WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


На правах рукописи

Ефремов Александр Михайлович

ПЕРЕНОС ГЕНОВ В КЛЕТКИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ С ПОМОЩЬЮ МОЛЕКУЛЯРНЫХ КОНЪЮГАТОВ: РАЗРАБОТКА НОСИТЕЛЕЙ И ОПТИМИЗАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ КОНСТРУКЦИЙ

03.03.04- клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2012

Работа выполнена на кафедре цитологии и гистологии биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского государственного университета и в отделе биохимии Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного Отделения Российской Академии Медицинских Наук.

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Андрей Петрович Перевозчиков

Официальные оппоненты:

д.б.н., профессор Падкина М.В.

Санкт-Петербургский государственный университет, кафедра генетики и селекции к.б.н., Киселёв А. Б.

НИИ акушерства и гинекологии имени Д.О. Отта РАМН

Ведущая организация:

Институт цитологии Российской Академии Наук

Защита состоится:

«13» декабря 2012 в _____ час на заседании совета Д.212.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу:

199034, Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, Санкт-Петербургский государственный университет, кафедра генетики и селекции, ауд.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского Государственного Университета Автореферат разослан __________________________2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета: д.б.н. Л. А. Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность проблемы. Генотерапия – перенос генов в соматические клетки организма в целях лечения заболеваний. Ключевым моментом, определяющим эффективность лечения, является выбор способа переноса ДНК в клетки-мишени.

Максимальная эффективность переноса обеспечивается вирусными векторами, однако данный подход имеет существенные ограничения (Gerard R.D., Chan L., 1996;

Temin H.M. et al., 1990). Невирусные методы переноса ДНК лишены ряда принципиальных недостатков, присущих вирусным средствам (побочные эффекты, высокая иммуногенность и токсичность), и могут быть использованы многократно (Schmidt-Wolf G.D. et al., 2003). Наиболее перспективными среди невирусных носителей ДНК являются молекулярные конъюгаты - катионные носители для конденсации ДНК за счет электростатических взаимодействий с последующим введением полиэлектролитных комплексов ДНК/носитель в клетки млекопитающих (Molas M. et al., 2003). Однако, для невирусных способов доставки чужеродной ДНК также существует ряд ограничений. Комплексы ДНК/катионный пептид, как правило проникают в клетки за счет адсорбционного эндоцитоза, что снижает адресность доставки (Ignatovich I.A. et al., 2003). Кроме того, эффективность трансфекции будет зависеть от размера образующихся комплексов и способности этих комплексов попадать в цитоплазму из эндосом (Molas M. et al., 2003). В этой связи представляется актуальным разработка пептидных катионных носителей, взаимодействующих с ДНК за счет электростатических сил и способных переносить эту ДНК в клетки путем специфического, рецептор-опосредованного эндоцитоза. Кроме этого, необходимо адаптировать подобранные in vitro молекулярные конъюгаты (комплексы ДНК/катионный пептид) к условиям in vivo. Взаимодействие таких комплексов с белками плазмы крови (прежде всего с сывороточным альбумином) может привести к частичной, или даже полной инактивации комплексов и существенно ограничивает возможности системного применения комплексов ДНК с молекулярными конъюгатами в целях генотерапии, или экспериментального исследования экзогенных генетических конструкций (Ignatovich I.A. et al., 2003).

Вторым по значимости фактором (после средств доставки), влияющим на специ­ фичность и эффективность генотерапии, является создание специфичных генетических конструкций, обеспечивающих экспрессию перенесенных в клетки чужеродных генов.

Помимо использования тканеспецифических и индуцибельных промоторов, важную роль в обеспечении продолжительной и интенсивной экспрессии перенесенного гена играет его экзон-интронная структура. Механизмы влияния интронов на продолжитель­ ность экспрессии экзогенных генов изучены недостаточно (Miao C.H. et al., 2001).

Целью данной работы являлась разработка молекулярных конъюгатов, способ­ ных обеспечить рецептор-опосредованный перенос генов in vitro и in vivo, а также вы­ явление факторов, влияющих на продолжительность работы перенесенного гена in vivo.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи исследования:

1. Разработать на основе катионных пептидов молекулярные конъюгаты, проникающие в клетки рецептор-опосредованым эндоцитозом. Выявить факторы, влияющие на трансфекционную активность комплексов чужеродной ДНК с катионными пептидными конъюгатами.

2. Исследовать трансфекционную активность комплексов ДНК с молекулярными конъюгатами in vivo в случае системного или локального переносов.

3. Определить генетические факторы, влияющие на продолжительность экспрессии гена аполипопротеина А1 человека после доставки его в составе невирусного вектора экспрессии в печень или в другие клетки млекопитающих.

Научная новизна работы. Впервые созданы молекулярные конъюгаты на осно­ ве синтетических пептидных катионов и лигандов люлибериновых и трансферринового рецепторов, способные попадать в клетки рецептор-опосредованым эндоцитозом.

Впервые получена работающая модель для направленного переноса генетических конструкций через рецептор к трансферрину в поверхностные ткани млекопитающих in vivo. Показана возможность переноса генетических конструкций в ткани зародыша мыши при гидродинамических инъекциях в организм матери. Продемонстрировано значение экзон-интронной структуры гена аполипопротеина А1 человека в поддержа­ нии долговременной экспрессии этого гена после его переноса мышам методом гидро­ динамических инъекций.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработанный поликатион NLS способен связывать плазмидную ДНК, однако комплексы ДНК/NLS не способны к трансфекции in vitro.

2. Созданы молекулярные конъюгаты NLS-LHRH, NLS-TSF7 и NLS-TSF12, способные доставлять плазмидную ДНК посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза в клетки, экспрессирующие значительные количества рецепторов люлиберина (конъюгат NLS-LHRH) и трансферрина (конъюгаты NLS-TSF7, NLSTSF12).

3. Комплексы ДНК с пептидом NLS-TSF7 способны к эффективному переносу в поверхностные ткани мышей. В модели заживления ран NLS-TSFобеспечивает перенос гена инсулин-подобного ростового фактора IGF1s и ускоряет процесс восстановления.

4. На продолжительность экспрессии экзогенного гена аполипопротеина Ачеловека в печени мышей влияют участки второго интрона гена, а не его 5'- и 3'-регуляторные области.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы представле­ ны в виде 6 статей, опубликованных в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК, а также в виде устных и стендовых докладов на следующих конференциях: IX Всероссийский форум с международным участием «Дни Иммунологии в Санкт-Петер­ бурге», Всероссийская медико-биологическая научная конференция молодых учёных «Фундаментальная наука и клиническая медицина», конференция «Живые системы» в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы».

Объем и структура диссертации. Диссертация содержит разделы «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследования», «Обсужде­ ние», «Выводы» и «Список цитируемой литературы». Диссертация представлена на 139 страницах, содержит 34 рисунка и 2 таблицы. В «Списке цитируемой литературы» 234 источников, из них 14 на русском языке и 218 на английском.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы работы. В работе использованы реактивы и другие материалы следу­ ющих фирм: «Sigma» (США), «Serva» (Германия), «Pharmacia» (Швеция), «Boehringer Mannheim» (Германия), а также отечественного производства, квалификации х.ч. и ч.д.а;

ферменты для генно-инженерных работ производства «Promega» (США), «Fermentas» (Литва) и НПО «СибЭнзим» (Россия). Для экспериментов in vivo использовались мыши линий C57Bl/6 и DBA (самцы), полученные из питомника «Рапполово» РАМН (Санкт-Пе­ тербург). Все процедуры с животными были проведены в соответствии с общепринятыми правилами обращения и ухода за ними. Для экспериментов in vitro использованы клеточ­ ную линию гепатоцеллюлярной карциномы (гепатомы) человека HepG2, фибробласты кожи человека линии VH-10 и клетки карциномы человека А431. Все клеточные культуры получены из банка клеточных культур Института цитологии РАН. кДНК – копия гена апо А1 человека и его хромосомный вариант в составе протяженного геномного локуса, включающего 5'-регуляторный район (геномный локус протяженностью более чем 5000 н.п., плазмида pAlg) были любезно предоставлены доктором L. Chan (Baylor College, Texas, USA). Плазмиды pCMVapo и pCMVLuc, представляют собой вектора экспрессии кДНК апо А1 человека или люциферазы светляка под контролем промотора ранних генов цитомегаловируса человека, сконструированы методами генной инженерии и описаны ра­ нее. Протяженная 5'-концевая регуляторная последовательности (-2491…+173 н.п.) гена аполипопротеина А1 человека и её делеционные варианты, соответствующие промотору только с гепатоцитарным энхансером (-256…+173 н.п. относительно точки инициации транскрипции), сцепленные с геном-репортером luc, кодирующим люциферазу светляка, описаны ранее (Перевозчиков А.П. и др., 1997; Лапиков И.А. и др., 2008).

Методы исследования. Используемые в работе пептиды синтезированы методом твердофазного синтеза и предоставлены С. В. Буровым (ИВС РАН).

Формирование комплексов ДНК с катионными пептидами. Формирование комплексов ДНК с K8, NLS, и молекулярными коньюгатами проводили в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) при различном соотношении зарядов ДНК и пептида в реакционной среде. Образо­ вание комплексов ДНК/пептид контролировали методом гель-ретардации в агарозном геле. Количество пептида, входившее в состав комплекса, определяли обратным титрова­ нием гепарином.

Трансформация с использованием катионных пептидов. Трансфекцию клеток препа­ ратами комплексов ДНК с катионными пептидами и молекулярными конъюгатами выпол­ няли на основании методики, предложенной Gottschalk с соавторами (Gottschalk S. et al., 1996). Комплексы ДНК/пептид с разными соотношениями зарядов ДНК и пептида готови­ ли, как описано выше, из расчета 12 мкг ДНК на чашку диаметром 35 мм в 500 мкл ФСБ.





После инкубации клеток с комплексами в течение 2-4 ч клетки отмывали от неинтернали­ зовавшихся комплексов три раза раствором гепарина (58 мкг/мл в ФСБ), после чего к клет­ кам добавляли среду DMEM c 10% сывороткой и инкубировали в атмосфере 5% CO при 370 С в течение 24 ч. В экспериментах по оценке эффективности трансфекции клеток с ис­ пользованием флюоресцентно-меченных пептидов клетки после инкубации в течение 2 ча­ сов при 37°C отмывались от неинтернализованного пептида раствором гепарина (58 мкг/мл в ФСБ) три раза по 10 минут.

Системное введение плазмидной ДНК в хвостовую вену мышей. Плазмидные ДНК (10 мкг на мышь) инъецировали с помощью иглы в хвостовую вену мышей С57bl/6 (самцы в возрасте 6-8 недель, массой от 12 до 19 г) гидродинамическим способом: за 4-5 с в 13 мл раствора Рингера (в зависимости от веса мыши). Для гидродинамических инъекций непосредственно перед экспериментом отбирали группу мышей с массами 1 грамм отно­ сительно среднего значения (m ). Точный объем (V) вводимого раствора вычисляли по ср.

формуле (Акифьев Б.Н. и др., 2004), полученной на основании данных F. Liu с соавторами (Liu F. et al., 1999):

V(мл)=0,057143хm +0,51ср Перенос комплексов плазмидной ДНК с молекулярными конъюгатами NLS-TSF7 в по­ верхностные ткани мышей. Перед нанесением ран кожа экспериментальных животных подготавливалась – удалялся волосяной покров. Резаные раны наносились с помощью хи­ рургического скальпеля на глубину примерно 2 мм, захватывая подлежащую мышечную ткань, в области нижней части спины. Колотые раны наносились путем десяти уколов инсулиновым шприцом в нижнюю часть спины. Инъекции экспериментальных препаратов наносились инсулиновым шприцом в виде 10 уколов в каждую рану. Плазмидная ДНК и комплексы плазмидной ДНК с молекулярным конъюгатом вводились в количестве 50 мкг ДНК на мышь в 100 мкл ФСБ, содержащем 4 мМ CaCl. Для измерения люцифераз­ ной активности на 3-й день после переноса мышам pCMVluc животных умерщвляли и вы­ резали участок тканей, включающий рану. Для постановки эксперимента использовалось 100 мг ткани каждого животного. Образцы гомогенизировали в буфере Reporter Lysis Buffer производства «Promegа», замораживали и после разморозки центрифугировали 3 мин при 10000 g. Супернатант использовали для измерения люциферазной активности и концентрации белка.

Анализ экспрессии генов методом RealTime ОТ-ПЦР. Оценку экспрессии синтетическо­ го гена инсулиноподобного фактора роста I типа (IGF-1) проводили на первые, третьи и седьмые сутки после переноса мышам pCMVIGF-1 методом RealTime ОТ-ПЦР. Для от­ рицательного контроля использовали мышей, не обработанных pCMVIGF-1. Выделение РНК из тканей осуществляли с использованием набора «TRI Reagent» производства фир­ мы «Sigma», по инструкции изготовителя. Синтез кДНК проводили с помощью набора Revert Aid® First Strand cDNA Synthesis Kit производства фирмы «Fermentas». Для измере­ ния относительного содержания мРНК применяли метод RealTime PCR с использованием SYBR GREEN (SYBR Green Supermix («Bio-Rad»). Все образцы нормировались по уровню экспрессии гена -актина. Реакцию проводили с использованием термоциклера IQ5 («BioRad»), предварительный анализ данных осуществляли с использованием прилагающегося программного обеспечения. В качестве отрицательного контроля использовалась реакция без добавления ДНК. Нормализацию данных проводили по количеству ткани, концентра­ ции РНК и кДНК.

Делеция участков плазмидной ДНК с помощью ПЦР. Для делеции второго (плазмида pS234) и третьего (плазмида pS34) интронов из плазмиды pSgapo (содержит геномный ген апо А1 под контролем собственной 5'-регуляторной области -256…+1 н.п. относительно точки инициации транскрипции) мы использовали методику, основанную на ПЦР. С плаз­ мидной ДНК раздельно ставились две ПЦР, включающие области, граничащие с делетиру­ емым участком в 5'-(Л) и 3'-(П) положении. Использовались праймеры для делеции третьего интрона Л: прямой 5'-AGAGACTGCGAGAAGGAG-3' обратный 5'-CAGTTGTCAAGGAGCTTTAGGTTTAGCTGTTTTCCCAAG-3' П: прямой 5'-GCCTTGGGAAAACAGCTAAACCTAAAGCTCCTTGACAACTGGG-3' о братный 5'-CCGCTCTAGAACTAGTGGAT-3' и для делеции второго интрона Л: прямой 5'-AGAGACTGCGAGAAGGAG-3' обратный 5'-GAAATGCCGAGCCTGGCTCCCCGTCAGGAAGAGCAC-3' П: прямой 5'-GGCCGTGCTCTTCCTGACGGGGAGCCAGGCTCGGCATTTC-3' обратный 5'- CCGCTCTAGAACTAGTGGA-3' Праймеры, фланкирующие область делеции, помимо участков, комплиментарных своей половине фрагмента, содержали участок, комплиментарный последовательности ДНК, фланкирующей область делеции с противоположной стороны. В результате этого раунда ПЦР, образовывались два фрагмента (Л и П) с перекрывающимися концами. Полученные фрагменты очищались от остатков праймеров и плазмидной ДНК с помощью препаратив­ ного гель-электрофореза. Эквимолярную смесь правого и левого фрагментов денатуриро­ вали и проводили кросс-отжиг с последующей амплификацией продукта с использовани­ ем краевых праймеров: прямой 5'-AGAGACTGCGAGAAGGAG-3', обратный 5'-CCGCTCTAGAACTAGTGGAT-3'. Полученными фрагментами с помощью генно-инже­ нерных манипуляций замещали соответствующие геномные части в плазмиде pSapo.

Определение в сыворотке крови мышей человеческого белка Апо А1. Для определения концентрации Апо А1 использовали метод твердофазного иммуноферментного анализа с использованием поликлональных антител кролика против человеческого Апо А1 и вто­ рых антител козы против кроличьих IgG, сконъюгированных с пероксидазой хрена. Поли­ клональные кроличьи антитела против человеческого Апо А1 были описаны ранее (McVicar J.P. et al., 1984).

Статистическая обработка полученных результатов. Значения ферментативных ак­ тивностей представлены как среднее арифметическое не менее трёх параллельных проб + стандартная ошибка среднего. Достоверность различий определяли с помощью непар­ ного t-теста. Различия рассматривались достоверными при p<0,05. Статистический анализ выполнялся с помощью программы Statistica 5.0, «StatSoft Inc».

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ Молекулярные конъюгаты. Выбор катионного носителя.

Направленность переноса ДНК в комплексах с молекулярными конъюгатами опре­ деляется структурой лигандной составляющей комплекса ДНК/катионный пептид, спе­ цифически взаимодействующей с рецепторами клеточной поверхности и обеспечиваю­ щей интернализацию комплексов ДНК/молекулярный конъюгат в клетки путем рецеп­ тор-опосредованного эндоцитоза. Катионной составляющей обычно отводится роль но­ сителя ДНК. Тем не менее, в ряде предыдущих исследований показана способность комплексов ДНК с катионными пептидами проникать в клетки за счет неспецифическо­ го адсорбционного эндоцитоза. Использование подобных пептидов в качестве катион­ ных составляющих молекулярных конъюгатов приводит к снижению специфичности переноса генов в клетки-мишени.

В задачи работы входил анализ способности различных катионных пептидов до­ ставлять чужеродную ДНК внутрь клеток путем неспецифического адсорбционного эн­ доцитоза. В работе использовали два катионных пептида – лизин-богатый модифициро­ ванный сигнал ядерной локализации T-антигена вируса SV40 (NLS – PKKKRKV) и ар­ гинин-богатый сигнал ядерной локализации белка Rev ВИЧ1 (NLS-Arg – RRNRRRR).

Оба пептида оказались способны формировать полиэлектролитные комплексы с плаз­ мидной ДНК за счет электростатических взаимодействий, аналогично описанным ранее катионным пептидам Tat и K8 (Ignatovich I.et al., 2003; Диже Э.Б. и др., 2006). Оценку трансфекционной активности пептидов NLS и NLS-Arg проводили в экспериментах по трансфекции клеток человека HepG2 комплексами плазмидой ДНК (pCMVluc) с ка­ тионными пептидами с последующим анализом эффективности переноса с помощью люциферазного теста (рис. 1). В качестве положительного контроля использовали ранее изученный катионный пептид K8 (Gottschalk S. et al., 1996).

Трансфекция клеток HepG2 комплексами ДНК с пептидом NLS-Arg приводит к вы­ сокому уровню люциферазной активности в лизатах клеток. В тех же условиях экспе­ римента, в лизатах клеток, трансфецированных комплексами pCMVluc с пептидом NLS, люциферазная активность не выявлялась. Таким образом, несмотря на электроста­ тическое связывание плазмидной ДНК, пептид NLS не способен доставлять ДНК в культивируемые клетки человека путем адсорбционного эндоцитоза (рис. 1). На осно­ ве полученных данных пептид NLS был выбран в качестве катионной составляющей для создания молекулярных конъюгатов.

Рис. 1. Активность люциферазы в экстрактах клеток HepG2 после переноса комплексов pCMVluc с катионными пептидами NLS, NLS-arg и К8.

По оси абцис указаны избытки зарядов катионных пептидов по отношению к ДНК.

По оси ординат (RLU) указана относительная активность люциферазы на микрограмм тотального белка: число зарегистрированных вспышек в минуту на 1 мг тотального клеточного белка (p<0,01) Комплексы ДНК с молекулярными конъюгатами проникают в клетки за счет рецептор-опосредованного эндоцитоза Для синтеза молекулярных конъюгатов в качестве лигандной части использовали агонист (EHWSYKLRPG) и антагонист (KPGFPSYKLRPG) рецепторов гонадолибери­ на, (Буров С. В. и др., 2010), а также пептидные лиганды трансферринового рецептора, описанные ранее Lee J.H. и соавторами (TSF-7 – AHAIYPRH и TSF-12 – ATHRPPMWSPVWP) (Lee J.H. et al., 2001). Рецепторы к люлиберину в норме присут­ ствуют на ограниченном числе клеток организма млекопитающих (гонады, гипофиз, мозг и плацента) (Schally A.V., 1999). Однако эти рецепторы обнаружены во многих ти­ пах опухолей, что делает агонисты и антагонисты люлиберина перспективными сред­ ствами доставки терапевтических агентов (Nagy A. et al., 2006). В отличие от рецепто­ ров люлиберина, рецепторы к трансферрину присутствуют во многих типах клеток, и их количество зависит от пролиферативной активности клеток.

В качестве катионной составляющей во всех случаях использовали пептид NLS (см. выше). В результате были получены следующие молекулярные конъюгаты (рис. 2).

Анализ интернализации молекулярных конюгатов клетками проводили с использовани­ ем флуоресцентно меченых конъюгатов NLS-LHRH, Nuk1 и комплексов ДНК с конъю­ гатом NLS-LHRH. Клетки гепатомы человека HepG2 (содержат значительные количе­ ства люлибериновых рецепторов) и фибробластов человека VH-10 (не содержат люли­ бериновых рецепторов) инкубировали с конъгатами в течение 10 мин. Присутствие флуоресцентной метки в культурах исследовали методом конфокальной микроскопии.

Как свободный NLS-LHRH и Nuk1, так и комплексы ДНК с NLS-LHRH обнаружива­ лись в везикулярных компартментах клеток гепатомы, но не фибробластов (рис. 2).

NLS-LHRH:

EHWSYKLRPG | PKKKRKV Nuk1:

PKKKRKV-KPGFPSYKLRPG NLS-TSF7:

PKKKRKV-ATHRPPMWSPVWP NLS-TSF12:

PKKKRKV-AHAIYPRH Рис. 2. Структура молекулярных конъюгатов (справа) и интернализация молекулярных конъюгатов LHRH-NLS (в, е), Nuk1 (б, д) и комплексов LHRH-NLS/ДНК (а, г) клетками HepG2 (а, б, в) и фибробластами человека (г, д, е) Полученные данные свидетельствуют о тканеспецифической доставке ДНК с по­ мощью молекулярных конъюгатов на основе лигандов люлибериновых рецепторов.

Ещё одно доказательство роли рецепторов люлиберина в проникновении комплексов конъюгатов с ДНК на основе аналогов люлиберина получено в экспериментах по до­ ставке коньюгатов на основе синтетических аналогов люлеберина NLS-LHRH и Nukклеткам HepG2 с избытками аларелина (известный агонист люлибериновых рецептров).

Установлено, что аларелин дозозависимо подавляет эффективность трансфекции кле­ ток комплексами ДНК с молекулярным конъюгатом NLS-LHRH и не влияет на уровень трансфекции клеток комплексами ДНК с конъюгатом Nuk1 (рис. 3).

Рис. 3 Влияние аларелина на эффективность переноса комплексов ДНК/NLS-LHRH и ДНК/Nuk1 в клетки HepG2.

По оси ординат (RLU) указана относительная активность люциферазы на микрограмм тотального белка: число зарегистрированных вспышек в минуту на 1 мг тотального клеточного белка (p<0,01) Полученные результаты указывают на рецептор-опосредованный характер проникнове­ ния комплексов ДНК с NLS-LHRH в клетки HepG2. В отношении путей проникновения в клетки комплексов ДНК с Nuk1 однозначных выводов сделать нельзя.

Специфичность взаимодействия пептидных лигандов TSF7 и TSF12 с рецептором трансферрина была установлена в предыдущих исследованиях (Lee J.H. et al., 2001).

Доказательства рецептор-опосредованного характера проникновения комплексов ДНК с молекулярными конъюгатами NLS-TSF7 и NLS-TSF12 получены в экспериментах по трансфекции клеток HepG2 комплексами pCMVluc/NLS-TSF7 и pCMVluc/NLS-TSFв присутствии 50-кратных молярных избытков соответствующих свободных молеку­ лярных конъюгатов. В обоих случаях добавление к клеткам молярных избытков сво­ бодных конъюгатов приводило к существенному снижению уровня трансфекции кле­ ток, что доказывает рецептор-опосредованный механизм интернализации клетками комплексов ДНК с молекулярными конъюгатами на основе пептидных лигандов транс­ ферриновых рецепторов.

На рисунке 4 приведены результаты люциферазного теста, демонстрирующие влияние различных факторов на эффективность трансфекции клеток HepG2 молекуляр­ ными конъюгатами NLS-LHRH, Nuk1, NLS-TSF7 и NSL-TSF12. Установлено, что уда­ ление CaCl из культуральной среды приводит к практически полному подавлению уровня экспрессии переносимого гена при использовании всех вышеперечисленных конъюгатов. Полученные данные хорошо согласуются с тем фактом, что как рецепторопосредованный, так и адсорбционный эндоцитоз угнетаются в отсутствие ионов Ca2+.

Еще одним важным фактором, существенно влияющим на эффективность трансфекции клеток полиэлектролитными комплексами, является присутствие в культуральной сре­ де белков сыворотки крови. В предыдущих исследованиях установлено, что трансфек­ ция клеток комплексами ДНК с катионными пептидами Tat и K8 в присутствии белков сыворотки крови приводит к существенному снижению уровня экспрессии перенесен­ ного гена (Ignatovich I.A. et al., 2003). Это подавление может иметь решающее значение при разработке систем переноса генов in vivo. Установлено, что введение при транс­ фекции клеток в культуральную среду 10% эмбриональной сыворотки коров (FCS) при­ водило к падению уровня экспрессии перенесенного гена для молекулярных конъюга­ тов NLS-LHRH, NLS-TSF7 и NLS-TSF12 (рис. 4).

Рис. 4. Уровень активности люциферазы в экстрактах клеток HepGпосле трансформации комплексами pCMVluc с молекулярными конъю­ гатами NLS-LHRH, Nuk1, NLS-TSF7 и NLS-TSF12: влияние белков сыво­ ротки и ионов кальция. По оси ординат (RLU) указана относительная ак­ тивность люциферазы на микрограмм тотального белка: число зарегистриро­ ванных вспышек в минуту на 1 мг тотального клеточного белка (p<0,01) Молекулярные конъюгаты на основе аналогов люлиберина в модели суицидаль­ ной генотерапии in vitro способны эффективно уничтожать опухолевые клетки Полученные данные о тканеспецифическом проникновении комплексов ДНК/LHRH-NLS и ДНК/Nuk1 (см. выше) в клетки HepG2 позволили перейти к модели­ рованию «суицидальной» генотерапии опухолей путем переноса в клетки вектора экс­ прессии гена тимидинкиназы вируса HSV1 (pPTK1) с последующей обработкой транс­ фецированных клеток ацикловиром. Клетки HepG2 трансфецировали комплексами pPTK1/NLS-LHRH и pPTK1/Nuk1, приготовленными при соотношении зарядов один к одному. Распределение клеток по фазам клеточного цикла оценивали методом про­ точной цитофлуорометрии. Результаты представлены на рисунке 5. Обработка клеток, трансфецированных комплексами pPTK1/NLS-LHRH, ацикловиром приводит к полно­ му исчезновению клеток в фазах клеточного цикла G2 и S и практически полному ис­ чезновению клеток в фазе G1. Более 90% клеточной популяции находятся в апоптоти­ ческом состоянии (рис. 5в). В случае использования конъюгата Nuk1 также наблюда­ лась массовая гибель клеток, однако, эффект был менее выражен, так как около 15% клеток оставались в фазе G1. Клетки в фазах S и G2 также отсутствовали. Апоптоз клеток обусловлен именно экспрессией «суицидального» гена, так как обработка ин­ тактных клеток HepG2 ацикловиром (рис. 5б) не приводила к существенным отклоне­ нием клеточного цикла по сравнению с контролем (рис. 5а).

Рис. 5. Анализ распределения клеток HepGпо фазам клеточного цикла методом проточной цитофлюорометрии:

а- интактные клетки (контроль);

б- клетки после обработки ацикловиром (50 мкг/мл) в течение 24 ч в- клетки, трансфецированные комплексами pPTK1/NLSLHRH после обработки ацикловиром (50 мкг/мл) в течение 24 ч г- клетки, трансфецированные комплексами pPTK1/Nukпосле обработки ацикловиром (50 мкг/мл) в течение 24 ч Системное введение комплексов pCMVluc/Nuk1 в хвостовую вену мышей приводит к трансфекции клеток печени Известно, что люлибериновый рецептор присутствует в клетках гипофиза, мозга, гонад и плаценты. В качестве мишени для переноса генетических конструкций с люци­ феразой наибольший интерес представляет плацента, благодаря удобному расположе­ нию и большому количеству кровеносных сосудов. Для модели переноса комплексов ДНК с пептидами NLS-LHRH и Nuk1 in vivo мы выбрали беременных самок мышей ли­ нии C57Bl/6. При введении комплексов ДНК/Nuk1 и ДНК/NLS-LHRH путем обычных («медленных») инъекций в хвостовую вену беременной мыши, люциферазная актив­ ность регистрировалась только при использовании комплексов ДНК/Nuk1 в печени взрослых самок, причем уровень люминесценции составлял порядка 5,8105 RLU/мг белка. В других тканях и при использовании комплексов ДНК/NLS-LHRH экспрессия люциферазного гена не наблюдалась. Как известно, в нормальных (не опухолевых) ге­ патоцитах рецепторы к люлиберину не найдены (Schally A.V. et al, 1996), что позволяет предположить не связанное с люлибериновым рецептором проникновение комплексов ДНК/Nuk1. Данное предположение подтверждается также результатами опытов in vitro на клетках гепатомы HepG2, где уровень трансфекции клеток комплексами ДНК с пеп­ тидом Nuk1 не снижался в присутствии избытков аларилина (рис. 2). Возможно, что пептид Nuk1 взаимодействует не только с рецепторами гонадолиберина, но и с какимито иными рецепторами на поверхности гепатоцитов. Отсутствие активности молекуляр­ ного конъюгата NLS-LHRH при системном введении мышам объясняется, по-видимо­ му, угнетающем действием белков плазмы крови (рис. 4).

Перенос гена инсулиноподбного фактора роста 1 с помощью конъюгата NLS-TSFв поврежденные поверхностные ткани мышей ускоряет заживление ран В экспериментах по локальному переносу in vivo молекулярный конъюгат NLSTSF7 оказался способен эффективно переносить гены в поверхностные ткани млекопи­ тающих (Ефремов А.М. и др., 2010).

Рис. 6. Динамика накопления РНК-продукта перенесенного гена IGF1s, нормализованного на единицу веса тканей образцов, на разных сроках методом RealTime ОТ-ПЦР. На графике приведены данные значения циклов выхода кривой реакции на плато (p<0,01) Эти данные позволили использовать NLS-TSF7 в системе регенерационной терапии по­ верхностных повреждений млекопитающих. Перенос вектора экспрессии гена инсули­ ноподобного фактор роста I типа человека pCMVIGF-1s (Иванов И.А. и др., 2007) в по­ верхностные раны мышей (DBA, самцы, 6 недель) осуществляли с помощью молеку­ лярного конъюгата NLS-TSF7. В эксперименте было сформировано 4 группы живот­ ных, по 10 мышей в каждой. Мышей из опытной группы инъецировали 50 мкг либо свободной pCMVIGF-1s, либо комплексами pCMVIGF-1s/NLS-TSF7. Контрольных мы­ шей инъецировали плазмидной ДНК с делетированным промотором (pdelIGF-1s) или свободным NLS-TSF7. На 3, 5 и 7 сутки по две мыши из каждой группы умерщвляли и из областей, прилегающих к ране, выделяли РНК, которую использовали для количе­ ственной оценки экспрессии IGF-1 методом RealTime ОТ-ПЦР. Уровень экспрессии гена IGF-1 на 3 и 5 сутки после начала эксперимента был выше от 64 до 128 раз при инъекциях комплексов pCMVIGF-1s/NLS-TSF7 по сравнению с инъекциями свободной pCMVIGF-1s (рис. 6). У мышей контрольной группы, инъецированных плазмидой с де­ летированным промотором, или свободным молекулярным конъюгатом NLS-TSF7, экс­ прессии IGF-1 человека зарегистрировано не было. Эти данные подтверждают ранее полученные результаты о высокой эффективности молекулярного конъюгата NLS-TSFпри доставке генов в поверхностные ткани млекопитающих.

Таблица 1. В таблице приведены средние значения площади раны (в мм2) в экспериментальных и контрольных группах мышей: pCMVIGF-1s – мыши, инъецированные свободным вектором экспрессии инсулин-подобного фактора роста I типа человека; pCMVIGF-1s/NLS-TSF7 – мыши, инъецированные комплексами pCMVIGF-1s/NLS-TSF7; pdelIGF-1s – мыши, инъецированные свободным вектором экспрессии инсулин-подобного фактора роста I типа человека с делетированным промотором; NLS-TSF7 – мыши, инъецированные свободным молекулярным конъюгатом NLS-TSF7.

Оценку скорости регенерации проводили, измеряя площадь ран на 7, 10, 14 и 21 сутки после начала эксперимента. Результаты суммированы в таблице 1. Инъекции как сво­ бодной pCMVIGF-1s, так и комплексов pCMVIGF-1s/NLS-TSF7 приводили к суще­ ственному ускорению процесса заживления раны по сравнению с контрольными жи­ вотными. Через 14 суток после начала эксперимента у мышей, инъецированных комплексами pCMVIGF-1s/NLS-TSF7, происходило полное заживление раны, тогда как в контроле площадь раны составляла около 10 мм2 (~17% от исходного размера, табли­ ца 1). Более того, у мышей, инъецированных комплексами pCMVIGF-1s/NLS-TSF7, на 10 сутки после начала эксперимента, размер раны был в два раза ниже, чем у мышей, инъецированных свободной плазмидой, и в 4 раза ниже, чем у контрольных групп. По­ лученные результаты свидетельствуют об эффективности разработанной системы неви­ русной регенерационной генотерапии поверхностных повреждений млекопитающих.

Влияние структуры гена апо А1 человека на продолжительность его экспрессии после переноса в печень мышей В предыдущих работах (De Geest B. et al., 2000; Акифьев Б.Н. и др., 2004) было показано, что в отличие от конструкции pCMVapo (кДНК копия гена апо А1 под контролем промотора CMV), геномный вариант гена апо А1 человека с полноразмер­ ной (-6194...+1 н.п.) 5'- и 3'- регуляторной областью (плазмида pAlg) способен поддер­ живать долговременную экспрессию более двух недель) после переноса в печень мы­ шей методом гидродинамических инъекций. На продолжительность экспрессии перене­ сенного гена могут влиять 5'- и 3'- регуляторные области, регуляторные элементы, ко­ торые могут находиться в кодирующей части и сама экзон-интронная структура гена (De Geest B. et al., 2000). Для установления роли собственно экзон-интронной структу­ ры геномного гена был получен делеционный вариант плазмиды pAlg – плазмида pSApo, представляющая собой ген апо А1 человека с сохранённой экзон-интронной структурой и усеченной 5'-регуляторной областью (-256…+1 н.п. относительно точки инициации транскрипции), содержащей собственно промотор гена и гепатоцитарный энхансер. Данный район 5'-регуляторной области гена апо А1 необходим и достаточен для его тканеспецифической экспрессии в гепатоцитах (Widom R.L. et al., 1991). Пере­ нос генетических конструкций с геном апо А1 человека в печень мышей проводили ме­ тодом гидродинамических инъекций (Акифьев Б.Н. и др., 2004). Установлено, что уда­ ление протяженных 5'- и 3'-регуляторных областей гена апо А1 человека не приводило к сокращению продолжительности экспрессии в печени мышей.

Продолжительная экспрессия гена апо А1 человека в печени мышей может быть обусловлена либо присутствием неких регуляторных элементов в составе интронов, либо важностью сплайсинга для стабилизации и эффективной трансляции мРНК апо А1. Для проверки этих вариантов были созданы генетические конструкции pSAи pSA234, представляющие собой производные плазмиды pSApo, лишенные, соответ­ ственно, третьего (плазмида pSA34) и второго и третьего (плазмида pSA234) интронов.

Рис. 7. Уровень апо А1 в крови мышей после внутривенных гидродина­ мических инъекций плазмидных векторов экспрессии: хромосомного гена апо А1 (pAlg) и гена апо А1 с сохраненной экзон-интроной структурой под контролем «печеночного энхансера» (pSapo), делеционого геномного вариан­ та с удалённым третьим интроном (pS34) и вторым и третьим интроном (pS234) по 20 мкг на животное. Мыши – C57Bl/6 (самцы). По оcи ординат – содержание в сыворотке Апо А1 человека; по оси абсцисс – дни после начала эксперимента; на рисунке представлена сводная гистограмма всех трех конструкций (p<0,05) Результаты переноса данных генетических конструкций в печень мышей в сравне­ нии с плазмидой pSApo приведены на рисунке 7. Обнаружено, что делеция третьего ин­ трона не сказывается на продолжительности работы перенесенного гена апо А1 (рис. 7).

Однако дополнительная делеция второго интрона приводит к прекращению экспрессии человеческого апо А1 уже на 5 день после начала эксперимента. Полученные результа­ ты свидетельствуют о существовании в пределах второго интрона регуляторных после­ довательностей, обеспечивающих продолжительную работу перенесенного гена апо Ав печени мышей.

Таким образом, в результате данной работы созданы молекулярные конъюгаты, способные эффективно доставлять ДНК в клетки млекопитающих рецептор-опосредо­ ванным эндоцитозом через рецепторы люлиберинов (конъюгат NLS-LHRH), или транс­ ферриновый рецептор (конъюгаты NLS-TSF7 и NLS-TSF12). Созданные молекулярные конъюгаты успешно апробированы на модели суицидальной генотерапии опухолей in vitro и модели регенеративной генотерапии поверхностных повреждений мышей in vivo. Изучены генетические факторы, влияющие на работу перенесенного гидродина­ мическими инъекциями гена апо А1 человека в организме мышей. В частности, уста­ новлена принципиальная важность второго интрона гена апо А1 человека в поддержа­ нии продолжительной (более недели) его экспрессии в печени мышей после гидродина­ мического переноса.

ВЫВОДЫ 1. Катионный пептид NLS, несмотря на формирование комплексов с ДНК, не способен доставлять ДНК в клетки человека in vitro но является перспективным носителем ДНК при разработке на его основе активных молекулярных конъюгатов.

2. Молекулярные конъюгаты на основе аналогов люлиберина (NLSLHRH и Nuk1) и трансферрина (NLS-TSF7) способны к переносу плазмидной ДНК в культивируемые клетки человека рецепторопосредованным эндоцитозом.

3. В модели «суицидной» генотерапии опухолей in vitro конъюгаты NLS-LHRH и Nuk1 оказались эффективным средством направленного переноса гена тимидинкиназы герпесвируса.

4. Локальный перенос комплексов пептида NLS-TSF7 с плазмидным вектором экспрессии инсулиноподобного фактора роста в повреждённые поверхностные ткани мышей ускоряет заживление ран.

5. Продолжительная, не менее двух недель, экспрессия гена аполипопротеина А1 человека после гидродинамического переноса в печень мышей обеспечивается вторым интроном гена.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАНЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ публикации в изданиях, рекомендованных ВАК России 1) Акифьев Б.Н., Диже Э.Б., Ефремов А.М., Могиленко Д.А., Олейникова Г.Н., Лапиков И.А., Жданова О.А., Кидготко О.В., Орлов С.В., Перевозчиков А.П.

Перенос гена человеческого аполипопротеина А-I мышам методом гидродинамических инъекций: факторы, влияющие на эффективность и продолжительность экспрессии гена в печени животного. Молекулярная биология, Т. 38, С. 1076-1084, 2004.

2) Диже Э.Б., Игнатович И.А., Буров С.В., Похвощева А.В., Акифьев Б.Н., Ефремов А.М., Перевозчиков А.П., Орлов С.В. Комплексы ДНК с катионными пептидами: условия формирования и факторы, влияющие на их проникновение в клетки млекопитающих. Биохимия, Т. 71, №. 12, С. 1659-1667, 2006.

3) Ефремов А.М., Буглаева А.О., Орлов С.В., Буров С.В., Игнатович И.А., Диже Э.Б., Шавва В.С., Перевозчиков А.П. Перенос генетических конструкций через трансплацентарный барьер в зародыши мыши. Онтогенез, Т. 41, № 2, С. 94-100, 2010.

4) Ефремов А.М., Духовлинов И.В., Диже Э.Б., Буров С.В., Леко М.В., Акифьев Б.Н., Могиленко Д.А., Иванов И.А., Перевозчиков А.П., Орлов С.В. Невирусная регенеративная генотерапия повреждений кожных покровов млекопитающих.

Цитология, Т. 52, № 5, С. 371-379, 2010.

5) Буров С.В., Яблокова Т.В., Дорош M.Ю., Кривизюк Е.В., Ефремов А.М., Орлов С.В. Аналоги люлиберина, содержащие последовательность ядерной локализации T-антигена вируса SV-40. Биоорганическая химия, Т. 36, № 5, С. 630-637, 2010.

6) Яблокова Т.В., Челушкин П.С., Дорош М.Ю., Ефремов А.М., Орлов С.В., Буров С.В. Синтез аналогов люлиберина и их использование в системах адресной доставки генов. Биоорганическая химия, 38(1), 31-39, 2012.

другие публикации 7) Ефремов А.М., Акифьев Б.Н., Диже Э.Б., Могиленко Д.А., Олейникова Г.Н., Лапиков И.А., Жданова О.Ю., Орлов С.В., Перевозчиков А.П. Влияние структуры гена Аполипопротеина А-I человека на его экспрессию после переноса мышам методом гидродинамических инъекций. Медицинская Иммунология, тезисы IX Конференции «Дни Иммунологии в Санкт-Петербурге», Т. 7, №2-3, 208) Ефремов А.М., Акифьев Б.Н., Диже Э.Б., Могиленко Д.А., Олейникова Г.Н., Лапиков И.А., Жданова О.Ю., Орлов С.В., Перевозчиков А.П. Экспрессия гена Аполипопротеина А-I человека после его переноса мышам методом гидродинамических инъекций. Онтогенез, тезисы докладов XIV школы «Биология развития», Т. 36 №5, 2005.

9) Орлов С.В., Диже Э.Б., Игнатович И.А., Буров С.В., Яблоква Т.В., Ефремов А.М., Акифьев Б.Н., Перевозчиков А.П. Суицидная генотерапия гормон- чувствительных опухолей человека: разработка невирусной системы направленного переноса гена тимидинкиназы вируса простого герпеса первого типа на основе аналогов люлиберинов. Сборник трудов конференции ««Живые системы» в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научнотехнологического комплекса России на 2007-2012 годы», 2010) Иванов И.А., Духовлинов И.В., Буров С.В., Ефремов А.М., Акифьев Б.Н., Диже Э.Б., Могиленко Д.А., Перевозчиков А.П.,Орлов С.В. Система невирусной регенеративной генотерапии поверхностных повреждений тканей человека. Сборник трудов конференции ««Живые системы» в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы», 20 СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1) Иванов И.А. Фармацевтическая композиция для генной терапии заболеваний, требующих стимуляции регенераторных процессов, включая повреждения тканей человека различной этиологии, на основе синтетического модифицированного гена инсулиноподобного фактора роста человека первого типа (ИФР-1, IGF-1). Заявка на изобретение 2007124538/15 от 02.07.2007.

2) Лапиков И.А., Могиленко Д.А., Диже Э.Б., Игнатович И.А., Орлов С.В., Перевозчиков А.П. AP1-подобные цис-элементы в 5'-регуляторной области гена аполипопротеина A-I человека. Молекулярная биология, Т. 42, №2, c. 295-305, 2008.

3) Перевозчиков А.П., Курышев В.Ю., Арредоуани М., Парфенова Н.С., Шавловский М.М., Суконина В.Е., Диже Э.Б., Орлов С.В., Денисенко А.Д., Гайцхоки В.С., Климов А.Н.

Направленный перенос гена аполипопротеина A-I человека и бактериальных геновмаркеров в печень крысы. Доклады РАН, 352, 571-574, 1997.

4) De Geest B., Van Linthout S., Lox M., Collen D., and Holvoet P. Sustained expression of human аpоlipoprotein А1 after adenoviral gene transfer in C57BL/6 mice: role of аpоlipoprotein А1 promoter, аpоlipoprotein А1 introns, and human аpоlipoprotein E enhancer.

Hum.Gene.Ther. 11:101-112, 2000.

5) Gerard R.D., Chan L. Adenovirus-mediated gene transfer: strategies and applications in lipoprotein research. Curr Opin Lipidol. Apr;7(2):105-11, 1996.

6) Gottschalk S., Sparrow J.T., Hauer J., Mims M.P., Leland F.E., Woo S.L., and Smith L.C. A novel DNA-peptide complex for efficient gene transfer and expression in mammalian cells.

Gene Ther 3:448-457, 1996.

7) Ignatovich I.A., Dizhe E.B., Pavlotskaya A.V., Akifiev B.N., Burov S.V., Orlov S.V., Perevozchikov A.P. Complexes of plasmid DNA with basic domain 47-57 of the HIV-1 Tat protein are transferred to mammalian cells by endocytosis-mediated pathways. J Biol Chem 278:42625-42636, 2003.

8) Lee J.H., Engler J.A., Collawn J.F., Moore B.A. Receptor mediated uptake of peptides that bind the human transferring receptor. Eur. J. Biochem., 268:2004-2012, 2001.

9) Liu F., Song Y., and Liu D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther 6:1258-1266, 1999.

10) McVicar J.P., Kunitake S.T., Hamilton R.L., Kan J.P. Characteristics of human lipoproteins isolated by selected-affinity immunosorption of apolipoprotein A-I. Proc Natl Acad Sci U S A.

Mar;81(5):1356-60, 1984.

11) Miao C.H., Thompson A.R., Loeb K., and Ye X. Long-term and therapeutic-level hepatic gene expression of human factor IX after naked plasmid transfer in vivo. Mol Ther 3:947-957, 2001.

12) Molas M., Gomez-Valades A.G., Vidal-Alabro A., Miguel-Turu M., Bermudez J., Bartrons R., Perales,J.C. Receptor-mediated gene transfer vectors:progress toward genetic pharmaceuticals.

Curr. Gene Ther., 3, 468–485, 2003.

13) Nagy A., Schally A.V. Targeting of cytotoxic luteinizing hormone-releasing hormone analogs to breast, ovarian, endometrial, and prostate cancers. 2006. Biol. Reprod. 73:851-814) Schally A.V. Luteinizing hormone-releasing hormone analogs: their impact on the control of tumorigenesis Peptide (Elmsford) 20:1247–1262, 1999.

15) Schally AV, Srkalovic G, Szende B, Redding TW, Janaky T, Juhasz A, Korkut E, Cai RZ, Szepeshazi K, Radulovic S. Antitumor effects of analogs of LH-RH and somatostatin:

experimental and clinical studies. J Steroid Biochem Mol Biol. 1990 Dec 20;37(6):1061-7, 1990.

16) Schmidt-Wolf G.D. and Schmidt-Wolf I.G. Non-viral and hybrid vectors in human gene therapy: an update Trends Mol. Med., 9, 67–72, 2003.

17) Temin H.M. Safety considerations in somatic gene therapy of human disease with retrovirus vectors. Hum Gene Ther 1:111-123, 1990.

18) Widom R.L., Ladias J.A., Kouidou S., and Karathanasis S.K. Synergistic interactions between transcription factors control expression of the аpоlipoprotein AI gene in liver cells. Mol Cell Biol 11:677-687, 1991.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.