WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

АНДРИАНОВА Екатерина Павловна

Получение рекомбинантных антигенов вируса ящура О/Тайвань/99, перспективных для разработки противоящурных вакцин, с использованием бактерий и растений

Специальность: 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук

Москва - 2012

Работа выполнена в лаборатории генетической инженерии и в группе молекулярной биологии вирусов растений федерального государственного бюджетного учреждения науки Центра «Биоинженерия» РАН.

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Эльдаров Михаил Анатольевич

  Официальные оппоненты:        

Соколова Надежда Львовна - доктор биологических наук, ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко», заместитель директора по инновационной деятельности.

Розанов Михаил Николаевич - кандидат биологических наук, ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова», Министерства здравоохранения РФ, доцент кафедры биологии.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова».

Защита состоится «____» ___________2012 г. в ______ ч. на заседании диссертационного совета Д.220.042.01 при ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина», по адресу: 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, 23. Тел. (495) 377-93-83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина».

Автореферат разослан «____» ___________ 2012 года и размещен на сайте http://www.vak.ed.gov.ru.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

профессор

  Грязнева Т.Н.

               

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность темы.

Начиная с двадцатого столетия животноводство многих экономически развитых стран мира несет большие убытки от эпидемических вспышек ящура. Недавние инфекционные вспышки ящура в Тайване (1997) и Великобритании (2001) существенно усилили обеспокоенность производителей и потребителей мяса сельскохозяйственных животных во многих странах мира. Основным способом контроля возникновения вспышек заболевания ящуром в настоящее время является вакцинация сельскохозяйственных животных вакцинами на основе инактивированного вируса. Несмотря на то, что иммунизация препаратами инактивированного вируса достаточно эффективна, такие вакцины имеют ряд существенных недостатков. Наиболее серьезные из них – проблемы безопасности, связанные с возможной утечкой не полностью инактивированного вируса, а также сложность достоверного диагностического различия вакцинированного животного от заболевшего, необходимость использования специальных лабораторий для их получения и недостаточно высокая скорость получения в условиях возникновения очага заболевания.

В связи с этими недостатками предпринимаются попытки разработать альтернативные вакцины против вируса ящура. В настоящее время разрабатываются методы использования в качестве вакцины фрагментов структурных и неструктурных белков вируса, например структурного белка VP1 или пустых вирусных капсидов, ослабленных вирусов, например с делецией участка капсидного белка VP1 или протеиназы Lpro. Такие вакцины не имеют некоторых недостатков традиционных вакцин, однако на сегодняшний день они менее эффективны по сравнению с вакцинами, созданными на основе инактивированного вируса. Поэтому задача получения альтернативной вакцины против ящура остается актуальной.

В настоящее время перспективной и представляющей огромный интерес для биотехнологических компаний системой получения белка является растение. Главными преимуществами использования растений для получения белка являются низкая конечная стоимость и биобезопасность продукта вследствие отсутствия у растений и животных общих патогенов. Рекомбинантные белки в растениях могут быть получены двумя методами: с помощью генетической трансформации или транзиентной экспрессии с помощью вирусных векторов. Создание трансгенного растения, а значит и получение белка из него, требует значительных временных затрат. Уровень экспрессии целевых белков трансгенными растениями обычно низок, что определяет высокую стоимость продукта вследствие сложности его очистки. Получение белка с использованием фитовирусной системы транзиентной экспрессии в растениях имеет ряд преимуществ; в первую очередь более высокий уровень экспрессии, биобезопасность и короткое время, необходимое для создания и тестирования экспрессионной системы.

Настоящая работа посвящена получению вакцинных белков вируса ящура, способных индуцировать иммунитет против заболевания ящуром у лабораторных животных, и разработке систем экспрессии этих белков в бактериях и растениях.

Цель и задачи исследований.

Целью работы является конструирование рекомбинантных вакцинных белков вируса ящура и разработка систем их экспрессии в бактериях и растениях.

Для этого в работе решались следующие задачи:

1. Создание систем транзиентной экспрессии предшественника капсидных белков Р1 и 3С-протеазы или отдельных капсидных белков вируса ящура (изолята O/Тайвань/99) в клетках растений Nicotiana benthamiana с помощью фитовирусных векторов;

2. Конструирование рекомбинантного гена, кодирующего искусственный белок НPE, содержащий набор иммуногенных В- и Т-клеточных эпитопов вируса ящура О-серотипа

3. Создание систем экспрессии белка НРЕ в клетках Escherichia coli и в растениях Nicotiana benthamiana;

4. Проверка иммуногенных свойств выделенных из клеток бактерий и растений препаратов белка НРЕ на лабораторных животных.

Научная новизна.

Впервые получен рекомбинантный вакцинный белок, содержащий комбинацию В- и Т-клеточных эпитопов вируса ящура в составе одной полипептидной цепи. Разработаны методы конструирования и получения такого полиэпитопного белка НРЕ, состоящего из фрагментов структурных (VP1, VP4) и неструктурных (2C, 3D) белков вируса ящура изолята О/Тайвань/99, в бактериальной системе экспрессии, а также методы его выделения и очистки.

Разработаны методы получения  высокоочищенных препаратов белка НРЕ из растений N.benthamiana в количествах, достаточных для проведения биологических испытаний.

Высокая иммуногенность белка HPE, его способность обеспечивать полную защиту лабораторных животных от инфекции вирусом ящура серотипа О, определяют перспективность использования белка HPE в качестве основы для разработки рекомбинантных противоящурных вакцин.

Научная новизна подтверждена положительным решением о выдаче патента Российской Федерации.

Практическая значимость работы.

Разработанные методы конструирования и получения вакцинного белка НРЕ могут быть использованы для создания новых недорогих эффективных рекомбинантных противоящурных вакцин. Показано, что такой вакцинный белок можно получать на достаточно высоком уровне в различных гетерологичных системах. По мере изучения антигенных сайтов вируса возможно включение эпитопов, находящихся в этих сайтах, в последовательность полиэпитопного белка. Такой подход к созданию полиэпитопного белка, предполагающий соединение наиболее иммуногенных эпитопов в составе одной полипептидной цепи, может  быть использован для разработки подходов к созданию противоящурных вакцин против других серотипов вируса, других вирусных инфекционных патогенов человека и животных.

Личный вклад соискателя заключается в проведении экспериментальных и теоретических исследований. Основные результаты работы получены лично автором при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.

Апробация результатов диссертации.

Полученные в диссертации результаты были представлены на следующих международных и российских конференциях: Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова (Москва - Пущино, 2009), 16-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология-наука ХХI века» (Пущино, 2012), конференции «Горизонты нанобиотехнологии» (Звенигород, 2009).

Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работ, в том числе 1 статья в журнале, входящем в перечень ВАК. Получен 1 патент на изобретение РФ.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 140 страницах машинописного текста и включают 25 рисунков и 3 таблицы. Диссертация состоит из разделов: “Введение”, “Цель и задачи работы”, “Обзор литературы”, “Материалы и методы”, “Результаты”, “Обсуждение”, “Выводы”, “Cписок публикаций по теме диссертации”, “Cписок цитируемой литературы”, который содержит 1 отечественный и 217 иностранных источника.

На защиту выносятся следующие положения и результаты:

1.        Изучена возможность получения пустых капсидов и отдельных капсидных белков VP0, VP1 и VP3 вируса ящура серотипа О в растениях N. benthamiana.

2.        Сконструирован ген, кодирующий последовательность рекомбинантного белка HPE, содержащего набор B- и Т-клеточных эпитопов капсидных белков VP1, VP4, 2C и 3D вируса ящура изолята О/Тайвань/99.

3.        Созданы системы экспрессии и очистки рекомбинантного белка НРЕ из клеток бактерий E. coli и растений N. benthamiana, позволяющие получать белок, в количествах достаточных для иммунологических испытаний.

4.        Полученный рекомбинантный белок HPE обладает высокой иммуногенностью и способен индуцировать протективный иммунный ответ, обеспечивающий полную защиту лабораторных животных от инфекции вирусом ящура О/Тайвань/99.





МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в лаборатории генетической инженерии и в группе молекулярной биологии вирусов растений Федерального Государственного Бюджетного Учреждения науки Центра «Биоинженерия» РАН в период с 2009 по 2012 гг.

Эксперименты по определению иммунологических характеристик препаратов очищенных белков были выполнены в Федеральном Центре Охраны Здоровья Животных (ФГУ ВНИИЗЖ, г. Владимир).

Все манипуляции с ДНК - субклонирование в плазмидные вектора, ПЦР-амплификацию, выделение плазмидной ДНК из клеток, электрофоретическое разделение ДНК в агарозном геле, обработку ДНК эндонуклеазами рестрикции, лигирование фрагментов ДНК и т.п. проводили согласно общепринятым методикам (Sambrook, 1989).

Приготовление белковых образцов и электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле проводили по стандартному методу (Sambrook, 1989). Для получения компетентных клеток А. tumefaciens и их трансформации использовали стандартную методику (Sambrook, 1989).

Для оценки достоверности полученных результатов иммунизации использовали биноминальный тест с уровнем значимости () равным 0,005.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Одним из перспективных подходов к созданию альтернативных вакцин против ящура является получение пустых вирусных капсидов - ВПЧ. Иммунологически такие частицы идентичны полноценным вирионам, поскольку пустые капсиды содержат полный набор поверхностных антигенов вируса (Rweyemamu et al., 1979). Также известно, что индивидуальные капсидные белки вируса ящура могут формировать пустые капсиды или капсидные интермедиаты (пентамеры) in vitro (Grubman et al., 1985). Поэтому задачей первого этапа нашей работы по получению вакцинных белков вируса ящура, было получение пустых капсидов ящура в растениях N. benthamiana методом транзиентной экспрессии. Для получения ВПЧ ящура необходимо было экспрессировать участки генома вируса, ответственные за синтез, протеолиз и сборку капсида: последовательности, кодирующие белок-предшественник структурных белков P1 с автокаталитическим пептидом 2A и вирусную протеазу 3Сpro.

1. Изучение возможности получения пустых капсидов вируса ящура в растениях.

Для получения предшественника капсидных белков была создана конструкция на основе бинарного вектора pA7248AMV, полученного на основе Х вируса картофеля (ХВК) (Марданова и др., 2009), кодирующая последовательности предшественника капсидных белков P1 и автокаталитического пептида 2A вируса ящура изолята О/Тайвань/99. Для визуальной оценки количества зараженных клеток и локализации предшественника Р1-2A в клетках растений соответствующая ему последовательность была слита с геном, кодирующим зеленый флуоресцентный белок (GFP) Zoanthus sp. (конструкция pA7248AMVP1uGFP, рис. 1). Для оценки уровня экспресии предшественника в качестве контроля использовали конструкцию pCCauGFP, экспрессирующую свободный GFP.

В областях листьев растений, инокулированных смесью суспензий агробактерий, трансформированных плазмидами pA7248AMVP1uGFP и полученной ранее в нашей лаборатории конструкцией pCCap24, кодирующей супрессор РНК-сайленсинга p24 вируса ассоциированного с скручиванием листьев винограда 2 (GLRaV-2), с помощью флуоресцентной микроскопии можно было видеть, что количество зараженных клеток лишь незначительно ниже количества клеток, экспрессирующих свободный GFP. Однако, в отличие от свободного белка GFP, GFP, слитый с предшественником Р1-2А, в большей части клеток накапливался в виде телец включений, что могло свидетельствовать о его нерастворимости.  Вестерн-блот анализ суммарных белковых экстрактов агроинокулированных листьев растений выявил наличие «шлейфа» (рис. 2), что могло являться свидетельством экспрессии предшественника Р1 с пептидом 2А, слитого с GFP в растениях в нерастворимом виде.

Рис. 1. Схема конструкции pA7248AMVP1uGFP

Для процессинга предшественника Р1 с образованием отдельных капсидных белков VP1, VP0 и VP3 необходима вирусная протеаза 3Cpro. С целью коэкспрессии предшественника P1-2А (конструкция pA7248AMVP1uGFP) и протеазы в растениях была получена конструкция pA7248AMV3CintR, кодирующая синтетический ген протеазы с встроенным интроном гена ADK1 (Adenosine kinase 1) из Arabidopsis thaliana. Такой подход позволяет преодолевать возможную токсичность криптической экспрессии гена 3Cpro на клетки A.tumefaciens и E. coli.

При коэкспрессии предшественника Р1-2А, слитого с GFP, и протеазы 3Cpro уровень экспрессии предшественника (при оценке экспрессии по уровню накопления GFP с помощью флуоресцентной микроскопии) был существенно ниже, чем при экспрессии предшественника без протеазы - были обнаружены лишь одиночные флуоресцирующие клетки. Также на листьях в местах инокуляции уже на третий день появлялись видимые некрозы, а на шестой день некротизировалась большая часть клеток (более 90%), что можно было видеть по специфической желто-зеленой флуоресценции, характерной для мертвых клеток. На вестерн-блоттинге с образцами листьев, в которых были экспрессированы предшественник и протеаза, сигнала, соответствующего индивидуальным капсидным белкам, выявить не удалось. Таким образом, свободная 3С протеаза, видимо, довольно токсична для растений, что может являться причиной пониженного уровня экспрессии предшественника.

Рис. 2. Вестерн-блоттинг образцов нерастворимых белков, полученных из листьев, экспрессирующих белок P1uGFP.

Сыворотка против белка VP0; 1 – Маркер молекулярного веса; 2 - препарат инактивированного вируса ящура; 3, 4 – образцы белков ткани листа, полученные путем фракционирования листового материала с применением 8М мочевины, из зоны, агроинокулированной культурой клеток С58С1/pCCaр24 (отрицательный контроль) и С58С1/рА7248AMVP1uGFP и С58С1/pCCaр24, соответственно;

Таким образом, для того, чтобы произошла сборка капсидов вируса ящура необходимо экспрессировать в одной клетке отдельные капсидные белки вируса VP0, VP1 и VP3. Однако, единовременная экспрессия нескольких белков с помощью векторов на основе ХВК, часто ведет к потере целевых генов, что является причиной очень низкого уровня накопления белков. Поэтому для экспрессии в растениях отдельных капсидных белков вируса ящура с автокаталитическим пептидом 2А или без него была использована векторная конструкция на основе генома вируса тристецы цитрусовых (ВТЦ) - pCCaCdR1uGFP, позволяющая экспрессировать множественные гены даже под последовательностями идентичных промоторов (Folimonov et al., 2007).

Для экспрессии индивидуальных капсидных белков вируса ящура в клетках растений на основе клостеровирусной плазмиды были получены две конструкции (pCCaCd3CP2auGFP и pCCaCd3CPuGFP), кодирующие последовательности капсидных белков вируса ящура под контролем индивидуальных субгеномных промоторов мажорного капсидного белка ВТЦ с автокаталитическим пептидом 2А и без него. Для визуальной оценки количества зараженных клеток в листьях растений в конструкции была включена последовательность, кодирующая белок GFP, с субгеномным промотором капсидного белка ВЖС.

В областях листьев, инокулированных суспензией агробактерий, трансформированных плазмидами, кодирующими отдельные капсидные белки, и плазмидой кодирующей супрессор РНК сайленсинга р24 на четвертый день после агроинокуляции можно было наблюдать экспрессию свободного GFP. Однако, на вестерн-блоттинге в растворимых фракциях образцов листьев, проинокулированных смесями агробактерий, трансформированных клостеровирусными конструкциями, кодирующими капсидные белки ящура, удалось детектировать только белок VP0, что могло означать, что белок VP0 экспрессировался в растениях в растворимом виде. Отсутствие сигнала, соответствующего белкам VP1 и VP3, могло указывать на то, что они могли экспрессироваться в нерастворимом виде и/или в небольшом количестве. Поэтому с помощью вестерн-блоттинга были проанализированы фракции нерастворимых белков образцов из листьев, инокулированных культурами агробактерий, трансформированных конструкциями, кодирующими капсидные белки ящура (pCCaCd3CP2auGFP и pCCaCd3CPuGFP), приготовленные путем фракционирования листового материала с экстракцией белков растения мочевиной. На вестерн-блоттинге с такими образцами с антителами против белка VP1, присутствовал сигнал в виде «шмера», что является косвенным подтверждением экспрессии белка VP1 в растениях на низком уровне и в виде нерастворимого белка. На вестерн-блоттинге с антителами против белка VP3 сигнал отсутствовал, что могло означать, что этот белок экспрессировался на очень низком уровне или же не экспрессировался вовсе.

Таким образом, были предприняты попытки транзиентной экспрессии в растениях компонентов, необходимых для сборки пустых капсидов вируса ящура – предшественника капсидных белков Р1 с автокаталитическим пептидом 2А и протеазы 3Сpro или отдельных структурных белков вируса ящура. Однако добиться получения ВПЧ ящура в растениях методом транзиентной экспрессии не удалось. Одной из основных причин низкого уровня накопления предшественника Р1-2А и отдельных капсидных белков было, вероятно, отсутствие оптимизации кодонового состава последовательностей генов, кодирующих эти белки, для их экспрессии в растениях.

Несмотря на то, что использование ВПЧ или предшественника капсидных белков Р1 в качестве основы для вакцины против ящура является важным направлением исследований, получение таких белков в количествах, позволяющих их выделение и практическое применение, остается достаточно трудоемкой задачей. В настоящее время на достаточно высоком уровне в растениях возможно получение белков только небольшого размера. Например, в работах, посвященных получению капсидного белка VP1 или его отдельных эпитопов (Carrillo et al., 2001; Wang et al., 2008; Wu et al., 2003), уровень их накопления в растениях был выше, чем уровень экспрессии предшественника (до 2% от растворимых белков клеток). В то же время, иммуногенность и протективность препаратов таких белков значительно уступает традиционным вакцинам, что связано, в том числе, и с ограниченным антигенным репертуаром белка VP1 по сравнению с общим набором распознаваемых эпитопов вириона.

Необходимость оптимизации кодонового состава экспрессируемого целевого белка, минимизации его размера для обеспечения  эффективной экспрессии в клетках растений учитывали на следующем этапе работы, посвященном получению искусственного рекомбинантного белка НРЕ, несущего комбинацию известных В- и Т-клеточных эпитопов вируса ящура в составе одной полипептидной цепи.

2. Получение полиэпитопного белка вируса ящура в бактериях

При дизайне синтетического гена искусственного полиэпитопного белка НРЕ были использованы аминокислотные последовательности известных В-клеточных эпитопов структурных белков и Т-клеточных эпитопов неструктурных белков вируса ящура серотипа О/Тайвань/99, перечисленные далее. В-клеточные эпитопы: VP4 (21-40 а.о.) (Zhang et al., 2007), VP1 (135-160 а.о.) (Zamorano et al., 1994) и (200-213 а.о.) (Van Lierop et al., 1992); и Т-клеточные эпитопы: 2C (68-76 а.о.) (Barfoed et al., 2006), 3D (1-115 а.о.) и (421-460 а.о.) (Garca-Briones et al., 2004). Последовательности эпитопов были разделены «гибкими» глицин-богатыми линкерами G4S2. Нуклеотидная последовательность гена HPE с оптимизированным для экспрессии в клетках N.benthamiana кодоновым составом была синтезирована компанией Евроген (Россия). Для удобства последующего субклонирования в 5’-и 3’-концевые последовательности гена были введены сайты рестрикции AscI и NdeI, XhoI и XmaI, между последовательностями, кодирующими В- и Т-эпитопы, был введен сайт EcoRI. При помощи метода ПЦР и олигонуклеотидов на N-конец такой химерной последовательности была добавлена аминокислотная последовательность шести аминокислотных остатков гистидина. Введенная N-концевая гексагистидиновая последовательность обеспечивала возможность последующей очистки рекомбинантного белка HPE методом металл-хелатной аффинной хроматографии. Схема синтетического гена HPE представлена на рис. 3.

Для создания штамма E.coli –продуцента белка HPE, ген НРЕ был клонирован в вектор pET23a(+) (Novagen), содержащий промотор фага Т7 обеспечивающий высокую экспрессию гетерологичных генов в штаммах E.coli, синтезирующих T7 полимеразу. Полученной рекомбинантной плазмидой pET23a-НPE трансформировали штамм E.coli Rosetta 2 (DE3). Выбор данного штамма в качестве реципиента для продукции белка HРЕ обусловлен тем, что он синтезирует РНК- полимеразу фага Т7, а также содержит дополнительную плазмиду pRARE2, обеспечивающую эффективную трансляцию редких кодонов.

Рис. 3. Схема синтетического гена H-PE.

Черным показаны глицинбогатые линкеры.

Уровень экспрессии белка HPE при культивировании полученного штамма при +37оС в условиях автоиндукции (Studier, 2005) составил порядка 50% от общего клеточного белка (рис. 4а). При таком высоком уровне продукции в штаммах E.coli целевые белки, как правило, образуют нерастворимые агрегаты – «тельца включения». Понижение температуры культивирования полученного штамма до +28оС и +21оС не приводило к повышению растворимости белка НРЕ.

а)  б)

Рис. 4. а - Экспрессия НРЕ белка в E. coli. 1 – Маркер молекулярного веса;

2 – Суммарный белок клеток культуры Rosetta2; 3 – Суммарный белок клеток культуры Rosetta2/pET23a-НPE.

б - Выделение и очистка НРЕ белка, полученного в E. coli. 1 – Маркер

молекулярного веса; 2 - препарат очищенного белка НРЕ.

Для выделения белка НРЕ использовали металл-хелатную аффинную хроматографию на Ni-NTA сефарозе в денатурирующих условиях. Фракции элюата, содержащие максимальное количество белка, диализовали против буфера G, содержащего 4 М мочевину, 10 мМ Tris-HCl pH 8.0. Степень чистоты полученного препарата составила не менее 85% (рис. 4б).

3. Получение полиэпитопного белка вируса ящура в растениях N. benthamiana.

Для получения НРЕ белка в клетках N. benthamiana использовали метод транзиентной экспрессии. Синтетический ген НРЕ был клонирован в фитовирусный экспрессионный вектор на основе полноразмерной кДНК ХВК - pА7248AMV. Полученной плазмидой pA7248AMV-HPE  трансформировали штамм A. tumefaciens EHA105.

В экстрактах листьев растений, агроинокулированных смесью культур, трансформированных конструкцией pA7248AMV-HPE и конструкцией, кодирующей супрессор РНК сайленсинга HCPro вируса мозайки турнепса, детектировали белок, совпадающий по электрофоретической подвижности с рекомбинантным белком  НРЕ, выделенным из клеток E.coli (рис. 5).

Рис. 5. Экспрессия белка НРЕ в растениях N. benthamiana. 1 – Маркер молекулярного веса; 2 – суммарный белок клеток культуры E. coli Rosetta2/pET23a-НPE, на геле примерно 0,5 мкг белка НРЕ; 3 – образец ткани листа из зоны, инокулированной культурами ЕНА105/ pA7248AMV-GUS и ЕНА105/HCPro; 4 - образец ткани листа из зоны, инокулированной культурами ЕНА105/pA7248AMV-HPE и ЕНА105/HCPro; 5 –препарат очищенного белка НРЕ, выделенный из растений.

Рис. 6. Вестерн-блот анализ препаратов белка НРЕ. 1 – белок культуры клеток Е. coli Rosetta2/pET23a-HPE, ~ 5 нг белка НРЕ; 2 – белок культуры клеток Е. coli Rosetta2; 3 - образец ткани листа из зоны, инокулированной культурами клеток ЕНА105/pA7248AMV-HPE и ЕНА105/HCPro, на дорожке ~ 5 нг белка НРЕ; 4 – образец ткани листа из зоны, инокулированной культурами ЕНА105/pA7248AMV-GUS и ЕНА105/HCPro; 5 – препарат очищенного белка НРЕ из растений, 25 нг.

Соответствие антигенных свойств белков НРЕ, полученных в клетках растений и бактерий, подтверждали вестерн-блот анализом с мышиными антителами против выделенного из E.coli и очищенного препарата белка НРЕ (рис. 6). Полученные данные также свидетельствуют в пользу того, что синтезируемый в растениях белок НРЕ не подвергается пост-трансляционным модификациям.

Антисыворотка к белку НРЕ была высокоспецифична, поскольку практически полностью отсутствовало взаимодействие антител с хозяйскими белками клеток бактерий и растений.

Для проверки влияния используемого супрессора РНК-сайленсинга на количество нарабатываемого белка в растениях одну половину листа агроинокулировали смесью культур, трансформированных конструкциями pA7248AMV-HPE и pCCaHCPro (кодирует супрессор РНК-сайленсинга, HCPro, вируса мозаики турнепса), а другую - pA7248AMV-HPE и pCCap24 (кодирует супрессор РНК-сайленсинга p24 вируса, ассоциированного с скручиванием листьев винограда 2 (GLRaV-2)).

Было обнаружено, что уровень экспрессии белка НРЕ при использовании супрессора p24, был выше, чем с супрессором HCPro. Из 120 гр листьев, инокулированных смесью культур агробактерий, трансформированных конструкциями pA7248AMV-HPE-3 и pCCap24, с помощью аффинной хроматографии выделяли около 8 мг белка НРЕ, что составляло около 67 мг белка на 1 кг свежих листьев. Таким образом, уровень накопления белка в растениях увеличился примерно в 2 раза – около 1,5% от всех белков клетки растения.

5. Схема получения белка HPE из клеток бактерий и растений

Разработанные технологические схемы получения полиэпитопного белка HPE из клеток бактерий и растений включают стадии получения биомассы, содержащей достаточное количество целевого белка, ее разрушения, фракционирования, аффинной хроматографии. Процесс получения рекомбинантного белка HPE приведен на рис. 7.

Основной схеме предшествуют стадии вспомогательных работ.

1. Технологическая схема получения белка HPE из клеток E. coli.

1.1. Получение культуры бактериального штамма-продуцента (ВР1б)

Плазмидой pET23a-НPE трансформируют компетентные клетки штамма E. coli Rosetta 2(DE3), ампициллин-устойчивые трансформанты отбирают на чашках c LB агаром, содержащим также 1% глюкозу, 30 мкг/мл хлорамфеникола. Одиночную колонию переносят в 2 мл среды ZYP-0.8G с ампициллином и хлорамфениколом, выращивают в течение ночи при 37°С при постоянном перемешивании.

Рис. 7. Схема получения белка HPE из клеток бактерий и растений

1.2. Подготовка буферных растворов и сорбента (ВР2).

Готовят буфера для фракционирования клеток и хроматографии белка:

Буфер А: 100 мМ NaH2PO4, 10 мМ Tris·Cl, 6 M GuHCl, рН 8.0. Буфер B: 100 мМ NaH2PO4, 10 мМ Tris·Cl, 8 M мочевина, рН 8.0. Буфер С: 100 мМ NaH2PO4, 10 мМ Tris·Cl, 8 M мочевина, рН 6.3. Буфер D: 100 мМ NaH2PO4, 10 мМ Tris·Cl, 8 M мочевина, рН 5.9. Буфер E: 100 мМ NaH2PO4, 10 мМ Tris·Cl, 8 M мочевина, рН 4.5. Буфер F: 6 M GuHCl, 0,2 M уксусная кислота. Буфер G: 4М мочевина, 10 мМ Tris pH 8.0.

Готовят индуцирующий буфер для приготовления суспензии A. tumefaciens для агроинокуляции растений: 10 мM MgSO4, 10 мM MES(2-(N-Морфолино)-этансульфоновая кислота), 150 мкМ ацетосирингона.

Уравновешивают Ni-NTA сефарозу (Promega) в буфере А.

1.3. Получение биомассы клеток для выделения белка (ТП1б).

200 мкл культуры штамм Rosetta 2 (DE3)/pET23a-НPE переносят в 100 мл среды ZYP-5052 с хлорамфениколом, ампициллином, выращивают 48 часов при 28°С в колбах объемом 500 мл, биомассу осаждают центрифугированием.

1.4. Получение грубого экстракта (ТП2б).

Полученную биомассу рекомбинантного штамма (2 г) суспендируют в 10 мл буфера А и разрушают ультразвуковой дезинтеграцией. Супернатант собирают после центрифугирования гомогената 15 мин при 14000 об/мин 15 мин, промывают дебрис 5 мл буфера А и дебрис отбрасывают.

1.5. Выделение белка (ТП3).

1.5.1. 5 мл суспензии Ni-NTA сефарозы (Promega), уравновешенной в буфере А инкубируют с осветленным клеточным лизатом в течение 30 мин при постоянном перемешивании (ТП3.1б).

1.5.2. Переносят суспензию лизата и сорбента в хроматографическую колонку, пропускают лизат через колонку со скоростью 0,5-1 мл/мин (ТП3.2б).

1.5.3. Промывают сорбент последовательно 4-х кратным избытком буфера А, В, С, D, E со скоростью 0,5-1 мл/мин, не допуская пересыхания сорбента в колонке (ТП3.3б.)

1.5.4. Элюируют белок 20 мл буфера F (ТП3.4б). Полученный препарат диализуют против буфера G. Выход очищенного таким образом белка HPE cоставляет примерно 20 мг из 100 мл культуры.

2. Технологическая схема получения белка HPE в N. benthamiana:

2.1. Получение культуры агробактерий для агроинокуляции (ВР1р).

Штаммы A. tumefaciens EHA105/pA7248AMV-HPE и A. tumefaciens EHA105/pCCap24 выращивают на качалке в 3 мл среды LB с антибиотиками (канамицин, рифампицин, гентамицин) и 10мМ MES 12 часов при 27°С. Клетки осаждают при 4000 об/мин в течение 5 минут, осадок ресуспендируют в 500 мкл индуцирующего буфера до конечной плотности (ОП600)=0,4. Выдерживают 3 часа при комнатной температуре.

2.2. Транзиентная экспрессия белка HPE в листьях N. benthaniana (ТП1р).

Суспензии индуцированных клеток штаммов A. tumefaciens EHA105/pA7248AMV-HPE и A. tumefaciens EHA105/pCCap24 смешивают в соотношении 1:1. Полученную смесь вводят шприцом в листья 3-х недельных растений N. benthaniana. Выдерживают растения в оптимальных условиях и при достаточном поливе 5 дней.

2.3. Получение грубого экстракта (ТП2р)

100 г инокулированных агробактериями листьев растирают в жидком азоте в ступке, кашицу суспендируют в 60 мл буфера А, перемешивают на мешалке в течение 30 мин, центрифугируют при 14000 об/мин 15 мин, супернатант отбирают.

2.4. Выделение белка (ТП3).

Полученный супернатант инкубируют с 1,3 мл суспензии Ni-NTA сефарозы, уравновешенной в буфере А, в течение 30 мин при постоянном перемешивании.

Рекомбинантный белок выделяют на колонке схеме, разработанной для клеток E. coli (стадии 1.5.2-1.5.4).

Выход белка составляет примерно 67 мг белка на 1 кг свежих листьев растений.

6. Антигенные и протективные свойства белка НРЕ.

Иммунологические характеристики препаратов очищенных белков из бактерий и растений были определены в опытах на лабораторных животных (морских свинках) в Федеральном Центре Охраны Здоровья Животных (ФГУ ВНИИЗЖ, г. Владимир).

Для определения минимальной дозы белка НРЕ, вызывающей иммунный ответ против вируса, группы морских свинок из 8 животных были однократно иммунизированы масляной эмульсией, содержавшей различные количества препаратов белка HPE, полученных из клеток бактерий или растений (300, 120 и 40 мкг на животное) в комбинации с масляным адъювантом Montanide ISA 70 (SEPPIC, Франция).

Через 17 сут после иммунизации у животных, иммунизированных бактериальным белком, были отобраны сыворотки крови, которые тестировали с помощью реакции микронейтрализации (Таблица 1). Сыворотки крови свинок, привитых растительным белком, были протестированы в непрямом варианте ИФА с антигеном вируса ящура O/Тайвань/99 (тест-система ФГУ ВНИИЗЖ) и с использованием набора O FMDV Ab PrioCHECK (Prionics, Швейцария) (Таблица 2). Через 21 день после иммунизации все группы морских свинок были подвергнуты контрольному заражению адаптированным к этим животным вирусом ящура О/Тайвань/99.

Однократная иммунизация морских свинок препаратами, содержащими 350 и 120 мкг растительного белка НРЕ на одно животное, индуцировала выработку антител, определяемых в референтном тесте O FMDV Ab PrioCHECK (Prionics, Швейцария).

Таблица 1. Антигенные и протективные свойства белка НРЕ, выделенного из клеток E.coli, при исследовании  на морских свинках

Номер группы

Количество вводимого белка на одно животное

РМН

Контрольное заражение: количество защищенных животных/количество животных в опыте

Статистическая значимость по группе (рсл)

1

350 мкг

>1:45

8/8

0,004

2

120 мкг

>1:32

8/8

0,004

3

40 мкг

>1:16

4/8

0,637

4

не вводили

<1:16

0/8

-

Таблица 2. Антигенные и протективные свойства белка НРЕ, выделенного из клеток N.benthamiana, при исследовании на морских свинках

Номер группы

Количество вводимого белка на одно животное

O FMDV Ab PrioCHECK

PI (PIпол50%)

Тест-система ФГУ «ВНИИЗЖ»

Контрольное заражение: количество защищенных животных/количество животных в опыте

Статистическая значимость по группе (рсл)

1

350 мкг

78±14,7%

>100

8/8

0,004

2

120 мкг

70±22,7%

>100

8/8

0,004

3

40 мкг

58,5±19,7%

>50

6/8

0,145

4

не вводили

16,3±6,5%

<50

0/8

-

Однократная иммунизация морских свинок эмульсионной вакциной, содержавшей в прививном объеме белок НРЕ в количествах 350 и 120 мкг/животное, индуцировала у животных формирование вируснейтрализующих антител к вирусу ящура типа О/Тайвань/99, выявляемых в РМН или ИФА и Вестерн-блоттинге. У всех иммунизированных этими дозами животных не происходило появления вторичных афт на передних лапах через 7 сут после заражения. При уровне =0,005 защищенность морских свинок, иммунизированных 350 и 120 мкг белка, была достоверной.

У группы свинок, иммунизированных бактериальным НРЕ в количестве 40 мкг/животное, вторичные афты регистрировали у четырех из восьми свинок, у иммунизированных растительным белком – у двух из восьми. Симптомы ящура появлялись у всех неиммунизированных (контрольных) морских свинок.

Результаты оценки иммуногенности бактериального и растительного полиэпитопных белков НРЕ свидетельствуют о том, что при однократной иммунизации морских свинок дозой 120 мкг/животное в комбинации с масляным адъювантом Montanide ISA 70, он способен индуцировать иммунный ответ у животных, детектируемый методами ИФА и РМН, а также вызывать устойчивость к контрольному заражению гомологичным адаптированным вирусом ящура типа О/Тайвань/99.

ВЫВОДЫ

1.        Созданы фитовирусные векторы для транзиентной ко-экспрессии в растениях предшественника капсидных белков вируса ящура серотипа О/Тайвань/99 Р1-2А, слитого с геном флуоресцентного белка uGFP и протеазы 3Сpro. Показано, что экспрессия гена предшественника P1-2A в растениях приводит к образованию нерастворимых телец включения.

2.        Сконструирован ген искусственного кандидатного вакцинного белка HPE, содержащего набор B- и Т-клеточных эпитопов капсидных белков VP1, VP4, 2C и 3D вируса ящура изолята О/Тайвань/99.

3.        Разработаны системы экспрессии и очистки белка НРЕ в клетках бактерий E. coli и растений N. benthamiana, обеспечивающие получение высокоочищенных препаратов для иммунологических испытаний.

4.        Рекомбинантный белок HPE обладает высокой иммуногенностью и индуцирует у лабораторных животных образование нейтрализующих антител к вирусу ящура О/Тайвань/99.

5.        Однократная иммунизация морских свинок белком НРЕ индуцирует иммунный ответ, обеспечивающий полную защиту лабораторных животных от заражения вирусом ящура О/Тайвань/99.

Практическое использование полученных

научных результатов

1.        Отработанный метод получения искусственного вакцинного белка HPE путем комбинирования в составе одной полипептидной цепи фрагментов структурных и неструктурных белков вируса ящура серотипа О, несущих иммунодоминатные В- и Т-клеточные эпитопы, может быть использован для дизайна и разработки экономичных, безопасных, простых в изготовлении кандидатных вакцин и тест-систем для диагностики и иммунопрофилактики заболеваний ящура, вызываемых вирусами других серотипов.

2.        Препараты кандидатного вакцинного белка НРЕ могут быть востребованы в научных исследованиях по изучению механизмов клеточного и гуморального противоящурного иммунитета, в качестве стандартного антигена в составе диагностических наборов для определения антител к вирусу ящура серотипа О.

3.        Результаты работы могут использоваться в учебном процессе по дисциплинам «биотехнология», «вирусология», «иммунология».

4.        Результаты исследований вошли в отчет о научных исследованиях по проекту «Продукция вакцинных белков в растениях», госконтракт № 02.527.11.0002, реализованного консорциумом российских и европейских участников – победителей конкурса FP7-KBBE-2008-2B проектов научного сотрудничества Россия-ЕС.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.        Полиэпитопный белок вируса ящура, полученный в бактериях и растениях, вызывает протективный иммунитет в морских свинках /Андрианова Е.П., Кременчугская С.Р., Луговская Н.Н. и др. // Биохимия. – 2011. – № 3. - Т. 76. - С. 415-424.

2.        Состав полиэпитопного белка для индукции иммунного ответа против вируса ящура /Андрианова Е.П., Кременчугская С.Р., Борисов В.В., Эльдаров М.А., Фолимонов А.С. // Патент РФ № 2453557 от 20.06.2012, Бюл. № 17.

3.        Андрианова Е.П., Эльдаров М.А., Фолимонов А.С. Полученный в растениях рекомбинантный белок, состоящий из эпитопов вируса ящура, как основа альтернативной вакцины // Биология – Наука ХXI Века: Сб. тезисов 16-й Межд. Пущинской школы-конференции молодых ученых. – Пущино: Пущинский науч. Центр РАН. – 2012. – С. 245-246.

4.        Андрианова Е.П., Фолимонов А.С. Получение белка, состоящего из эпитопов вируса ящура, в бактериях и растениях для изучения возможности разработки альтернативного метода вакцинирования //Горизонты нанобиотехнологии: сб. тезисов Всеросс. научной школы для молодежи – Звенигород: Центр «Биоинженерия» РАН. – 2009. С. 15-16.

5.        Продукция полиэпитопного белка вируса ящура в бактериях и растениях с целью получения потенциальной вакцины / Андрианова Е.П., Кременчугская С.Р., Борисов В.В. и др. // Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова: сб. тезисов Междунар. научной конф. – М.: ИБХ РАН. – 2009. – С. 7-9.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.