WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


На правах рукописи

АНТОНЫЧЕВА Марина Владимировна

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЧУМНОГО МИКРОБА НА ОСНОВЕ СУХОГО АВТОЛИЗАТА ПЕКАРСКИХ ДРОЖЖЕЙ, ПОЛУЧЕННОГО ПО УСОВЕРШЕНСТВОВАННОЙ ТЕХНОЛОГИИ

03.02.03 – микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Саратов – 2012

Работа выполнена в ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный консультант:

Кандидат медицинских наук, доцент Никифоров Алексей Константинович Официальные оппоненты доктор медицинских наук, доцент ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», заведующий отделом образовательных программ и подготовки специалистов Бойко Андрей Витальевич кандидат медицинских наук, доцент ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского» Минздравсоцразвития Российской Федерации, доцент кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Пронина Елена Александровна Ведущее учреждение: ФКУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита диссертации состоится «___»_________________2012 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 208.078.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»

Автореферат разослан «___»________________2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, старший научный сотрудник Слудский А.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Возбудитель чумы Yersinia pestis по-прежнему представляет реальную опасность и угрозу жизни людей в связи с существованием активных природных очагов чумы во всем мире (Евразии, Африке, Северной и Южной Америке) и высоким уровнем миграции населения. Недостаточный объем мониторинга в природных очагах обуславливает возможность возникновения вспышечных заболеваний. В настоящее время (1990–20гг.) отмечают растущий уровень заболеваемости на о. Мадагаскар, с регистрацией в 2010–2011 гг. значительного числа случаев легочной чумы [Кутырев В.В. и соавт., 2011; WER, 2010]. Кроме того, необходимо учитывать возможность использования возбудителя чумы в целях биотерроризма [Онищенко Г.Г. и соавт., 2003].

Для успешного мониторинга природных очагов чумы необходимо решение комплекса задач, связанных с разработкой и внедрением новых диагностических и профилактических средств (Приказы Роспотребнадзора № 774 от 17.11.2005 г. и № 152 от 08.05.2008 г.).

Питательные среды, относящиеся к средствам диагностики, при проведении эпидемиологического надзора в природных очагах чумы на территории Российской Федерации должны соответствовать нормативным требованиям [МУК 4.2.2316, 2008; МУ 3.3.2.2124, 2006; Стандарты качества лекарственных средств. № 91500.05.001, 2000].

При производстве МИБП1 к питательным средам предъявляют дополнительные требования. Они должны быть эффективными по выходу целевого продукта, а полученные с их применением лекарственные средства – безопасными для человека. Кроме того, производство питательных сред должно быть также экономичным и конкурентоспособным [Онищенко Г.Г., Меджидов М.М., 2001].

В производстве МИБП наибольшее распространение получили среды, приготовленные из мясных и казеиновых гидролизатов. Однако это сырье является пищевым или технически ценным, к тому же может содержать в своем составе термоустойчивые антибиотики, прионы и другие «неконтролируемые факторы» [Телишевская Л.Я., 2000;

Раевский К.К., 2007; Himedia, 2003]. В связи с этим, фирмы-производители микробиологических питательных сред, расширили ассортимент сред на основе растительного и дрожжевого белка [Himedia, 2003].

Таким образом, при производстве микробиологических сред актуальными задачами остаются как поиск сырья для белковых основ, не уступающих мясным по питательной ценности и удовлетворяющих требованиям стандартности и безопасности, так и разработка способов его эффективной переработки.

В обзорных работах, посвященных питательным средам, дрожжевая биомасса выделена как перспективный вид сырья для приготовления белковых основ [Равилов А.З. и соавт. 1999; Телишевская Л.Я., 2000]. Работы по получению питательных основ МИБП – медицинские иммунобиологические препараты (диагностические и профилактические) из биомассы, в основном кормовых дрожжей, и конструированию из них микробиологических сред были развернуты в 70 - 80-е годы ХХ века. Полученные экстракты и автолизаты применяли в составе питательных сред как пептидные и витаминные добавки, а после более глубокого автолиза или гидролиза – в качестве белковых основ питательных сред для культивирования различных микроорганизмов, в том числе и чумного микроба [Борисенко Е.Г.,1967; Bridson Е., Brecker А., 1970; Бендас Л.Г., 1971; Шеремет О.В.,1979, 1991; Бобрышев В.И. и соавт. 1980; Милютин В.Н. и соавт., 1982; Раскин Б.М., 1985]. Однако на III съезде Общества биотехнологов (2005 г.), было отмечено, что в нашей стране прекращено промышленное производство кормовых дрожжей, и доступным сырьем остаются пекарские и пивные дрожжи. По своему составу наиболее близки к мясу говядины пекарские дрожжи, содержащие протеины до 52–56%. Автолизат пекарских дрожжей по физико-химическому составу близок к триптическому перевару по Хоттингеру [Козлов Ю.А., 1950; Биргер М.О., 1982].

Способность дрожжевой клетки к автолизу предопределяет выбор экономичного способа биоконверсии этого белкового сырья. Известно, что создание определенных условий индуцирует и ускоряет течение этого процесса [Шкляр Б.Х., 1977; Эль-Регистан Г.И., Бабаян Т.Л., 1987; Кислухина О.В. и соавт., 1990; Белоусова Н.И. и соавт., 1995;

Плакунов В.К., 2001].

На основе автолизатов пекарских или пивных дрожжей сконструированы среды для культивирования широкого круга микроорганизмов [Альпер-Юльчевская Б.Я., 1940;

Козлов Ю.А., 1950; Дятлов И.А. и соавт., 1998; Тимербаева Р.Х. и соавт., 2000; Иванова Н. Г. и соавт. 2001]. В литературе, кроме пилотной работы сотрудников РосНИПЧИ «Микроб», использовавших для получения автолизата способ индукции процесса натрием хлорида [Авдеева Н.Г. и соавт., 2000], нами не найдено данных об использовании для культивирования чумного микроба питательных сред, сконструированных из автолизата пекарских дрожжей, в качестве единственного источника аминокислот. Однако известны работы по применению сред из панкреатического перевара пекарских дрожжей для диагностики возбудителей чумы и холеры [Мазрухо А.Б. и соавт., 2004; 2005; 2009;

2011]. Таким образом, конструирование питательных сред на основе дрожжевого автолизата для культивирования чумного микроба остается актуальной задачей.

Цель работы – конструирование новых микробиологических сред для культивирования чумного микроба на основе сухого автолизата пекарских дрожжей, полученного усовершенствованным способом.

Задачи исследования:

1. Изучить возможность индукции автолиза пекарских дрожжей химическими веществами и ферментными препаратами. Определить оптимальный комплекс методов контроля эффективности процесса автолиза.

2. Усовершенствовать технологию аппаратного способа получения сухого дрожжевого автолизата при масштабировании процесса.

3. Провести анализ химического состава и физико-химических свойств сухого автолизата пекарских дрожжей в соответствии с требованиями, предъявляемыми к качеству белковой основы микробиологических сред.

4. Сконструировать оптимальные по составу плотные и жидкие питательные среды для культивирования чумного микроба на монооснове – сухом автолизате пекарских дрожжей и оценить свойства сконструированных сред по биологическим показателям.

5. Испытать среды на основе сухого дрожжевого автолизата при экспериментально-производственном культивировании чумного микроба.

6. Обосновать экономическую целесообразность использования питательных сред на основе дрожжевого автолизата.

Научная новизна Впервые для культивирования чумного микроба сконструированы питательные среды на монооснове – сухом автолизате пекарских дрожжей, сохраняющие стабильными культурально-морфологические, биохимические свойства микроорганизма и его чувствительность к бактериофагу Л-413С.

Сконструированные экономичные жидкие и плотные питательные среды впервые использованы в производстве экспериментальных серий бактериофага диагностического чумного Л-413С.

Процесс изготовления автолизата оптимизирован применением индукторов ферментной природы в условиях направленного изменения рН гидролизуемой среды. В качестве индуктора автолиза дрожжевых клеток был впервые использован новый комплексный ферментный препарат микробного происхождения – протеовибрин, выделенный ранее из ультрафильтрата культуральной жидкости производственного штамма Vibrio cholerae М 41 серовара Огава [Кузьмиченко И.А. и соавт., 2002; 2003; 2010]. Приоритетность выполненных исследований по стимулированию автолитической активности дрожжей протеовибрином с целью получения эффективной и экономически выгодной питательной основы, пригодной для микробиологических целей, подтверждена патентом «Способ получения питательной основы и питательная среда для культивирования микроорганизмов» (№ 2360962, приоритет от 15.02.2007).

Предложен комплексный подход в выборе методов контроля эффективности автолиза и впервые для этих целей рекомендовано использовать метод кондуктометрии.

Практическая значимость Сконструированы жидкая и плотная питательные среды для культивирования чумного микроба и его бактериофагов, отвечающие требованиям контроля по биологическим и физико-химическим показателям. Питательные среды, приготовленные на основе сухого автолизата пекарских дрожжей для культивирования чумного микроба, использованы в производстве экспериментальных серий бактериофага диагностического чумного Л-413С. Доказана экономическая целесообразность внедрения этих сред в производство МИБП.

Предложен новый способ получения белковой основы питательных сред автолизата пекарских дрожжей, отличающийся от аналогов тем, что в качестве индуктора в процессе автолиза использован ферментный препарат протеовибрин и оптимизирована рецептура питательных сред для культивирования чумного микроба. Методические рекомендации «Приготовление автолизата пекарских дрожжей и конструирование на его основе питательных сред для культивирования чумного микроба» одобрены Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 5 от 24.11.09 г.) и утверждены директором РосНИПЧИ «Микроб». Определен комплекс методов, позволяющий определить эффективность процесса автолиза. Методические рекомендации «Оценка эффективности автолиза пекарских дрожжей комплексом физико-химических методов» также одобрены Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 7 от 27.06.06 г.) и утверждены директором РосНИПЧИ «Микроб».

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Автолиз пекарских дрожжей, индуцированный протеолитическим ферментом в условиях щелочной среды, эффективнее способа, основанного на применении натрия хлорида.

2. Усовершенствованный технологический процесс производства автолизата пекарских дрожжей позволяет получить полноценную сухую питательную основу для микробиологических сред, соответствующую требованиям НД по физико-химическим свойствам и составу.

3. Сконструированные питательные среды на основе сухого автолизата пекарских дрожжей обеспечивают питательные потребности чумного микроба с сохранением стабильными его культурально-морфологических, биохимических свойств, чувствительности к бактериофагу Л-413С и соответствуют требованиям НД, предъявляемым к питательным средам.

4. Сконструированные питательные среды на основе сухого автолизата пекарских дрожжей для культивирования чумного микроба по эффективности не уступают средам, приготовленным из мясного сырья, и пригодны для масштабированного культивирования штаммов чумного микроба.

Апробация работы Материалы, вошедшие в диссертационную работу, были представлены и обсуждены на ежегодных научно-практических конференциях «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в РосНИПЧИ «Микроб» (2005–2011 гг.). В виде тезисных работ материалы были представлены на: VI Межгосударственной научнопрактической конференции «Санитарная охрана территории государств-участников содружества независимых государств: Проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005); II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инфекции, обусловленные иерсиниями» в НИИЭМ им. Пастера (Санкт-Петербург, 2006); научнопрактической конференции ГИСК им. Тарасевича «Вакцинология 2006». Совершенствование иммунобиологических средств профилактики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2006); VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007); совещании и проблемной комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы» (Ростов-на-Дону, 2008); международной научно-практической конференции «Биотехнология в Казахстане: проблемы и перспективы инновационного развития», посвященной 50-летию НИИ проблем биобезопасности НЦБ МОН РК (Алматы, 2008); V международной конференции «Проблемы обращения с отходами лечебно-профилактических учреждений» (Москва, 2009); международной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями» в ФГУН НИИЭМ им. Пастера Роспотребнадзора (Санкт-Петербург, 2010).

Публикации По теме диссертации опубликовано 15 работ, в том числе 6 статей, 4 из них в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки России для публикации основных научных результатов, представляемых на соискание искомой ученой степени, и одно изобретение (Пат. 2360962 РФ МПК С12N1/20).

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 152 страницах компьютерного текста, состоит из введения, одной главы обзора литературы, шести глав собственных исследований, заключения, выводов, приложения и списка литературы. Работа иллюстрирована 30 таблицами, 15 рисунками. Список литературы содержит 279 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Штаммы микроорганизмов. При конструировании сред для культивирования чумного микроба использованы тест-штаммы, рекомендуемые для контроля качества сред по биологическим показателям [МУ 3.3.2.2124, 2006]: Yersinia pestis ЕV НИИЭГ, полученный из лаборатории препаратов против чумы и других особо опасных инфекций ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича, а также Y. pestis Р-1680, Y. pestis И-2377, Y.

pseudotuberculosis И-199 и Y. pestis КМ 277 (ЕV 11М pFSK 3) (рFra- pCad- pPst- pFSK-3;

Kmr), полученные из Госколлекции патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб».

Методы.

Микробиологические методы: тинкториальный метод [Шкляр Б.Х., 1977; Коваковская С.С., 1978]; культуральный метод [ГФ РФ ХII, 2008]; определение чувствительности и скорости роста на питательной среде [МУК 4.2.2316, 2008; МУ 3.3.2.2124, 2006]; определение эффективности питательной среды по накоплению биомассы [МУК 4.2.2316, 2008; МУ 3.3.2.2124, 2006; Дятлов И.А. и соавт., МР, 1991]; определение эффективности питательной среды по биосинтезу капсульного антигена методы РНГА2 и РНГА – реакция непрямой гемагглютинации ИФА3 [МУ 3.3.2.2124, 2006; Наумов А.В., Самойлова Л.В., 1992], РИД4 [Зильбер Л.А., 1968]; определение показателя прорастания [МУК 4.2.2316, 2008; МУ 3.3.2.2124, 2006];

определение показателя стабильности основных биологических свойств микроорганизмов [МУК 4.2.2316, 2008; МУ 3.3.2.2124, 2006]; метод Грация [ТУ 9386-020-018981092008].

Биохимические методы: определение протеолитической активности на плотных тест-средах [Шкляр Б.Х., 1977]; определение наличия низкомолекулярной фракции белка [МУК 4.2.2316, 2008]; определение пептидов [МУК 4.2.2316, 2008]; колориметрический метод определения белка по Лоури [ГФ РФ ХII, 2008]; фенол-сернокислый метод определения содержания углеводов [Dubois М. et al, 1956]; метод ВЖЭХ [ГФ РФ ХII, 2008].

Химические методы: метод формольного титрования [МУК 4.2.2316, 2008]; определение сульфатной золы [Ф РФ ХII, 2008]; определение общего азота [МУК 4.2.2316, 2008]; аргентометрическое определение хлоридов [МУК 4.2.2316, 2008]; колориметрическое определение общего фосфора в присутствии восстановителя [Фердман Д.Л., Сопин Е.Ф., 1957]; метод Фиске-Суббароу [Фердман Д.Л., Сопин Е.Ф., 1957]; метод де Ваарда [Неменова Ю.М., 1972]; метод Гадиента [Петрунькина А.М., 1961]; метод колориметрии с роданистыми солями для определения железа [Фердман Д.Л., Сопин Е.Ф., 1957]; качественное определение наличия тяжёлых металлов [ГФ РФ ХII, 2008].

Физические методы: потенциометрическое определение активности ионов водорода [МУК 4.2.2316, 2008];турбидиметрический метод [Кислухина О.В., и соавт., 1990];

кондуктометрическое определение удельной электропроводимости [МР, Иркутск, 2003];

колориметрическое определение цветности [ГФ РФ ХII, 2008]; колориметрическое определение количества тирозина по стандартной кривой [Алексеенко Л.П., 1968]; ареометрическое измерение относительной плотности автолизата [Азевич З.Ф. и соавт., 1990]; определение массовой доли влаги [МУК 4.2.2316, 2008]; метод визуального определения прозрачности и цветности [МУК 4.2.2316, 2008]; определение растворимости [МУК 4.2.2316, 2008].

Обработку результатов проводили с применением методов вариационной статистики [Ашмарин И.П., Воробьёв А.А., 1962; Лакин Г.Ф., 1990] и рассчитывали: среднее арифметическое (М); среднее квадратическое отклонение (); среднюю ошибку среднего арифметического (m); степень достоверности различий по Стьюденту (p).

Все исследования проведены самостоятельно или при активном участии автора, за исключением работы по определению содержания аминокислот в сухих сериях автолизата, выполненной по договору о научно-исследовательском сотрудничестве в ИБФРМ РАН (г. Саратов) с использованием метода ВЭЖХ на хроматографе Knauer Smartline 5000.

ИФА – иммуноферментный анализ РИД-реакция иммунодиффузии Материалы и оборудование для приготовления сухого автолизата пекарских дрожжей. Оптимизацию процесса автолиза проводили в условиях лабораторного эксперимента и масштабированного производства. При приготовлении сухого автолизата пекарских дрожжей (САПД5) –основы микробиологических сред – использовали дрожжи хлебопекарские прессованные (ГОСТ 171-81) в виде водной суспензии.

Для протеолитического воздействия на дрожжевые клетки применяли коммерческие препараты: трипсин (Serva), проназу (Serva), пепсин (Spofa) и экспериментальный ферментный комплекс – протеовибрин с известной активностью ферментов [Кузьмиченко И.А. и соавт. 2002, 2003, 2010]. Шестичасовой автолизат пекарских дрожжей использовали как самостоятельный полиферментный препарат, внося его в дозе 1, 3 и 5% к объему исходной дрожжевой взвеси. В лабораторных условиях автолиз проводили в объеме до 10,0 л при периодическом перемешивании и температуре (49+1) оС. В качестве бактериостатического и плазмолизирующего вещества использовали хлороформ (до 1–2%). Через 4 ч после приготовления взвеси дрожжей и инициации процесса автолиза проводили коррекцию рН среды (8,0+0,5) натрием двууглекислым, натрия гидроокисью или аммонием углекислым. Длительность процесса составляла 18–30 ч. Пробы отбирали через каждые 2 ч. Ферментативный процесс останавливали прогреванием биомассы при режиме 110 оС (0,5 кгс/см2) в течение 30 мин. После отстаивания взвеси в течение 1 сут, надосадочную жидкость декантировали, фильтровали и сушили на сублимационной установке (LZ 9 W Frigera). Лабораторным способом получено 79 серий автолизата пекарских дрожжей, из них 23 серии в лиофилизированной форме.

Для масштабирования процесса автолиза (объем дрожжевой взвеси 500 л) и производства экспериментальных серий САПД реакторным способом использовано оборудование и технологическая линия, состоящая из реактора (РЗРЯ-100), сепаратора (АСЭБ 3000), аппарата для фильтрации (ЭПВ.СЦ-300/080), вакуум-выпарной установки (УВВ50), емкостей для сбора супернатанта (РЗРЯ 600 и РЗРЯ-100), а также установки для высушивания препарата (КЯУЛ 101325.002).

По оптимизированной технологической схеме произведено 5 серий САПД. При анализе физико-химических свойств и определении химического состава использован САПД, приготовленный по предложенной ранее [Дятлов И.А. и соавт., 1998] исходной технологической схеме реакторным способом с индукцией автолиза натрием хлористым. Препаратом сравнения был экстракт автолизированных пекарских дрожжей Autolizate Yeast exract, «SERVA» (Германия), также была использована экспериментальная серия автолизата пивных дрожжей «Авимин», ООО «БИТРА», Москва).

Материалы и оборудование для приготовления питательных сред и диагностические препараты. Плотные и жидкие питательные среды на основе серий САПД, полученных реакторным и лабораторным способом, готовили по общепринятой методике [Биргер М.О., 1982]. В качестве контрольных питательных сред были использова сухой автолизат пекарских дрожжей;

ны среды лабораторного изготовления для культивирования чумного микроба на основе гидролизата по Хоттингеру, предварительно прошедшие контроль. Среды, используемые для культивирования Y. pestis Р-1680, дополнительно содержали тиамин (0,00мг/л), для культивирования Y. pestis КМ 277 – канамицин (20 мкг/мл).

Диагностические препараты: Для определения стабильности культуральноморфологических свойств чумного микроба применяли «Бактериофаг чумной диагностический Л-413С» (РосНИПЧИ «Микроб», Россия). Для определения капсульного антигена использовали «Диагностикум чумной эритроцитарный антительный» (Казахский научный центр карантийных и зоонозных инфекций им. М. Айкимбаева, Казахстан), «Диагностикум чумной эритроцитарный иммуноглобулиновый» (ФГУ ЦНИИ МО РФ, Киров) и для РИД по Оухтерлони - специфические чумные сыворотки экспериментальных серий (РосНИПЧИ «Микроб», Саратов).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Оптимизация индуцированного автолиза пекарских дрожжей. В ходе экспериментов изучены условия автолиза пекарских дрожжей и возможность индукции этого процесса химическими веществами и ферментными препаратами. Для оценки автолитической активности дрожжей использованы методики, основанные на различных принципах действия: турбидиметрический метод, ориентированный на изменение оптической плотности автолизируемого субстрата; метод определения конечных продуктов автолиза (аминного азота или тирозина); потенциометрический метод регистрации изменения реакции среды и метод кондуктометрического измерения удельной электропроводимости среды.

На основании проведенных исследований, был выбран оптимальный комплекс методов контроля эффективности процесса. Для определения качества сырья – оценки эффективности автолиза пекарских дрожжей, впервые был применен метод кондуктометрии. В качестве контрольных параметров I стадии процесса предложено применять комплекс методов до стабилизации показателей: турбидиметрическое определение степени лизиса дрожжевых клеток по изменению экстинкции взвеси после инкубации и формольное титрование для определения аминного азота. Методы доступные, простые в исполнении и позволяют оперативно оценить эффективность автолиза.

На этом этапе исследований был определён гидромодуль – оптимальное соотношение разводящей жидкости (воды) и биомассы дрожжей в реакционной смеси. Анализ результатов, полученных в каждом объёмно-весовом соотношении, свидетельствует об увеличении степени лизиса клеток, росте содержания низкомолекулярных азотсодержащих веществ с разбавлением суспензии дрожжевых клеток и подтверждает данные литературы [Белоусова Н.И. и соавт., 1995]. Однако значительное разбавление суспензии, на наш взгляд, создает дополнительные трудности при концентрировании супернатанта и приводит к увеличению энергозатрат при масштабировании процесса. Таким образом, экспериментально доказано, оптимальным соотношением дрожжей и воды является 1:4.

При обосновании способа индукции процесса автолиза было изучено действие протеолитических ферментных препаратов (трипсина, пепсина, проназы, протеовибрина и собственно автолизата пекарских дрожжей). Предварительно определяли активность ферментов при температуре (37+1) оС на плотной тест-среде с обезжиренным молоком и дозы, выравнивали по активности (табл. 1).

Таблица 1 – Влияние ферментов различного происхождения на показатели автолиза пекарских дрожжей через 24 ч инкубации Вариант автолиза Nамин,% Прирост* Степень автолиза М+m Nамин, % М+m % М+m Трипсин 16000 усл.ед./л, n=10 0,182+0,01 62,5+1,5 49+0,Трипсин 80000 усл.ед./л, n=14 0,186+0,01 66,2+1,4 50,99+0,Протеовибрин 16000 усл.ед./л, n=10 0,180+0,01 60,7+1,6 51+0,Протеовибрин 80000 усл.ед./л, n=14 0,196+0,01 75,4+1,5 52,63+0,Пепсин 80000 усл.ед./л, n=10 0,130+0,0015 40+4 49,30+0,Проназа 80000 усл.ед./л, n=10 0,168+0,0035 60+2 45,16+0,До 1% автолизата, n=10 0,129+0,015 15,2+1,8 38,0+0,0До 3% автолизат, n=10 0,152+0,015 36,1+1,5 45,0+0,До 5% автолизат, n=14 0,168+0,01 40,0+1,6 45,1+0,Контроль, n=14 0,112+0,02 100+1,6 32,7+0,*Уровень аминного азота в контроле условно приняли за 100%; разница с контролем статистически достоверна (<0,05) Было изучено воздействие на автолиз клеток пекарских дрожжей минимальных доз ферментов (16 и 80 и 120 тыс. усл.ед./л). Также изучено действие шестичасового свежеприготовленного автолизата, в качестве комплексного ферментного препарата, в концентрации 1, 3 и 5% в автолизируемой взвеси дрожжей. Автолитический процесс протекает эффективнее в присутствии ферментов трипсина, протеовибрина и шестичасового автолизата (3 и 5%), что отмечено по уровню накопления аминного азота, уже через 12 ч автолиза. Их применение позволяет повысить в автолизате содержание аминного азота через 24 ч на 62,5–75,4%. Статистически значимы и результаты, свидетельствующие об эффективности автолиза с применением минимальных доз фермента (до 80000 усл.ед./л), однако при масштабировании процесса не удалось воспроизвести результат малообъемного эксперимента.

Таким образом, доказано, что применение трипсина и протеовибрина в дозах (80– 100 тыс. усл.ед./л) сокращает время автолиза на 6 ч и увеличивает в 1,5–1,7 раза выход водорастворимой части автолизата (по аминному азоту до 0,196 %). Использование ферментов трипсина и протеовибрина в дозах более 120 тыс усл.ед./л создает условия для протеолитического гидролиза дрожжевой биомассы. Впервые в качестве индуктора автолиза дрожжевых клеток был использован ферментативный комплекс – протеовибрин, выделенный из отходов производства холерной вакцины, и доказана перспективность его применения.

Подтверждены данные литературы о протеолитической активности шестичасового автолизата пекарских дрожжей. Отмечено его индуцирующее действие на автолиз при добавлении к свежеприготовленной дрожжевой взвеси в концентрации 3–5%. Однако автолизат в качестве индуктора значительно уступает трипсину и протеовибрину, так как способствует повышению в автолизате содержания аминного азота только на 35– 40%, по сравнению с контролем.

При изучении автолитического процесса установлено, что создание щелочной или кислой реакции способствует активации ферментной системы дрожжевой клетки.

Направленное изменение реакции среды (рН 8,0+0,5), через 4 ч с начала автолиза, позволяет получить продукт – автолизат со средней степенью гидролиза в течение 20–24ч.

По уровню накопления аминного азота в реакционной смеси и степени лизиса дрожжевых клеток через 24 ч выявлены статистически значимые различия с контролем (р<0,001). Концентрация аминного азота в автолизате выше контрольных показателей на 74–85%. Однако при сравнении показателей, свидетельствующих об эффективности автолиза, таких как содержание аминного азота и степень лизиса дрожжевых клеток, не было выявлено статистически достоверного отличия между испытанными веществами (табл.2). В эксперименте при создании кислой реакции дрожжевой биомассы отмечено индуцирующее действие кислоты на автолиз (различие с контролем статистически значимое р<0,05), однако прирост аминного азота составил 14,8% за 24 ч.

Таблица 2 – Влияние на автолиз пекарских дрожжей химических веществ Показатель Натрий гид- Натрий двууг- Аммоний Кислота Контроль эффективно- роокись лекислый углекислый соляная сти автолиза (n=18) M+m (n=18) M+m (n=12) M+m (n=12) M+m (n=18)M+m Содержание 0,188+0,001 0,192+0,001 0,200+0,006 0,124+0,005 0,112+0,Nамин,% Прирост* 74,1+1,0 77,7+1,0 85,1+1,4 14,8+1,3 1Nамин,% Степень ав- 47+0,5 47,5+0,5 48+0,5 31,5+0,5 32,7+0,толиза, % *Уровень Nамин. в контроле условно приняли за 100%.

На следующем этапе было изучено сочетанное применение комплексного ферментного препарата – протеовибрина и натрия двууглекислого. Этот способ позволил получить автолизат пекарских дрожжей с максимальной концентрацией аминного азота (до 0,23%) через 18–20 ч, что свидетельствует об интенсификации процесса в созданных условиях. В технологическом процессе получения автолизата пекарских дрожжей оправдано применение натрия двууглекислого, относящегося к пищевым продуктам и не требующего особых условий хранения и применения.

Таким образом, для приготовления дрожжевой взвеси предложен гидромодуль 1:и способ двустадийного режима индуцированного автолиза, основанного на изменении реакции среды при добавлении в дрожжевую взвесь натрия двууглекислого (8 г/л).

Оптимизация этапов технологического процесса масштабированного получения сухого автолизата. Одной из основных наших задач было усовершенствование технологии производства САПД, для решения которой проведены мероприятия по существенному изменению аппаратного обеспечения технологического процесса. Предложен способ двустадийного режима индуцированного автолиза, основанного на изменении реакции среды при добавлении в дрожжевую взвесь натрия двууглекислого (г/л). Применение этого индуцирующего автолиз способа, вместо ранее применяемого натрия хлорида (2%), позволило сократить продолжительность I стадии технологического процесса с 30–34 ч до 20–24 ч. Затем была демонтирована система, используемая на стадии концентрирования полуфабриката, состоящая из теплообменника трубчатого, форсунки распыления и насоса импеллерного, и установлен вакуум-выпарной аппарат (УВВ-50). Это позволило сократить технологическую операцию с 96 до 15 ч. Для достижения заданной концентрации полуфабриката (упаривания в 4,5–5 раз) на ранее используемой системе требовалось до 4-5 сут. Расход энергии и пара при применении УВВ-50 снижен в 8 раз; проточной воды в 4 раза. Эти мероприятия сокращают и вероятность контаминации полуфабриката посторонней микрофлорой. Кроме этого, для осветления препарата предложено использовать соли кальция хлористого и натрия фосфорнокислого двузамещенного, что обеспечивает образование геля фосфата кальция и фильтрацию на установке с фильтром марки ЭПВ.СЦ-300/080 вместо ранее используемой фильтрации на аппарате Сальникова.

Мероприятия по оптимизации масштабированного получения автолизата пекарских дрожжей позволили в итоге получить САПД, соответствующий требованиям НД [МУК 4.2.2316, 2008] по физико-химической характеристике.

Характеристика показателей качества сухого автолизата пекарских дрожжей и питательных сред на его основе. Оценку качества питательных основ и микробиологических сред проводили с помощью совокупности физико-химических и биологических показателей [МУК 4.2.2316, 2008; МУ 3.3.2.2124, 2006].

В соответствии с НД [МУК 4.2.2316, 2008, Стандарты качества лекарственных средств. № 91500.05.001, 2000], физико-химическая характеристика препарата должна содержать описательные сведения о внешнем виде, прозрачности, цветности, растворимости, а также влажность, рН и количественное содержание пептидов, общего и аминного азота, хлоридов, углеводов. Однако было бы целесообразно расширить спектр характеристики питательных основ. Для роста микроорганизмов имеет значение и уровень содержания отдельных аминокислот, и их соотношение, а также минеральный состав среды и наличие тяжелых металлов. Поэтому нами были дополнительно определены содержание аминокислот, общего и неорганического фосфора, железа, кальция, магния, солей тяжелых металлов и индола.

Сухие образцы автолизатов – аморфные порошки светло-кремового цвета с приятным хлебным запахом. Исключение – «Авимин» и автолизат пекарских дрожжей, полученный с использованием натрия хлористого, у которых отмечен темно-коричневый цвет. Это свидетельствует о наличие меланоидов в основе, что характерно для питательных основ низкого качества. Все образцы хорошо растворимы и имели нейтральные значения рН в пределах 7,0+0,3. Растворы – прозрачные, однако отмечена опалесценция растворов, приготовленных из темных по окраске автолизатов. По содержанию пептидов (1,2–1,8 %) дрожжевые автолизаты близки к гидролизату по Хоттингеру. Следы “непереваренного” белка определены только в препарате «Авимин».

По показателю влажности образцы автолизата, полученные по оптимизированной технологии – 2,7–3,5%, соответствовали нормативному показателю (не более 5%). Отмечена недопустимо высокая влажность до 7,5% и высокая степень гигроскопичности у препаратов в лиофилизированной форме. Во всех исследованных нами образцах содержание хлоридов в допустимых пределах – 0,65–0,7%, кроме серий САПД, приготовленных с использованием натрия хлористого, где содержание хлоридов – 1,5%, что превышает нормируемый показатель (1%). Подтверждены данные литературы о высоком содержании в автолизатах дрожжей углеводов (12,1+1,0%), что конкретизирует область их применения в качестве основы сред для культивирования микроорганизмов, исключая использование в составе дифференциально-диагностических сред.

При анализе содержания кальция (г/кг), магния (г/кг) и железа (мг/кг) в образцах автолизата, полученного нами по оптимизированной технологии и в образце автолизата «SERVA» получены сопоставимые результаты – 1,6; 6,5; 99,0 и 1,5; 2,0; 100,0 соответственно. Содержание этих катионов значительно выше в образцах серий САПД, полученных с применением натрия хлористого, где в технологической схеме использована водопроводная вода и близко к содержанию в автолизате «Авимин», соответственно 10,0;

8,5; 225,0 и 9,2; 5,8; 150,0. Во всех образцах автолизатов отсутствуют тяжелые металлы и индол, отрицательно влияющие на ростовые свойства питательных сред.

При исследовании автолизатов, полученных с использованием разных ферментных препаратов, выявлено, что применяемый фермент влияет на профиль аминокислотного состава автолизата. Выявлена зависимость содержания глютамина, аргинина, аланина и лизина от метода индукции автолиза пекарских дрожжей. Уровень этих аминокислот выше в образцах, полученных с применением ферментного препарата – протеовибрина. Определен полный набор аминокислот, содержание которых отличается стабильностью. По сумме содержания свободных аминокислот образцы можно отнести к основам со средней глубиной расщепления белка.

Таким образом, результаты исследований физико-химического состава САПД, приготовленного по оптимизированной схеме, свидетельствуют о соответствии требованиям НД (МУК 4.2.2316, 2008) по физико-химической характеристике, его стандартности и полноценном составе микро- и макроэлементов и аминокислот.

Определение качества питательной основы САПД по биологическим показателям было осуществлено в процессе конструирования питательных сред.

Конструирование питательных сред на основе сухого автолизата пекарских дрожжей для культивирования чумного микроба. Оптимизация состава плотных и жидких дрожжевых сред (ДС) была проведена как по содержанию в них количества белковой основы (САПД), так и по составу солей. Прототипом по минеральному составу явились среды для культивирования чумного микроба на основе гидролизата по Хоттингеру по прописи, модифицированной в РосНИПЧИ «Микроб». В результате работы по оптимизации состава сред предложены варианты плотной и жидкой сред на монооснове САПД, которые приведены в сравнении с составом контрольных сред (К) по Хоттингеру. Были также испытаны жидкая и плотная комбинированные среды (КС), приготовленные на основе гидролизата по Хоттингеру с добавлением САПД до 2,5%, с аминным азотом в среде 0,8 и 1,0 г/л соответственно (табл.3).

Таблица 3 – Состав экспериментальных дрожжевых сред Жидкая питательная среда Состав среды К (г/л) ДС (г/л) КС (г/л) Питательная основа/Nамин в среде Хоттингер/0,8 САПД/0,15-0,3 Хоттингер+САПД/0,Натрий хлористый 3,0 3,0 3,Аммоний молибденовокислый 0,5 0,5 0,Натрия метабисульфит 0,05 0,05 0,Плотная питательная среда Состав среды К (г/л) ДС (г/л) КС (г/л) Питательная основа/Nамин в среде Хоттингер/1,0 САПД/0,25-0,5 Хоттингер+САПД/1,Натрий хлористый 3,0 3,0 3,Натрий фосфорнокислый двузаме- 2,0 2,0 2,щенный Калий фосфорнокислый двузаме- 2,0 2,0 2,щенный Аммоний молибденово-кислый 1,0 0,5 1,Натрия метабисульфит 0,1 0,05 0,Железо сернокислое (II) 7/в 0,006 0,006 0,0Агар 18-20 18-20 18-Ростовые качества сред были проконтролированы при температурных режимах и 37оС. Определены чувствительность, показатель прорастания, скорость роста, эффективность среды и способность сохранять стабильные морфологические и биохимические свойства микроорганизмов при культивировании и многократном пассировании (МУ 3.3.2.2124, 2006). Результаты, полученные при культивировании Y. pestis ЕV НИИЭГ, представлены в табл.4. Штаммы Y. pestis Р-1680, Y. pestis И-2377, Y. pestis КМ227, Y. pseudotuberculosis И-199 растут на всех испытанных экспериментальных средах и сохраняют типичную морфологию при аналогичных значениях аминного азота.

Штаммы чумного микроба, выросшие на экспериментальных средах, сохраняют типичную морфологию. Плотная дрожжевая среда незначительно уступает агару по Хоттингеру по показателю эффективности – выходу биомассы, однако, что важно для производственных питательных сред, позволяет чумному микробу синтезировать капсульный антиген (по данным РНГА) аналогично результату на контрольной среде. Комбинированная плотная среда способствует более интенсивному накоплению биомассы, что в 1,2–1,3 раза больше результата, полученного на контрольной среде по Хоттингеру.

Используя прием поэтапного исключения из среды солей, и их двойного уменьшения или увеличения, нами установлено, что содержание натрия сульфита и аммония молибденовокислого в дрожжевой среде может быть уменьшено в два раза по сравнению с контрольной средой, соответственно до 0,05 и 0,5 г/л.

Таблица 4 – Ростовые свойства плотных питательных сред (рН 7,2) при культивировании Y.pestis EV НИИЭГ Показатель Плотная питательная среда / Nамин, % (n=15) ДС/ ДС/ ДС/ ДС/ ДС/ ДС/ КС/ К/ 0,015 0,020 0,025 0,030 0,050 0,060 0,1 0,1-0,Чувствительность (из 3+1,0 8+2,0 7,5+1,0 8+2,2 8+2,0 8+2,1 8+2 8+2,разведения 10-7) М+m Прорастание (из разве- 30+5,0 47+3,2 49+3,4 55+3,8 65+2,8 60+4,1 65+2,5 55+2,дения 10-6), % М+m Эффективность:

концентрация биомас- <1 1,5+0,2 1,8+0,25 2,6+0,5 3,5+0,5 4,0+0,5 6,6+0,2 5,2+0,сы (млрд м.к./мл) М+m синтез АГ (37оС), титр –* 1:64 1:512 1: 1024 1: 1024 1: 1024 1:2048 1: 10РНГА Диаметр колоний, (мм) Точеч- <1,0 1,0 1,0 >1,0 >1,0 1,2+0,1 1,1+0,М+m ные Характер роста Ати- Ати- Типич- Типич Типич- Ати- Типич Типичпичныйпичный ный пич- ный пичный пич- ный ный ный *Прочерк – нет роста при 37 оС Заключительным этапом работы по конструированию плотных питательных сред для культивирования чумного микроба было определение способности сред на основе САПД длительно сохранять стабильными основные биологические свойства при многократном пассировании штамма. Культура чумного микроба на примере Y. pestis ЕV НИИЭГ после десяти пассажей на плотной среде (ДС/0,05) сохраняла основные биологические свойства.

Аналогичным образом были испытаны жидкие среды, приготовленные на монооснове САПД (Nамин 0,015; 0,02; 0,025; 0,03; 0,05%), и среда, комбинированная с использованием САПД в виде ростостимулирующей добавки (Nамин 0,08%). Жидкие дрожжевые среды (Nамин 0,015–0,03%) обеспечивали полноценный рост всех тест-штаммов чумного микроба. В табл. 5 представлены основные характеристики роста Y. pestis EV НИИЭГ при культивировании на жидких питательных средах. Все жидкие среды при посеве чумного микроба из разведений 10-6 и 10-5 (посевное число 100 и 1000 м.к.) оказались высокочувствительными, обеспечивали рост во всех трех пробирках. Характер роста Y. pestis ЕV НИИЭГ на ДС/0,015–0,05 был типичным, но по показателю эффективности – концентрации биомассы, контрольной среде соответствовали среды ДС/0,025; ДС/0,03; ДС/0,05. Достоверно значимое различие с контролем (<0,05) по выходу биомассы при культивировании Y. pestis ЕV НИИЭГ было получено на средах ДС/0,03, ДС/0,05 и КС.

Таблица 5 – Ростовые свойства жидких питательных сред (рН 7,2) при культивировании Y.pestis EV НИИЭГ Показатель Жидкая питательная среда / Nамин, % (n=15) ДС/0,01 ДС/0,02 ДС/0,02 ДС/0,03 ДС/0,05 КС/0,08 К/0,5 Концентрация биомассы (млрд 0,75+0,2 1,55+0,15 1,7+0,2 1,8+0,15* 1,9+0,2* 2,5+0,2* 1,65+0,м.к./мл) М+m Характер Типич- Типич- Типич- Типич- Атипич- Типич- Типичроста ный ный ный ный ный ный ный *<0,Однако жидкая экспериментальная среда ДС/0,05 не обеспечивала стабильности основных биологических свойств чумного микроба. При высеве на плотную среду после инкубации в бульоне, колонии чумного микроба в диаметре были (1,6+0,2) мм и не имели характерной кружевной периферической зоны, отмечалась диссоциация – рост в виде S- и R-форм. Эффективность среды с моноосновой САПД (Nамин 0,03%) достоверно выше, чем среды по Хоттингеру на 15%. Культивирование штамма Y. pestis ЕV НИИЭГ на комбинированной жидкой среде доказало высокую эффективность среды, достоверно превосходящую контрольную среду по Хоттингеру на 50% и дрожжевую среду – 32%.

Таким образом, в результате проведенной работы по оптимизации состава сред показано, что плотная (Nамин0,025–0,05%) и жидкая (Nамин0,015–0,03%) среды на основе автолизата пекарских дрожжей по биологическим показателям соответствуют требованиям, предъявляемым к средам культивирования чумного микроба, и позволяют накапливать АГ аналогично результату на контрольной среде. Плотная и жидкая комбинированные среды, с использованием автолизата в качестве ростостимулирующей добавки, также по биологическим показателям соответствуют требованиям, предъявляемым к средам культивирования чумного микроба и по эффективности (концентрации биомассы) превосходят контрольную среду на 27 и 50%.

Применение питательных сред на основе дрожжевого автолизата для масштабированного культивирования чумного микроба. Практический интерес представляло применение сред культивирования чумного микроба на основе САПД в производстве МИБП. Среды были использованы для экспериментального производства диагностических средств – произведено 6 серий бактериофага чумного диагностического Л413С. Для сред культивирования штамма Y. pestis ЕV НИИЭГ использован САПД в виде моноосновы и в качестве ростостимулирующей добавки (2,5%) в составе комбинированных сред на основе гидролизата по Хоттингеру.

Все среды как приготовленные на основе автолизата пекарских дрожжей, так и содержащие автолизат в виде добавки оказались пригодными для воспроизводства чумного бактериофага Л-413С. Они обеспечивали высокую концентрацию фаговых частиц на этапе размножения, хорошую выживаемость после лиофилизации, а также стабильность свойств в процессе хранения. Однако более эффективными, на наш взгляд, являются среды, в которых дрожжевой автолизат является питательной белковой моноосновой. Среды на монооснове САПД с минимальным содержанием азота (0,025%) обеспечивали наиболее высокую специфическую активность, превышающую в 2,4 раза результат, полученный на контрольной среде по Хоттингеру, соответственно – 20,0107 и 8,4107 фаговых частиц (табл. 6).

Таблица 6 – Физико-химические и биологические показатели бактериофага Л-413С Требова- САПД – монооснова САПД –добавка Бульон по ХотПоказатель ния к Хоттингеру тингеру НД* ДС/1 ДС/2 ДС/3 КС/4 КС/5 К/1 К/Растворимость, мин 3 1 1 1 1 1 1 рН 6,5-7,5 6,96 7,0 7,1 6,43 7,1 6,45 6,Потеря в массе при 3 1,75 0,6 0,5 1,73 0,4 1,3 0,высушивании, % Специфическая ак- тивность частиц:

до лиофилизации n106 20,0107 4,65107 4,6107 4,0107 2,59107 8,4107 5,01после лиофилизации n105 8,0106 1,6106 1,0106 1,9107 1,0106 3,8106 1,11Спектр литической Типич- Типич- Типич- Типич- Типич- Типич- Типич- Типичактивности ный ный ный ный пич- ный ный ный ный НД*- ТУ 9386-020-01898109-20Тенденция преимущества сред на основе САПД с минимальным содержанием аминного азота сохранялась как при лиофилизации чумного бактериофага, так и в процессе хранения в течение срока наблюдения при разных температурных режимах. Результаты изучения свойств препаратов в процессе хранения свидетельствуют о стабильности таких показателей, как растворимость и потеря в массе при высушивании в течение срока годности (3 года), а также через 1 год после его истечения.

Экономически целесообразным является и использование САПД в качестве ростостимулирующей добавки. Способ комбинированного использования основ позволяет использовать мясной перевар в значительно меньшем количестве (на 30%),что обеспечивает в сочетании с азотистыми основаниями САПД содержание в готовой жидкой среде аминного азота 0,08%. Комбинированная среда способна полностью обеспечивать питательные потребности чумного микроба и способствует выживаемости чумного бактериофага на этапе лиофилизации и хранения.

Опыт использования жидкой экспериментальной среды для масштабированного выращивания чумного микроба. Для изучения возможности применения сухого автолизата пекарских дрожжей в производстве диагностических и препаратов, в условиях масштабированного эксперимента в качестве объекта для экспериментальнопроизводственного культивирования были использованы штаммы: Y.pestis EV НИИЭГ и Y. pestis КМ 277 при режиме культивирования 28 и 37 оС.

Установлено, что глубинное культивирование штаммов чумного микроба (Y.pestis КМ 277 и Y. pestis EV НИИЭГ) на жидкой среде (N амин. 0,015%), сконструированной на основе САПД, при 28 оС и 37 оС позволяет накапливать как биомассу, так и капсульный антиген (дот-ИФА). Эффективность экспериментальной жидкой среды сопоставима по результатам контрольной среде по Хоттингеру. При культивировании Y.pestis КМ 277 и Y. pestis EV НИИЭГ на плотных дрожжевых средах (при 28 оС) получены результаты, не уступающие результатам с контрольной среды по Хоттингеру. Определено, что штамм Y.pestis КМ 277 при культивировании на экспериментальных средах с основой САПД при температурном режиме 28 оС (до 24 ч) по способности синтеза в среду капсульного антигена превосходит штамм Y. pestis EV НИИЭГ.

В следующей серии экспериментов для культивирования штаммов чумного микроба (Y.pestis КМ 277 и Y. pestis EV НИИЭГ) использована серия жидкой питательной среды на основе САПД (N амин. 0,015 %). Инкубацию до 24 ч осуществляли при 28 оС в реакторе У-6 с объемом питательной среды 125 л. Определение ФI было проведено методом РИД. Анализируя данные, полученные при культивировании Y.pestis КМ 277 при температуре 28 оС, следует отметить высокий уровень секреции в среду Ф1 – 5,0 мг/мл, и в то же время небольшой выход биомассы с единицы объема питательной среды – 14109 м.к./мл. Соответственно результаты, полученные при культивировании в тех же условиях Y.pestis EV НИИЭГ – 2,5 мг/мл и 35 109 м.к./мл. На основании сравнения данных, полученных при масштабированном выращивании штаммов чумного микроба на экспериментальной среде и среде по Хоттингеру [Никифоров А.К., 2011], можно заключить, что разработанная жидкая среда на основе САПД не уступает по эффективности традиционно применяемой среде.

Учитывая, что современное производство питательных сред должно быть экономически эффективным, было проведено сравнение стоимости основ, приготовленных из разного сырья. Установлено, что применение в составе питательных сред культивирования моноосновы – автолизата пекарских дрожжей может снизить себестоимость МИБП. Рассчитанная стоимость автолизата меньше, чем стоимость гидролизата по Хоттингеру и гидролизата казеина соответственно в 3,3 и 1,3 раза.

Экономический эффект связан и с уменьшение количества основы, используемой для приготовления жидкой среды культивирования, так как дрожжевые среды обеспечивают питательные потребности чумного микроба и способствуют накоплению целевого продукта (бактериофага или капсульного антигена) при содержании в них минимального количества аминного азота (0,015–0,025%). При приготовлении питательных сред для культивирования штамма-продуцента бактериофага, дрожжевой основы расходуется меньше в 2 и 1,8 раза, чем гидролизата по Хоттингеру и казеинового гидролизата. Следовательно внедрение жидких сред на основе автолизата пекарских дрожжей в производство может существенно (в 5,3 раза) снизить себестоимость МИБП.

Таким образом, в результате оптимизации производства автолизата пекарских дрожжей предложены технологические способы, позволяющие получить сухую стандартную основу питательных сред полноценную по аминокислотному составу и со стабильным содержанием микро- и макроэлементов.

При выращивании тест-штаммов доказана пригодность жидкой и плотной сред, сконструированных на монооснове – сухом автолизате пекарских дрожжей для культивирования чумного микроба. Доказана эффективность применения дрожжевых сред при экспериментальном производстве чумного бактериофага Л-413С, для накопления биомассы и ФI при глубинном культивировании штаммов чумного микроба.

ВЫВОДЫ 1. Индуцированный протеовибрином автолиз пекарских дрожжей в условиях щелочной среды (рН 8,0+0,5) сокращает продолжительность процесса в 1,7 раза и повышает выход азотсодержащих веществ до 20% по сравнению со способом, предложенным ранее с применением натрия хлорида.

2. Предложенный комплекс оперативных методов контроля, включающий определение концентрации аминного азота в реакционной смеси и степени лизиса дрожжевых клеток на стадии технологического процесса, а также измерение удельной электропроводимости на стадии входного контроля сырья, позволяет определить эффективность автолиза.

3. Усовершенствованный технологический процесс производства автолизата пекарских дрожжей с применением направленного изменения рН среды, способа фильтрации, концентрирования на вакуум-выпарной установке и распылительного высушивания позволяет получить полноценную сухую питательную основу для микробиологических сред, соответствующую требованиям НД по физико-химическим свойствам и химическому составу.

4. Плотная и жидкая среды на основе автолизата пекарских дрожжей по биологическим показателям соответствуют требованиям, предъявляемым к средам для культивирования чумного микроба.

5. Комбинированные плотная и жидкая среды с использованием автолизата в качестве ростостимулирующей добавки (аминный азот 0,1 и 0,08% соответственно) по биологическим показателям соответствуют требованиям, предъявляемым к средам культивирования чумного микроба, и по накоплению биомассы (при 37 и 28 оС) превосходят контрольную среду по Хоттингеру (на 27 и 50% соответственно).

6. Сконструированные дрожжевые среды обеспечивают при масштабированном культивировании питательные потребности чумного микроба и способствуют накоплению целевого продукта (бактериофага или капсульного антигена) при содержании в них минимального количества аминного азота (0,015-0,025%).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Антонычева М.В., Шульгина И.В., Базлов Г.В., Вахрушина Н.И., Нижегородцев С.А., Астафьева С.В., Дятлов И.А. Применение питательных сред на основе сухого аутолизата дрожжей для культивирования чумного микроба // Санитарная охрана территории государств-участников содружества независимых государств: Матер.VI Межгос.

науч.-практ. конф. – Волгоград, 2005. – С. 206-208.

2. Антонычева М.В., Шульгина И.В., Вахрушина Н.И., Нижегородцев С.А., Волох О.А., Астафьева С.В., Дятлов И.А. Использование сухого автолизата дрожжей для сред культивирования чумного и псевдотуберкулезного микробов // Инфекции, обусловленные иерсиниями, НИИЭМ им. Пастера: Матер. II Всеросс. науч.-практ. конф. с международ. участием. – СПб, 2006. – С. 32-34.

3. Аленкина Т.В., Зинина О.С., Антонычева М.В., Шульгина И.В., Вахрушина Н.И.

Изготовление бактериофага диагностического чумного Л-413С на жидких средах из аутолизата пекарских дрожжей // Инфекции, обусловленные иерсиниями, НИИЭМ им.

Пастера: Матер. II Всеросс. науч.-практ. конф. с международ. участием. – СПб., 2006. – С. 27-29.

4. Антонычева М.В., Шульгина И.В., Аленкина Т.В., Зинина О.С., Вахрушина Н.И., Нижегородцев С.А. Применение сухого автолизата дрожжей в производстве медицинских иммунобиологических препаратов // Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики и лечения инфекционных болезней: Матер.

науч.-практ. конф. ГИСК им. Тарасевича. – М., 2006. – С. 15.

5. Пат. 2360962 Российской Федерации МПК С12N1/20 Способ получения питательной основы и питательная среда для культивирования микроорганизмов возбудителе чумы и холеры / Кузьмиченко И.А., Громова О.В., Киреев М.Н., Плотников О.П., Грачева И.В., Виноградова Н.А., Солодовников Н.С., Нижегородцев С.А., Антонычева М.В.

– №2007122604; заявл. 15.02.2007; опубл. 10.07.09 // Бюлл. 2009. – №19.

6. Крушельницкий Р.В., Антонычева М.В., Нижегородцев С.А., Вахрушина Н.И., Шульгина И.В., Белоусов А.Д. Использование отходов производства автолизата пекарских дрожжей для приготовления белковой питательной основы // Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ: Матер. VIII Межгос. науч.-практ. конф. госуд. - участ. СНГ. – Саратов: ООО «Приволжское изд-во», 2007. – С. 236-237.

7. Кузьмиченко И.А., Громова О.В., Киреев М.Н., Плотников О.П., Грачева И.В., Виноградова Н.А., Червякова Н.С., Нижегородцев С.А., Антонычева М.В. Питательные среды для культивирования возбудителей холеры, чумы, псевдотуберкулеза, приготовленные с использованием ферментативного комплекса холерного вибриона – протеовибрина // Холера и патогенные для человека вибрионы: Матер. совещ. и пробл. комиссии.

– Ростов-н/Д, 2008. – Вып. 21. – С. 126-127.

8. Базлов Г.В., Щербаков Д.А., Антонычева М.В., Васин Ю.Г., Строганов В.В., Шульгина И.В., Никифоров А.К., Вахрушина Н.И., Нижегородцев С.А. Концентрирование автолизата пекарских дрожжей в процессе производства сухой питательной основы // Биотехнология в Казахстане: проблемы и перспективы инновационного развития: Матер.

междунар. науч.-практ. конф., посв. 50-летию НИИ проблем биобезопасности НЦБ МОН РК. – Алматы, 2008. – С. 57-61.

9. Антонычева М.В., Шульгина И.В., Никифоров А.К., Кузьмиченко И.А., Нижегородцев С.А. Безотходные технологии в производстве медицинских иммунологических препаратов // Проблемы обращения с отходами лечебно-профилактических учреждений:

Сб. матер. V междунар. конф. – М., 2009. – С. 34-35.

10. Антонычева М.В., Кузьмиченко И.А., Никифоров А.К., Волох О.А., Шульгина И.В. Эффективность автолиза пекарских дрожжей, индуцированного ферментными препаратами // Пробл. особо опасных инф. – 2009. – Вып. 3(101). – С. 62-65. (из перечня ВАК) 11. Зинина О.С., Аленкина Т.В., Антонычева М.В., Вахрушина Н.И., Никифоров А.К.

Перспективы применения питательных сред на основе аутолизата пекарских дрожжей в производстве чумных бактериофагов // Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств-участников СНГ: Матер. X Межгос. науч.-практ.

конф. государств – участников СНГ (5-6 октября, г. Ставрополь).

– 2010. – С. 188-189.

12. Аленкина Т.В., Зинина О.С., Антонычева М.В., Вахрушина Н.И., Никифоров А.К.

Эффективность применения сред на основе аутолизата пекарских дрожжей в производстве бактериофага диагностического чумного Л-413С // Журн. инф. патол. – Иркутск, 2010.

Вып. 3. – С. 15-17.

13. Аленкина Т.В., Зинина О.С., Антонычева М.В., Вахрушина Н.И., Никифоров А.К. Оптимизация стадии репродукции в технологии производства бактериофага диагностического чумного Л-413С // Пробл. особо опасных инф. 2011. Вып. 2(108). – С. 79-82. (из перечня ВАК) 14. Жулидов И.М., Абрамова Е.Г., Никифоров А.К., Антонычева М.В., Шульгина И.В., Лобовикова О.А., Вахрушина Н.И., Белоусов А.Д., Еремин С.А., Киреев М.Н., Шарапова Н.А., Савицкая Л.В., Михеева Т.А., Минаева Л.Н., Галкина М.В., Свинцов Р.А., Аленкина Т.В., Васин Ю.Г., Базлов Г.В. Безотходные технологии в производстве гетерологичного антирабического иммуноглобулина // Пробл. особо опасных инф. 2011. В. 4 (111). – С.80-84. (из перечня ВАК) 15. Базлов Г.В., Комиссаров А.В., Никифоров А.К., Антонычева М.В., Белоусов А.Д. Совершенствование технологии получения экстракта автолизата пекарских дрожжей // Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н.И. Вавилова. – 2012. – № 1. – С. 11-14. (из перечня ВАК) Подписано в печать 19.01.2012. Формат 6084 1/16. Бумага офсетная.

Печать офсетная. Гарнитура Таймс. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз.

Отпечатано на полиграфическом оборудовании ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт “Микроб” Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46.







© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.