – в разведении 1:100. В данном случае, для сравнения двух качественных признаков: «есть» или «нет», определённых у одних и тех же больных, была проведена статистическая обработка по критерию Мак–Нимара. В итоге было выявлено, что экспериментальные значения критерия больше критического, с вероятностью ошибки менее 0,01 (<1%). Таким образом, можно с достоверностью более 99% (мощность критерия >0,09) утверждать, что предложенный метод диагностики  позволит выявить антитела к M.tuberculosis при различной локализации возбудителя.

На третьем этапе для подтверждения результативности РГЗА в выявлении противотуберкулёзных антител нами было проведено сравнение данных в параллельных исследованиях в качественных тестах: в реакции гидрозольной аглютинации (РГЗА) и в иммунохроматографической реакции (ИМХР) с тест – полосками с коллоидным золотом - производства ВНИИБП ФМГА. Проведено тестирование 44 проб (сывороток крови) от больных различными формами туберкулёза с различной локализацией, бактериологически подтверждённым диагнозом. В контрольную группу вошли 40 образцов, из которых взяли: 20 пациентов с заболеваниями сходных локализаций, но не имеющих туберкулёза в анамнезе (больные с хроническими бронхитами, бронхиальной астмой и другие); 20 – здоровые доноры. В данном случае в РГЗА использовали оптимальный с нашей точки зрения гидрозоль - «берлинскую лазурь» с адсорбированными рекомбинантными антигенами (BL(DT3)/pCFP-ESAT). Постановка осуществлялась с заведомо положительными и отрицательными сыворотками крови в титрах 1:20-1:200 по выше описанной методике. Обобщение полученных результатов обследования здоровых и больных лиц туберкулёзом представлены в табл. 5.

Таблица 5- Обобщение полученных серопозитивных и серонегативных

результатов  в РГЗА и ИМХР

Культуральный

и микробиоло-

гический методы

Реакция гидрозольной

агглютинации (РГЗА)

Иммунохроматографический метод (ИМХР) (ВНИИБП)

Положительный

Отрицательный

Положительный

Отрицательный

Положительный 44 сыворотки

40

4

31

13

Отрицательный 40 сывороток

39

1

36

4

Общий результат 84 сыворотки

79

5

67

17

Чувствительность

91% (40/44)

70% (31/44)

Специфичность

98% (39/40)

91% (36/40)

При сравнении полученных данных исследования на тест-полосках с коллоидным золотом (ВНИИБП) и нами изготовленного гидрозольного реагента было установлен следующий факт. Последний показал чувствительность 91% (40/44) и специфичность 98% (39/40), а также хорошую корреляцию результатов с данными культурального и микробиологического методов (общая согласованность данных =96,6%). При этом аналогичные показатели для тест-полосок были ниже. Результаты расчёта чувствительности сравниваемых реакций имели преимущество РГЗА перед ИМХР (показатель чувствительности составил 91, 0% и 70, 0% соответственно). Анализируя показатели выявления специфических антител, было установлено, что РГЗА, в сравнении с ИМХР, позволила повысить результативность серодиагностики туберкулёза в этой группе больных в 3,2 раза (р <0,05) и увеличить расшифровку диагноза до 13,4%. В ходе исследований мы провели сравнительной анализ результатов традиционных и экспресс-анализов и их технико-экономическое обоснование, которые показывают явные преимущества применения реакции гидрозольной агглютинации в выявлении антител к микобактериям туберкулёза.

       Таким образом, в ходе работы было выявлено, что наиболее эффективным диагностикумом в выявлении анитител к  M. Tuberculosis как в сыворотке крови, так и в капиллярной является гидрозоль - гексацианферрат II железа III («берлинская лазурь»), с адсорбированными рекомбинантными антигенами (BL(DT3)/pCFP-ESAT).

Экспериментальные данные по определению антигена хорионического

гонадотропина человека (ХГЧ)

За последнее время накопилось большое количество данных о целесообразности включения в широкую практику методов экспрессной диагностики ХГЧ (хорионического гонадотропина человека), основанных на выявлении антигена. Преимуществами этих методов являются: простота и экспрессность постановки, экономичность, отсутствие сложной аппаратуры и т.д. Наши исследования были направлены на изучение возможности РГЗА для выявления антигена ХГЧ в сыворотке крови и моче беременных женщин. С этой целью мы использовали реакцию гидрозольной агглютинации с гидрозольным реагентом, нагруженным мышиными моноклональными антителами к бета субъединице ХГЧ. Нами было исследовано 259 образцов сывороток крови и 287 проб мочи беременных женщин. Концентрация ХГЧ (от 31 мМЕ/мл до 281000 мМЕ/мл.) была ранее определена иммунохемилюминесцентным методом (хемилюминесцентный анализатор CENTAUR) в различные сроки беременности (от 1 до 39 недель). В качестве референсного метода для выявления ХГЧ в моче также использовали тест - полоски со специфическими моноклональными антителами мечеными коллоидным золотом, производство ООО «Прогрессивные Био-Медицинские Технологии» г. Москва. Разведение «положительной» и «отрицательной» сывороток проводили в буферном растворе в U – образном планшете в титрах 1:100 и 1:1000. Мочу брали без разведения. В качестве отрицательных образцов брали сыворотку и мочу мужчин. В данной работе в качестве твёрдой фазы использовали те же гидрозольные реагенты: гексацианферрат II железа III и оксид железа (Fе3O4), на поверхности которых адсорбировали по определённой технологии моноклональные антитела к бета-субъединице ХГЧ. Выбор оптимального соотношения биолиганда и растворов «берлинской лазури» и оксида железа (Fe3O4) остановили на - 250 мкг антител на 1 мл исходных коллоидных растворов. Исследование проводили параллельно с сывороткой крови и мочой беременных женщин. Данные исследования сведены в табл. 6.

Таблица 6- Сравнение экспериментальных данных в РГЗА с гидрозольными диагностикумами с ИХЛА и ИМХР для детекции бета-субъединицы ХГЧ

Методы исследования

       Моча

Сыворотка в разведении 1:100

Сыворотка в разведении 1:1000

40 «-»

287«+»

30  «-»

259«+»

30  «-»

259 «+»

Реакция агглютинации с «берлинской лазурью»

-

+

-

+

-

+

Реакция агглютинации с оксидом железа (Fe3O4)

-

+

-

+

-

+

Хемилюминисцентный тест (ИХЛА)

Исследование не проводили

-

+

-

+

ИМХР (тест-полоски с коллоидным зотом)

-

+

Исследование не проводили

Сопоставляя показатели РГЗА с гидрозолями на основе «берлинской лазури», оксида железа (Fe3O4) с другими методами (хемилюминисцентный тест, ИМХР с тест-полосками с коллоидным золотом), мы не обнаружили существенных различий при определении содержания хорионического гонадотропина человека в сыворотке крови и в моче беременных женщин. Проведённая статистическая обработка полученных данных показала, что результаты исследования при использовании сравниваемых методов хорошо коррелируют (р=0.921), достоверных отличий по биологическим жидкостям не выявлено.

ВЫВОДЫ

1. Разработан и апробирован новый иммунохимический метод гидрозольной агглютинациии (РГЗА) на основе «берлинской лазури» и оксида железа (Fe3O4) для выявления специфических антител к возбудителям: гепатита псовых, птичьего гриппа, туберкулеза как в сыворотке крови, так и в капиллярной крови.

2. Гидрозольные диагностикумы с нативными и генно-инженерным антигеном применимы в случае выявления антител к M. tuberculosis. Сравнивая гидрозоли различного состава, были обнаружены преимущества использования препарата на основе «берлинской лазури» с генно-инженерным антигеном. Во-первых, он обеспечивает сохранность специфических иммунохимических свойств диагностикума в течение одного года, в то время как диагностикум на основе «берлинской лазури» с нативным антигеном лишь в одномесячный  период специфической иммунохимической  активности. Во-вторых, по совокупности иммунохимических свойств «берлинская лазурь» с адсорбированным генно-инженерным антигеном является наиболее  универсальным определителем, обеспечивающим лучшую дифференцировку «+» и «-» результатов. В-третьих, данная гидрозоль обладает высокой чувствительностью (91%) и позволяет определять в образцах крови специфические антитела в титре от 1:100 до 1:2560. Кроме того, немаловажным является и тот факт, что обнаружение противотуберкулёзных антител возможно у больных с различной локализацией патологического процесса.

3. Разработаны новые диагностические препараты на основе «берлинской лазури» и оксида железа (Fe3O4), нагруженные мышиными моноклональными антителами к бета субъединице ХГЧ для выявления антигена хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) в сыворотке крови и в моче беременных женщин. Положительная корреляция наблюдалась при детекции антигена ХГЧ в исследуемых сыворотках в титрах от 1:100 до 1:1000 и в неразведенной моче при помощи обеих гидрозолей.

4. Диагностическая ценность реакции гидрозольной агглютинации с антигенным и антительным диагностикумами определяется высокой специфичностью (в среднем 98%) и чувствительностью (91%), простотой постановки, минимальных затратах.  Её использование повышает информативность серологической диагностики заболеваний: гепатита псовых, птичьего гриппа, туберкулеза и диагностики беременности.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. С целью повышения качества лечебной помощи медицинским и ветеринарным специалистам рекомендуется гидрозольные препараты использовать как скрининговые тесты в диагностике самых разнообразных нозологий – туберкулеза, птичьего гриппа и гепатита псовых.

2. Материалы исследований внедрены и используются в учебном процессе на кафедре общей химии Кировской медицинской академии при чтении лекций и проведении практических занятий со студентами лечебного и педиатрического факультетов.

3. Теоретические положения, методики расчета и результаты исследований диссертации  использованы в отчёте о НИР по договору № 14-06/11-К от 20 июня 2011г. Результаты научных исследований использованы для разработки методических рекомендаций (положений) в рамках темы: «Лазурь», выполненной по заказу Федерального медико–биологического агенства (ФМБА) Минздравсоцразвития РФ, для оформления проекта технических условий и инструкции по применению. Предполагается выпуск теста для диагностики туберкулеза на профильных предприятиях ФМБА.

       

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИСЕРТАЦИИ

1. Усовершенствование методик выявления инфекционных и соматических патологий при помощи реакции гидрозольной агглютинации /Попова С.В., Мешандин А.Г., Ворона М. В. и др. // Информационный лист № 43-024-08. –Киров: ЦНТИ. – 2008. – С. 1-2.

2. Использование гидрозольных препаратов в качестве экспрессных бесприборных диагностикумов в выявлении антител к М.tuberculosis /Попова С.В., Мешандин А.Г., Плехов В.Л. и др. // Материалы V съезда общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. – Москва: РАН. – 2008. - С. 283-284.

3. Попова С.В., Мешандин А.Г. Использование гидрозольных препаратов в качестве экспрессных бесприборных диагностикумов в выявлении антител к M.tuberculosis, птичьего гриппа, определение ХГЧ // Вятский медицинский вестник.– Киров: КГМА. – 2009. - № I. - С.117.

4. Попова С.В., Мешандин А.Г., Ворона М. В. Изучение коллоидных растворов на основе гексацианферрата железа в качестве возможных диагностических препаратов// Вятский медицинский вестник. – Киров: КГМА. – 2009. - № I. - С.111.

*5. Попова С.В., Мешандин А.Г. Применение метода гидрозольной агглютинации в диагностике туберкулёзной инфекции //Российском биомедицинский журнал.– 2009.- № 10.- С. 478-491.

*6. Попова С.В., Мешандин А.Г. Использование гидрозольных препаратов в качестве экспрессных диагностикумов в ветеринарии // Ветеринарный врач. – 2010. - № 4 - С. 24-26.

*7. Попова С.В., Мешандин А.Г., Ворона М. В.  Экспрессный бесприборный метод гидрозольной агглютинации //Вестник РГМУ.– 2010.- специальный выпуск 2.- С. 536-537.

*8. Попова С.В., Мешандин А.Г., Ворона М. В. Диагностические препараты на основе коллоидного раствора гексацианферрата железа и оксида железа // Сборник научных трудов. – Самара: СГМУ. – 2010. - С. 263-264.

* - публикации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.