WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

Ромащенко Александр Викторович

Поведенческий и электрофизиологический ответ таежного клеща (Ixodes persulcatus Sch.) на половые феромоны человека и другие запаховые стимулы

03.03.01  Физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

НОВОСИБИРСК  2012г.

Работа выполнена в лаборатории экологической генетики млекопитающих Института цитологии и генетики Сибирского отделения Российской Академии Наук и в лаборатории биомедицинской информатики Конструкторско-технологического института вычислительной техники Сибирского отделения Российской Академии Наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук,

профессор М. П. Мошкин

Научный консультант:

доктор биологических наук

А.С. Ратушняк

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

М.А. Гилинский

кандидат биологических наук

М.А. Тихонова

Ведущее учреждение:

Институт проблем экологии

и эволюции имени А.Н. Северцова

Защита диссертации состоится «___» ____________ 20___ г. на заседании диссертационного совета Д. 001.14.01  в конференц-зале ФГБУ «НИИ физиологии» СО РАМН по адресу: 630117, г. Новосибирск, ул. Ак.Тимакова, 4,

т.(383)334-89-61, факс  (383) 335-97-54,  e-mail: dissovet@physiol.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ физиологии СО РАМН

Автореферат разослан ____________________________ 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук                                        Бузуева И.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность проблемы. Исключительная прикладная значимость изучения иксодовых клещей состоит в том, что они являются переносчиками возбудителей опасных трансмиссивных заболеваний человека и животных, таких как весенне-летний энцефалит, болезнь Лайма и другие боррелиозы, различные геморрагические лихорадки, лихорадка Скалистых гор, паралич скота и многие другие. Одним из самых распространенных видов рода Ixodes в Российской Федерации является таежный клещ (Ixodes persulcatus Sch.), обладающий широким поясным ареалом, проходящим по южной части России (Романенко, 2007).

Знание конкретных механизмов реализации поисковой активности клещей как главного фактора, определяющего вероятность попадания особи на прокормителя, может быть использовано в разработке более эффективных средств управления поведением данных эктопаразитов. Внутри одного вида прокормителя существуют половые и возрастные различия особей по зараженности членистоногими  эктопаразитами (Crooks, 2001; Hughes, 2001). Является ли это следствием различий в поведенческой активности или результатом разной ольфакторной привлекательности индивидуумов до конца не ясно. Существует всего несколько работ, выполненных на гамазовых клещах и их прокормителях – летучих мышах, посвященных изучению половых различий в привлекательности запаха хозяина (Christe, 2007). Согласно этим работам, запах самки летучих мышей является более привлекательными по сравнению с запахом самцов. В работе Романенко (2006) показана большая привлекательность запаха мужчины по сравнению с запахом женщины. При этом, не известны компоненты, ответственные за реализацию данного эффекта. Не изучена даже привлекательная значимость половых феромонов человека, многие из которых идентифицированы и синтезированы (Michael et al., 1975; Grosser et al., 2000) и, соответственно, доступны для исследования.

Известно, что запаховые стимулы играют ведущую роль в определении клещом наиболее вероятного места встречи с прокормителем. В поведенческих опытах, подтвержденных электрофизиологическими исследованиями, определен спектр аттрактивных для клеща веществ, являющихся компонентами запаха шерсти и выдоха млекопитающих, который во многом совпадает со спектром аттрактантов других паразитических видов (Guerin et al., 2000). Метод, использованный в большинстве работ, связанных с электрофизиологическим ответом клеща на запаховые стимулы, основан на регистрации первичной сенсорной информации. Этот метод позволяет судить о наличии рецепторов к данному спектру веществ, но не оценивать значимость стимула для клеща. Поэтому при поиске веществ для управления поведением клеща целесообразно регистрировать ответ на запаховый стимул в областях вторичной обработки информации, поступающей от органов восприятия в обонятельные ядра синганглия.

Среди причин, определяющих изменчивость поведенческих реакций клеща, заслуживают внимания вариации его внутреннего состояния, в частности, степень гидратированности и энергетические запасы, которые формируют конкурирующие мотивации – уход в подстилку для пополнения запасов влаги и стремление к поиску прокормителя как необходимые условия для ресурсного обеспечения следующих фаз жизненного цикла (Леонович, 1989). Кроме того, согласно результатам некоторых авторов, на поведение клеща влияет его инфекционный статус. В ряде работ продемонстрирована связь между наличием боррелии B. Burgdorferi sp. sl. в кишечнике Ixodes persulcatus и локомоторной активностью данного вида клещей (Наумов, 1999; Alekseev, 2000). Также известно, что, у клещей присутствуют суточные изменения активности. До конца не ясно, являются ли они лишь результатом дегидратации в процессе ожидания прокормителя, или же у клещей есть эндогенный ритм активности, который определяет изменения поисковой мотивации в соответствии со временем суток.

Внутренними механизмами, регулирующими пищевое поведение членистоногих, являются октопамин- и серотонинергические системы нейромедиаторов (Дьяконова, 2007). Известно, что в синганглии (мозге) иксодовых клещей в большом количестве присутствуют как октопаминовые, так и серотониновые рецепторы. Вместе с тем, их влияние на поисковое поведение клеща практически не изучено. При этом, нейротрансмиттерные системы мозга клеща могут являться мишенью для акарицидных средств.

Исходя из всего вышесказанного, были сформулированы цель и задачи исследования:

Цель исследования

Изучить поведенческий и электрофизиологический ответ таежного клеща (I. persulcatus) на половые феромоны человека в зависимости от индивидуальных особенностей данного эктопаразита.

Задачи:

  1. Исследовать поведенческую реакцию I. persulcatus на синтетические половые феромоны человека и другие запаховые стимулы в условиях высокого (тест ольфакторного преферендума) и низкого (тест запахового поля) градиента концентрации данных стимулов.
  2. Оценить влияние физиологического возраста, инфекционного статуса клеща, времени суток на его спонтанную двигательную активность и ольфакторное поведение.
  3. Исследовать электрофизиологический ответ синганглия таежного клеща на половые феромоны человека и другие запаховые стимулы.
  4. Исследовать роль серотонина и октопамина в регуляции ольфакторного поведения и электрофизиологического ответа синганглия таежного клеща на синтетические половые феромоны человека и другие запаховые стимулы.

Положения, выносимые на защиту:

    1. Ключевую роль в формировании поведенческого ответа таежного клеща на ольфакторные стимулы играет его мотивационное состояние, формирующееся, прежде всего, под действием эндогенных факторов.
    2. Октопамин и серотонин регулируют поведенческую активность таежного клеща. Серотонин повышает уровень двигательной активности таежного клеща и не влияет на его мотивацию. Октопамин снижает уровень локомоторной активности клеща и меняет его мотивационное состояние.
    3. Компоненты синтетического женского феромона человека являются аттрактивными сигнальными стимулами для таежного клеща. Мужской синтетический феромон не вызывает ни поведенческого, ни синганглионарного ответа клеща.

Научная новизна. Впервые у клещей в синганглии локализована область вторичной обработки сенсорной информации и зарегистрирована ее реакция на различные запаховые стимулы. Впервые показана корреляция между поведенческой реакцией и сдвигом фокального потенциала синганглия иксодового клеща (I. persulcatus) в ответ на различные запаховые стимулы. Впервые на основе и поведенческих, и электрофизиологических опытов продемонстрирована сигнальная значимость женского полового феромона для клещей. Впервые для клещей показано наличие эндогенного суточного ритма поисковой активности. Впервые исследовано влияние серотонина и октопамина на поведенческие и электрофизиологические ответы клеща, вызванные запаховыми стимулами. Показано, что серотонин повышает локомоторную активность и амплитуду электрофизиологической реакции синганглионарных центров обработки сенсорной информации в ответ на хемосигналы разной модальности, а октопамин подавляет поисковую мотивацию.

Практическое значение. Разработана методика регистрации электрофизиологического ответа областей синганглия клеща, ответственных за обработку сенсорной информации и формирование двигательного ответа на ольфакторные стимулы. С помощью данной методики можно осуществлять быстрый поиск аттрактантов и репеллентов. Эта методика является скрининговой, подходит для быстрой потоковой проверки большого количества химических соединений. Эффективность поведенческого и электрофизиологического скрининга возрастает при использовании клещей с высокой поисковой мотивацией. Для этого разработана методика автоматической поведенческой классификации клещей по уровню мотивированности на поиск прокормителя. Данные о роли серотонина и октопамина в модуляции поведения таежного клеща могут помочь в разработке новых средств управления поведением клеща. Так же, на основе наших данных можно заключить, что использование парфюмерных средств с добавлением синтетических половых феромонов привлекает клещей к местам, посещаемым людьми, и, соответственно, повышает риск укуса клещом и инфицирования.





Апробация и публикации. Основные положения работы были представлены на IX международной конференции по исследованию вкуса и запаха (Пекин, 2009). По теме диссертации опубликовано 4 работы.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования изложенных в 4 главах, посвященных спонтанной активности и поведенческому ответу таежного клеща на запаховые стимулы, влиянию нейротрансмиттеров на поведение данного вида; влиянию возбудителей трансмиссивных инфекций, физиологического возраста и времени суток на поведение клеща и исследованию его электрофизиологического ответа на запаховые стимулы. Работа содержит обсуждения, выводы и список используемой литературы, который включает 211 названий. Работа изложена на 177 страницах. Иллюстративный материал представлен 9 таблицами и 36 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Сбор клещей проводили на территории дендрария Центрального Сибирского ботанического сада СО РАН (ЦСБС СО РАН) с 2006 по 2009 гг. во 2-3 декаде мая. После отлова клещей помещали во влажный бинт и содержали при + 4 0С. Через неделю их пересаживали в камеры дифференцированной влажности, которые представляли собой стеклянные пробирки с градиентом влажности между сухой ватной пробкой и влажной ватой на дне (Alekseev, Dubinina, 1996).

Использованные запаховые стимулы. В качестве запаховых стимулов использовали женский (осмоферин, OSMOPHERINE®) и мужской (осмоферон, OSMOPHERONE®) феромоны. В состав осмоферина входят производные жирных кислот (пирролин изовалерианат и бутират), которые, содержатся в вагинальном секрете женщин в рецептивную фазу менструального цикла (Michael et al., 1975). Осмоферон представляет собой производное андростенола (4,16-андростандиен-3-он), входящее в состав мужского пота (Michael et al., 1975). Использовали 0,25%-ые водные растворы феромонов, данная концентрация рекомендована компанией производителем в качестве добавки в парфюмерные композиции, имитирующие естественный запах мужчин или женщин. Кроме того, в качестве негативного контроля использовали вещества с известной химической формулой, обладающие репеллентным эффектом для клещей, 10% раствор аммиака и 96% этиловый медицинский спирт, а также 30% раствор ДЭТА.

В качестве препаратов, предположительно модулирующих поведенческий ответ таежного клеща, использовали два основных нейротрансмиттера беспозвоночных октопамин и серотонин. На основе пилотных экспериментов (данные не представлены) была выбрана концентрация 10-6 М для обоих нейротрансмиттеров. Это соответствует данным литературы об использовании этих веществ для модуляции активности других видов беспозвоночных (Barron et al., 2002; Claassen D.E., Kammer, 1986).

Тест на высоту подъема. Для измерения высоты подъема использовали установку, состоящую из стеклянного капилляра диаметром 1 мм и длиною 40 см, наклоненного под углом 750. Нижний конец капилляра был опущен в чашку Петри, заполненную водой, а верхний (около длины) был освещен 100 Вт лампой. Таким образом, клещ совершал вертикальные миграции в условиях градиента температуры и влажности.

Тест ольфакторного преферендума (ТОП). Для тестирования использовали установку, состоящую из расположенного горизонтально Y-образного стеклянного тройника, выходы из которого были закрыты для тестируемого клеща наконечниками, изготовленными из пластмассовых пробирок (эппендорф). Концентрации запаховых стимулов в рукавах тройника были  исследованы методом газовой хроматографии на поликапиллярном хроматографе с фотоионизационным детектором ЭХО-В ФИД. Соотношение концентраций запахового стимула в разных рукавах тройника соответствовала пропорции - 0:0,5:1. В данной установке были созданы условия высокого градиента запахового стимула при переходе из одного рукава в другой.

Тест запахового поля (ТЗП). Для изучения поведения клещей в запаховом поле, использовали чашку Петри диаметром 9 см с нанесенным запаховым стимулом, помещенную в центр вентилируемого пластикового бокса (30 см Х 50 см Х 40 см). Скорость потока воздуха в месте размещения чашки составляла 0,5 м/с. Стимул наносили на внутреннюю поверхность чашки Петри. Для каждого стимула использовали отдельную чашку, которую после окончания тестирования тщательно отмывали и ополаскивали дистиллированной водой. Концентрации запаховых стимулов в разных точках установки были  исследованы методом газовой хроматографии на поликапиллярном хроматографе с фотоионизационным детектором ЭХО-В ФИД. Для сбора проб использовали пассивные концентраторы на основе сорбента Tenax TA. Концентрация запахового стимула внутри чашки Петри менялась на порядок медленнее, чем в условиях ТОП (низкий градиент запаха).

Обработка видеозаписей. В работе использовали свободно распространяемую программу ImageJ (версия 1.43u, с http://rsb.info.nih.gov/ij), написанную на языке программирования Java и предназначенную для обработки цифровых изображений. Дальнейшую обработку данных проводили с помощью программного обеспечения разработанного автором данного диссертационного исследования.

Электрофизиологические исследования были выполнены на отдельной группе самок таежного клеща (n = 25) методом вызванных потенциалов (ВП). Отведение суммарных (фокальных) электрических потенциалов  производили от наружной поверхности синганглия в преэзофагальной области (см. рис. 1). Использовали стеклянные регистрирующие микроэлектроды, заполненные физраствором, с диаметром отверстия 20-30 мкм, индифферентный электрод находился в том же растворе, что и синганглий.

Рисунок 1.

Вид сверху на препарат клеща (Б), используемый в электрофизиологических опытах, с указанием места отведения на сагиттальном срезе синганглия (А). Штриховая стрелка указывает положение условного сагиттального среза. Штрихпунктирная стрелка указывает положение органа Галлера. Синганглий на рисунке находится в черном квадрате (А, Б). Положение электрода (El); подача стимула в область органа Галлера (Р1, Р2); эзофагус (E) проходит сквозь синганглий. (AcN) ассоциативные нервные волокна; (ChG) хелицеральный ганглий; (OpsG) опистоматический ганглий; (PG1-4) с 1 по 4 педальный ганглий; (PhN) фарингеальный нерв; (PpG) педипальпальный ганглий; (Pr) процеребрум; (PriN) первичный нерв; (RN) рекуррентный нерв; (SbP) постэзофагальная часть; (SpP) преэзофагальная часть; (StP) стомодеальный мост (Marzouk et al., 1987).

Определение наличия ДНК боррелии и РНК вируса клещевого энцефалита в организме клеща выполнялось сотрудниками ИБХиФМ СО РАН с помощью PCR и RT-PCR анализа, соответственно (Ткачев и др., 2007; Фоменко и др. 2006).

Определение физиологического возраста (истощенности жирового тела) клеща проводили методом световой микроскопии (в проходящем свете), на основе степени контрастности кишечника особи по отношению к окружающим тканям (модификация методики Разумовой (Разумова, 1975)).

Сравнение частот встречаемости проводили по критерию 2. Для показателей, чьи вариационные ряды приближались к нормальному, применяли дисперсионный анализ. При множественном сравнении средних применяли LSD тест, а при сравнении 2-х средних t-критерий Стьюдента. На графиках, в тексте и в таблицах данные представлены в виде среднее ± стандартная ошибка среднего (±SE).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Исследование спонтанной поисковой активности таежного клеща

1.1. Вариабельность спонтанной поисковой активности таежных клещей

Согласно данным Леоновича (1989), дегидратированные клещи, стремящиеся уйти в подстилку, передвигаются в основном по дну чашки Петри, а «увлажненные» клещи передвигаются преимущественно по краю, на максимально доступной высоте относительно поверхности Земли. Автор делает вывод, что клещи, передвигающиеся преимущественно по краю чашки, мотивированы на поиск прокормителя, клещи, передвигающиеся преимущественно по дну чашки, мотивированы на уход в подстилку для восстановления водного баланса.

Для исследования индивидуальной изменчивости различных показателей спонтанной двигательной активности клещей при перемещении по чашке Петри в отсутствии запаховых стимулов, использовали гидратированных особей, содержавшихся до теста в отсутствии освещения. При анализе полученных результатов обращает на себя внимание бимодальное распределение исследуемых клещей по стандартному отклонению (SD) расстояния до центра чашки Петри в каждый момент времени 5-ти минутного теста (W = 0,883 p<0,014, критерий Шапиро-Уилка). Разделение клещей на группы в соответствии с двумя модальными классами SD от центра имело ясную графическую интерпретацию: группа 1, «немотивированные» на поиск особи; группа 2, клещи, «мотивированные» на поиск прокормителя (рис. 2). Особи группы 2, по сравнению с клещами группы 1, проводили больше времени и преодолевали большее расстояние при движении по краю тестовой арены, на максимально доступной в данном тесте высоте (53,73±4,85, 19,06±4,91, соответственно, критерий Манна-Уитни U, p<0,05). Кроме того, у них было достоверно выше общее расстояние, пройденное за время теста (117,58±8,18, 91,25±7,71, соответственно, критерий Манна-Уитни U, p<0,05).

Рисунок 2.

Траектории движения в тесте запахового поля без стимула клещей с высоким (группа 1, SD>0,3 см) и низким (группа 2, SD0,3 см) уровнем спонтанной поисковой активности. Показана регистрация данных за вычетом траектории 1го подхода к краю чашки Петри. Пунктиром обозначен край чашки Петри.

1.2. Факторы, влияющие на спонтанную поисковую активность таежных клещей

Сравнение «мотивированных» и «немотивированных» на поиск особей, показало, что эти клещи достоверно не отличаются по контрастности кишечника, которая характеризует степень истощенности энергетических запасов (U критерий Манна-Уитни, p<0,05).

Ни зараженность боррелией, ни зараженность ВКЭ у «мотивированных» и «немотивированных» на поиск особей достоверно не отличалась (2 = 0,78, p = 0,54, 2 = 0,21, p = 0,75, соответственно).

Анализ соотношения «мотивированных» и «немотивированных» на поиск особей в разное время суток (11-20) показал, что при тестировании в первой половине дня (11-14 ч) и вечером (17-20) доля клещей, отнесенных к группе 2 («мотивированные» особи), составляла 8 особей из 10, при тестировании в 14-17 часов она падала до 3 особей из 12 (2 = 4,79, p = 0,028, n = 22).

Таким образом, на основе данных о спонтанной локомоторной активности удалось разделить выборку на две группы. К первой группе относились клещи, проявлявшие более выраженный положительный геотаксис, ко второй, особи, проявлявшие более выраженный отрицательный геотаксис. Показано, что проявление клещом реакции отрицательного геотаксиса свидетельствует о наличии у него мотивации к поиску прокормителя (Леонович, 1989, 2005, Таежный клещ…, 1985). При этом, эти две группы не отличались по степени контрастности кишечника, что является характеристикой физиологического возраста клеща (Разумова, 1975), ни по зараженности ВКЭ или Borrelia sp. Использованные нами особи по степени дегидратации не отличались, поэтому основное влияние на формирование поисковой мотивации у клеща оказывало время суток. Наблюдаемый нами двухфазный ритм поисковой активности соотноситься с таковым, наблюдаемым in vivo (Crooks, Randolph, 2006).

2. Исследование поведенческого ответа таежного клеща на запаховые стимулы

2.1. Поведенческая реакция на запаховые стимулы в тесте запахового поля (ТЗП)

У клещей группы 1 («немотивированные» на поиск) модальность предъявляемого стимула не влияла ни на общее расстояние (F1.86=0,11, p=0,92), ни на расстояние, пройденное по стенке и краю чашки (F1.86=0,45, p=0,74). Клещи группы 2 проходили меньшее расстояние по стенке чашки Петри в присутствии запаха аммиака или спирта по сравнению с контрольным тестом без стимула (LSD-тест, p<0,05). Общее расстояние, пройденное в присутствии аммиака клещами группы 2, было достоверно ниже по сравнению с остальными тестами (LSD-тест, p<0,05).

Анализ траектории движения клещей группы 2 («мотивированных» на поиск особей) показал, что при предъявлении в качестве запаховых стимулов осмоферина или аммиака, достоверно увеличивалось значение SD расстояния до центра чашки Петри. Это отражает рост числа челночных перемещений в центр чашки Петри (области высокой концентрации стимула) и обратно, по сравнению с контролем (LSD-тест, p<0,05). Примеры траекторий движения клещей группы 2 при предъявлении осмоферина и аммиака представлены на рисунке 3. В группе 1 значение SD дистанции до центра достоверно не менялось при разных стимулах (LSD-тест, p>0,05).

Рисунок 3.

Примеры изменение траектории движения клещей с низким значением стандартного отклонения расстояния до центра (группа 2) в ответ на предъявление стимулов. Пунктиром обозначен край чашки Петри.

2.2. Поведенческая реакция на запаховые стимулы в тесте ольфакторного преферендума (ТОП)

Предъявление женского феромона в качестве запахового стимула приводило к достоверному увеличению доли времени в пятиминутном тесте, которую клещ проводил в рукаве с максимальной концентрацией запахового стимула, по сравнению с контрольным (вода) тестом (56,07±5,26%, 32,41±5,72%, соответственно, t-критерий Стьюдента, p<0,05). Реакция на мужской феромон достоверно не отличалась от реакции на воду. Распределение значений процента времени, проводимого клещом в рукаве со стимулом, достоверно отличалось от нормального (рис. 3). И в тестах с осмофероном, и в тестах с осмоферином можно выделить группу клещей, не заходивших в рукав с максимальной концентрацией запахого стимула (40% и 20%, соответственно). В случае осмоферина неотреагировавших клещей достоверно меньше по сравнению с осмофероном (2=4,76, p=0,029).

Вертикальную активность клещей, использованных в ТОП, изучали в тесте на высоту подъема (ТВП). Получилось, что клещи, не заходившие в рукав со стимулом ни в тестах с осмофероном, ни в тестах с осмоферином (n = 7, что составляет 14% от общего числа протестированных клещей), демонстрировали достоверно меньшие значения максимальной высоты подъема в ТВП, по сравнению с остальными особями (5,35±0,62см, 19,3±1,66см, соответственно; по U критерию Манна-Уитни, p<0,05)

Выполненное на дополнительной группе клещей (n=7) исследование поведенческой реакции на репеллент (ДЭТА, спирт) показало, что в 100% случаев при использовании ДЭТА и спирта клещи доходили до развилки Y-образного ольфактометра и после “знакомства” со стимулом оставались в течение всего периода наблюдений в рукаве с минимальной концентрацией ольфакторного стимула.

2.3. Исследование электрофизиологического ответа таежного клеща на запаховые стимулы

Нам удалось зарегистрировать изменения фокального поверхностного потенциала в ответ на выдох человека на дорсальной стороне в преэзофагальной области синганглия таежного клеща. Запаховый стимул вызывал либо положительный, либо отрицательный сдвиг вызванного потенциала, или не вызывал никакой реакции. Примеры вызванных потенциалов представлены на рисунке 4.

Рисунок 4.

Примеры зарегистрированных сдвигов фокального поверхностного потенциала преэзофагальной области синганглия клеща в ответ на различные запаховые стимулы. Черной стрелкой отмечено начало подачи стимула.

В пилотном эксперименте, проведенном на 10 самках таежного клеща, только у особей, поднимавшихся в тесте на высоту подъема выше 10 см, удалось зафиксировать изменение фокального поверхностного потенциала в преэзофагальной области синганглия в ответ на выдох человека.

Запах спирта, ДЭТА и аммиака вызывал электрофизиологическую реакцию в 100% случаев, осмоферин в 88%, а осмоферон только в 36%. Различия по частоте ответных реакций на осмоферон и на другие стимулы были статистически значимым 2 = 20,68; p<0,01 для спирта, ДЭТА, аммиака и 2 = 12,22; p<0,01 для осмоферина.

Направление сдвига потенциала в ответ на конкретный запаховый стимул варьировало от препарата к препарату. При этом ДЭТА и спирт инициировали в основном положительные сдвиги фокальных поверхностных потенциалов синганглия клеща (88%; 92%, соответственно). Аммиак вызывал в 52% отрицательный и в 48% положительный сдвиг вызванных потенциалов. Различия с реакциями на ДЭТА и спирт высоко достоверны 2 = 11,52; p<0,01 и 2 = 9,19; p<0,01, соответственно. Осмоферин чаще (68%) вызывал негативные сдвиги фокального потенциала. Различия с реакциями на ДЭТА и спирт высоко достоверны - 2 = 15,36; p<0,01 и 2 = 18,36; p<0,01, соответственно. По частоте возникновения отрицательных/положительных сдвигов фокального потенциала осмоферин и аммиак достоверно не отличались (2 = 1,26; p = 0,25). В 9 случаях из 25, осмоферон вызывал достоверный сдвиг потенциала. В 55% случаев это был положительный сдвиг, в 45% - отрицательный, что достоверно отличалось от реакции на ДЭТА (2 = 4.26; p = 0,04) и спирт (2 = 6,05; p = 0,01), но не на осмоферин (2 = 1,52; p = 0,21) и аммиак (2 = 0,15; p = 0,69).

Сигнальная значимость женского полового феромона (синтетического аналога «копулинов»), в состав которого входят алифатические альдегиды (Michael, 1975), наличие рецепторов к которым показано в капсулярных сенсиллах органа Галлера (Steullet, Guerine, 1994), была продемонстрирована как в поведенческих тестах, так и в электрофизиологических опытах. Мужской феромон не вызывал у клещей значимого ответа. В наших тестах данное вещество инициировало как горизонтальные миграции клеща в сторону стимула, при расположении источника стимула на расстоянии от особи (ТОП), так и подъем на растительность, при расположении источника стимула вблизи от особи (ТЗП). Как известно, у клещей рода Ixodes рецепторы к аммиаку присутствуют в составе сенсилл передней группы органа Галлера (Haggart, Davis, 1980). Для I. scapularis доказано, что аммиак является компонентом агрегационного феромона, присутствует в экскрементах клещей и стимулирует горизонтальные миграции клещей в сторону источника запаха (Sonenshine et al., 2003). Кроме того, аммиак является компонентом мочевой метки млекопитающих (Sherlock, Goh, 1983). Поэтому, в отличие от осмоферина, стимулирующего отрицательный геотаксис, наличие NH3 приводило к тому, что клещ увеличивал время, проведенное вблизи этого запаха, то есть аммиак действовал как агрегационный стимул. Спирт, известный репеллент эктопаразитов (Osterkamp, 1999), снижал уровень вертикальной активности, не меняя, при этом, траектории движения клеща, инициировал горизонтальные миграции от источника стимула, вызывал противоположный по направлению, относительно осмоферина и аммиака, сдвиг фокального потенциала синганглия. Исходя из полученных результатов, изменение двигательной активности в ответ на предъявление ольфакторных стимулов в поведенческих тестах коррелировало с изменением фокального потенциала синганглия в ответ на те же соединения (отсутствие реакции на осмоферон и противоположный ответ на осмоферин, аммиак и ДЭТА, спирт).

2. Влияние нейротрансмиттеров на поведение и активность синганглионарных центров обработки сенсорной информации таежных клещей

3.1. Влияние нейротрансмиттеров на спонтанную поисковую активность таежных клещей

Введение серотонина не влияло на соотношение «мотивированных»/ «немотивированных» особей в группе в сравнении с контролем. В группе клещей, которым вводили октопамин, доля особей «немотивированных» на поиск была достоверно выше по сравнению с контролем и группой особей, которым вводили серотонин (2 = 5,51. p = 0,015; 2 = 5,02, p = 0,04, соответственно).

Введение нейротрансмиттеров не отражалось на показателях спонтанной поисковой активности «немотивированных» на поиск клещей. Введение октопамина клещам группы 2 («мотивированные» особи) достоверно снижало как суммарное расстояние, пройденное за время теста, так и расстояние, пройденное по стенке чашки Петри, по сравнению с особями, которым вводили физраствор или серотонин (LSD-тест, p<0,05). Введение  серотонина «мотивированным» клещам увеличивало как суммарное расстояние, так и расстояние, пройденное по стенке чашки, по сравнению с контрольной группой и группой клещей, которым вводили октопамин (LSD-тест, p<0,05).

3.2. Влияние нейротрансмиттеров на поведенческий ответ клещей на запаховые стимулы в тесте запахового поля

Двухфакторный дисперсионный анализ показал, что у клещей, «немотивированных» на поиск, ни вводимый препарат, ни стимул не влиял на расстояние, проходимое клещом по стенке чашки Петри (препарат: F2.171 = 0,33, p = 0,71; стимул: F3.171 = 2,17, p = 0,09; препарат и стимул: F6.171 = 0,57, p = 0,74), на суммарное пройденное расстояние влиял только стимул (препарат: F2.171 = 0,65, p = 0,52; стимул: F3.171 = 6,84, p<0,01; препарат и стимул: F6.171 = 0,41, p = 0,81). Клещи группы 1, вне зависимости от вводимого препарата, проходили достоверно меньшее расстояние в присутствии аммиака по сравнению с остальными стимулами (LSD-тест, p<0,05). При сравнении расстояния, пройденного по стенке чашки Петри, и общего пройденного расстояния в присутствии различных запаховых стимулов клещами группы 2 («мотивированные» на поиск особи), которым вводили октопамин и физиологический раствор, достоверных отличий не обнаружено (LSD-тест, p<0,05). У клещей, которым вводили серотонин, на все стимулы была более выражена реакция отрицательного геотаксиса по сравнению с контрольной группой клещей (LSD-тест, p<0,05). По суммарному пройденному расстоянию между этими группами достоверных различий нет (LSD-тест, p<0,05). У клещей обеих групп вводимый препарат на значение SD до центра влияния не оказывал.

3.3. Влияние нейротрансмиттеров на электрофизиологический ответ клещей на запаховые стимулы

При изучении влияния нейротрансмиттеров на ольфакторную реакцию препарата клеща было установлено, что серотонин (n = 12) в 100% вызывал увеличение амплитуды ответа, не меняя при этом направление реакции. Отношение амплитуды реакции после введения серотонина по отношению к амплитуде реакции до введения составляло в среднем 3,45±1,45. Изменение амплитуды реакции от стимула не зависело (F3.27 = 0,2, p = 0,75).

Влияние октопамина было изучено на 13 препаратах клещей. Введение октопамина вызывало смену направления сдвига фокального потенциала на противоположный. При этом достоверных отличий по амплитуде не обнаружено (U критерий Манна-Уитни, p<0,05). В случае феромонов и аммиака различий по частоте изменения направления сдвига потенциала в ответ на предоставление стимула нет (рис. 6). При предъявлении спирта или ДЭТА изменение направления электрофизиологического ответа возникало достоверно реже (1/13, 0/13, соответственно) по сравнению со всеми остальными стимулами (рис. 5).

Рисунок 5.

Распределение частот наличия (черные столбцы)/отсутствия (белые столбцы) изменений в направлении сдвига фокального поверхностного потенциала синганглия в ответ на запаховый стимул после введения октопамина.

Введение октопамина или его агонистов повышает общую двигательную активность, снижает пороги активации двигательных и избегательных программ у тараканов (Goldstein, Camhi, 1991), сверчков (Stevenson et al., 2005), саранчи (Orchard et al., 1993). Серотонин вызывает противоположные октопамину эффекты в регуляции избегательного поведения: повышает пороги избегательных реакций таракана (Goldstein, Camhi, 1991); подавляет ответ интернейронов избегательного поведения на сенсорную стимуляцию церок у сверчков (Hoerner, Heblich, 2005). У моллюсков наблюдается противоположная ситуация: серотонин повышает двигательную активность, октопамин – наоборот (Дьяконова, 2007). Показано, что у клещей серотонин, с одной стороны, увеличивает уровень вертикальной активности в ответ на предъявление запаха вне зависимости от его модальности, с другой, этот нейротрансмиттер увеличивает амплитуду электрофизиологического ответа области синганглия, в которой удалось зафиксировать электрофизиологический ответ на ольфакторные стимулы. Октопамин в поведенческих опытах увеличивал процент немотивированных на поиск прокормителя клещей, но на интенсивность ответа не оказывал влияния, а в электрофизиологических изменял направление ответа на запаховый стимул, не влияя на его амплитуду. Таким образом, серотонин может участвовать в формировании поведенческого «араузала», как компонента неспецифической поведенческой реакции (Dyakonova et al., 1999; Дьяконова, 2007; Davenport, Evans, 1984; Bailey et al., 1983). При этом, исходя из полученных данных, октопамин участвует в регуляции программы поведения, связанной с уходом в подстилку (реакции избегания у клеща), т.е. участвует в регуляции суточного эндогенного ритма. Таким образом, таежный клещ по выполняемым серотонином и октопамином функциям ближе к моллюскам, чем к насекомым.

ВЫВОДЫ

  1. На основе исследования спонтанной активности клещей в тестах на высоту подъема и перемещении в открытом поле, на момент исследования можно выделить особей «мотивированных» и «немотивированных» на поиск. «Мотивированные» на поиск клещи характеризуются более выраженным отрицательным геотаксисом, высоким уровнем локомоторной активности и наличием реакции на запаховые стимулы.
  2. На формирование поисковой мотивации у клеща оказывает влияние время суток, но не инфекционный статус или объем энергетического запаса.
  3. Женский половой феромон человека (осмоферин) индуцирует у клещей с высокой поисковой мотивацией как поведенческий, так и электрофизиологический ответ. Мужской феромон (осмоферон) не имеет сигнального значения для имаго таежного клеща.
  4. Реакция преэзофагальной области синганглия клеща, гомологичной «антеннеальной доле» насекомых, на аттрактивные (женский синтетический феромон и аммиак) и репеллентные (ДЭТА, спирт) запахи коррелирует с поведенческим ответом на данные соединения.
  5. Введение серотонина повышает локомоторную активность клещей с высокой поисковой мотивацией, но не влияет на поведение «немотивированных» особей. Введение октопамина подавляет локомоторную активность и увеличивает долю клещей с низкой поисковой мотивацией.
  6. Серотонин увеличивает амплитуду синганглионарного ответа таежного клеща на запаховые стимулы, не меняя при этом направления сдвига фокального потенциала. Октопамин, наоборот, не влияет на амплитуду реакции, но меняет направление синганглионарного ответа.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Работы, публикованные в журналах включенных в список ВАК:

  1. Ромащенко А.В., Ратушняк А.С., Запара Т.А. и др. Поведенческие и электрофизиологические реакции таежного клеща (Ixodes persulcatus) в ответ на синтетические половые феромоны человека // Зоол. журн. 2010. Том. 89. № 6. С. 682–693.

Работы, публикованные в журналах не включенных в список ВАК:

  1. Ромащенко А.В., Мошкин М.П. Биология таежного клеща как векторного организма в очагах клещевых инфекций // Инфекции, передаваемые клещами в Сибирском регионе / отв. ред. В.В. Власов, В.Е. Репин; Ин-т хим. биол. и фунд. мед. СО РАН. – Новосибирск: Изд-во СО РАН, 2011. – С. 13–20.
  2. Ромащенко А.В., Ратушняк А.С., Запара Т.А. и др. Факторы изменчивости поведенческих и электрофизиологических реакций таежных клещей (Ixodes persulcatus) на половые феромоны человека // Инфекции, передаваемые клещами в Сибирском регионе / отв. ред. В.В. Власов, В.Е. Репин; Ин-т хим. биол. и фунд. мед. СО РАН. – Новосибирск: Изд-во СО РАН, 2011. – С. 20–35.
  3. Ткачев С.Е., Бахвалова В.В., Панов В.В. и др. Исследование генетической структуры популяции вируса клещевого энцефалита, выявленного на территории лесопарковой зоны Новосибирского научного центра// Инфекции, передаваемые клещами в Сибирском регионе / отв. ред. В.В. Власов, В.Е. Репин; Ин-т хим. биол. и фунд. мед. СО РАН. – Новосибирск: Изд-во СО РАН, 2011. – С. 108–117.
  4. Olfactory reactions to synthetic human sex pheromones by a taiga tick (Ixodes persulcatus) / Beijing international meeting on research in taste and smell. 2009. P. 32.





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.