WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


На правах рукописи

Варшаломидзе Ольга Эдуардовна

ПЛАЗМИДНЫЕ ПЕРЕСТРОЙКИ И ИЗМЕНЕНИЯ В ПОДВИЖНОСТИ, МЕТАБОЛИЗМЕ АЗОТА И УСТОЙЧИВОСТИ К СОЛЯМ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ У БАКТЕРИЙ AZOSPIRILLUM BRASILENSE

03.02.03 – микробиология 03.01.04 – биохимия А В Т О Р Е Ф Е Р А Т диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов – 2011

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (ИБФРМ РАН) Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Кацы Елена Ильинична доктор биологических наук Шелудько Андрей Вячеславович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Попов Юрий Алексеевич доктор биологических наук Плешакова Екатерина Владимировна

Ведущая организация: Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук

Защита диссертации состоится «25» января 2012 г. в 14:00 ч на заседании диссертационного совета Д 002.146.01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (410049, г. Саратов, просп. Энтузиастов, 13).

Тел. / факс (8452) 970383.

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Минобрнауки РФ и на сайте ИБФРМ РАН: http://ibppm.ru/dissertacionnyy-sovet/

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН.

Автореферат разослан «__» декабря 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор В.Е. Никитина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Являющиеся ассоциативными партнерами растений, бактерии рода Azospirillum из семейства Rhodospirillaceae способны к существованию в разнообразных климатических поясах и экологических нишах (Levanony et al., 1989;

Bashan, Holguin, 1997, 1998; Katupitiya et al., 1995). Изучению особенностей метаболизма и многокомпонентных геномов азоспирилл посвящены многочисленные работы широкого круга исследователей. Повышенный интерес к биохимии и генетике этих бактерий объясняется их способностью стимулировать рост широкого круга растений (это plant-growth-promoting rhizobacteria, или PGPR).

У многих ассоциированных с растениями бактерий сформировались сложные мозаичные геномы – главным образом, за счет дупликаций генов и масштабного горизонтального генетического переноса (MacLean et al., 2007). Присутствие многочисленных мобильных генетических элементов в геномах азоспирилл также предполагает потенциальную возможность разнообразных генетических перестроек (Pothier et al., 2008; Katsy, Prilipov, 2009; Katsy, 2011). Пока известно очень немного оригинальных работ, посвященных изучению у азоспирилл динамики геномов и ее физиологических последствий. Между тем пластичность одной из плазмид (85-МДа плазмида, или р85) модельного штамма A. brasilense Sp245, исследуемого и в настоящей работе, привела к различиям в плазмидном составе культур Sp245, поддерживаемых в разных лабораториях мира, и к утрате р85 тем вариантом Sp245, геном которого был секвенирован недавно в США (Pothier et al., 2008; Khalsa-Moyers, 2010).

Среда обитания почвенных бактерий разнообразна по химическому составу, и существование в такой среде требует от организмов устойчивости и гибкости. В связи с этим пластичность генома является важной характеристикой бактерий, так как способствует возникновению неоднородных по своим адаптивным свойствам популяций. Получены первые данные о том, что образование фенотипических вариантов некоторых ризобактерий способствует их лучшему взаимодействию с растениями (Achouak et al., 2004).

Одним из факторов, жизненно важных для бактерий, является наличие в среде источника азота. Для азоспирилл характерна способность к азотфиксации в микроаэрофильных условиях и к использованию азотсодержащих солей (соли аммония, нитраты и нитриты) в условиях аэрации (Tal, Okon, 1985). Процесс диссимиляторной денитрификации (как правило, при недостатке кислорода) у бактерий может катализироваться респираторной мембранносвязанной или периплазматической нитратредуктазой; цитохром cd1 или медьсодержащей нитритредуктазой; гетеродимерной, получающей электроны от цитохрома c или однокомпонентной, получающей электроны от хинола NO-редуктазой и N2Oредуктазой (Zumft, 1997). Денитрификация может служить для нейтрализации редуцирующего потенциала в клетке, а также для дальнейшего превращения нитрита, в определенной концентрации способного ингибировать рост азоспирилл (Lee et al., 2002). Продукты нитрат- и нитритредукции могут влиять на поведение бактерий и их взаимодействие с растениями (Van Alst et al., 2007; Molina-Favero et al., 2008). У модельного штамма A. brasilense Sp245 охарактеризована периплазматическая нитратредуктаза и кодирующие ее гены napABC (Steenhoudt et al., 2001), две копии гена нитритредуктазы nirK, локализованные в разных плазмидах (Pothier et al., 2008), гены norB (Braker, Tiedje, 2003) и nosZ (Rich et al., 2003) с неопределенной локализацией в геноме. Других сведений об идентификации у азоспирилл генов денитрификации к началу наших работ в литературе не было.

Известны исследования, показавшие, что устойчивость азоспирилл к ряду тяжелых металлов выше по сравнению с другими ризобактериями (например, Tugarova et al., 2006). Несколько работ посвящены механизмам поступления металлов в клетку и их последующим превращениям (Ignatov et al., 2001; Kamnev et al., 1997, 2004). Для поддержания баланса ионов металлов в клетке бактериями используются несколько описанных в литературе систем (Bruins et al., 2000; Choudhury, Srivastava, 2001). Одним из способов выведения ионов из клетки является антипорт ионов и протонов, осуществляемый системой из трех–четырех белков. Мембранные белковые компоненты этой системы, или протон-субстрат антипортеры, из суперсемейства RND (restriction, nodulation, division – резистентность, образование клубеньков, деление клеток) подразделяются на основе экспортируемого субстрата. Разные экспортеры тяжелых металлов RND (HME) осуществляют выброс одновалентных и двухвалентных катионов (Nies, 1999). Устойчивость бактерий к тяжелым металлам часто обеспечивается продуктами экспрессии плазмидных генов (Mergeay et al., 2003;

Nies, 2003; и др.). Однако данных о генетических аспектах устойчивости азоспирилл к тяжелым металлам (кобальт, медь, цинк и др.) в литературе обнаружено не было.

Важным свойством, способствующим лучшему приспособлению бактерий к окружающей среде, является их подвижность. Наличие у азоспирилл специализированных двигательных органелл – жгутиков (Tarand et al., 1978; Hall, Krieg, 1984; Khammas et al., 1989) позволяет им перемещаться по направлению к наиболее благоприятным условиям, закрепляться на поверхности корней растений.

Исследования влияния плазмидных перестроек на такие важные механизмы приспособления бактерий к обитанию в гетерогенных экологических нишах, как подвижность, системы адаптации к разным источникам азота и устойчивость к солям тяжелых металлов, по-видимому, позволят расширить представления об адаптационном потенциале азоспирилл, обусловливаемым пластичностью генома.

Целью диссертационной работы явилось получение новых данных о функциях плазмид Azospirillum brasilense и о влиянии динамики геномов на физиологобиохимические характеристики этих бактерий.

В соответствии с поставленной целью в ходе выполнения работы решались следующие задачи:

1. Характеристика нуклеотидной последовательности клонированного ранее 18.3т.п.н. XhoI-фрагмента 85-МДа плазмиды A. brasilense Sp245, утрата которой дериватом Sp245.5 сопровождалась блокированием диссимиляторной нитритредукции.

2. Сравнительный анализ геномов A. brasilense Sp245, Sp7 и Cd и вариантов штамма Sp245 с новым плазмидным профилем с использованием в полимеразных цепных реакциях праймеров к ДНК p85.

3. Исследование поведения A. brasilense Sp245 и его суперроящихся вариантов со спонтанными геномными перестройками в средах, содержащих в качестве источника азота хлорид аммония, нитрат или нитрит.

4. Анализ гемагглютинирующей активности и подвижности клеток штамма A.brasilense Sp245 и его деривата Sp245.5 (с крупной плазмидной перестройкой и новым липополисахаридом) в присутствии разных источников азота.

5. Сравнение устойчивости к солям тяжелых металлов у бактерий A. brasilense Sp245 и Sp7 и их производных со спонтанными плазмидными перестройками.

Научная новизна работы. Показано, что у модельного штамма A. brasilense Sp245 спонтанные геномные перестройки, затрагивающие плазмиду p85, могут сопровождаться утратой протяженных сегментов p85 или их сохранением в геноме азоспирилл.

Кроме генов медьсодержащей нитритредуктазы (nirK) и гетеродимерной NOредуктазы (norCB), в плазмидной ДНК азоспирилл (p85 из штамма A. brasilense Sp245) впервые выявлены гены активатора NO-редуктазы NorD; АТФ-азы NorQ;

предполагаемого сенсора NO; цистатион–-лиазы, катализирующей образование возможного антагониста NO – гомоцистеина; одного из регуляторов транскрипции LysR типа и каталитической субъединицы I цитохром c оксидазы (ccoN); а также последовательности, кодирующие компоненты предсказанной эффлюкс-помпы, осуществляющей выброс катионов из клеток. В ДНК типового штамма A. brasilense Sp7 и его производного Cd обнаружен локус, высоко гомологичный nirK и orf2(кодирующей предсказанный белок с консервативным доменом “субъединица Е формилметанофурандегидрогеназы”) из p85 штамма A. brasilense Sp245.

Впервые показано, что спонтанные плазмидные перестройки могут приводить к появлению субпопуляций (вариантов) штамма A. brasilense Sp245 с различиями в росте и подвижности в средах с NO3 и (или) NO2 и в эффективности восстановления нитрата и нитрита.

Установлено, что на подвижность бактерий A. brasilense Sp245 оказывают влияние межклеточные контакты, опосредуемые взаимодействиями поверхностного белка–гемагглютинина с О-специфическим полисахаридом (ОПС) этого штамма.

Отсутствие таких белок-углеводных взаимодействий вследствие появления нового ОПС у деривата A. brasilense Sp245.5 (в клетках которого вместо двух резидентных плазмид образовалась новая мегаплазмида), по-видимому, является одной из причин заметных изменений в коллективной подвижности этих бактерий.

На примере A. brasilense впервые выявлено влияние динамики генома на устойчивость бактерий к ионам тяжелых металлов: описано необычное явление существенного спонтанного повышения толерантности бактерий к солям кобальта (II), цинка (II), меди (II) и серебра (I).

Научно-практическая значимость работы. Новые знания о влиянии динамики геномов PGPR A. brasilense на экологически значимые свойства этих бактерий (осуществление денитрификации; заселение новых территорий благодаря индивидуальной и социальной подвижности; устойчивость к солям тяжелых металлов и др.) будут полезны при разработке аграрных биотехнологий. Выявленные в плазмиде р85 из A. brasilense Sp245 последовательности, кодирующие ферменты денитрификации и компоненты предсказанной эффлюкс-помпы, могут быть клонированы в других бактериях с целью расширения адаптационного потенциала новых хозяев. Дериват Sp245.5 PGPR A. brasilense Sp245, обладающий, как оказалось, относительно высоким уровнем устойчивости к ряду тяжелых металлов, может быть использован в работах по биоремедиации загрязненных почв. Бактерии штамма A.brasilense Sp245.5, подробно охарактеризованные в данной работе, уже нашли применение в исследованиях пяти лабораторий ИБФРМ РАН (генетики микроорганизмов, микробиологии, биохимии, иммунохимии, экологической биотехнологии).

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. В плазмиде p85 из штамма A. brasilense Sp245 находится комплекс генов, потенциально важных для обеспечения диссимиляторной редукции NO2 и NO и для защиты этих бактерий от токсического действия NO и ионов тяжелых металлов.

2. Спонтанные генетические перестройки могут приводить к утрате из генома A.

brasilense Sp245 протяженных сегментов 85-МДа плазмиды или к их сохранению в составе новых молекул ДНК.

3. Плазмидные перестройки в ряде случаев сопровождаются появлением вариантов штамма A. brasilense Sp245 с индивидуальными различиями в скорости движения и роста в присутствии разных источников азота, нитрат- и нитритредукции, гемагглютинирующей активности и устойчивости к солям тяжелых металлов.

4. Существенное повышение толерантности деривата A. brasilense Sp245.5 к солям серебра, кобальта, меди и цинка определяется несколькими факторами, в том числе, усилением протонзависимого эффлюкса ионов Ag+, Cu2+ и Zn2+.

Диссертационная работа выполнена в лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН в рамках двух плановых тем НИР (науч. рук. –д.б.н. проф. Е.И. Кацы):

“Изучение вклада плазмид в определение подвижности и образования мажорных компонентов клеточной поверхности у почвенных ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense” (№ госрегистрации 01200606181) и “Изучение генетической регуляции социальной подвижности и образования мажорных компонентов клеточной поверхности у бактерий, ассоциированных с растениями” (№ госрегистрации 01200904390). Исследования были частично поддержаны грантами Российского фонда фундаментальных исследований (06-04-48204-а; рук. – д.б.н. Е.И.

Кацы) и Президента РФ (НШ-3171.2008.4; рук. – заслуженный деятель науки РФ, д.б.н. проф. В.В. Игнатов).

Личный вклад соискателя. Экспериментальные данные, на основе которых сформулированы положения и выводы, представленные к защите, получены лично автором. Соискатель принимала непосредственное участие в постановке задач исследования, подготовке и проведении экспериментальных работ, обработке и обсуждении полученных результатов, подготовке публикаций.

Автор выражает благодарность зав. лаб. генетики микроорганизмов (ЛГМ) ИБФРМ РАН д.б.н. проф. Е.И. Кацы, сотрудникам ЛГМ ИБФРМ РАН в.н.с. д.б.н.

А.В. Шелудько и с.н.с. к.б.н. Л.П. Петровой, сотрудникам лаборатории микробиологии ИБФРМ РАН (зав. лаб. – д.б.н. проф. В.Е. Никитина) с.н.с. к.б.н. Е.Г.

Пономаревой и с.н.с. к.б.н. Е.П. Ветчинкиной и зав. лаб. молекулярной генетики ФГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздравсоцразвития РФ к.б.н. А.Г.

Прилипову за помощь при выполнении работ и сотрудничество.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на IV Межрегиональной конференции молодых ученых “Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой” (Саратов, 2008), 5-м Московском международном конгрессе “Биотехнология: состояние и перспективы развития” (Москва, 2009) и V Всероссийской конференции молодых ученых “Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой” (Саратов, 2010). Диссертационная работа обсуждена и одобрена на расширенном заседании ЛГМ ИБФРМ РАН 22.11.2011, протокол № 185.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ, в том числе, три статьи в рецензируемых журналах и две статьи в сборниках.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 173 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц и 23 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов собственных исследований (из 9 подразделов), а также заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 3источников, из них 52 на русском и 253 на английском языке. В Приложении приведены обсуждаемые в работе кодирующие последовательности из двух сегментов p85, депонированные в базу данных GenBank (NCBI, США) под номерами EU194339, EU595700–EU595706, EU784144, GU904166, GU904167 и GQ168585).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ В обзоре литературы дана характеристика бактерий рода Azospirillum как одного из основных модельных объектов в исследованиях ассоциативного микробно– растительного взаимодействия. Проанализированы современные данные о динамике геномов как одном из факторов формирования внутрипопуляционного разнообразия бактерий; свойствах и функциях плазмид азоспирилл; генетико-биохимических аспектах диссимиляторной денитрификации и влиянии этого процесса на взаимодействие микроорганизмов с растениями; механизмах устойчивости бактерий к ионам тяжелых металлов.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе использованы бактерии A. brasilense дикого типа: Sp245 (Baldani et al., 1983), Sp7 (Tarrand et al., 1978) и Cd (Eskew et al., 1977); а также производные штаммов Sp245, Sp7 и Sp7-S (лишенного 115-МДа плазмиды, или p115) (Матвеев с соавт., 1987). Дериват Sp245.5 утратил 85-МДа и 120-МДа (p120) плазмиды с образованием нового ~300-МДа репликона после длительного хранения бактерий в богатой среде (Петрова, 1998; Кацы с соавт., 2002). Обездвиженные мутанты Sp245 – SK051 и SK248 – содержат коинтеграты p85 с вектором для омегонового мутагенеза pJFF350 (Кацы с соавт., 2001). Плазмидный состав у пяти независимых спонтанных суперроящихся (Swa++) вариантов Sp245.P1–Sp245.Р5 ранее не анализировался (Борисов, 2004; Шелудько с соавт., 2006). Производные штамма Sp7-S (Sp7.1–Sp7.10) содержат дериваты 90-МДа плазмиды, или pRhico, с различиями в молекулярной массе и структуре (Петрова с соавт., 2005а, 2010). Вариант Sp7.K2 – производный штамма Sp7, спонтанно утратившего p115 (Петрова с соавт., 2005а; Матора с соавт., 2008). Для поддержания рекомбинантной плазмиды pEK248X использован штамм Escherichia coli DH1 (Sambrook et al., 1989). Плазмида pEK248X – это лигированный сам на себя KmR XhoI-фрагмент коинтеграта p85::pJFF350 из мутанта SK248, содержащий 18.3 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.) из ДНК p85 (Кацы с соавт., 2001).

Культуры A. brasilense выращивали при 28–30°С на малатно-солевой среде (Dbereiner, Day, 1976) с NH4Cl (1 г/л) (MSM) или на среде с пептоном, сукцинатом и солями (MPSS) (Методы общей бактериологии, 1984); E. coli – на среде LB (Sambrook et al., 1989) при 37°С.

Плазмидный состав бактерий изучали с помощью метода Eckhardt (1978).

Рекомбинантную плазмиду pEK248X выделяли из клеток E. coli DH1 методом щелочного лизиса (Sambrook et al., 1989). ДНК р85, представленную в pEK248X, секвенировали посредством праймерной “прогулки” (Sambrook et al., 1989) в прямом и обратном направлениях в лаборатории молекулярной генетики ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского (Москва).

Для постановки полимеразных цепных реакций (ПЦР) на ДНК азоспирилл праймеры, специфичные к двум сегментам р85 штамма A. brasilense Sp245 (таблица 1), и условия ДНК-амплификации подбирали с помощью программы Primer Select из пакета программ Lasergene (DNA Star, США). Условия амплификации при постановке BOX-, ERIC-, RAPD- и REP-ПЦР соответствовали описанным ранее (Rademaker et al., 1998; de Bruijn, 1992; Fancelli et al., 1998). Амплификацию ДНК проводили в автоматическом термоциклере Терцик (ДНК технология, Москва, Россия). Для электрофореза продуктов ПЦР использовали 2%-ные агарозные гели.

Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей осуществляли с использованием алгоритмов BLAST и Fasta. Положение инициирующих кодонов в открытых рамках считывания (orf) определяли в соответствии с расстоянием от предсказанных последовательностей Шайн-Дальгарно и по результатам выравнивания соответствующих аминокислотных последовательностей со сходными белками из баз данных (когда это было возможно). Предсказание сайтов связывания регуляторов транскрипции делали с использованием базы данных и сервера PRODORIC. Свойства белковых продуктов orf изучали с помощью инструментов, представленных на серверах Pfam, PSORTb, SCOP, ProDom, PredictProtein, SMART, SignalP и SUPERFAMILY.

Таблица 1. Праймеры для постановки ПЦР на ДНК A. brasilense Праймеры Нуклеотидная последовательность Положение* Ссылка Праймеры к 18.9-т.п.н XhoI-фрагменту pP1 5'-CGGCGCCGTGGGTGGTCT-3' 4938–49Данная работа 5'-CGGTGGCAAGCGGGAAATG-3' 5403–53P2 5'-CGTCGGCGCCTTGTTGAGAAT-3' 7042–70Данная работа 5'-CGGTGCGCCTGCTGCTGGAAGA-3' 7452–74P3 5'-CCGGATGCGCGTGCTGAC-3' 7805–78Данная работа 5'-CGGCCCCGGGTATGGAT-3' 8226–82P4 5'-TGTGGGTGTCGGGCATCAT-3' 9439–94Данная работа 5'-GAATCGGCGGCGTCACC-3' 9847–98P5 5'-TCGTGGAGGCGGTGAAAGTGT-3' 10703–107Данная работа 5'-GCGCGGGTGGGCAACGAT-3' 11627–116P6 5'-CGGCACGGTGATGGAAGACG-3' 15337–153Кацы с соавт., 5'-CGACGGGGAGGCGCTGGTGGACT-3' 15772–15720P7 5'-ACCCCGCTGCCCGCTTGTGTTC-3' 17280–173Данная работа 5'-CCGCCGCTTCCCCGTGACCTT-3' 18019–179Праймеры к 9.1-т.п.н. XhoI-фрагменту pP8 5'-CAGCGACCGGCACATCAAGGAAGT-3' 4377–44Данная работа 5'-GGCGACGCGGCGGAACAGC-3' 4785–47P9 5'-GCGGCAGCGTGGCAGTTTGAC-3' 6600–66Данная работа 5'-CGGCGTCGGCGTGGCGTTCG-3' 7180–71P10 5'-CGGGTCGCGGTGGATGTGGAT-3' 7793–78Данная работа 5'-CTGACTTCCGGCGCCGCG-3' 8322–83Праймеры для REP-ПЦР BOX 5'-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3' (Rademaker et al., 1998) Множественные ERIC 5'-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3' повторы (de Bruijn, 1992) 5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3' нуклеотидных REP 5'-IIIIICGICGICATCIGGC-3' последователь- (de Bruijn, 1992) 5'-ICGICTTATCIGGCCTAC-3' ностей RAPD 5'-GTTTCCGCCC-3' (Fancelli et al., 1998) * Координаты приведены в соответствии с нуклеотидными последовательностями 18.3-т.п.н. и 9.1-т.п.н. XhoI-фрагментов p85 из A. brasilense Sp245.

Определение гемагглютинирующей активности бактерий. В ячейки иммуноферментных планшетов с 96 лунками вносили по 50 мкл: 18-ч бактериальных культур (А590 = 0.5); суспензий бактерий, отмытых от среды в 0.05 М фосфатносолевом буфере (ФСБ) (рН 7.0) (А590 = 0.5; А590 = 1.0); суспензий бактерий (А590 = 0.5) в ФСБ после 8 ч инкубации при 37°С в присутствии 2 мг/мл трипсина; культуральной жидкости, освобожденной от бактерий центрифугированием (использовали культуры с А590 = 0.5). Готовили серию двукратных разведений в ФСБ каждого из вариантов. К полученным разведениям добавляли по 50 мкл 2%–ной суспензии в ФСБ трипсинизированных или нативных кроличьих эритроцитов; через 18 ч инкубации при 4°С определяли титр гемагглютинации.

Изучение скорости роста бактерий в присутствии разных источников азота.

Бактерии выращивали 18 ч на плотной MSM, а затем инокулировали в конические 250-мл колбы со 100 мл среды MPSS, содержащей KNO3 или KNO2 (1 г/л). Так как работа ферментов, принимающих участие в метаболизме азота, зависит от условий аэрации, то в первой серии экспериментов колбы помещали в качалку для интенсивной аэрации и инкубировали при 200 об/мин. Во второй серии опытов для выращивания бактерий в стационарных условиях брали колбы на 100 мл, содержащие 40 мл среды. Измеряли оптическую плотность культуральной жидкости на фотоколориметре КФК–3 каждые 2 ч при =590 нм (А590) в кювете толщиной 1 см.

Результаты представляли в виде графической зависимости A590 от времени. Во всех случаях проводили не менее пяти независимых экспериментов в трех повторностях.

Нитрит в культуральной жидкости определяли по (Nicolas, Nason, 1957).

Изучение подвижности бактерий. Бактерии выращивали в жидкой MSM 18 ч при 30°С. По окончании инкубации из культуры клеток готовили препарат “раздавленная” или “висячая” капля. Для наблюдения за бактериями (в жидкой или полужидкой среде) использовали фазово-контрастный микроскоп Jenaval, соединенный с цифровой видеокамерой Sony DCR–TRV900E. При микроскопии каждого препарата проводили видеозапись движения бактерий. Скорость записи – видеокадров/с, видеофайлы сохраняли на компьютере в формате AVI. Используя объект–микрометр, записывали видеофайл с масштабной линейкой.

Видеоизображение подвергали компьютерному анализу, позволяющему отображать траекторию движения отдельных клеток. У 50–150 единичных клеток определяли среднюю скорость движения по траектории. Оценивали подвижность всех клеток в поле зрения микроскопа. Для определения среднего показателя процента подвижных клеток обрабатывали не менее пяти файлов.

Для оценки подвижности бактерий в жидкой среде в присутствии препаратов полимеров клеточной поверхности A. brasilense Sp245 суспензии бактериальных клеток в ФСБ смешивали на покровном стекле с растворами гемагглютинина (ГА), липополисахарида (ЛПС), О-специфического полисахарида (ОПС) ОПСI или ОПСII, ЛПС-белкового комплекса (ЛПБК) или полисахарид-липидного комплекса (ПСЛК) в ФСБ (конечные концентрации полимеров приведены в Главе 3) и инкубировали 1 мин и 30 мин. Определяли процент подвижных клеток и скорость их движения.

ГА был охарактеризован в лаборатории микробиологии (ЛМ) ИБФРМ РАН под руководством д.б.н. проф. В.Е. Никитиной. Препараты ЛПС, ОПСI, ОПСII, ЛПБК или ПСЛК любезно предоставлены д.б.н. проф. С.А. Конновой с коллегами (лаборатория биохимии ИБФРМ РАН).

Для выявления возможного ингибирования связывания ГА с бактериальными клетками в раствор ГА (10 мкг/мл) добавляли до 0.1 мг/мл ЛПС, ОПСI, ОПСII, ЛПБК или ПСЛК. Через 1 ч инкубации при 28°C растворы смешивали с суспензией клеток и определяли скорость движения бактерий. В контрольных опытах использовали ФСБ без добавления полимеров.

Изучение устойчивости бактерий к солям тяжелых металлов. Определяли минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) соли, т.е. ее концентрацию, предотвращающую видимый рост бактерий в течение 18–24 ч инкубации. Бактерии выращивали в жидкой среде, культуры доводили до одинаковой оптической плотности и рассевали из серийных разведений на плотную среду с различной концентрацией сульфата меди, нитрата серебра, хлорида кобальта и сульфата цинка.

Для изучения влияния солей тяжелых металлов на рост клеток A. brasilense Sp2и Sp245.5 в жидкой среде и в жидкой среде, содержащей ингибитор эффлюкс-помп карбонилцианид-м-хлорофенилгидразон (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone, или СССР), использовали эти соли в варьирующих концентрациях. Инокулировали по 100 мкл 24-ч культур бактерий, выращенных в 20 мл жидкой MSM с 0.01% дрожжевого экстракта, в колбы с 15 мл среды, содержащей соль тяжелого металла.

Колбы инкубировали на качалке при 140 об/мин и 30°C. Через 24 ч инкубации измеряли оптическую плотность культур при 590 нм (A590). СССР добавляли в среды из 1-мМ раствора до требуемой конечной концентрации.

Все количественные результаты подвергали статистической обработке с использованием пакета Microsoft Office Excel 2003 (11.6355.6360) SP1.

Доверительные интервалы определяли для 95% уровня значимости. Для оценки достоверности различий между средними значениями использовали t-критерий Стъюдента.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1 Идентификация в плазмиде p85 из бактерий A. brasilense Sp2комплекса генов денитрификации. В результате анализа нуклеотидной последовательности 18.3-т.п.н. XhoI-фрагмента р85, представленного в рекомбинантной плазмиде pEK248X, был идентифицирован комплекс генов, важных для осуществления денитрификации (рис. 1).

Рис. 1. Генетическая карта 18.3-тпн XhoI-фрагмента 85-МДа плазмиды A. brasilense Sp245.

Горизонтальными стрелками изображены orf со свойствами кодирующих последовательностей азоспирилл и направление их транскрипции. Двунаправленными стрелками обозначены целевые участки ПЦР-амплификации с использованием пар праймеров P1–P7. X – XhoI-сайт рестрикции.

Масштабная линейка соответствует 1 т.п.н. IS-элементы ISAzba1 и ISAzba2, а также orf414 и orf418, кодирующие предсказанные гликозилтрансферазы, охарактеризованы ранее (Katsy, Prilipov, 2009; Кацы с соавт., 2010). Возможная функция гипотетического продукта трансляции orf171 не предсказана.

В p85 выявлены структурные гены медьсодержащей нитритредуктазы (nirK) и гетеродимерной NO-редуктазы (norCB), а также ранее не описанные у азоспирилл гены norQD. Продукт orf208 сходен с консервативными белками из ряда бактерий и содержит домен “субъединица Е формилметанофурандегидрогеназы”. Роль субъединицы Е в работе вышеназванного фермента, обнаруженного у метаногенных и сульфатредуцирующих микроорганизмов, не определена. В белке ORF1обнаружены два гемэритриновых домена. Полагают, что гемэритрин является регулятором ответа на NO (Strube et al., 2007), играет значимую роль при попадании организмов в условия лимитации по кислороду, будучи его накопителем, и опосредует аэротаксис бактерий в качестве кислородного сенсора (Isaza et al., 2006).

В секвенированном фрагменте p85 также обнаружена orf293, кодирующая регулятор транскрипции LysR–типа. Регуляторы LysR участвуют в контроле транскрипции разнообразных генов, в том числе, в условиях кислородного стресса. ORF2обладает значимым сходством с белком HdfR, являющимся негативным регулятором транскрипции мастер-оперона flhDC, продукты которого необходимы для экспрессии остальных флагеллярных генов у E. coli и ряда других гамма-протеобактерий (Ko, Park, 2000).

Многие бактерии адаптируются к микроаэробным условиям, благодаря работе цитохром c оксидазы cbb3-типа, кодируемой опероном ccoNOQP. Нуклеотидные последовательности гена ccoN, впервые выявленного нами в плазмидной ДНК азоспирилл, и ccoN из оперона ccoNOQP (cytNOQP), ранее охарактеризованного у типового штамма A. brasilense Sp7 (Marchal et al., 1998), идентичны на 85%.

Кодируемая p85 каталитическая субъединица I (CcoN) цитохром c оксидазы обладает свойствами, достаточными для работы фермента в качестве протонной помпы.

Интересно, что перед генами p85 nirK, norC и ccoN есть потенциальные сайты связывания регулятора транскрипции RegA одного из белков двухкомпонентной сенсорно–регуляторной системы PrrBA (RegBA), модулирующей экспрессию ряда генов у альфапротеобактерии Rhodobacter sphaeroides в зависимости от редоксстатуса клетки (Laratta et al., 2002; Laguri et al., 2003). Наличие потенциальных сайтов связывания белков–регуляторов транскрипции FNR (regulator of fumarate and nitrite reduction), ANR (arginine nitrate regulator) и DNR (dissimilatory nitrate respiration regulator) перед генами nirK и norC, выявленными нами в плазмиде p85, свидетельствует о возможной активации экспрессии этих генов в ответ на снижение концентрации O2 и присутствие оксидов азота. Перед nirK, norC, orf293 и ccoN в pесть и потенциальные сайты связывания регулятора NarL, находящегося под контролем сенсора нитрата/нитрита NarX (Zumft, 1997). Гены norCBQD и nirK, orf2и orf181, по-видимому, образуют опероны. Поэтому белки-регуляторы транскрипции, потенциальные сайты связывания которых находятся перед norC и nirK, могут оказывать влияние на экспрессию всех генов предполагаемых оперонов norCBQD и nirKorf208orf181.

В секвенированном сегменте p85 обнаружен и ген metC (рис. 1). В случае E. coli metC-мутанты, дефектные по синтезу гомоцистеина, имели более высокий уровень экспрессии гена флавогемоглобина (hmp), индуцируемой NO. При повышении концентрации гомоцистеина в клетках E. coli уровень экпрессии hmp падал. В связи с этими и другими данными возникло предположение о том, что гомоцистеин является антагонистом NO (Membrillo-Hernandez et al., 1998). Продукт orf164, также локализованной в p85 (рис. 1), по-видимому, не связан с процессами денитрификации или регуляции метаболизма в ответ на оксиды азота и редокс-статус клетки.

У производного A. brasilense Sp245.5 с крупной плазмидной перестройкой исчезновение p85 и одного из двух фрагментов тотальной ДНК, гомологичных 2.4т.п.н. EcoRI фрагменту p85, содержащему, как сейчас выяснилось, часть гена nirK, а также orf208 и orf181, сопровождалось утратой способности бактерий к нитритредукции (Кацы, 2002а). Ранее в реакциях гибридизации с вышеназванным EcoRI-фрагментом p85 позитивные сигналы были обнаружены в p85 и плазмиде с молекулярной массой более 300 МДа. С 2.4-т.п.н. EcoRI фрагментом pгибридизовались 2.7-т.п.н. и 2.4-т.п.н. EcoRI фрагменты тотальной ДНК штамма Sp245 (Кацы с соавт., 2002). Коллеги из Франции также обнаружили у A. brasilense Sp245 два гомологичных гена nirK, локализованных в разных плазмидах (Pothier et al., 2008). Плазмида p85 может претерпевать спонтанные генетические перестройки, и в штамме, поддерживаемом в одной из французских лабораторий, появилась ее 150МДа производная (Pothier et al., 2008). Pothier с соавт. (2008) локализовали гены nirK и norCB в 150-МДа плазмиде (p150) “своего” штамма Sp245. Нами установлено, что белки NorC и NirK, кодируемые соответственно p150 и p85 из двух вариантов Sp245, идентичны на 100%. Белок NorB, кодируемый 150-МДа дериватом p85, короче идентифицированного нами NorB на 87 аминокислотных остатков. Уровень идентичности аминокислотных последовательностей двух NorB составляет 92%. Есть ли в 150-МДа плазмиде из “французского” штамма Sp245 другие гены, обнаруженные нами в p85, не известно.

3.2 Выявление в плазмиде p85 из A. brasilense Sp2последовательностей, кодирующих предсказанные белки -экспортеры ионов тяжелых металлов. В настоящей работе в результате анализа нуклеотидной последовательности плазмиды р85 у азоспирилл впервые идентифицированы orf (orf122x, orf115 и orf176) (рис.1), предсказанные продукты которых, по-видимому, образуют помпу, осуществляющую выброс катионов из клетки (таблица 2).

Таблица 2. Характеристика предсказанных продуктов трансляции открытых рамок считывания, выявленных в плазмиде p85 из A. brasilense Sp2Условное Координаты домена в аминокислотной Genbank номер доступа, название обозначение, последовательности и его название; наиболее сходного белка: % величина и E-value идентичности/% сходства предсказанная (координаты выровненных локализация последовательностей) Orf и продукта orf сходного белка; E-value Orf122x (38–57), (67–89) Трансмембранные ZP_00056507, COG3696, >122 а.о.*/>13.3 участки Возможная помпа для выброса кДа серебра из -протеобактерии (1–98) COG3696, Возможная помпа для Цпм** Magnetospirillum magnetotacticum:

выброса серебра; 2e81/91 (1–90:942–1031); e(20–103) 2A0601, Помпа для выброса тяжелых металлов (кобальт–цинк– кадмий); 3eOrf115 (1–25) Сигнальный пептид ACH82433, Консервативный 115 а.о./11.9 кДа гипотетический белок из (56–106) Pfam11604, CusF_Ec, Вне цп*** протеобактерии Acidithiobacillus Медьсвязывающий периплазматический ferrooxidans: 44/67 (46–115:50– белок CusF; 6e119); 9e(58–97) PRK09838, Периплазматический медьсвязывающий белок; 5e(58–96) COG5569, Неохарактеризованный консервативный белок; 5eOrf176 (52–169) COG3019, Предсказанный EAS40039, Возможный 176 а.о./18.7 кДа металлсвязывающий белок; 6e33 консервативный Вне цп*** периплазматический белок из (84–153) pfam04214, DUF411, Белок с протеобактерии Psychromonas sp.:

неизвестной функцией; 5e17. Некоторые 49/65 (47–170:15–140); 3еиз членов семейства определяют устойчивость бактерий к катионам металлов Примечание: *Аминокислотный остаток. **Цитоплазматическая мембрана. **Вне цитоплазмы.

Подобные белковые помпы, состоящие из расположенного в цитоплазматической мембране антипортера протонов, периплазматического белка и белка, локализованного в наружной мембране (Nikaido, 1996), охарактеризованы у Ralstonia metallidurans (Mergeay et al., 2003) и включают Cnr систему (устойчивость к никелю и кобальту) (Liesegang et al., 1993), Ncc систему (устойчивость к никелю, кобальту и кадмию) (Schmidt, Schlegel, 1994) и Czc систему (устойчивость к кобальту, цинку и кадмию) (Mergeay et al., 1985). У Pseudomonas aeruginosa помпа CzrCBA вносит вклад в устойчивость бактерий к цинку и кадмию (Hassan et al., 1999). У E. coli четырехкомпонентная помпа CusCFBA определяет устойчивость к одновалентным катионам серебра и меди (Franke et al., 2003) и, по-видимому, участвует в поддержании гомеостаза меди (Grass, Rensing, 2001). Об идентификации у каких-либо штаммов Azospirillum генов, определяющих устойчивость к тяжелым металлам, ранее не сообщалось.

Локализация комплекса генов денитрификации и orf, кодирующих предсказанную эффлюкс-помпу, в плазмидной ДНК A. brasilense Sp245, к тому же недалеко от ISэлементов ISAzba1 и ISAzba2 (Katsy, Prilipov, 2009) (см. рис. 1), свидетельствует о потенциальной мобильности этих генов и высокой вероятности их горизонтального переноса в популяциях ризосферных бактерий.

3.3 Сравнительный анализ ДНК бактерий штаммов A. brasilense Sp245, Sp7 и Cd в полимеразных цепных реакциях с праймерами к ДНК плазмиды p85 из штамма Sp245. Осуществлен сравнительный анализ геномных ДНК бактерий штаммов A. brasilense Sp245, Sp7 и Cd в ПЦР с парами праймеров P1 и P7 к локусам p85 (рис. 1), кодирующим экологически значимые белки. Эти исследования выполнены совместно с с.н.с. ЛГМ ИБФРМ РАН к.б.н. Л.П.

Петровой.

В ПЦР на ДНК A. brasilense Sp7 и Cd с праймерами P7 к последовательностям p85, кодирующим предсказанные компоненты эффлюкс-помпы, осуществляющей выброс тяжелых металлов из клеток, были получены негативные результаты. Повидимому, в геномах штаммов Sp7 и Cd нет локусов, идентичных orf122x и orf176 из плазмиды p85 A. brasilense Sp245.

Однако в ПЦР на ДНК A. brasilense Sp245 и Sp7 с праймерами к nirK-orf208 (P1) образовались ампликоны с ожидаемой длиной 466 п.н., что свидетельствует о существовании высоко гомологичных локусов у двух штаммов азоспирилл. В случае ПЦР с P1 на ДНК A. brasilense Cd был получен слабый позитивный результат, что, повидимому, объясняется сохранением в геноме этого штамма одного из двух участков гомологии 2.4-т.п.н EcoRI-фрагменту с генами nirK–orf208–orf181, локализованного вне p115 (Кацы с соавт., 2002).

Утрата p115 штаммом A. brasilense Cd сопровождается потерей способности бактерий к восстановлению нитрита, что также свидетельствует о вкладе генов p115 в процесс денитрификации. Полученные нами косвенные данные о сходной роли p1и p85 в процессе диссимиляторной нитритредукции согласуются с предположением о возможном родстве этих плазмид, основанном на явлении невозможности их совместного поддержания в одной клетке (несовместимости) (Кацы, 1992).

3.4 Анализ изменений в структуре ДНК, произошедших у спонтанных суперроящихся производных A.

brasilense Sp245. Данный подраздел работы выполнялся совместно с с.н.с. к.б.н. Л.П.

Рис. 2. Плазмидный профиль Петровой. Нами установлено, что у четырех штамма A. brasilense Sp245 (1) и его спонтанных производных A.brasilense Sp245 с спонтанных Swa++ вариантов Sp245.P(2), Sp245.P2 (3), Sp245.P3 (4), ускоренным роением (Sp245.P1–Sp245.P4) Sp245.P4 (5) и Sp245.P5 (6).

вместо 85-МДа репликона появилась примерно Молекулярная масса плазмид в МДа в два раза более крупная плазмида (рис. 2), поуказана слева. Различия в плазмидных видимому, являющаяся продуктом профилях обозначены стрелками.

межмолекулярной генетической рекомбинации.

В то же время плазмидные профили бактерий штаммов Sp245 и Sp245.P5 идентичны.

Ранее было показано, что геномы азоспирилл обладают пластичностью, и ДНК некоторых плазмид вовлечена в спонтанные геномные перестройки (Кацы с соавт., 2002; Петрова с соавт., 2005, 2005а; Vial et al., 2006). Так, Pothier et al. (2008) отметили различия в плазмидном составе культур A. brasilense Sp245, поддерживаемых в разных лабораториях. Эти авторы предположили, что самая маленькая плазмида, обнаруженная в клетках штаммов Sp245 из Реховота (Израиль) и Лувена (Бельгия), образовала коинтеграт с другой плазмидой в клетках штамма Sp2из Лиона (Франция) (Pothier et al., 2008). Интересно, что плазмидные профили наших штаммов A. brasilense Sp245 и Sp245.P5 аналогичны таковым у образцов Sp245 из Реховота и Лувена, а размер новой плазмиды вариантов Sp245.P1–Sp245.P4 близок к размеру вероятного коинтеграта из французского штамма Sp245.

С использованием ПЦР с 10 парами праймеров к двум XhoI-фрагментам p85 (рис.

1; рис. 3) мы проверили, сохранились ли соответствующие локусы p85 в клетках спонтанных суперроящихся вариантов Sp245.P1-Р5. Все ПЦР на ДНК Sp245 и пяти его Swa++ вариантов дали идентичные позитивные результаты. Повидимому, новая плазмида, обнаруженная в клетках Рис. 3. Генетическая карта 9.1-тпн XhoI-фрагмента p(по Katsy, Prilipov, 2009; Ковтунов с соавт. 2012). штаммов Sp245.P1–Sp245.PГоризонтальными стрелками изображены orf и (рис. 2), является дериватом p85.

направление их транскрипции; двунаправленными С целью более тонкого стрелками – целевые участки ПЦР-амплификации с анализа изменений в структуре использованием праймеров P8–P10. int – ген фаговой ДНК, происходящих при интегразы; tnpA – ген транспозазы IS-элемента ISAzba3;

спонтанном появлении orf319 кодирует 3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфатсуперроящихся производных сульфотрансферазу, а orf119 – мембранный белок Sp245, были поставлены ПЦР толерантности к толуолу Ttg2. X – XhoI-сайт рестрикции.

Масштабная линейка соответствует 1 т.п.н. (ERIC-, RAPD-, REP-, BOX-ПЦР) с праймерами, к консервативным мотивам в повторяющихся последовательностях нуклеотидов бактерий. С помощью данного подхода оказалось возможным выявление тонких различий в архитектуре геномов штамма Sp245 и некоторых из его суперроящихся производных (рис.

4).

В REP- и BOX-ПЦР различия между ДНК Sp245 и его Swa++ вариантами уловить не удалось, возможно, в связи с отсутствием в pРис. 4. Результаты ERIC-ПЦР (а) и RAPD-ПЦР (б) на ДНК A. brasilense Sp245 (1), Sp245.P1 (2) и нуклеотидных повторов, Sp245.P2 (3). (Различия в составе продуктов ПЦР соответствующих праймерам, на ДНК Sp245, Sp245.P3, Sp245.P4 и Sp245.P5 не использованным в данных выявлены.) М – маркерная ДНК, 100 bp+ DNA разновидностях ПЦР.

ladder (Fermentas, Латвия). Длина ряда маркерных 3.5 Сравнительное фрагментов ДНК в п.н. указана слева. Стрелками исследование ДНК бактерий обозначены межштаммовые различия.

штамма A. brasilense Sp245 и его спонтанного деривата Sp245.5 с крупной плазмидной перестройкой. Как показано ранее, SDS-PAGE профили белков внешней мембраны у штаммов Sp245 и Sp245.5 почти идентичны (Кацы с соавт., 1994), но структура ОПС у них абсолютно разная. Повторяющееся звено ОПС у штамма Sp245 является пентасахаридом, состоящим из остатков Dрамнозы (Fedonenko et al., 2002), а у Sp245.5 – дисахаридом, образованным остатками N-ацетил-D-галактозамина и N-ацетил-D-маннозаминуроновой кислоты (Федоненко с соавт., 2010). Sp245 продуцирует полисахариды, связывающие флуоресцентный краситель калькофлуор (ПССК) (Cal+ фенотип) (Katzy et al., 1998), а Sp245.5 имеет Cal– фенотип (Кацы с соавт., 2002). В отличие от штамма A. brasilense Sp2бактерии Sp245.5 не способны к восстановлению нитрита (Кацы, 2002, 2002а).

С целью анализа изменений в структуре ДНК Sp245.5 были поставлены ПЦР с праймерами к ДНК р85 из Sp245.

Эта работа выполнялась совместно с с.н.с. к.б.н. Л.П. Петровой. Во всех ПЦР Рис. 5. Результаты ПЦР с праймерами к на клеточной ДНК Sp245 были получены плазмиде р85 из A. brasilense Sp245 на ДНК ампликоны ожидаемого размера. ПЦР на бактерий штаммов Sp245 (1) и Sp245.5 (2). М – тотальной ДНК деривата Sp245.5 с маркерная ДНК, 100 bp+ DNA ladder праймерами P1–P3 и P5–P7 не дала (Fermentas, Латвия). На панелях P1–Pникаких продуктов, а в ПЦР с Pпоказаны результаты ПЦР с праймерами P1, образовались два ампликона размером P2, P3, P4, P5, P6 и P7. Длина ряда маркерных ~1.35 и 1.9 т.п.н (вместо 409 п.н.) (рис. 5).

фрагментов (в п.н.) приведена слева.

Таким образом, 18.3-т.п.н. XhoIфрагмент p85, в котором мы выявили гены денитрификации и три orf, кодирующие предсказанные компоненты эффлюкс-помпы, очевидно, был утрачен или очень сильно поврежден в процессе спонтанной плазмидной перестройки, произошедшей у Sp245.5.

3.6 Различия в подвижности и гемагглютинирующей активности клеток штаммов A. brasilense Рис. 6. Характеристика колоний, формируемых Sp245 и Sp245.5. В аэробных A.brasilense Sp245 после точечной инокуляции условиях на полужидких средах суспензии клеток в полужидкие среды, содержащие без источника связанного азота разные источники азота (1 г/л). а – на средах с клетки штамма Sp2концентрацией агара 0.2, 0.4 или 0.6%. (1 – без формируют колонии, связанного азота; (2–4) в присутствии: 2 – NH4Cl, 3 – превышающие диаметр колоний, KNO3, 4 – KNO2). Время инкубации – 36 ч. б – на средах, содержащих 0.4% агара (1 – диаметр колоний на образованных в присутствии поверхности агара; 2 – диаметр колоний в толще агара).

аммония, нитрата или нитрита Время инкубации – 36 ч и 72 ч.

(рис. 6). Край колоний образован бактериями, мигрирующими в толще среды (2–3 мм от поверхности). На поверхности агара клетки формируют в пределах колонии диски меньшего диаметра. Вероятно, азоспириллы, будучи микроаэрофилами (Tarrand et al., 1978), в отсутствие азота преимущественно формируют колонию в микронише, благоприятной для работы нитрогеназы.

На средах с 0.2–0.4% агара в ряду “аммоний–нитрат–нитрит” наблюдается уменьшение размера колоний (рис. 6). Максимальный диаметр колоний на полужидкой MSM (концентрация агара 0.4%), содержащей хлорид аммония или нитрат калия, не зависит от концентрации соли (1–3 г/л).

Изменение концентрации аммония или нитрата в среде не влияет на скорость движения клеток штамма Sp245. Так, при концентрации солей 1 или 3 г/л скорость, соответственно, составляет 28.6 ± 1.5 и 28.6 ± 1.4 мкм/с в присутствии аммония и 29.± 1.5 и 29.8 ± 1.4 мкм/с в присутствии нитрата. Скорость движения клеток, выросших на среде с нитритом, несколько уменьшается с увеличением его концентрации.

Клетки, выросшие с 1 г/л или 3 г/л нитрита калия, двигаются, соответственно, со скоростью 24.4 ± 1.2 или 22.4 ± 1.4 мкм/с. Однако диаметр колоний в сходных условиях не изменяется.

Возможно, присутствующий в среде источник азота влияет не только на скорость движения клеток, но и на взаимодействия, определяющие контакты между перемещающимися бактериями, что сказывается на диаметре колоний. На средах с 0.6% агара различия в размере колоний нивелируются (рис. 6а), очевидно, в результате того, что клетки на более плотных средах между собой находятся в более тесном контакте, чем бактерии в присутствии 0.2–0.4% агара, и роль взаимодействий, модулируемых источником азота, становится не столь существенной.

Средняя скорость движения клеток A. brasilense Sp245.5, выросших в жидкой среде, существенно снижена по сравнению с таковой у штамма дикого типа. Клетки Sp245 движутся со скоростью 29.3 ± 0.9 мкм/с, а у Sp245.5 этот показатель составляет 17.1 ± 0.8 мкм/с. На полужидких средах поведение деривата Sp245.5 заметно отличается от поведения Sp245. Клетки Sp245.5 формируют “диффузную” колонию, тогда как бактерии Sp245 образуют четко очерченный диск (рис. 7). В случае Sp245.фронт движущихся бактерий, в отличие от дикого типа, характеризуется несколько меньшей плотностью клеток. Размер колоний у Sp245.5 превышает таковой у Sp245, хотя у деривата скорость движения клеток ниже.

Скорее всего, фенотип колоний Sp245.5, образуемых в полужидкой среде, обусловлен кардинальными имениями свойств поверхностных полисахаридов и, как следствие, нарушением углевод–углеводных или белок–углеводных взаимодействий.

Межклеточные контакты обеспечиваются компонентами бактериальной поверхности, в Рис. 7. Различия в характере частности, полисахаридными и белковыми распространения в полужидкой структурами. Уровень продукции и свойства среде бактерий штаммов A.

поверхностных полимеров у азоспирилл могут brasilense Sp245 (а) и Sp245.5 (б) меняться в зависимости от источника азота в среде через 36 ч после точечной инокуляции их культур в MSM, инкубации, что, в свою очередь, сказывается и на содержащую 0.4% агара.

способности клеток вызывать гемагглютинацию Масштабная линейка соответствует (Никитина с соавт., 1994; Yagoda–Shagam et al., 1 см.

1988).

Совместно с сотрудниками ЛМ ИБФРМ РАН (зав. лаб. – д.б.н. проф. В.Е.

Никитина) к.б.н. Е.Г. Пономаревой и к.б.н. Е.П. Ветчинкиной было проведено сравнение гемагглютинирующей активности клеток A. brasilense Sp245 и Sp245.5 и изучено влияние различных источников азота на способность азоспирилл к гемаглютинации.

Агглютинацию трипсинизированных эритроцитов вызывают жидкие культуры Sp245 (А590=0.5), выросшие в стационарных условиях на среде с 1 г/л хлорида аммония; суспензии отмытых клеток из этих культур в ФСБ и культуральная жидкость. Во всех случаях титр реакции агглютинации составил 1:4, что может быть обусловлено различной степенью связывания гемагглютининов с поверхностью бактериальной клетки и особенностями комплексов, образуемых гемагглютининами с другими молекулами, влияющими на активность агглютининов. Обработанные трипсином клетки штамма Sp245 (А590 = 0.5) утрачивали способность агглютинировать трипсинизированные эритроциты. В суспензиях клеток (А590 = 1.0) у деривата Sp245.5 титр реакции гемагглютинации составил 1:32, а у родительского штамма Sp245 – 1:16.

На способность культур штамма Sp245 вызывать агглютинацию эритроцитов влияет источник азота в среде выращивания бактерий. Титр агглютинации трипсинизированных эритроцитов жидкими культурами Sp245 (А590 = 0.5), выросшими на среде с 1 г/л нитрита или нитрата калия, составил 1:16, а в случае 1 г/л хлорида аммония – 1:4. Изменение содержания хлорида аммония (1, 3 или 0.05 г/л) не влияло на агглютинирующие свойства культур Sp245. Ранее сообщалось (Антонюк, 2005), что исключение аммония из состава среды культивирования в случае штамма Sp245 приводит к снижению гемагглютинирующей активности бактерий. Напротив, у штамма A. brasilense Sp7 способностью к гемагглютинации обладали только клетки, выросшие на средах с низким содержанием азота (например, 0.05 г/л KNO3) (Никитина с соавт., 1994). Можно предположить, что у штаммов Sp245 и Spразличаются механизмы регуляции синтеза или активности агглютининов.

3.7 Подвижность бактерий штаммов A. brasilense Sp245 и Sp245.5 в присутствии полимеров, выделенных с поверхности клеток Sp245.

Сотрудниками ЛМ ИБФРМ РАН с поверхности клеток штамма Sp245 выделен препарат гемагглютинина, после очистки гель-фильтрацией представляющий собой белок с молекулярной массой около 67 кДа.

При определениии специфичности агглютинина Sp245 (в ЛМ ИБФРМ РАН) ингибированием углеводами и углеводсодержащими полимерами реакции гемагглютинации выделенные с поверхности штамма Sp245 ЛПБК и ЛПС в концентрации 50.5 мкг/мл подавляли активность 1.0 мкг/мл ГА в отношении трипсинизированных эритроцитов. При этом ни один из 35 использованных моно- и дисахаридов и аминосахаров не блокировал гемагглютинирующей активности данного белка. Из обнаруженных у Sp245 двух ОПС с тонкими различиями в антигенной структуре и заряде (Katzy et al., 1998; Федоненко с соавт. 2004) только кислый препарат ОПСI в концентрации 25 мкг/мл ингибировал активность ГА (1.мкг/мл). Следует заметить, что ЛПБК, ЛПС, ОПСI и ОПСII в диапазоне концентраций 500–25 мкг/мл не вызывают агглютинацию трипсинизированных эритроцитов.

Только ПСЛК в концентрации 500 мкг/мл вызывает агглютинацию. При снижении его концентрации до 250–25 мкг/мл агглютинации эритроцитов не происходит.

Однако в концентрациях 250–25 мкг/мл ПСЛК не блокирует активность ГА.

Нами установлено, что добавление к суспензии клеток Sp245 ГА приводит к заметному снижению скорости движения бактерий в жидких средах (рис. 8). ГА не оказывает влияния на подвижность клеток мутанта Sp245.5 с кардинальной перестройкой в структуре ОПС ЛПС и утратой ПССК (рис. 8).

Предварительная инкубация ГА с ЛПС, ЛПБК и ОПСI приводит к ингибированию его воздействия на скорость движения клеток. В присутствии ПСЛК или ОПСII действие ГА на скорость Рис. 8. Влияние движения бактерий на 9.полимеров, или 12.6% менее выделенных с эффективно в сравнении с поверхности клеток незаблокированным штамма Sp245, на белком (рис. 8б). У подвижность A.brasilense в жидких штамма Sp245 в состав средах.

ЛПС, ЛПБК и ПСЛК (а) скорость входят сходные движения клеток моносахариды и антигены, разных штаммов идентичные таковым у азоспирилл в: 1 – ФСБ; 2 – ФСБ + ГА. ОПСI (Коннова с соавт., Концентрация ГА – 1992; Федоненко с соавт., мкг/мл. Время 2001; 2004).

инкубации – 1 мин.

Полярный жгутик (б) скорость штамма Sp245 покрыт движения клеток чехлом, антигенные штамма Sp245 в:

1 – ФСБ; 2 – ФСБ + детерминанты которого ЛПС, 3 – ФСБ + идентичны детерминантам ЛПБК, 4 – ФСБ + ЛПС (Бурыгин, 2003). По– ПСЛК, 5 – ФСБ + видимому, снижение ОПСI, 6 – ФСБ + скорости клеток в ОПСII.

присутствии ГА является Концентрация полисахаридов – следствием его взаимодействия не только с клеткой, но и с полярным жгутиком, мкг/мл. Время обеспечивающим движение. В пользу этого предположения говорит отсутствие инкубации – 1 мин.

изменений в подвижности при добавлении этого ГА к клеткам штамма A. brasilense Sp7 (рис. 8а). ЛПС и чехол полярного жгутика Sp7 и Sp245 имеют разную антигенную структуру (Бурыгин, 2003).

Результаты измерения скорости движения мутантов и данные ингибиторного анализа позволяют говорить о значительном сродстве ГА к ЛПС Sp245.

Моносахариды рамноза, глюкоза, галактоза и глюкозамин, входящие в состав ЛПС, ЛПБК или ПСЛК (Коннова с соавт., 1992; Skvorsov, Ignatov, 1998; Федоненко с соавт., 2001; 2004), не блокируют действие ГА на подвижность.

Таким образом, у A. brasilense Sp245 гемагглютинирующая активность бульонных культур и скорость роения в полужидких средах варьируют при использовании разных источников азота. Клетки Sp245.5, обладающие гемагглютинирующей активностью, вдвое превышающей активность Sp245, на полужидкой среде формируют “диффузные” колонии, а не четкие кольца роения, как Sp245.

Полученные данные свидетельствуют о влиянии на социальную подвижность бактерий межклеточных контактов, опосредуемых взаимодействием поверхностного гемагглютинина с ОПСI, модулируемым в зависимости от окружающих условий.

Природа источника азота в окружающей среде и степень доступности кислорода влияют на скорость движения клеток, и, вероятно, на межклеточные контакты A.

brasilense Sp245, обусловленные взаимодействиями ГА и ОПСI.

3.8 Рост и подвижность бактерий штамма A. brasilense Sp245 и его спонтанных суперроящихся производных в присутствии разных источников азота. При выращивании на жидкой MPSS с нитратом калия в условиях интенсивной аэрации у A. brasilense Sp245 дикого типа и его суперроящихся вариантов (Sp245.P1–Sp245.P5) в течение первых 4-х ч наблюдался одинаковый рост с незначительными различиями. Лаг-фаза длилась 6–8 ч, после чего наиболее интенсивно рос штамм Sp245.Р5, а наименьший прирост наблюдался у Sp245.Р3.

Через 16–18 ч при значении оптической плотности культуры A590 = 1.5–2 скорость роста перестала изменяться. Более подробно на средах с нитратом или нитритом наблюдали за ростом родительского штамма Sp245 и его вариантов Sp245.Р3 и Sp245.Р5.

При выращивании бактерий на среде с нитритом на качалке лаг-фаза длилась 10– 18 ч. Максимальная плотность культуральной жидкости составляла 1.2–1.3 и достигнута она была через 36–48 ч. Штамм Sp245.Р5 в этих условиях также опережал рост штамма Sp245, а Sp245.Р3 отставал от них. В отсутствие аэрации на среде с KNO3 или с KNO2 зависимость концентрации клеток от времени стала линейной.

Скорость роста штамма Sp245.Р5 на среде с KNO3 осталась столь же высокой, как в предыдущих экспериментах. При этом Sp245.Р3 и дикий тип росли одинаково. На среде с KNO2 оптическая плотность клеточных суспензий у всех трех штаммов изменялась практически одинаково. Стационарные условия более близки к природным, уровень содержания кислорода в этом случае способствует работе ферментов ассимиляционной и диссимиляционной нитритредукции, наблюдается умеренный рост бактерий. При этом использование KNO2 как источника азота, видимо, является энергетически не столь выгодным, как использование нитрата (Van Alst et al., 2007), чем можно объяснить меньшую скорость роста. Одинаковый для дикого штамма и его вариантов рост в этих условиях может быть обусловлен отсутствием различий в работе фермента, восстанавливающего нитрит.

Изучено накопление нитрита бактериями, выращенными на MPSS с KNO3 в условиях интенсивной аэрации. Измерения проводили спустя 16 ч после начала культивирования, так Рис. 9. Накопление нитрита при как именно с этого времени хорошо видны культивировании A. brasilense Sp2различия в скорости роста штаммов.

(1), его Swa++–производных Sp245.PРезультаты представлены на рис. 9. Следует (2) и Sp245.P5 (3) в жидкой MPSS с отметить, что мы наблюдали образование KNO3 (1 г/л) в условиях интенсивной клеточных агрегатов при выращивании аэрации.

азоспирилл на среде MPSS с KNO3. Внутри агрегатов кислородные условия могут быть более выгодными для активности нитрат- и нитритредуктазы. В условиях интенсивной аэрации из-за перемешивания культуры содержание кислорода в среде нестабильно, и можно предположить, что у штамма Sp245.P3 эти ферменты более устойчивы к колебаниям концентрации кислорода, чем у других исследованных штаммов. Хотя нельзя исключить, что полученные результаты являются следствием формирования вариантом Sp245.P3 наиболее устойчивых агрегатов клеток.

Способность перемещаться в направлении корней растения, наряду с аэро- и хемотаксисом помогает азоспириллам колонизировать корневую систему растений (Кацы, 1996). Подвижность важна как показатель энергетической активности клетки.

В жидкой MPSS с нитратом калия клетки Sp245.P1, Sp245.P3 и Sp245.P5, выросшие в условиях интенсивной аэрации, плавали значительно быстрее – со скоростью 33.8 ± 1.0, 34.2 ± 1.4, 34.9 ± 1.5 мкм/с, соответственно, чем клетки штамма Sp245 (29.0 ± 1.мкм/с). При замене нитрата на нитрит у Sp245 и Sp245.P3 подвижность подавлялась до 24.5 ± 2.0 и 26.8 ± 2.3 мкм/с, соответственно, а у Sp245.P1 и Sp245.P5 скорость движения практически не снижалась (31.4 ± 1.5 и 32.7 ± 3.0 мкм/с, соответственно).

Снижение подвижности клеток азоспирилл происходит также и в случае изменения источника азота в бедной по составу среде MSM. Стоит отметить, что при культивировании бактерий с нитратом накопленный бактериями нитрит (рис. 9) не влияет на их подвижность.

На полужидких средах с концентрацией агара 0.4% и выше азоспириллы синтезируют латеральные жгутики. Оказалось, что на полужидкой MPSS с нитратом клетки Sp245.P1, Sp245.P3 и Sp245.P5 двигаются быстрее родительского штамма. На MPSS с нитритом скорость движения клеток падает у Sp245.P1, Sp245.P3 и Sp245, и межштаммовые различия нивелируются. В случае штамма Sp245.P5 замена нитрата на нитрит не влияет на подвижность клеток (таблица 3).

Показано, что диаметр колоний, формируемых в полужидкой MSM всеми исследованными штаммами, максимален в отсутствие солей азота в среде и снижается при их добавлении (до 1 г/л) в ряду NH4Cl > KNO3 > KNO2. При этом на MSM с нитритом калия все исследованные варианты Sp245.P утрачивают способность к ускоренному по сравнению с диким типом роению. Аналогичные результаты получены и на MPSS (таблица 3).

Таблица 3. Зависимость от источника азота скорости движения клеток и диаметра колоний в полужидкой среде MPSS у A. brasilense Sp245 и его производных Скорость движения клеток, мкм/с Диаметр колоний, мм Штамм Источник азота NH4Cl KNO3 KNO2 NH4Cl KNO3 KNOSp245 15.8 ± 0.9 15.5 ± 1.0 13.5 ± 0.8 17.4 ± 2.8 12.3 ± 1.0 7.7 ± 1.Sp245.P1 19.1 ± 0.9 18.2 ± 1.2 14.5 ± 1.3 35.8 ± 2.0 17.2 ± 2.4 8.6 ± 1.Sp245.P3 19.2 ± 1.0 18.7 ± 1.5 14.0 ± 1.2 36.2 ± 1.7 15.0 ± 0.8 6.1 ± 0.Sp245.P5 19.9 ± 1.0 19.1 ± 1.2 18.4 ± 1.2 37.9 ± 1.4 24.7 ± 1.9 17.1 ± 2.Примечания: Время инкубации 36 ч. Концентрация агара 0.4%; хлорида аммония, нитрата или нитрита калия – 1 г/л.

Варианты Sp245.P1 и Sp245.P5 быстрее восстанавливают нитрат и нитрит в условиях денитрификации, чем штамм Sp245.

Таким образом, выявлены различия в поведении спонтанных вариантов Sp245.P с изменениями в структуре p85, имеющих одинаковый суперроящийся фенотип в присутствии молекулярного азота или хлорида аммония, при замене источников азота в среде на нитрат или нитрит.

По-видимому, в исследованиях механизмов ассоциативного взаимодействия азоспирилл с растениями следует учитывать возможные последствия спонтанных вариаций в структуре геномов азоспирилл, которые, как показано нами, могут приводить к формированию субпопуляций A. brasilense с различиями в метаболизме нитратов/нитритов.

3.9 Сравнение устойчивости к солям тяжелых металлов у бактерий A.brasilense Sp245 и Sp7 дикого типа и их производных с плазмидными перестройками. Механизмы, обеспечивающие устойчивость микробов к ионам тяжелых металлов и поддержание гомеостаза тех из них, которые существенны для жизнедеятельности, тесно переплетаются (Silver, 1992; Choudhury, Srivastava, 2001; Cnovas et al., 2003; Franke et al., 2003). В ЛГМ ИБФРМ РАН была выявлена выраженная динамика геномов A. brasilense, проявляющаяся, в частности, в появлении вариантов с измененным плазмидным составом. Спонтанные плазмидные перестройки сопровождались изменением ряда культурально-физиологических характеристик бактерий (Кацы с соавт., 2002; Петрова с соавт, 2005, 2005а, 2010).

Локализация генов предсказанной эффлюкс-помпы в плазмиде р85 из штамма A.

brasilense Sp245 позволила предположить, что плазмидные перестройки могли повлиять на устойчивость бактерий к тяжелым металлам. В предварительных экспериментах определили МИК солей серебра, меди, кобальта и цинка (AgNO3, CuSO4 5H2O, CoCl2 6H2O, ZnSO4 7H2O), предотвращающие видимый рост бактерий на плотной среде в течение 48–72 ч инкубации. МИК определяли для A.

brasilense Cd и Sp7, производных Sp7.1–Sp7.10 и Sp7.K2; Sp245, его мутантов SK051, SK248 и спонтанных дериватов Sp245.5 и Sp245.P1–Sp245.Р5.

Оказалось, что на плотной MSM только бактерии Sp245.5 выдерживают значительно более высокие концентрации ионов Ag+, Cu2+, Co2+ и Zn2+, чем Sp245 и другие штаммы азоспирилл. Сравнительная токсичность использованных металлов для штамма Sp245 и его деривата Sp245.5 имела одинаковый характер:

Ag+>Co2+>Cu2+>Zn2+.

МИК AgNO3 на жидкой среде для обоих штаммов оказалась на порядок ниже, чем на плотной (таблица 3). Возможно, аэрация и перемешивание усиливают влияние иона серебра. Значимых различий в МИК солей кобальта, меди и цинка при выращивании бактерий на плотных или жидких средах не наблюдалось. Вероятно, это объясняется более выраженной способностью двухвалентных ионов к образованию комплексов с молекулами на поверхности бактерий (Левина, 1972).

Мы задались вопросом о возможных причинах резкого повышения уровня устойчивости деривата A. brasilense Sp245.5 к одновалентным и двухвалентным катионам. На других объектах было показано, что ключевым механизмом устойчивости к ионам тяжелых металлов является активный эффлюкс, обеспечиваемый работой RND-транспортеров, белков CDF (cation diffusion facilitators – ускорители диффузии катионов) и АТФ-аз P-типа. Для работы RND-транспортеров и CDF необходим градиент протонов (Nies, 2003).

В следующей серии экспериментов сравнили влияние солей серебра, кобальта, меди и цинка на рост клеток Sp245 и Sp245.5 в жидкой среде и в жидкой среде с добавлением ингибитора эффлюкс-помп СССР, нарушающего трансмембранный градиент протонов (Досон с соавт., 1991). Протонофор использовали в концентрации 0.625 мкМ, не влияющей на рост бактерий, но немного подавляющей скорость их плавания в жидких средах (что служит показателем изменений в клеточной энергетике).

В случае штамма A. brasilense Sp245 МИК кобальта, меди и цинка в присутствии CCCP снижались, но низкий уровень устойчивости к серебру оставался прежним.

Добавление CCCP не влияло на толерантность деривата A. brasilense Sp245.5 к кобальту, подавляло его устойчивость к меди и серебру до уровней дикого типа и вызывало снижение устойчивости к цинку (таблица 4).

По-видимому, значительное повышение устойчивости клеток штамма A. brasilense Sp245.5 к солям меди и серебра и, в меньшей степени, к солям цинка связано с активизацией процесса эффлюкса этих металлов.

У Sp245.5 изменен состав поверхностных полисахаридов, которые в первую очередь взаимодействуют с ионами, чем, возможно, объясняется отличная от штамма дикого типа устойчивость к солям кобальта и цинка. Не исключено, что определенный вклад привносят какие-то изменения в процессе внутриклеточного преобразования кобальта, который не зависит от работы помпы (Kamnev et al., 2004).

Таблица 4. МИК ионов тяжелых металлов для штаммов A. brasilense, инкубируемых в жидкой MSM в отсутствие или в присутствии 0.625 мкМ CCCP МИК мкМ мМ A. brasilense Ag+ + Co2+ + Cu2+ + Zn2++ Ag+ Co2+ Cu2+ Zn2+ CCCP CCCP CCCP CCCP Sp245 0.5 ± 0.05 0.5 ± 0.1 0.4 ± 0.03 0.3 ± 0.04 0.9 ± 0.1 0.6 ± 0.1 3.1 ± 0.4 2.1 ± 0.Sp245.5 0.9 ± 0.1 0.6 ± 0.1 0.7 ± 0.03 0.7 ± 0.04 4.7 ± 0.8 0.8 ± 0.1 11.5 ± 0.7 8.1 ± 0.Крупная геномная перестройка, произошедшая в клетках A. brasilense Sp245.5, могла оказать влияние на экспрессию многих плазмидных и (или) хромосомных генов, ответственных за толерантность бактерий к тяжелым металлам. Возможная избыточность и взаимозаменяемость генов, ответственных за устойчивость A.brasilense Sp245 к тяжелым металлам, могла замаскировать негативные последствия утраты локализованных в p85 последовательностей, кодирующих компоненты одной из эффлюкс-помп. Для уточнения функции продуктов трансляции orf122x, orf115 и orf176, выявленных в p85, необходимы дополнительные молекулярно-генетические и биохимические исследования.

Интересно, что более устойчивый к солям тяжелых металлов дериват A. brasilense Sp245.5 обладает также повышенной способностью к колонизации корней пшеницы по сравнению со штаммом дикого типа (неопубликованные данные сотрудников ЛГМ ИБФРМ РАН). По-видимому, штамм Sp245.5 может найти применение в работах по инокуляции растений в условиях загрязнения почв тяжелыми металлами – при разработке технологий биоремедиации.

ВЫВОДЫ 1. В 85-МДа плазмиде (p85) бактерий Azospirillum brasilense Sp245 выявлены гены медьсодержащей нитритредуктазы NirK; гетеродимерной NO-редуктазы NorCB;

активатора NO-редуктазы NorD; АТФ-азы NorQ; предполагаемого сенсора NO (Orf181); цистатион–-лиазы MetC, катализирующей синтез возможного антагониста NO – гомоцистеина; регулятора транскрипции LysR типа; каталитической субъединицы I цитохром c оксидазы CcoN и консервативного белка (Orf208). В ДНК бактерий A. brasilense Sp7 и Cd обнаружен локус, высоко гомологичный nirK–orf2из p85.

2. В плазмиде р85 из A. brasilense Sp245 идентифицированы три открытые рамки считывания, кодирующие компоненты предсказанной эффлюкс-помпы, осуществляющей выброс катионов тяжелых металлов из клеток.

3. С помощью полимеразных цепных реакций с 10 парами праймеров к 18.3-т.п.н.

и 9.1-т.п.н XhoI-фрагментам p85 показано, что спонтанные плазмидные перестройки могут сопровождаться утратой из клеток A. brasilense этих сегментов p85 (у деривата Sp245.5) или их сохранением в составе новой плазмиды (у вариантов Sp245.P1, Sp245.P2, Sp245.P3 и Sp245.P4).

4. У производного A. brasilense Sp245.5 исчезновение 85- и 120-МДа репликонов при образовании новой мегаплазмиды сопровождается снижением скорости плавания бактерий, двукратным повышением их гемагглютинирующей активности и изменением морфологии макроколоний, формируемых в полужидких средах, по сравнению с таковыми у Sp245. В присутствии препарата поверхностного белкагемагглютинина штамма Sp245, обладающего сродством к его О-специфическому полисахариду (ОПСI), снижается скорость плавания клеток этого штамма, но не деривата Sp245.5 с иной структурой ОПС.

5. У спонтанных суперроящихся вариантов A. brasilense Sp245.P1, Sp245.P2, Sp245.P3, Sp245.P4 и Sp245.P5, более подвижных в присутствии N2 и NH4Cl, чем Sp245, выявлены межштаммовые различия в росте и подвижности в средах с NO3 и (или) NO2 и в эффективности восстановления нитрата и нитрита.

6. Дериват A. brasilense Sp245.5 с крупной плазмидной перестройкой и новым липополисахаридом устойчив к значительно более высоким концентрациям солей серебра, кобальта, меди и цинка, чем родительский штамм Sp245. Характер влияния карбонилцианид-м-хлорофенилгидразона на минимальные концентрации ионов тяжелых металлов, ингибирующие рост культур Sp245.5, свидетельствует об активизации у деривата протонзависимого эффлюкса ионов Ag+, Cu2+ и Zn2+.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах 1 Шелудько А.В., Пономарева Е.Г., Варшаломидзе О.Э., Ветчинкина Е.П., Кацы Е.И., Никитина В.Е. Гемагглютинирующая активность и подвижность бактерий Azospirillum brasilense в присутствии разных источников азота // Микробиология. – 2009. – Т. 78, № 6. – С. 749–756.

2 Петрова Л.П., Варшаломидзе О.Э., Шелудько А.В., Кацы Е.И. Локализация генов денитрификации в плазмидной ДНК бактерии Azospirillum brasilense // Генетика. – 2010. – Т.

46, № 7. – С. 904–910.

3 Shelud'ko A.V., Varshalomidze O.E., Petrova L.P., Katsy E.I. Effect of genomic rearrangement on heavy metal tolerance in the plant-growth-promoting rhizobacterium Azospirillum brasilense Sp2// Folia Microbiol. – 2011. – http://dx.doi.org/10.1007/s12223-011-0074-5.

Статьи в сборниках 4 Варшаломидзе О.Э., Шелудько А.В., Пономарева Е.Г., Никитина В.Е., Кацы Е.И. Влияние источников азота на подвижность и свойства клеточной поверхности Azospirillum brasilense // Биология: традиции и инновации в XXI веке / Ред. Т.В. Балтина. – Казань: Изд-во КГУ, 2008.

– С. 29–31.

5 Кацы Е.И., Шелудько А.В., Петрова Л.П., Варшаломидзе О.Э., Кулибякина О.В., Шульгин С.В. Спонтанные и индуцированные изменения в социальной подвижности ассоциативной бактерии Azospirillum brasilense // Бюлл. МОИП. Отдел биол. – 2009. – Т. 114, № 2, прил. 1. – С. 132–133.

Тезисы докладов 6 Варшаломидзе О.Э., Шелудько А.В., Кацы Е.И. Подвижность Azospirillum brasilense в присутствии разных источников азота // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: Матер. IV Межрегион. конф. мол. уч. – Саратов: Научная книга, 2008. – С. 19.

7 Кацы Е.И., Петрова Л.П., Шелудько А.В., Варшаломидзе О.Э., Кулибякина О.В., Прилипов А.Г. Изменения в структуре плазмид и вариации в проявлении признаков, значимых для взаимодействия ассоциативной бактерии Azospirillum brasilense с растениями // Матер. 5-го Московского междунар. конгр. “Биотехнология: состояние и перспективы развития”. – М.:

ЗАО “Экспо-биохим-технологии”, РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2009. – Ч. 1. – С. 283.

Katsy E.I., Petrova L.P., Shelud’ko A.V., Varshalomidze O.E., Kulibyakina O.V., Prilipov A.G.

Changes in plasmid structures and variations in the traits important for the interactions of the associative bacterium Azospirillum brasilense with plants // Proceed. 5th Moscow Intern. Congr.

“Biotechnology: State of the Art and Prospects of Development”. – Moscow: JSC “Expo-biochemtechnologies”, D.I. Mendeleyev University of Chemistry and Technology of Russia. – 2009. – Part 1. – P. 284.

8 Варшаломидзе О.Э., Петрова Л.П., Шелудько А.В., Кацы Е.И. Анализ подвижности ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense в присутствии нитратов и нитритов // Симбиоз Россия 2010: Сб. тез. III Всеросс. с междунар. уч. конгр. студ. и аспир.-биол. – Нижний Новгород, 2010 г. – С. 89–90.

9 Варшаломидзе О.Э., Шелудько А.В., Петрова Л.П., Кацы Е.И. Влияние плазмидных перестроек на уровень устойчивости ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense к солям тяжелых металлов // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: Матер. V Всеросс. конф. мол. уч. – Саратов: Научная книга, 2010. – С. 40.

Подписано в печать 14.12.2011. Формат 6084 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Times. Печать RISO. Усл.п.л. 2. Тираж 100 экз.







© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.