WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

ПОТАПОВА ОКСАНА ВАЛЕНТИНОВНА

патоморфологические, МОЛЕКУЛЯРНО-КЛЕТОЧНЫЕ

ОСНОВЫ ПАТОГЕНЕЗА ГРИППА А/H5N1 У МЛЕКОПИТАЮЩИХ

И особенности его развития при ПРОФИЛАКТИКЕ

МОДИФИЦИРОВАННЫМ ДЕКСТРАНОМ

03.03.04 клеточная биология, гистология, цитология

14.03.02 патологическая анатомия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Новосибирск – 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный центр клинической и экспериментальной медицины» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (Новосибирск)

Научный консультант:

Заслуженный деятель науки РФ,

академик РАМН,        

доктор медицинских наук, профессор  Шкурупий Вячеслав Алексеевич

Официальные оппоненты:

руководитель лаборатории

иммунологии репродукции

ФГБУ «НЦКЭМ» СО РАМН

доктор медицинских наук, профессор  Трунов Александр Николаевич

профессор кафедры патологической анатомии

ГБОУ ВПО «НГМУ» Минздрав России

доктор медицинских наук, профессор Агеева Татьяна Августовна

руководитель группы молекулярно-генетических

и морфологических методов исследования

ФГБУ «НИИТО» Минздрав России

доктор медицинских наук, профессор Ларионов Петр Михайлович

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

(ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрав России)

Защита состоится «18» декабря 2012 г. в 10.00 часов на заседании

Диссертационного совета Д 001.048. 01. при ФГБУ «НЦКЭМ» СО РАМН

по адресу: 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2, тел./факс (383) 333-64-56

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НЦКЭМ» СО РАМН

Автореферат разослан «___» _________ 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук                                                Пальчикова Н.А.

Общая характеристика работы



Актуальность темы. Грипп занимает особое место в инфекционной патологии человека, не имея себе равных по распространенности и частоте заболеваний. Особый интерес представляет возбудитель гриппа А/H5N1, характерными особенностями которого является широкая географическая распространенность, высокая патогенность для человека, приводящая к тяжелому заболеванию с высокой смертностью при отсутствии специфического иммунитета в человеческой популяции (To K.F. et al., 2001; Pei F. et al., 2005; Suzuki Y., 2005). По данным ВОЗ на 10 августа 2012 года заболеваемость человека гриппом А/H5N1 зарегистрирована в 58 странах мира, а общее количество вирусологически подтверждённых случаев заболевания людей, вызванного штаммами гриппа А/H5N1, составило 608, из которых 359 (60%) закончились летальным исходом. При этом среди детей до 15 лет летальность при гриппе А/H5N1 достигает 89% (www.who.int/ru/, 2012).

По оценке ВОЗ в связи с высокой изменчивостью вирусов гриппа А/H5N1 и его способностью к прямой передаче от птиц к человеку существует постоянная угроза возникновения пандемии (www.who.int/ru/, 2012).

Несмотря на многочисленные исследования, проведенные за последние 10 лет, механизмы высокой вирулентности новых рекомбинантных высокопатогенных штаммов вируса гриппа А/H5N1 остаются малоизученными. Имеющиеся в современной литературе данные не дают полноценного представления о механизмах развития заболевания и его осложнений, что диктует необходимость дальнейшего изучения патогенетических аспектов, особенно для новых, ранее неисследованных штаммов, в частности, выделенных на территории Российской Федерации.

Комплексное исследование на молекулярно-клеточном уровне структурно-функциональных особенностей клеток органов-мишеней у млекопитающих при гриппе А/H5N1 является необходимым условием для понимания основных механизмов развития вирусной инфекции и важнейших ее патоморфологических проявлений, обусловливающих высокую летальность у людей и животных. Это позволит улучшить проспективное прогнозирование исходов инфекционного заболевания, обусловленного вирусами гриппа А, и одновременно разработать принципиально новые патогенетически обоснованные подходы к профилактике и лечению гриппа А/H5N1 у людей, направленные на снижение риска заболеваемости, уменьшение частоты и тяжести его осложнений.

Высокая антигенная вариабельность, свойственная вирусам гриппа А, отсутствие специфических вакцин, нерациональная фармакотерапия приводят к появлению новых штаммов, резистентных к основным противовирусным препаратам (Cheung C.L. et al., 2006; Menno N. et al., 2006). Все это определяет особую значимость разработок по созданию новых эффективных средств неспецифической профилактики гриппа А, не оказывающих прямого действия на вирус, что исключало бы возможность возникновения лекарственной резистентности.

Такими препаратами являются иммуномодуляторы микробного происхождения, в частности, модифицированные крупномолекулярные полисахариды (окисленные декстраны), которые способны повышать функциональную активность клеток моноцитарно-макрофагальной системы (Шкурупий В.А., 2007). Однако исследований, направленных на изучение эффективности таких препаратов при вирусных инфекциях и, в частности, при гриппе А/H5N1 у млекопитающих и человека не проводили.

На основании вышеизложенного были сформулированы цель и задачи исследования.

Цель исследования: изучить патоморфогенез гриппа А/H5N1 А/goose/Krasnoozerskoye/627/05 у мышей и его молекулярно-клеточные проявления при профилактике модифицированным декстраном.

Задачи исследования:

  1. Исследовать патогенность вируса гриппа А/H5N1 А/goose/Krasnoozerskoye/627/05 для млекопитающих на мышиной модели.
  2. Исследовать топологию вируса в клетках легких, печени, почек, селезенки, головного мозга мышей, инфицированных вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, на разных сроках заболевания методом иммуногистохимии.
  3. Исследовать морфофункциональные и ультраструктурные изменения в органах мышей, инфицированных вирусом гриппа А/H5N1 А/goose/Krasnoozerskoye/627/05, и особенности морфогенеза вирусной инфекции.
  4. Исследовать роль про- и противовоспалительных цитокинов в патогенезе гриппа А/H5N1 по цитокиновому профилю инфицированных мышей в сыворотке крови и в клетках органов в динамике развития вирусной инфекции.
  5. Исследовать молекулярно-клеточные пути реализации клеточной гибели в органах мышей, инфицированных вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05.
  6. Изучить динамику фибротических проявлений в органах инфицированных мышей и молекулярно-клеточные механизмы их регуляции при гриппе А/H5N1.
  7. Сформулировать патогенетическое обоснование профилактики гриппа А/H5N1 модифицированным декстраном (диальдегиддекстраном) на основе полученных данных о патогенезе вирусной инфекции, изучить его профилактическую эффективность для мышей, инфицированных вирусом гриппа А/H5N1 А/goose/Krasnoozerskoye/627/05.
  8. Исследовать особенности иммунологических реакций у мышей, инфицированных вирусом гриппа А/H5N1 А/goose/Krasnoozerskoye/627/05, при профилактике диальдегиддекстраном.
  9. Изучить структурно-функциональные проявления гриппа А/H5N1 в органах инфицированных животных после профилактического введения им диальдегиддекстрана.

Научная новизна. В ходе эксперимента впервые методом иммуногистохимии выявлены особенности топологии вируса гриппа А/H5N1 А/goose/Krasnoozerskoye/627/05 в динамике развития вирусной инфекции. Показана пролонгированная персистенция вируса гриппа А/H5N1 в альвеолоцитах, макрофагах, фибробластах, эндотелиоцитах легких; гепатоцитах, клетках Купфера, синусоидальных эндотелиоцитах печени; мезангиальных и эндотелиальных клетках почек; лимфоцитах, макрофагах синусов и эндотелиоцитах селезенки; нейронах, глиальных и эндотелиальных клетках головного мозга.

Высокая тропность вируса гриппа А к эндотелиоцитам сосудов легких и экстрапульмонарных органов способствует ранней диссеминации вируса и генерализации инфекционного процесса, а также детерминирует структурные изменения микроциркуляторного русла с деструкцией эндотелиальной выстилки сосудов, повышением их проницаемости, тромботическими и геморрагическими осложнениями, создающие условия для острой гипоксии – фактора риска развития в органах ишемии, ведущей к распространенным деструктивным изменениям и полиорганным нарушениям.

Показано, что успешная пролонгированная репликация вируса гриппа А/H5N1 А/goose/Krasnoozerskoye/627/05 в клетках органов инфицированных мышей отчасти обусловлена блокадой интерферонового противовирусного ответа, проявляющейся в снижении уровня эндогенных интерферонов – IFN-, IFN-, что в дальнейшем усугубляется масштабным апоптозом лимфоидных клеток селезенки и тимуса и угнетением лимфоидного ростка костного мозга.

Персистенция вируса гриппа А/H5N1 А/goose/Krasnoozerskoye/627/05 в клетках различного гистогенеза сопряжена с существенной активацией клеточного звена иммунитета, проявляющейся в увеличении экспрессии провоспалительных цитокинов (TNF- и IL-6), лизосомальных гидролаз (лизоцима, катепсина Д, миелопероксидазы), NO-синтаз (eNOS и iNOS), ростовых факторов и их рецепторов (FGF, FGFR, VEGFR) в клетках легких, печени, головного мозга, селезенки. Это является пусковым фактором процессов деструкции, пролиферации, ангиогенеза и раннего фиброзирования в органах инфицированных животных. Высокий уровень пролиферации в рассматриваемых экспериментальных условиях носит двойственный характер: с одной стороны способствует восстановлению утраченных структур, с другой – увеличивает концентрацию новых клеток, необходимых для проникновения, репликации и персистенции вируса гриппа А, способствуя тем самым прогрессированию инфекции.

Показано, что масштабы некроза и апоптоза и их соотношение, а также пути реализации этих процессов в различных органах при гриппе А/H5N1 зависят от длительности развития инфекции и органно-тканевой принадлежности: в печени, почках и головном мозге инфицированных мышей гибель клеток происходит путем некроза, в легких и селезенке в структуре деструктивных изменений преобладает гибель клеток апоптозом. Основными механизмами апоптоза при гриппе А/H5N1 являются: митохондриальный, реализуемый на ранних сроках инфекционного процесса и связанный преимущественно с цитопатическим действием вирусов; рецепторно-опосредованный, обусловленный с гиперсекрецией провоспалительных цитокинов, в частности TNF-, и активацией каспазы-3 через TRAIL – домены.

Персистенция вируса гриппа А/H5N1 в фибробластах органов инфицированных мышей является триггерным фактором инициации их фиброзирования. Прогрессирующее развитие фиброза в органах мышей при гриппе А/H5N1 детерминировано многими факторами: пролонгированной персистенцией вируса в клетках органов, включая макрофаги и фибробласты, блокадой интерферонового ответа, ишемией, инфильтративными изменениями с повышением гидролитического потенциала и избыточной продукцией свободных радикалов в локусах воспаления, гиперцитокинемией. «Дисбаланс» этих процессов в динамике развития вирусной инфекции, видимо, одна из причин раннего фиброза.

Предложено средство (диальдегиддекстран) и патогенетически обосновано его применение для профилактики вирусной инфекции, индуцированной вирусом гриппа А/H5N1. Показана его высокая профилактическая эффективность при экспериментальном инфицировании мышей вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, которая проявляется увеличением средней продолжительности жизни животных на 24,8%, уменьшением летальности в 3,2 раза, уменьшением числа инфицированных клеток различного гистогенеза в органах мышей, прежде всего, макрофагов и фибробластов легких, уменьшением масштабов повреждения паренхиматозных органов, выраженными антифибротическими эффектами.

Механизмы профилактического действия диальдегиддекстрана при гриппе А/H5N1 у мышей опосредованы повышением мощности механизмов естественной резистентности макроорганизма, прежде всего, клеток системы мононуклеарных фагоцитов, проявляющимся повышением уровня IFN-, IFN- за счет усиления интерферон-продуцирующей функции эффекторных клеток, нормализацией дифференцировочного потенциала и баланса между различными ростками костномозгового кроветворения, уменьшением масштабов апоптоза лимфоцитов в органах иммуногенеза, снижением внутриклеточного синтеза провоспалительных цитокинов – TNF-, IL-6, лизосомальных гидролаз (лизоцима, катепсина Д, миелопероксидазы), NO-синтаз, что существенно снижает масштабы гемодинамических, деструктивных, фибротических осложнений.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные существенно дополняют известные сведения о морфопатогенезе гриппа А /H5N1, в том числе вызываемого новым штаммом, дополняют сведения о механизмах развития осложнений вирусной инфекции, свидетельствуют о необходимости поиска новых средств и способов ранней профилактики и лечения гриппа.

Результаты исследования молекулярно-клеточных и патоморфологических особенностей морфогенеза вирусной инфекции, вызываемой новыми штаммами вируса гриппа А/H5N1, могут быть использованы в процессе преподавания патологической физиологии, патологической анатомии, клеточной биологии, курса «инфекционные болезни», послужить основой для разработки средств и способов патогенетически обоснованной профилактики и терапии гриппа А.

Полученные данные о высокой эффективности предложенного средства (диальдегиддекстрана) при профилактики гриппа А/H5N1 А/goose/Krasnoozerskoye/627/05 у мышей могут послужить основой для доклинических испытаний данной субстанции как средства профилактики гриппа А и его осложнений у человека.

Работа выполнена в рамках Федеральной целевой научно-технической программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013гг.», государственный контракт №02.740.11.0709.

Внедрение результатов. Результаты исследования внедрены в учебный процесс в ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава России: на кафедре патологической анатомии лечебного факультета по темам: «Компенсаторно-приспособительные процессы», «Клеточная смерть. Некроз. Апоптоз», «Инфекционные болезни. ОРВИ».

Основные положения, выносимые на защиту:

  1. Высокая патогенность вируса гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 связана с его пролонгированной персистенцией в клетках альвеолярного эпителия, гепатоцитах, нейронах, резидентных макрофагах, фибробластах, эндотелиоцитах сосудов и во внеклеточных пространствах, что обусловлено блокадой интерферонового ответа и детерминирует каскад патологических реакций в морфогенезе гриппа А/H5N1 А/goose/Krasnoozerskoye/627/05 с развитием вазопатического, отечно-деструктивного, гиперпластического и фибропластического синдромов, вследствие которых формируется капиллярно-паренхиматозный блок с развитием острой гипоксии, что определяет масштабные процессы деструкции, реализуемые путем некроза и апоптоза, и инициирует пролиферацию и ускоренную дифференцировку коллагенпродуцирующих клеток с ранним постгипоксическим фиброзированием органов.
  2. Персистенция вируса гриппа А/H5N1 А/goose/Krasnoozerskoye/627/05 в клетках различного гистогенеза сопряжена с активацией клеточного звена иммунитета, проявляющейся в увеличении экспрессии провоспалительных цитокинов (TNF- и IL-6), лизосомальных гидролаз (лизоцима, катепсина Д, миелопероксидазы), NO-синтаз (eNOS и iNOS), металлопротеиназ и их ингибиторов, ростовых факторов и их рецепторов (FGF, FGFR, VEGFR) в клетках легких, печени, головного мозга, селезенки, что приводит к вторичной альтерации тканей органов, расширяя масштабы повреждения органов, и ускоряет процессы пролиферации клеток, приводя к неполноценной репарации тканей с развитием фиброза.
  3. Ддиальдегиддекстран оказывают выраженный профилактический дозозависимый эффект при экспериментальном инфицировании мышей вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, который проявляется увеличением средней продолжительности жизни животных и снижением летальности, уменьшением инфицирующей способности вирусов, снижением масштабов деструктивных и фибротических процессов, что, видимо, обусловлено его иммуномодулирующими свойствами, опосредованными через активацию системы мононуклеарных фагоцитов, способствующими стимуляции интерфероногенеза, снижению синтеза провоспалительных цитокинов, лизосомальных гидролаз, NO-синтаз, что существенно снижает масштабы осложнений – гемодинамических, деструктивных, фибротических.

Апробация работы. Материалы исследований доложены и обсуждены на: Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России за 2007-2012г.г.» (Москва, 2007); The Third European Influenza Conference (Vilamoura, Portugal, 2008); Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России за 2007-2012г.г.» (Москва, 2008); III Съезде Российского общества патологоанатомов (Самара, 2009); IV Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2009); V Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2011); XLIX Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2011); IV Международной Научно-практической конференции молодых ученых "Клинические и теоретические аспекты современной медицины" (Москва, 2012).

Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 25 печатных работ, из которых 11 статей в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки Российской Федерации; 1 Евразийский патент на изобретение.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 389 страницах машинописного текста, включает введение, обзор литературы, описание материала и методов исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, список литературы, приложение. Диссертация иллюстрирована 62 таблицами и 80 рисунками, в том числе микрофотографиями. Список литературы включает 451 источник, в том числе 350 работ зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В качестве инфекционного агента был выбран вирус гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, выделенный из легкого гуся, погибшего во время вспышки гриппа птиц в селе Красноозерское Новосибирской области в сентябре 2005 года. Экспериментальные работы с данным штаммом вируса гриппа A/H5N1 были проведены на базе лаборатории отдела зоонозных инфекций и гриппа ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» (Новосибирск) в соответствии с санитарными правилами безопасности работы с микроорганизмами III – IV групп патогенности и гельминтами (СП 1.2.731 от 25.01.05).

Для проведения экспериментов использовали беспородных белых мышей-самцов 6-8 – недельного возраста (питомник лабораторных животных ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора). Животных содержали в стандартных условиях со свободным доступом к пище и воде. Продолжительность периода адаптации животных к условиям содержания перед проведением эксперимента составила две недели. Исследование проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. № 755), с соблюдением международных принципов Хельсинской декларации. Из эксперимента мышей выводили под эфирным наркозом путем дислокации позвонков в шейном отделе.

Исследование выполнено в трех экспериментах.

Первый эксперимент был направлен на изучение морфогенеза гриппа птиц у беспородных мышей. Для этого было сформировано две группы экспериментальных животных. Мышам контрольной группы, состоявшей из 40 животных, вводили 50 мкл стерильного фосфатного буфера рН=7,2 по 25 мкл в каждый носовой ход. Вторая группа состояла из 60 мышей, которых интраназально инфицировали вирусом гриппа (ВГ) А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 в дозе 10 МЛД50 в 50 мкл фосфатного буфера рН=7,2 по 25 мкл в каждый носовой ход. По 20 животных в каждой группе оставляли для определения средней продолжительности жизни и вычисления процента летальности.

Второй эксперимент был направлен на разработку технологии профилактики гриппа А/H5N1 у млекопитающих с применением окисленной формы декстрана с молекулярной массой 60кДа (диальдегиддекстран, далее ДАД). Выбор данной субстанции обусловлен тем, что при гриппе А/H5N1 происходит угнетение неспецифического противовирусного интерферонового ответа с истощением лимфоидной ткани в центральных и периферических органах иммуногенеза (Pei F. et al., 2005). Помимо этого наблюдали успешную репликацию вирусов в макрофагах с задержкой их апоптоза (Peiris M., 2006). Крупномолекулярные окисленные формы полисахаридов, в частности, ДАД, обладающие иммуномодулирующими свойствами, воздействуют на факторы естественной резистентности – клетки моноцитарно-макрофагальной системы, вызывая повышение их функциональной активности (Шкурупий В.А., 2007). Способ и оптимальную профилактическую дозу определяли экспериментальным путем с учетом разрешенных доз для полисахаридов (Машковский А.Д., 1999). Эффективность оценивали по показателям летальности и средней продолжительности жизни мышей, инфицированных вирусом гриппа А/H5N1. Учитывая генерализованный характер вирусной инфекции, был выбран внутривенный способ введения ДАД.

Для проведения второго эксперимента было сформировано 5 групп по 20 животных, которых инфицировали ВГ А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05. Первая группа служила контролем. Мышам 2, 3, 4 и 5 групп предварительно вводили ДАД в дозах 125мг/кг, 250мг/кг, 500мг/кг и 1000мг/кг, соответственно. Поскольку период после введения декстранов характеризуется фазностью ответа иммунной системы (Шкурупий В.А., 2007) оптимальным было двукратное профилактическое введение препарата с разницей в двое суток, что позволяет получить максимальную стимуляцию иммунной системы на момент заражения (через сутки после второй инъекции).

В третьем эксперименте исследовали эффективность диальдегиддекстрана для профилактики гриппа у млекопитающих и патоморфологические особенности течения вирусной инфекции. Для проведения эксперимента было сформировано 3 опытные группы животных:

Первая группа – контрольная – интактные животные (20 мышей).

Вторая группа (H5N1) состояла из 60 мышей, которых инфицировали ВГ А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 без предварительного введения ДАД.

Третья группа (H5N1+ ДАД) состояла из 60 мышей, которых инфицировали ВГ А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 после профилактического внутривенного введения ДАД в дозе 1000 мг/кг. Доза инфицирования и сроки получения экспериментального материала для светооптического исследования полностью соответствовали условиям первого эксперимента.

В каждом эксперименте определяли летальность в процентах и среднюю продолжительность жизни (СПЖ) инфицированных животных. Для определения СПЖ находили среднее арифметическое от продолжительностей жизни в сутках всех экспериментальных мышей, причем продолжительность жизни выживших считали равной 14 суткам. Летальность выражали как частоту смертей (%) особей от общего числа мышей, инфицированных вирусом гриппа А/H5N1.

Для исследования цитокинового профиля в динамике заболевания определяли уровни сывороточных цитокинов: TNF-, эндогенных интерферонов IFN-, IFN-, IFN- с применением метода иммуноферментного анализа (ИФА) по следующей методике. Образцы сыворотки в объеме 200 мкл инкубировали 1 час при +37°С при непрерывном встряхивании с последующим промыванием буфером и дистиллированной водой. Инкубировали с вторичными антителами, также 1 час при +37°С. Индикаторным компонентом являлся конъюгат пероксидазы со стрептавидином, при этом измеряли активность связанной пероксидазы с использованием автоматического фотометра для микропланшетов.

Во всех экспериментах для светооптического исследования образцы тканей органов (легких, печени, почек, головного мозга, селезенки) лабораторных животных, инфицированных вирусом гриппа А/H5N1, получали через 1, 3, 6 и 10 сутки от момента инфицирования от 10 животных на каждом сроке. Животных контрольной группы выводили из эксперимента на 1 и 10 сутки. От них получали образцы тканей из тех же органов.

Объектами морфологических исследований служили образцы тканей легких, печени, почек, головного мозга и селезенки экспериментальных животных. Для светооптического исследования образцы фиксировали в 10% растворе формалина, далее обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации и заключали в парафиновую заливочную смесь «HISTAMIX» (Россия). Срезы толщиной 4-5 мкм готовили на ротационном микротоме НМ355S (“Microm”, Германия). От каждого объекта изготавливали по 5-8 микроскопических срезов. Для изучения использовали следующие гистохимимческие окраски: на фибрин по Вейгерту, пирокрофуксином по ван Гизон (Пирс Э., 1962), азотнокислым серебром, орсеином. После окрашивания препараты помещали в заключающую среду BioMaunt («BioVitrum», Россия). От каждого объекта изготавливали по 5-6 микроскопических срезов.

Для исследования топологии вируса гриппа А/H5N1 в динамике заболевания использовали ИГХ-метод, который основан на связывании антитела InfA («Abcam») с антигеном вируса гриппа А на поверхности или внутри микроорганизмов. В качестве контроля использовали нативную ткань, которую предварительно депарафинизировали стандартным методом.

Проводили ИГХ-исследование с использованием непрямого AEC (стрептавидин-пероксидазного) метода с применением специфических первичных антител (табл.1).

Таблица 1

Список первичных антител на исследуемые маркеры

Название антитела (производитель)

Характеристика

Разведение

Cathepsin D (DBS)

Myeloperoxidase (DBS)

Lysozyme (DBS)

Оценка лизосомального синтеза клетками органов-мишеней

1:100

1:100

1:50

iNOS (Spring BioScience)

eNOS (Abcam)

Оценка экспрессии клетками исследуемых органов различных изоформ NO-синтаз, которые посредством радикалов NO блокируют электрон-транспортные группы вируса

1:100

1:130

TNF-α (DBS)

IL-6 (Novocastra)

Оценка численной плотности клеток, экспрессирующих провосполительные цитокины

1:100

1:50

CD-1α (Spring BioScience)

CD-4 (Spring BioScience)

CD-8 (Abcam)

CD-68 (DBS)

Fibroblast (DBS)

Маркеры фенотипирования дендритных клеток, лимфоцитов, макрофагов и многоядерных клеток, фибробластов клеточных инфильтратов для исследования клеточного состава инфильтратов в строме органов-мишеней

1:80

1:50

1:25

1:100

1:25

PCNA (Novocastra)

Оценка пролиферативной и репаративной активности компетентных клеток

1:200

Сaspase-3 (Abcam)

Сaspase- (Abcam)

TRAIL (Novocastra)

Granzim B (Spring BioScience)

Оценка путей реализации клеточной гибели компетентных клеток

1:100

1:100

1:100

1:100

CD-31 (BioCare Medicine)

CD-34 (Spring BioScience)

Эндотелиальный клеточный маркер,

маркер стволовых клеток, адгезии и новообразованных сосудов

1:200

1:100

Inf A (Abcam)

Оценки репликации вируса гриппа А в клетках

1:120

VEGFR (Spring Bioscience)

FGF-b (Abcam)

FGFR-1 (Spring Bioscience)

Маркер рецептора фактора роста сосудов

Маркеры фактора роста фибробластов

и его рецептора

1:100

1:500

1:50

MMP-2(Spring Bioscience)

MMP-9 (Spring Bioscience)

MMP-10 (Spring Bioscience)

TIMP-2 (Spring Bioscience)

Определение экспрессии матриксных металлопротеиназ и их ингибитора

1:100

1:50

1:50

1:100





Для проведения ИГХ-исследования срезы легких толщиной в 3 мкм подвергали депарафинизации, регидратации, демаскировке антигенов в микроволновой печи мощностью 700W, в течение 20-25 минут. Затем, после однократного промывания в дистиллированной воде и фосфатном буфере (PBS), производили блокирование эндогенной пероксидазы в течение 5 минут. Время экспозиции с первичными антителами составляло 30–45 минут при температуре 37°С. Срезы инкубировали со стрептавидин-пероксидазным комплексом, DAB-субстратом и дополнительно докрашивали гематоксилином Майера. Для визуализации была применена система детекции NovoLink (Novocastra).

Анализ гистологических препаратов проводили на микроскопе AxioImager A1 c фотокамерой AxioCam MRc5 («Carl Zeiss», Германия). Морфометрию структурных элементов тканей осуществляли с помощью закрытой тест системы из 100 точек площадью 3,64х105 мкм2 (при определении численной и/или объемной плотностей структур) (Автандилов Г.Г., 1990) и инструментов программы AxioVision (rel. 4.8).

При оценке характера и степени выраженности структурных изменений в органах-мишенях учитывали численную плотность (Nai) клеток, экспрессирующих исследуемые маркеры (табл.3), объемную плотность (Vv) и клеточный состав инфильтратов, объемную (Vv) и численную (Nai) плотность сосудов микроциркуляторного русла, долю тромбированных сосудов (%), объемную плотность (Vv) кровоизлияний, oбъемную (Vv) плотность фиброзной ткани: коллагеновых, эластических и ретикулярных волокон. Расчет «фибропластической активности» проводили по соотношению объемной плотности коллагеновых волокон, приходящихся на один фибробласт (Шкурупий В.А., 2007) в закрытой тестовой системе.

Статистический анализ результатов выполняли с использованием пакета статистического анализа Microsoft Office Excel 2007 и стандартного пакета программ STATISTICA v.6. Определяли средние арифметические величины (M), стандартную ошибку средней величины (m). Для выявления вероятности достоверности различий сравниваемых средних величин применяли t-критерий Стьюдента. Статистически значимыми считали различия при 5% уровне значимости (р<0,05). Корреляционный анализ Пирсона применялся для нахождения связей (зависимостей) между нормально распределенными количественными признаками. Сила предполагаемой взаимосвязи между величинами определялась по значению коэффициента корреляции (Петри А., Сэбин К., 2003).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Исследование патогенности для млекопитающих (по показателю летальности и средней продолжительности жизни) штамма вируса гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05

При исследовании патогенности ВГ А/Н5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 для мышей при дозе в 10МЛД50 наблюдали гибель животных, начиная с 7 суток после инфицирования. По окончании срока наблюдения летальность инфицированных животных составила 75% при показателе средней продолжительности жизни животных – 9,4 суток. Гибели интактных мышей не наблюдали. Полученные данные указывают на высокую патогенность исследуемого штамма ВГ А/H5N1 для мышей, показанную также в ранее проведенных исследованиях (Шестопалов А.M. и др., 2008).

Патогенность ВГ определяется уникальными свойствами вирусов, обусловливающими нейротропность, эффективность репликации, как в лёгких, так и в других органах. В связи с этим были изучены особенности топологии ВГ А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 в органах-мишенях инфицированных мышей в динамике инфекционного процесса.

3.2 Особенности топологии вируса гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 в органах млекопитающих в динамике инфекционного процесса

При исследовании образцов органов с помощью ИГХ-анализа с использованием Inf A – антитела к антигену ВГ А – уже через сутки после инфицирования выявляли белок ВГА в клетках всех исследуемых органов. Динамика изменений численной плотности Inf A+ клеток органов представлена на рисунке 1.

Рис. 1 Численная плотность Inf A+ клеток в органах мышей, инфицированных

ВГ А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05

Поскольку адгезия вирусов гриппа А и их проникновение в клетки макроорганизма связаны с наличием на их поверхности определенного типа рецепторов сиаловых кислот (Russell R.J. et al., 2008), первичными клетками-мишенями для ВГ А/Н5N1 являются альвеолоциты, располагающие этими рецепторами, о чем свидетельствовали высокие значения показателя численной плотности Inf A+ альвеолоцитов в 1 и 3 сутки после инфицирования с последующим уменьшением к 10 суткам в 2 раза.

Следует отметить, что во все сроки наблюдения из всех типов инфицированных клеток органов наибольшая частота репликации ВГ А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 была зарегистрирована в эндотелиоцитах сосудов. Наличие вирусного антигена в эндотелии сосудов всех органов доказывает его выраженную эндотелиотропность, что может обусловливать успешную диссеминацию ВГ А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 и раннюю генерализацию процесса с эффективной репликацией ВГ в высокоспециализированных клетках экстрапульмонарных органов с поражением всех систем макроорганизма.

Вторыми по частоте инфицирования были клетки системы мононуклеарных фагоцитов.

Увеличение количества Inf A+ эндотелиоцитов сосудов в органах с 1 по 3 сутки эксперимента свидетельствует об успешной репликации ВГ А/H5N1 в альвеолоцитах и высвобождении их в кровяное русло с развитием виремии и ранней генерализацией процесса. На это указывало увеличение численной плотности Inf A+ специализированных клеток органов с 1 по 3 сутки эксперимента. Количество инфицированных макрофагов также было максимальным на 3 сутки эксперимента.

В период с 3 по 10 сутки эксперимента наблюдали уменьшение численной плотности содержащих вирусный антиген клеток всех типов в 2 и более раза, что свидетельствует о частичной элиминации вируса, возможно, за счет деструкции клеток, в том числе путем апоптоза, при репликации ВГ. При этом наименьшую скорость снижения величины данного показателя отмечали для эндотелиальных клеток, что, по-видимому, связано с продолжающейся циркуляцией вируса в крови экспериментальных животных. Снижение показателя численной плотности Inf A+ макрофагов может быть относительным за счет формирования многоядерных клеток путем слияния макрофагов, а так же за счет разрушения макрофагов в процессе репликации в них ВГ А/H5N1.

Таким образом, исследование тканевых структур легких, печени, почек, селезенки мышей, экспериментально зараженных ВГ А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, выявило наличие большого количества вируса в тканевых структурах органов на всех сроках эксперимента и способность использованного штамма эффективно реплицироваться не только в легких, но в экстрапульмонарных органах беспородных мышей. Достаточно значимая концентрация Inf A+ клеток в головном мозге свидетельствует о его высокой нейротропности, что также может быть одной из причин высокой патогенности данного штамма ВГ А/H5N1. Ранняя репликация во всех органах может быть обусловлена и эндотелиотропностью ВГ А/H5N1 с ранней диссеминацией ВГ и генерализацией процесса.

Следует также принять во внимание, что персистенция вируса, хотя и в существенно меньшем количестве клеток, сохранялась на 10 сутки эксперимента, когда клинически наблюдали начальные признаки выздоровления.

Для исследования возможных механизмов развития инфекционного процесса было проведено изучение образцов органов экспериментально зараженных мышей на тканевом, молекулярно-клеточном и субклеточном уровнях.

3.3 Патоморфологические особенности развития инфекционного процесса в органах млекопитающих, инфицированных вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05

При гистологическом исследовании образцов легких экспериментальных животных регистрировали признаки острого респираторного повреждения легких: паретическое расширение сосудов с тромбозом микроциркуляторного русла, множественные кровоизлияния, интерстициальный и альвеолярный отек легких, многочисленные воспалительные инфильтраты в интерстиции, участки некроза с формированием очагов острой эмфиземы, прогрессирующий перибронхиальный и периваскулярный фиброз.

При морфометрическом анализе полученных образцов легких с 1 по 3 сутки регистрировали увеличение численной и объемной плотности сосудов на 16,4% и 23,4%, соответственно, что было связано с прогрессированием фибриноидных изменений в стенке сосудов и, одновременно, активацией процессов неоангиогенеза (более 30% визуализируемых сосудов были представлена новообразованными CD34+ сосудами). Об активации неоангиогенеза свидетельствовало и увеличение с 1 по 10 сутки в 2,5 раза количества эндотелиальных клеток, на мембране которых регистрировали экспрессию VEGFR (рис.2). Однако, по-видимому, их доля была недостаточной для эффективного восстановления трофики органов (об этом свидетельствовали деструктивные процессы в органах макроорганизма). Численная доля тромбированных сосудов составила на 3 сутки после инфицирования 21,87% от общей численной плотности сосудов в легочной ткани и была в 2 раза выше по сравнению с величиной аналогичного параметра в 1 сутки после заражения. В период с 3 по 10 сутки развития инфекционного процесса уменьшение величины данного показателя составило 27%. Объемная плотность кровоизлияний в интерстиций легкого к 10 суткам была в 4 раза большей, чем на первые сутки. Это свидетельствует о повреждении стенки сосудов в результате фибриноидного некроза, приводящем к повышению их проницаемости.

Рис. 2. Патоморфологические изменения в легких мышей, инфицированных ВГ А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05

Объемная плотность инфильтратов в интерстиции легких была высокой уже на первые сутки после инфицирования с последующим увеличением величины данного параметра к 10 суткам на 48%.

При ИГХ-исследовании клеточного состава инфильтратов отмечали преобладание (выше 80%) CD68+клеток – макрофагов. Также наблюдали CD68+многоядерные клетки. Численная плотность таких клеток увеличивалась с 1 по 6 сутки в 1,6 раза с последующим уменьшением к 10 суткам. Поскольку многоядерные клетки экспрессировали молекулярный маркер, характерный для клеток макрофагального ряда, можно предположить, что происходит задержка апоптоза инфицированных клеток.

Клетки, составляющие от 15% до 18% от общего числа клеток инфильтратов у инфицированных мышей, были представлены преимущественно CD8+-лимфоцитами (супрессоры/цитотоксические лимфоциты), в то время как у животных контрольной группы единичные лимфоциты, встречающиеся в альвеолярных перегородках, имели положительное окрашивание с CD4+ (хелперы). Таким образом, в составе инфильтратов в легких инфицированных мышей преобладали клетки, обладающие цитотоксическим потенциалом – цитотоксические лимфоциты и активированные макрофаги, что создало в локусах воспаления высокий уровень провоспалительных цитокинов и лизосомальных гидролаз, приводящих к альтерации легочной ткани. Следует особо отметить, что уже с 3 суток развития инфекционного процесса в инфильтратах увеличивалось количество фибробластов. Это, отчасти, детерминировало прогрессирование фибротических осложнений: величина показателя объемной плотности фиброзной ткани в легких мышей увеличилась в период с 1 по 3 сутки после инфицирования в 4,1 раза, в период с 3 по 10 сутки – в 3 раза (рис.2).

При светооптическом исследовании в паренхиме печени инфицированных животных в первые шесть суток обнаружены паретическое расширение и полнокровие крупных вен и синусоидов с явлениями стаза и гемолиза эритроцитов, фибриноидные изменения в сосудистой стенке. C первых суток после заражения отмечали дистрофические изменения гепатоцитов, которые были представлены гидропической дистрофией с переходом в балонную. Зоны некроза наблюдали преимущественно центролобулярно. Объемная плотность деструктивных изменений в печени на 6 сутки после инфицирования была максимальной и составила 93,78%, что свидетельствует о субтотальном повреждении гепатоцитов и развитии печеночной недостаточности. К 10 суткам от начала эксперимента величина данного показателя уменьшилась на 17,6%, оставаясь на высоком уровне (рис.3).

Рис. 3. Патоморфологические изменения в печени мышей, инфицированных ВГ А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05

Помимо деструктивных изменений оценивали репаративную активность паренхимы печени, показателем которой служила численная плотность двуядерных гепатоцитов и экспрессия маркера пролиферации PCNA в ядрах паренхиматозных клеток.

В группе инфицированных животных в первые сутки после заражения численная плотность двуядерных гепатоцитов была почти в 5 раз меньше по сравнению с величиной аналогичного параметра у мышей контрольной группы, что свидетельствует о резком угнетении репаративных процессов. В период с 1 по 6 сутки численная плотность двуядерных гепатоцитов продолжала снижаться, однако, с 6 по 10 сутки после инфицирования регистрировали увеличение данного параметра в 8 раз (рис.3), что свидетельствует об активации регенераторных процессов у выживших животных. Об активации пролиферативных процессов свидетельствовало и возрастание количества PCNA+гепатоцитов с 1 по 10 сутки инфекционного процесса в 6,2 раза (рис.3). Эти изменения в паренхиме печени, видимо, обусловили относительное уменьшение доли деструктивно измененных гепатоцитов к 10 суткам развития воспаления.

Таким образом, проведенные исследования показали, что в патогенезе изменений в печени при вирусной инфекции, вызванной ВГП, преобладают деструктивные изменения с угнетением клеточного звена иммунного ответа и репаративных процессов.

В почках ведущим патоморфологическим признаком были структурные проявления гемодинамических нарушений, которые наблюдали в виде паретического расширения сосудов с тромбозом микроциркуляторного русла. Показатель численной плотности сосудов в интерстиции в период с первых до третьих суток после инфицирования животных уменьшился на 15%, что связано с увеличением диаметра сосудов в эти же сроки эксперимента на 34,8% из-за фибриноидных изменений. Гемоциркуляторные нарушения и ишемия определяют выраженные дистрофические изменения в эпителии проксимальных канальцев, регистрируемые с первых суток после заражения, которые были представлены гидропической дистрофией с переходом в балонную и формированием очагов некронефроза. Объемная плотность деструктивных изменений в почках была максимальной на 6 сутки инфицирования и составила 82,5% с последующим уменьшением величины данного показателя к 10 суткам на 15% (рис.4), что, связано с восстановлением гемодинамики в паренхиме почек, связанное с активацией ангтогенеза. С 3 по 10 сутки после инфицирования регистрировали увеличение численной плотности капилляров микроциркуляторного русла на 41,5%. При этом величина данного показателя увеличилась за счет новообразованных сосудов с тонкими стенками, что коррелировало с увеличением количества VEGFR+эндотелиальных клеток с 3 по 10 сутки заболевания в 3,4 раза (рис.4)

Рис. 4. Патоморфологические изменения в почках мышей, инфицированных ВГ А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05

В ответ на ишемию происходила активация фибропластических процессов с развитием периваскулярного фиброза, величина показателя объемной плотности фиброзной ткани в период со 1 по 10 сутки после инфицирования увеличилась в 2,8 раза (рис.4).

Таким образом, инфицирование мышей ВГ А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 сопровождается развитием острого тубулонекроза, связанного, прежде всего, с гемодинамическими нарушениями, наблюдаемыми при гриппе А.

При гистологическом исследовании в головном мозге мышей, инфицированных ВГ А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, в мягкой мозговой оболочке отмечали признаки серозного лептоменингита в виде отека и скоплений единичных лимфоцитов. Одним из ведущих патоморфологических признаков вирусного поражения центральной нервной системы при гриппе А/H5N1 является отечно-деструктивный синдром, связанный с ранними гемоциркуляторными нарушениями. Начиная с 3 суток, в ткани головного мозга инфицированных мышей отмечали явления неоангиогенеза с увеличением численной плотности сосудов к 10 суткам заболевания на 25,6% (рис.5) преимущественно за счет CD34+капилляров. Количество VEGFR+эндотелиоцитов с 1 по 10 сутки эксперимента увеличилось в 6,5 раз. На фоне развивающейся сосудистой ишемии в ткани головного мозга были выражены нарастающий перицеллюлярный и периваскулярный отек, мультифокальные очаги ишемических некрозов. Величина показателя объемной плотности деструктивных изменений с 1 по 6 сутки инфицирования возросла в 3,5 раза с последующим уменьшением к 10 суткам на 19% (рис.5).

Рис. 5. Патоморфологические изменения в головном мозге мышей, инфицированных ВГ А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05

При изучении патоморфологических особенностей органов иммуногенеза у мышей, инфицированных ВГ А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, в динамике развития вирусной инфекции наблюдали активацию костномозгового кроветворения, обусловленную, вероятно, гиперсекрецией провоспалительных хемокинов и цитокинов (IL-1, IL-6, TNF-), обладающих гемопоэз-стимулирующим эффектом. В костном мозге инфицированных мышей с 1 по 3 сутки после заражения происходила активация миелоидного ростка кроветворения, которая характеризовалась увеличением численности ранних предшественников (недифференцированных бластов, миелобластов, промиелоцитов и миелоцитов). Одновременно отмечали снижение относительного количества зрелых клеток (нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов), что, вероятно, связано с их «выходом» на «периферию», на что указывает распространенные инфильтративные изменения в паренхиме внутренних органов, наиболее выраженные в легких мышей. На более поздних сроках (6 и 10 сутки после инфицирования) относительное содержание зрелых нейтрофилов в костном мозге практически достигает контрольных величин, а число лимфоцитов – остается ниже контроля. Снижение относительного числа лимфоцитов, вероятно, можно объяснить с низкой дифференцировочной активностью миелоидного ростка в сторону лимфоидных клеток, а также с TNF-индуцированным апоптозом лимфоцитов в органах иммуногенеза (селезенке и тимусе), который регистрировали при ИГХ-исследовании образцов данных органов.

При морфометрическом исследовании в селезенке уже через сутки после заражения отмечали снижение количества лимфоцитов в герминативной зоне фолликулов и в периартериальных зонах с последующим прогрессирующим истощением лимфоидной ткани. Величина показателя численной плотности фолликулов с 1 по 10 сутки развития инфекционного процесса уменьшилась в 2,2 раза с одновременным уменьшением диаметров фолликулов на 45% в эти же сроки наблюдения. Герминтативные центры в фолликулах практически не визуализировали. При иммуногистохимическом исследовании было показано одновременное уменьшение CD4/CD8 лимфоцитов более, чем на 50%., в большей степени связанное с апоптозом лимфоцитов. В цитоплазме лимфоцитов на всех сроках наблюдения отмечали положительную реакцию с моноклональными антителами к caspase-3 – индуктору апоптоза - количество иммунопозитивных клеток лимфоидного ряда увеличилось в 1,7 раза (с 114,5 до 199,53). Вместе с апоптотическими изменениями в паренхиме селезенки визуализировали очаги некроза. Объемная плотность деструктивных процессов нарастала с 1 по 10 сутки в 3 раза (рис.6).

Рис. 6. Патоморфологические изменения в селезенке мышей, инфицированных ВГ А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05

В расширенных синусоидах наблюдали гемостаз, скопления нейтрофилов, гиперплазию клеток макрофагального ряда. С 1 по 10 сутки инфекционного процесса количество иммунопозитивных CD68+клеток увеличилось в 1,7 раза (рис.6). Также в синусоидах наблюдали гигантские CD68+многоядерные клетки (рис.6), численная плотность которых с 3 по 10 сутки развития болезни возросла в 2,1 раза. Полученные данные свидетельствуют о развитии гемофагоцитарного синдрома при гриппе А, который, вероятно, был связан с блокадой каспазо-зависимого апоптоза макрофагов, инфицированных ВГ А/H5N1. На это указывает и данные ИГХ-анализа – в CD68+гигантских клетки экспрессию маркера апоптоза не наблюдали. В динамике развития инфекционного процесса в селезенке регистрировали фибротические осложнения: разрастание фиброзной ткани наблюдали преимущественно в периваскулярных зонах. Величина показателя объемной плотности фиброзной ткани в период с 1 по 10 сутки после инфицирования ВГ А/H5N1 увеличилась в 5 раз (рис.6).

Особенности морфогенеза гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05

Обобщая полученные данные по исследованию структурных изменений в органах экспериментальных животных, инфицированных ВГ А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, в морфогенезе вирусной инфекции можно выделить ведущие патоморфологические признаки (синдромы):

1. Вазопатический, представленный гемодинамическими нарушениями в органах с многочисленными кровоизлияниями и явлениями гиперкоагуляции и тромбоза микроциркуляторного русла по типу синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания, которые приводят к недостаточности кровоснабжения и ишемии тканей органов.

2. Деструктивный, характеризующийся распространенными дистрофическими и некротическимипроцессами, обусловленными персистенцией ВГ А/H5N1 в клетках органах и его цитопатическим действием, гемодинамическими нарушениями и цитотоксическими повреждениями, вызванными реакцией клеточного звена иммунитета мышей на проникновение ВГ А/H5N1. Это обусловливает проявления полиорганных нарушений, которые наблюдали в клинической картине заболевания с явлениями острой дыхательной недостаточности, гепато-ренального синдрома, церебральных нарушений, приводящих к высокой летальности животных (85%). Истощение лимфоидной ткани в центральных и периферических органах иммуногенеза (селезенка, тимус), связанная с индукцией апоптоза в лимфоцитах, что ведет к угнетению клеточного звена иммунитета.

3. Гиперпластический, выраженный гиперплазией альвеолоцитов, гепатоцитов, глиоцитов и эндотелиоцитов, новообразованием капилляров; гиперплазией клеток системы мононуклеарных фагоцитов с образованием многоядерных (полиплоидных) макрофагов и развитием гемофагоцитарного синдрома, что, возможно, приводит к успешной репликации вируса с его последующей диссеминацией.

4. Фибропластический, обусловленный ранней активацией фибропластических процессов с развитием фибротических осложнений в органах мышей, преимущественно в легких.

3.4. Молекулярно - клеточные основы патогенеза гриппа А/H5N1 у млекопитающих

Исследование цитокинового профиля в сыворотке крови и клетках органов инфицированных мышей

В исследовании были изучены профили цитокинов – TNF-, эндогенных интерферонов – IFN-, IFN- – в сыворотке крови экспериментальных животных с применением метода иммуноферментного анализа (ИФА) Уровень IFN- у мышей, инфицированных ВГ А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, был повышен на 1 сутки после инфицирования со снижением к 3 суткам в 2 раза. На 6 сутки наблюдали повторное повышение уровня IFN-, который на 10 сутки не отличался от величины аналогичного параметра в контрольной группе. Значительное снижение уровня IFN- в крови мышей на 3 сутки может быть обусловлено TNF-индуцированным апоптозом лимфоцитов. Уровень TNF- у инфицированных мышей был достоверно выше по сравнению с величиной аналогичного параметра в контроле на всех сроках наблюдения. При этом отмечали его повышение с 1 по 3 сутки после заражения в 1,6 раза с последующим снижением на 24% (рис.7).

Рис. 7. Уровни концентрации эндогенных интерферонов IFN-, IFN- и цитокина TNF- в сыворотке крови мышей, инфицированных ВГ А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05

Были изучены профили цитокинов – TNF-, IL-6 – в органах мышей на 1, 3, 6, 10 сутки после инфицирования. Исследование показало экспрессию обоих цитокинов в клетках различного гистогенеза в исследуемых органах на всех сроках наблюдения. При этом отмечено, что в 1 сутки после инфицирования наибольшее количество клеток, экспрессирующих TNF- и IL-6, было представлено альвеолоцитами, эндотелиоцитами и макрофагами легких мышей. Вероятно, репликация ВГ А/Н5N1 в клетках легких выступает инициатором острой фазы воспаления (рис.8). Наибольшего значения величины показателей численной плотности IL-6+ клеток во всех органах достигало на 3 сутки, TNF-+ клеток на 6 сутки после инфицирования. На 10 сутки хоть и регистрировали уменьшение величин исследуемых параметров, но их значения значительно превышали значения аналогичных параметров в контрольной группе. Из полученных результатов следует, что высокая патогенность ВГ A/H5N1 для мышей связана с цитотоксическими эффектами самих вирусов и с длительной гиперпродукцией провоспалительных цитокинов в ответ на инфицирование, приводящей к усугублению нарушений кровообращения с явлениями гиперкоагуляции и увеличению цитотоксического потенциала макрофагов.

Рис. 8. Экспрессия провоспалительных цитокинов в тканях внутренних органов мышей, инфицированных ВГ А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05

Исследование кислород-независимых факторов защиты клеток органов мышей после инфицирования ВГ А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05

Для оценки гидролитического потенциала клеток органов мышей, инфицированных ВГ A/H5N1A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, и роли кислород-независимых факторов неспецифической защиты организма при гриппе A/H5N1 было проведено ИГХ-исследование с моноклональными антителами к лизоциму, катепсину Д и миелопероксидазе. Экспрессию исследуемых маркеров наблюдали в клетках всех органов, а их количество на всех сроках исследования в несколько раз превосходила значения аналогичных параметров в контрольной группе (рис. 9). Несмотря на то, что через сутки после инфицирования большинство визуализируемых InfA+клеток были представлены эндотелиоцитами, максимальная концентрация клеток, экспрессирующих лизосомальные гидролазы, была в популяциях клеток системы мононуклеарных фагоцитов (макрофагах легких, клетках Купфера, макрофагах селезенки) и альвеолоцитах. Таким образом, полученные данные позволяют предполагать, что инфицирование мышей ВГ А/Н5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 ведет к ранней (1-3 сутки заболевания) активации кислород-независимых факторов защиты в клетках различного гистогенеза. Высокий гидролитический потенциал клеток играет двойственную роль в патогенезе гриппа A/H5N1. С одной стороны, это является фактором неспецифической защиты клеток, способствующим элиминации вирусов, с другой – может стать триггерным моментом в инициации некроза собственных клеток макроорганизма с развитием распространенных деструктивных осложнений в органах.

Рис. 9. Экспрессия Lysozyme, Cathepsin D и Myeloperoxidase в органах мышей, инфицированных ВГ А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05

Исследование кислород-зависимых факторов защиты клеток органов мышей при гриппе А/H5N1

Для определения роли кислород-зависимых факторов защиты в патогенезе гриппа A/H5N1 у мышей, инфицированных ВГ A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, было проведено ИГХ-исследование образцов органов с моноклональными антителами к iNOS и eNOS. Экспрессию исследуемых маркеров наблюдали в клетках всех органов инфицированных мышей, а их количество на всех сроках исследования в несколько раз превосходила значения аналогичных параметров в контрольной группе (рис. 10) и имело наибольшие значения в легких животных.

Количество клеток, в цитоплазме которых регистрировали экспрессию eNOS, было максималь-ным в 1 сутки эксперимента и по сравнению с контролем было большим в легких – в 5 раз, в печени – в 6,1 раза, головном мозге – в 3,8 раза, селезенке – в 3,9 раза. При этом большинство клеток было представлено эндотелиоцитами сосудов органов. К 6 суткам эксперимента концентрация клеток, экс-прессирующих еNOS уменьшалась во всех исследуемых органах в 1,2-1,5 раза (рис.10). Это, возможно, может быть связано с «переключением» на продукцию iNOS, как более сильного индуктора оксида азота. К 10 суткам инфекционного процесса значимого снижения величин данного показателя не происходило, что может быть обусловлено уменьшением числа InfА+ клеток в органах инфицированных мышей. Возможно, поддержание на постоянном уровне количества eNOS+ клеток сопряжено либо с элиминацией клеток с вирусом, либо с элиминацией вируса из клеток.

Рис. 10. Экспрессия NO-синтаз в органах мышей, инфицированных ВГ А/H5N1

В проявлениях экспрессии eNOS и iNOS исследованными клетками проявлялась закономерность. Экспрессия eNOS была максимальной на первых этапах формирования ответной реакции на инфицирование и была большей, чем iNOS. Экспрессия последней в макрофагах легких, печени и селезенки, а также альвеолоцитах и эндотелиоцитах сосудов легких и головного мозга усиливалась по мере снижения экспрессии eNOS: с 1 по 6 сутки инфекционного процесса в органах инфицированных мышей наблюдали увеличение количества iNOS-иммунопозитивных клеток в легких – в 3,6 раза, в печени – в 8 раз, головном мозге – в 3,2 раза, селезенке – в 8 раз. С 6 по 10 сутки происходило снижение величины данного параметра в печени и селезенке, менее выраженное уменьшение наблюдали в легких и головном мозге (рис.10). Наибольшая экспрессия NO-синтаз в легких инфицированных животных во все сроки наблюдения показала, что кислород-зависимые механизмы являются наиболее предпочтительными для эффективной противовирусной защиты в легких. С другой стороны, избыточная выработка продуктов перекисного окисления ведет к дестабилизации клеточных мембран и повреждению легочной ткани.

Пути реализации гибели клеток и их роль в морфогенезе инфекционного процесса

При проведении световой микроскопии в органах мышей, инфицированных ВГ A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, регистрировали распространенные деструктивные изменения, представленные участками некроза и апоптоза.

В структуре деструктивных изменений в легких превалировали апоптотические изменения: количество caspase-3+ клеток уже на 1 сутки после инфицирования было в 17,3 раза выше по сравнению с контрольными величинами, с 1 по 10 сутки инфекционного процесса величина данного показателя возросла в 2,6 раза.

При этом в структуре апоптоза в легких мышей, инфицированных ВГ А/H5N1, на ранних сроках заболевания с 1 по 3 сутки преобладающим был митохондриальный путь реализации через активацию каспазы-9, что в большей степени связано, с цитопатическим действием вирусов.

Концентрация caspase-9+ клеток легких с 1 по 3 сутки инфекционного процесса увеличилась в 2,2 раза с последующим снижением к 10 суткам на 70% (рис.11).

Рис. 11. Экспрессия маркеров апоптоза в клетках

легких мышей, инфицированных ВГ А/H5N1

Снижение было обусловлено переключением на рецепторно-плазмолеммный путь реализации апоптоза клеток легких через активацию доменов смерти TRAIL. Количество TRAIL+ клеток в легких инфицированных мышей увеличилось в 2 раза и коррелировало с повышением уровня TNF- в клетках легких в эти же сроки заболевания, что может служить свидетельствовалом о реализации прокаспазного механизма клеточной гибели, связанного с гиперцитокинемией.

Свой вклад в инициацию апоптоза в легких инфицированных мышей вносят цитотоксичиеские CD8+лимфоциты, которые за счет секреции перфорина формируют в мембране альвеолоцитов трансмембранные каналы, по которым внутрь клетки поступают сериновые протеазы, в частности, гранзим В, превращающий прокаспазу-3 в активную каспазу-3. Увеличение численной плотности лимфоцитов, экспрессирующих гранзим В, наблюдали с 3 по 10 сутки после инфицирования в 2,2 раза, что по срокам совпадало с наибольшими значениями объемной плотности инфильтративных изменений в легких инфицированных животных.

Преобладание масштабов апоптоза над масштабами некроза наблюдали и при исследовании образцов селезенки инфицированных мышей. Изменение величин численной плотности TRAIL+ клеток и caspase-9+ клеток имели ту же тенденцию, что и в легких инфицированных животных (рис.12). Необходимо отметить, что в составе апоптотически измененных клеток преобладали лимфоциты, тогда как макрофаги, экспрессирующие исследуемые маркеры были единичными.

Рис. 12. Экспрессия маркеров апоптоза

в клетках селезенке мышей, инфицированных

ВГ А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05

С масштабной гибелью лимфоцитов с истощением лимфоидной ткани, по-видимому, связана недостаточность интерферонового ответа у экспериментальных животных, инфицированных ВГ А/H5N1, которую наблюдали при исследовании цитокинового профиля в сыворотке крови.

В структуре деструктивных изменений в ткани печени, почек и головного мозга мышей, инфицированных вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, преобладали некротические изменения в печени свыше 90%, головном мозге – более 40%, почках – до 85%, что, видимо, связано с нарушением оксигенации тканей за счет сосудистых изменений с явлениями гиперкоагуляции и формированием тромбов в микроциркуляторном русле. Об ишемическом механизме наблюдавшихся повреждений свидетельствовали локализации зон некрозов в органах: центролобулярные в печени, периваскулярные в головном мозге, субтотальные повреждения в почках по типу некронефроза. Также свидетельством ишемического некроза паренхиматозных клеток данных органов является и меньшие, по масштабу апоптотические изменения клеток: в головном мозге – не более 12% клеток, в почках – до 3%, в печени – 10%. При этом в исследуемых органах реализация апоптоза происходила рецепторно-опосредованным путем, о чем свидетельствовало преобладание TRAIL+клеток. Численные плотности клеток с экспрессией маркеров апоптоза представлены на рис. 13.

Рис. 13. Экспрессия маркеров апоптоза в печени, головном мозге и почках мышей, инфицированных ВГ А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05

Таким образом, полученные результаты исследований показали, что при инфицировании мышей вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 происходит массивная гибель паренхиматозных клеток органов-мишеней (легких, селезенки, печени, головном мозге, почках), обусловленная патологическими изменениями сосудистого русла и, как следствие этого, гемодинамическими нарушениями с многочисленными кровоизлияниями в тканях, гиперкоагуляцией и тромбозом микроциркуляторного русла. Гемоциркуляторные нарушения, в свою очередь, приводят к ишемии и некробиотическим изменениям в легких, головном мозге, почках, печени. Кроме очагов некрозов, обусловленных цитопатическим действием вируса и гипоксией, в органах-мишенях наблюдали апоптоз паренхиматозных клеток, доминирующий в легких и селезенке инфицированных животных. Основными механизмами апоптоза явились:

-митохондриальный, реализуемый через активацию каспазы-9 и связанный с цитопатическим действием вирусов гриппа А;

- рецепторно-плазмолеммный, связанный с гиперсекрецией провоспалительных цитокинов, в частности, TNF-a и активацией каспазы-3 через TRAIL- домены смерти.

При этом масштабы некроза и апоптоза, а также пути их реализации в различных органах при гриппе А/H5N1 зависят от сроков инфицирования и органно-тканевой принадлежности.

Особенности фиброгенеза в органах мышей в динамике развития гриппа А/H5N1

При гистологическом исследовании образцов органов мышей, инфицированных ВГ А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, наблюдали увеличение объемной плотности соединительной ткани во всех органах в динамике развития заболевания. Но масштабы фиброзирования были наиболее выражены в легких инфицированных мышей, что послужило основанием для изучения механизмов раннего фиброзирования при гриппе А/H5N1 в образцах легких животных.

Величина показателя объемной плотности фиброзной ткани в легких мышей увеличилась в период с 1 по 3 сутки после инфицирования в 4,1 раза, в период с 3 по 10 сутки – в 3 раза (рис.2). При этом на ранних сроках заболевания (1-3 сутки) увеличение содержания коллагеновых волокон было более выражено перибронхиально и периваскулярно. Начиная с 6 суток, отчетливо выявляли прирост соединительной ткани в межальвеолярных перегородках и в инфильтратах с формированием очагов интерстициального фиброза.

Увеличение концентрации соединительной ткани в легких инфицированных мышей уже с 1 суток инфекционного процесса обусловлено, прежде всего, персистенцией ВГ А/H5N1 в фибробластах, что было показано при ИГХ-исследовании: количества Inf+ фибробластов возросло в 2 раза с 1 по 3 сутки после инфицирования (с 7,1 до 14,7) с последующим снижением к 10 суткам инфекционного процесса в 2,3 раза (рис.1). Успешная репликация ВГ А/H5N1 в фибробластах запускает процесс пролиферации данного типа клеток, что нашло отражение в повышении величины численной плотности фибробластов с 1 по 10 сутки инфекционного процесса в 2,9 раза. На активацию пролиферативных процессов указывала и повышение количества PCNA+ фибробластов в 2 раза в динамике заболевания. «Фибропластическая активность» фибробластов в 1 сутки после инфицирования была меньшей, чем у интактных животных в 1,8 раз, в последующем к 10 суткам увеличилась более чем в 6 раз, что могло свидетельствовать об ускоренной дифференцировке фибробластов.

Таким образом, раннее фиброзирование органов при гриппе А детерменировано многими факторами: персистенцией вируса в клетках органов, включая макрофаги и фибробласты, блокадой интерферонового ответа, ишемией, инфильтративными изменениями с повышением гидролитического потенциала и избыточной продукцией свободных радикалов в локусах воспаления, гиперцитокинемией. «Дисбаланс» этих процессов в рассматриваемой ситуации, видимо, одна из причин раннего фиброза легких.

Патогенетические аспекты гриппа А/H5N1 А/goose/Krasnoozerskoye/627/05

Анализ полученных результатов позволил выделить ключевые патогенетические аспекты в развитии экспериментальной вирусной инфекции, обусловленной ВГ А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05.

Одной из причин высокой патогенности ВГ А/H5N1 для млекопитающих является воздействие белков вируса на иммунную систему. На ранних сроках после инфицирования (с 1 по 6 сутки) в сыворотке крови животных при ИФА были снижены уровни IFN-. Известно, что неструктурный белок NS2 вируса гриппа опосредованно нейтрализует синтез и эффекты IFN-, что приводит к угнетению неспецифического противовирусного интерферонового ответа. Угнетение ВГ А/H5N1 выработки IFN- эффекторными клетками приводит к продуктивной репликации вируса в клетках хозяина и, учитывая тропность ко многим органам, к генерализации инфекции. Под действием вирусной РНК в эпителиоцитах и макрофагах происходит гиперпродукция провоспалительных цитокинов (IL-6, TNF-), уровни которых были повышены с 1 суток не только в сыворотке крови инфицированных животных, но и непосредственно в тканях органов (легких, печени, селезенки, головного мозга). Цитокины вызывают острый иммунный ответ с выраженной реакцией сосудистого русла. Они стимулируют мобилизацию нейтрофилов, моноцитов из костного мозга, активацию полиморфноядерных лейкоцитов, макрофагов, тромбоцитов, что было показано в результате цитологических исследований костного мозга.

Зарегистрированная при ИГХ-исследовании в легких и селезенке блокада каспазо-зависимого апоптоза клеток системы мононуклеарных фагоцитов,так называемый гемофагоцитарный синдром, возникающий в результате недостатка IFN-, свидетельствует о снижении микробицидного потенциала макрофагов за счет угнетения NO-синтазной активности и приводит к успешной репликации вируса.

При проведении лабораторных исследований в костном мозге животных, инфицированных ВГ А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, наблюдали активацию миелоидного ростка кроветворения, которая характеризовалась увеличением численности ранних предшественников (недифференцированных бластов, миелобластов, промиелоцитов и миелоцитов). При этом отмечали снижение относительного количества зрелых клеток (нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов) в костном мозге в ранний период (с 1 по 3 сутки после инфицирования), что, вероятно, связано с их «выходом» в кровь, где наблюдали умеренное повышение их численности. На более поздних сроках (6 и 10 сут) после инфицирования относительное содержание зрелых нейтрофилов в костном мозге практически достигает контрольных величин, а число лимфоцитов – остается ниже контроля. При сопоставлении изменений этих клеток в крови и костном мозге мышей, инфицированных ВГ А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, видно, что снижение относительного числа лимфоцитов, вероятно, объясняется низкой дифференцировочной активностью миелоидного ростка в сторону лимфоидных клеток.

По-видимому, это связано с TNF-индуцированным апоптозом лимфоцитов в органах иммуногенеза (селезенке), который обнаружен при ИГХ-исследовании. В цитоплазме лимфоцитов на всех сроках наблюдения отмечали наличие маркеров апоптоза: caspase-3, caspase-9, TRAIL. Это приводит к массовой гибели лимфоцитов и истощению лимфоидной ткани, обнаруженной при патоморфологическом исследовании. С данным феноменом, по-видимому, связана недостаточность интерферонового ответа у экспериментальных животных на поздних сроках инфицирования вирусом гриппа A/H5N1, которую наблюдали при исследовании цитокинового профиля в сыворотке крови. Угнетением клеточного звена иммунитета можно объяснить слабо выраженные клеточные реакции в тканях с низкими значениями показателей объемной плотности инфильтратов в паренхиматозных органах.

Важным моментом в генезе нарастающей функциональной недостаточности систем органов экспериментальных животных является быстропрогрессирующий фиброз тканей, выявленный при гистохимическом окрашивании (по ван Гизон), что может свидетельствовать об активации фибробластов в условиях ишемии и под влиянием провоспалительных цитокинов.

Уменьшение деструктивных изменений в печени и почках выживших животных к 10 суткам после инфицирования с одновременным увеличением численной плотности лимфоцитов в тканях, возможно, связано с возрастающей секрецией противовоспалительных цитокинов – IL-10, IL-12 и альтернативной активацией макрофагов, что приводит к снижению их цитотоксического действия и усилению эндоцитоза продуктов клеточной деструкции с одновременным повышением репаративной активности в поврежденных тканях.

Таким образом, в основе патогенеза ВГ А/H5N1 (A/goose/Krasnoozerskoye/627/05) лежит, прежде всего, персистенция ВГ А/H5N1 и неполноценный противовирусный интерфероновый ответ, запускающий каскад цитокин-опосредованных реакций, приводящих к необратимым структурно-функциональным изменениям в системах органов экспериментальных животных.

3.5. Патогенетическое обоснование профилактики гриппа А/H5N1 у млекопитающих с применением модифицированного крупномолекулярного полисахарида (диальдегиддекстрана)

Учитывая полученные данные об угнетении неспецифического противовирусного интерферонового ответа вирусами H5N1 и морфологические данные об истощение лимфоидной ткани в центральных и периферических органах иммуногенеза (костный мозг, селезенка, тимус), предположили, что иммуномоделирующая терапия в сочетании с противовирусными препаратами может способствовать более легкому развитию вирусной инфекции со снижением частоты возникновения осложнений и процента летальности у пациентов.

Помимо снижения интерферонового ответа при инфекции, вызванной гриппом A/H5N1, также наблюдали успешную репликацию вирусов в макрофагах с задержкой их апоптоза. Это может свидетельствовать о снижении микробицидного потенциала клеток системы мононуклеарных фагоцитов, вероятно, за счет уменьшения их NO-синтазной активности. В связи с этим можно полагать, что для усиления противовирусного иммунитета наиболее целесообразно применение иммуномодуляторов, воздействующих на клетки моноцитарно-макрофагальной системы, вызывая повышение их функциональной активности. Это определяет актуальность разработки и создания новых эффективных антивирусных лекарственных форм, оптимально сочетающих в спектре фармакологической активности вирусингибирующие свойства и способность стимулировать неспецифическую резистентность организма со снижением токсических осложнений.

В работах выполненных под руководством академика РАМН, профессора В.А.Шкурупия было доказано, что вышеперечисленными свойствами обладают модифицированные крупномолекулярные полисахариды (диальдегиддекстраны) (Шкурупий В.А., 2007) К тому же, они обладают дополнительными свойствами, а именно: детоксицирующим, гепатопротекторным, активируют пластические процессы.

В связи с вышесказанным в нашем исследовании для разработки технологии лечения и профилактики гриппа А/H5N1 (A/goose/Krasnoozerskoye/627/05) у мышей был выбран диальдегиддекстран (ДАД) с молекулярной массой 60кДа.

Учитывая генерализованный характер инфекционного процесса, для достижения максимального эффекта был выбран внутривенный способ введения препаратов.

Дозу ДАД подбирали экспериментальным путем, учитывая разрешенные дозы для полисахаридов. Для выбора оптимальной эффективной профилактической дозы ДАД при экспериментальном инфицировании беспородных белых мышей ВГ А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 было проведено 3 независимых повтора эксперимента, в каждом из которых было сформировано 6 групп мышей, которых инфицировали /H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05. Первая группа служила контролем. Мышам 2,3,4 и 5 групп предварительно вводили ДАД в дозах 125мг/кг, 250мг/кг, 500мг/кг и 1000мг/кг соответственно. Животным 6 группы внутривенно вводили 0.2 мл 0,85% водного раствора NaCl.

Поскольку период после введения декстранов характеризуется фазностью ответа иммунной системы (Шкурупий В.А., 2007) оптимальным было двукратное профилактическое введение препарата с разницей в двое суток, что позволяет получить максимальную стимуляцию иммунной системы на момент заражения (через сутки после второй инъекции).

Определение профилактической эффективности диальдегиддекстрана при инфицировании мышей ВГ А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, выбор оптимальной дозы

Анализируя данные экспериментальной работы по исследованию профилактической эффективности препаратов, представленные в таблице, мы видим, что показатели средней продолжительности жизни (СПЖ) и процента летальности в контрольных группах различаются на 1,8% и 3,8 % соответственно, что говорит о влиянии стрессового фактора на вышеуказанные показатели. При дальнейшем анализе результатов в качестве контроля мы будем использовать результаты, полученные в группе контроля раствора препарата.

В группе животных, в которой для профилактики инфекции ВГ А/H5N1 применяли ДАД в низких дозах (125мг/кг), процент летальности был больше чем в контроле на 4,4 %, а показатель СПЖ был ниже на 1,1 %, Двукратное увеличение дозы испытуемой субстанции позволило улучшить эти показатель на 17,4 и 8,1 % соответственно относительно контроля. Наилучшего результата удалось добиться при применении препарата в наибольшей из исследуемых доз (1000мг/кг). В опытной группе, для которой ДАД был применен в указанной дозе, наблюдали увеличение показателя СПЖ на 24,2 %, и уменьшение процента летальности в 3,2 раза по сравнению с контролем (табл.2)

Таблица 2

Результаты исследования профилактической эффективности препарата ДАД при экспериментальном инфицировании мышей ВГ А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05

Экспериментальные группы

Доза

СПЖ

Летальность,%

H5N1+ДАД

125мг/кг в объеме 0,1 мл

9,0 ± 0,6

80,0 ± 10,0

250мг/кг в объеме 0,2 мл

9,9 ± 0,3

63,3 ± 5,8

500мг/кг в объеме 0,2 мл

10,7 ± 0,3

53,3 ± 5,8

1000мг/кг в объеме 0,4 мл

12,4 ± 0,3

23,3 ± 5,8

H5N1 + 0,85% р-р NaCl

0,2 мл

10,7 ± 1,1

73,3 ± 5,8

H5N1

МЛД10

10,9 ± 1,2

76,6 ± 11,6

Примечание: H5N1+ ДАД – экспериментальные группы, в которых мышей инфицировали ВГ A/H5N1 после профилактического введения ДАД.

Таким образом, исходя из приведенных выше данных, можно сделать вывод о том, что субстанция ДАД оказывает профилактическое действие при экспериментальном инфицировании ВГ А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 при двукратном внутривенном введении за 3 и 1 сутки до инфицирования в дозе превышающей 250мг/кг. При введении препарата в дозе 1000мг/кг наблюдается выраженный профилактический эффект, который проявляется увеличением показателя СПЖ на 24,2 % и уменьшения процента летальности в 3,2 по сравнению с контролем. Доза препарата 125 мг/кг не оказывает профилактического действия при гриппозной инфекции,

3.6 Молекулярно-клеточные особенности гриппа А/H5N1 у мышей при профилактическом введении диальдегиддекстрана

При иммуногистохимическом исследовании было обнаружено снижение числа Inf+клеток, преимущественно макрофагов, во всех органов инфицированных мышей, получавших ДАД. Существенные различия в численности инфицированных клеток отмечали начиная с 3 суток после инфицирования. В динамике развития инфекционного процесса на 10 сутки после инфицирования доля тромбированных сосудов в ткани легкого инфицированных мышей была в 11,9 раза больше, чем в контроле и в 6,6 раза больше, чем в группе мышей с профилактическим введением ДАД. Снижение интенсивности процессов тромбирования сосудов и уменьшение объемной плотности кровоизлияний в строме легких при профилактическом введении ДАД может быть связано как с лучшей сохранностью эндотелиальной выстилки сосудов вследствие опосредованного эффекта ДАД, так и со способностью декстранов улучшать реологические свойства крови и стимулировать репаративные процессы (Шкурупий В.А.,2007). У инфицированных мышей после профилактического введения ДАД отмечали уменьшение объемной плотности воспалительных инфильтратов в интерстиции легких более, чем в 3 раза по сравнению с непрофилактируемыми животными. Величина показателя фиброзной ткани в легких инфицированных мышей после введения ДАД уменьшилась в 4,2 раза по сравнению с таковой у инфицированных мышей, не получавших ДАД. При введении ДАД у инфицированных мышей отмечали уменьшение деструктивных изменений в паренхиме печени и головном мозге на всех сроках наблюдения в 2 и более раз по сравнению с инфицированными животными, не подвергавшихся профилактике ДАД.

Таким образом, результаты исследования образцов легких, печени, почек и головного мозга мышей, инфицированных ВГ А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, при профилактическом введении ДАД показали, что данная субстанция способствует уменьшению масштабов деструктивных изменений за счет снижения степени повреждения гемических сосудов и тромботических осложнений, снижению объема фибротических осложнений. Увеличение численной плотности лимфоцитов в синусоидах печени и инфильтратов в паренхиме почек может свидетельствовать об активации клеточного звена иммунитета под действием ДАД, что нашло наибольшее отражение при изучении структурных изменений в лимфоидных органах животных

На фоне предварительного введения ДАД в дозе 1000мг/кг наблюдали изменения миелоидного ростка костномозгового кроветворения у мышей в динамике развития ВГ А/H5N1, характеризующиеся тенденцией уменьшения содержания недифференцированных бластов костного мозга. В группе инфицированных нелеченных животных отмечено увеличение содержания промиелоцитов, а в группах мышей, получавших препараты, напротив, отмечено их уменьшение. На 1 и 3 сутки наблюдения было отмечено увеличение содержания палочкоядерных нейтрофилов костного мозга у мышей, получавших ДАД. В последующие сроки содержание палочкоядерных нейтрофилов в костном мозге мышей этих групп практически не отличалось от их численности у животных, инфицированных ВГ А/H5N1. У мышей при профилактическом введении ДАД отмечали увеличение относительного содержания лимфоцитов костного мозга по сравнению с группой инфицированных животных: показатели данного параметра были в 3,5 раза выше на 1 сутки после инфицирования и в 1,3 раза выше на 10 сутки от начала развития инфекционного заболевания. В группе мышей с профилактическим введением ДАД на 1 сутки после инфицирования относительное содержание моноцитов в костном мозге увеличилось более чем в 3 раза по сравнению с группой инфицированных нелеченных животных. Таким образом, профилактическое введение ДАД способствует поддержанию нормальной численности лимфоцитов и нейтрофилов периферической крови мышей при гриппе А/H5N1 за счет нормализации дифференцировочного потенциала и баланса между различными ростками костномозгового кроветворения.

Профилактическое введение ДАД приводит к увеличению численной плотности и диаметров лимфоидных фолликулов по сравнению с нелеченными животными. Уменьшение количества многоядерных клеток в синусах селезенки может свидетельствовать о противовирусной активности ДАД, связанной с активацией механизмов естественной резистентности, которые реализуются через элими-нацию вируса путем гибели инфицированных макрофагальных клеток.

В исследовании были изучены профили цитокинов – TNF-, эндогенных интерферонов – IFN-, IFN- – в сыворотке крови экспериментальных животных с применением метода иммуноферментного анализа. Профилактическое введение ДАД приводило к значительному повышению уровня IFN- в крови на всех сроках наблюдения. Уже на 1 сутки после заражения он составил 25пг/мл, превышая в 1,7 раза аналогичный параметр у мышей, не получавших ДАД. С 1 по 10 сутки отмечали равномерное снижение величины данного параметра на 40%. (рис.14)

Уровень IFN- у мышей, которым вводили ДАД, был значительно выше величин аналогичного параметра в группе мышей, не получавших препарат. Эти отличия были наиболее значимыми (в 12 раз) на 6 сутки после заражения (рис.14), что можно связать с увеличением количества лимфоцитов в костном мозге животных.

Рис. 14. Концентрация эндогенных интерферонов IFN-, IFN- и цитокина TNF- в сыворотке крови мышей, инфицированных ВГ А/H5N1 без профилактики и после профилактического введения ДАД

Уровень TNF- у инфицированных мышей, не получавших препарат был достоверно выше по сравнению с величиной аналогичного параметра в контроле и у мышей, которым вводили ДАД, на всех сроках наблюдения. При этом отмечали его повышение с 1 по 3 сутки после заражения в 1,65 раза с последующим снижением на 24%. У мышей, получавших ДАД, уровень TNF- был повышен только на 1 сутки после заражения на 10% по сравнению с контролем. Затем наблюдали его постепенное снижение к 10 суткам на 34% (рис.14).

Иммуногистохимическое исследование уровня цитокинов в тканях органов мышей, инфицированных ВГ А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, после профилактического введения ДАД, показало уменьшение численной плотности клеток органов, экспрессирующих TNF- и IL-6, по сравнению с величиной аналогичного показателя в образцах группы, не получавшей препарат, на всех сроках наблюдения (рис.15). Это свидетельствует о снижении экспрессии провоспалительных цитокинов, что согласовано со снижением объемной плотности кровоизляний и деструктивных изменений, наблюдавшимся при светооптическом изучении ткани легких, печени, почек, головного мозга.

Также отмечали уменьшение численной плотности лимфоцитов с положительной иммуногистохимической реакцией к маркерам апоптоза: caspase-3, TRAIL (рис.16,17), что, свидетельствует о снижении процессов TNF- –опосредованной апоптотической гибели лимфоцитов. Это приводит к повышению численной плотности лимфоцитов и увеличению выработки ими IFN-, ингибирующего образование фиброзной ткани, что, вероятно, объясняет значительный антифибротический эффект в органах, наблюдавшихся при профилактическом введении ДАД.

Рис. 15. Экспрессия провоспалительных цитокинов в тканях внутренних органов мышей, инфицированных ВГ А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 без профилактики и после профилактического введения ДАД

Рис. 16. Экспрессия маркеров апоптоза в легких мышей, инфицированных ВГ А/H5N1 без профилактики и после профилактического введения ДАД

Рис. 17. Экспрессия маркеров апоптоза в экстрапульмонарных органах мышей, инфицированных ВГ А/H5N1 без профилактики и после профилактического введения ДАД

Таким образом, профилактическое введение ДАД оказывает выраженное действие на уровни цитокинов, определяющих патогенез ВГ А/H5N1, что приводит к нормализации цитокинового ответа и, как следствие, уменьшению деструктивных изменений в поражаемых органах.

Также после профилактического введения ДАД отмечали выраженное снижение численной плотности клеток, экспрессирующих лизосомальные гидролазы, во всех органах, начиная с 1 суток после инфицирования (рис.18,19), что профилактировало деструктивные изменения в органах инфицированных мышей в динамике гриппа А А/H5N1.

Рис. 18. Экспрессия Lysozyme, Cathepsin D и Myeloperoxidase в легких, печени и головном мозге мышей, инфицированных ВГ А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 без профилактики и после профилактического введения ДАД

Рис. 19. Экспрессия Lysozyme, Cathepsin D и Myeloperoxidase в селезенке мышей, инфицированных ВГ А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 без профилактики и после профилактического введения ДАД

Анализ результатов исследования экспрессии NO-синтаз в клетках органов инфицированных животных показал, что численная плотность eNOS+клеток была ниже в группе мышей, получавших ДАД, количество iNOS+позитивных клеток в органах мышей обеих групп имели минимальные различия (рис.20).

Рис. 20. Экспрессия NO-синтаз в клетках органов мышей, инфицированных ВГ А/H5N1 без профилактики и после профилактического введения ДАД

Таким образом, результаты исследования показывают, что диальдегиддекстран оказывает профилактическое действие при экспериментальной вирусной инфекции, индуцированной вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 при его двукратном внутривенном введении за 3 и 1 сутки до инфицирования в дозе превышающей 250мг/кг. Наиболее выраженный профилактический эффект ДАД, проявлением которого было увеличение показателя средней продолжительности жизни на 24,8% и уменьшения процента летальности в 3,2 раза по сравнению с инфицированными непрофилактируемыми животными, был выявлен при двукратном введении препарата в дозе 1000мг/кг за 3 и 1 сутки до инфицирования мышей.

Эффективность профилактического введения диальдегиддекстрана подтверждается снижением кровоизлияний, доли тромбированных сосудов, объемной плотности деструктивных изменений и воспалительных инфильтратов, объемной плотности фиброзной ткани в органах мышей, особенно в легких. Профилактическое введение ДАД приводит к увеличению численной плотности и диаметров лимфоидных фолликулов по сравнению с нелеченными животными. Уменьшение количества многоядерных клеток в синусах селезенки может свидетельствовать о противовирусной активности ДАД, связанной с активацией механизмов естественной резистентности, которые реализуются через элиминацию вируса путем гибели инфицированных макрофагальных клеток. Это может быть связано с активацией косномозгового кроветворения и активацией макрофагов по альтернативному пути с повышением продукции противовоспалительных цитокинов и ростовых факторов при введении модифицированного декстрана.

Профилактическое введение ДАД оказывает выраженное действие на уровни цитокинов, определяющих патогенез ВГ А/H5N1, способствуя значительному повышению уровня IFN-, IFN- с одновременным снижением провоспалительного цитокина TNF- в сыворотке крови инфицированных животных на всех сроках наблюдения. При иммуногистохимическом исследовании уровней цитокинов в клетках различного гистогенеза органов мышей, получавших ДАД, также отмечали значительное снижение численной плотности эффекторных клеток, экспрессирующих провоспалительные цитокины ИЛ-6 и TNF-, по сравнению с таковыми в группе инфицированных животных без профилактического введения ДАД. Таким образом, профилактическое введение ДАД оказывает выраженное действие на уровни цитокинов, определяющих патогенез ВГ А/H5N1, что приводит к нормализации цитокинового ответа и, как следствие, уменьшению деструктивных изменений в поражаемых органах.

Снижение численной плотности клеток органов инфицированных мышей, экспрессирующих внутриклеточные гидролазы (лизоцим, катепсин Д, миелопероксидазу), NO-синтазы способствует уменьшению гидролитического потенциала в тканях и предотвращает избыточную продукцию оксида азота, в высоких концентрациях способных оказывать неблагоприятные эффекты на клетки, что отражено в уменьшении деструктивных процессов в органах мышей, инфицированных вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, при профилактике модифицированным декстраном.

С активацией клеток системы мононуклеарных фагоцитов по альтернативному пути, возможно, связано и снижение интенсивности процесса фиброзирования легких, в том числе и за счет уменьшения секреции металлопротеиназ и выработки лимфокинов, относящихся к классу IFN-. Известно, что лимфоцитарный цитокин IFN- ингибирует синтез коллагена и снижает стимулирующее влияние на фибробласты других цитокинов. Возможно, ДАД способствует стимуляции интеферон-индуцирующей функции клеток мишеней, прежде всего мононуклеаров, что объясняет значительные снижение величины показателя объемной плотности фиброзной ткани в группах мышей, получавших ДАД.

Таким образом, вышеописанные эффекты ДАД позволяют предположить перспективность использования модифицированных крупномолекулярных полисахаридов в качестве иммуномодулирующих средств, воздействующих на клетки моноцитарно-макрофагальной системы, вызывая повышение их функциональной активности, механизм действия которых требует дальнейших исследований.

ВЫВОДЫ

  1. Вирус гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 обладает высокой патогенностью для млекопитающих (мышей), вызывая системный инфекционный процесс с высокой летальностью (более 75%) и пролонгированной персистенцией в период начала реконвалесценции.
  2. Высокая патогенность вируса гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 связана, прежде всего, с его способностью к персистенции в клетках альвеолярного эпителия, гепатоцитах, нейронах, резидентных макрофагах, фибробластах, эндотелиоцитах сосудов и во внеклеточных пространствах.
  3. Высокая тропность вируса гриппа А/Н5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 к эндотелиоцитам сосудов органов мышей, его цитотоксичность детерминируют деструктивные изменения микроциркуляторного русла (эндотелиальной выстилки и стенки сосудов), проявляющиеся увеличением их проницаемости, тромботическими и геморрагическими осложнениями, создающие патогенетические условия для острой гипоксии – фактора риска усиления деструктивных процессов в тканях органов вне прямой связи с цитопатичностью вируса.
  4. Инфицирование мышей вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 приводит к угнетению неспецифического противовирусного интерферонового ответа, проявляющегося в опосредованном уменьшении синтеза интерферонов – IFN-, IFN- в связи с угнетением лимфоидного ростка гемопоэза и апоптоза лимфоцитов в органах иммуногенеза (селезенке, тимусе), что способствует репликации вируса в клетках хозяина и, учитывая его тропность ко многим органам, к генерализации инфекции.
  5. Персистенция вируса гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 в эпителиоцитах и макрофагах органов мышей сопряжена с гиперпродукцией провоспалительных цитокинов (IL-6, TNF-), уровни которых были повышены в сыворотке крови и клетках различного гистогенеза у инфицированных животных во все сроки наблюдения, острым иммунным ответом, проявляющимся мобилизацией нейтрофилов, моноцитов из костного мозга, гемоциркуляторными нарушениями с развитием отечно-деструктивного синдром, индукцией рецепторно-опосредованного апоптоза клеток органов.
  6. Инфицирование мышей вирусом гриппа А/Н5N1 приводит к стимуляции клеточного звена иммунитета с активацией кислород-независимых (протеазы) и кислород-зависимых (eNOS и iNOS-синтазы) факторов защиты в клетках различного гистогенеза, вне зависимости от выполняемых ими специфических функций, что характеризует их как единую систему противовирусной защиты организма, с другой стороны, сопровождается лабилизацией клеточных мембран с развитием вторичной альтерации тканей органов, расширяя масштабы повреждения клеток и их пролифирации, приводя к неполноценной репарации тканей с развитием фиброза органов.
  7. Инфицирование мышей вирусом гриппа А/Н5N1 сопряжено с масштабными по распространенности деструктивными изменениями в органах, связанными с персистенцией вируса, гемодинамическими нарушениями и токсическими эффектами, обусловленными реакцией клеточного звена иммунитета.
  1. Масштабы некроза и апоптоза, их соотношение и пути реализации при гриппе А/H5N1  зависят от длительности инфекционного процесса в различных органах: с преобладанием  некротических изменений в печени, головном мозге и почках инфицированных мышей,  обусловленных в большей степени гемодинамическими нарушениями; реализацией апоптозного пути гибели клеток легких и селезенки;
  2. Основными механизмами апоптоза при гриппе А/H5N1 являются: митохондриальный, реализуемый на ранних сроках инфекционного процесса и связанный в большей степени с цитопатическим действием вирусов; рецепторно-опосредованный, обусловленный гиперсекрецией провоспалительных цитокинов, в частности, TNF- и активацией каспазы-3 через TRAIL – домены.
  1. Для вирусной инфекции А/Н5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 характерна картина раннего развития высокой активности репаративных процессов в органах, проявляющаяся пролиферативной активностью альвеолоцитов, гепатоцитов, глиоцитов и эндотелиоцитов, новообразованием капилляров, заместительной репаративной регенераций в системе соединительной волокнистой ткани. Гиперпластические процессы обусловлены и активацией инфицированных клеток, экспрессирующих ростовые факторы и их рецепторов (FGF, FGFR, VEGFR). Высокий уровень пролиферации в рассматриваемых экспериментальных условиях носит двойственный характер – способствует восстановлению утраченных структур, с другой стороны – увеличивает концентрацию новых клеток, необходимых для проникновения, репликации и персистенции вируса гриппа А, способствуя тем самым прогрессированию инфекции.
  2. Персистенция вируса гриппа А/H5N1 в фибробластах и макрофагах органов является триггерным фактором, «запускающим» процессы раннего и избыточного коллагенообразования, при этом процессы синтеза и протеолиза структур внеклеточного матрикса в органах детерминированы многими факторами: персистенцией вируса в клетках органов, блокадой интерферонового ответа, ишемией, инфильтративными изменениями с повышением гидролитического потенциала и избыточной продукцией свободных радикалов в локусах воспаления, гиперцитокинемией, численностью фибробластов и макрофагов. «Дисбаланс» этих процессов при гриппе А/H5N1, видимо, одна из причин раннего фиброза легких.
  3. Модифицированный полисахарид (диальдегиддекстран) оказывает выраженный профилактический дозозависимый эффект при экспериментальном инфицировании мышей вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, который проявляется увеличением средней продолжительности жизни животных, уменьшением процента летальности, уменьшением числа инфицированных клеток различного гистогенеза в органах мышей, прежде всего, макрофагов и фибробластов легких, уменьшением масштабов повреждения паренхиматозных органов, выраженным антифибротическим эффектом.
  4. Эффекты профилактического действия диальдегиддекстрана при гриппе А/H5N1 у мышей опосредованы повышением мощности механизмов естественной резистентности макроорганизма – активацией клеток системы мононуклеарных фагоцитов, проявляющейся повышением уровня IFN-, IFN- за счет усиления интерферон-продуцирующей функции эффекторных клеток, нормализации дифференцировочного потенциала и баланса между различными ростками костномозгового кроветворения, уменьшением масштабов апоптоза лимфоцитов в органах иммуногенеза, снижением внутриклеточного синтеза провоспалительных цитокинов – TNF-, IL-6, лизосомальных гидролаз (лизоцима, катепсина Д, миелопероксидазы), NO-синтаз, что существенно снижает масштабы гемодинамических, деструктивных, фибротических. осложнений.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

  1. Патоморфогенез птичьего гриппа, обусловленного штаммами вируса H5N1, выделенными на территории России, с целью разработки средств и способов его профилактитки и лечения у млекопи-тающих / Потапова О.В., Шкурупий В.А., Лузгина Н.Г. // Материалы итоговой конференции по результатам мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП по приоритетным направлениям развития НТК России за 2007-2012гг..- Москва, 2007.- С. 82-83.
  2. Структурные изменения в печени мышей, инфицированных ви-русом гриппа птиц субтипа H5N1 / Шаркова Т.В., Потапова О.В., Шкурупий В.А., Шестопалов А.М., Дроздов И.Г., Шестопалова Л.В.// Бюллетень экспериментальной биологии и ме-дицины. – 2008. – Т.146.- №7.- С. 210-212.
  3. Characteristics of Morphogenesis of Pathological Changes of Mice Target Organs Developing under the influence of Highly Pathogenic Influence Vi-rus of H5N1 Subtype / Шестопалов А.М., Шестопалова Л.В., Шаркова Т.В., Шкурупий В.А., Зайковская А.В., Потапова О.В. //Addedum & Participants List.- The Tird European Influenza Con-ference.- Portugal 14-17 September 2008. - P. 6-7.
  4. Структурные изменения легких у мышей, инфицированных вирусом гриппа птиц H5N1 субтипа / Шестопалова Л.В. , Шкурупий В.А., Шаркова Т.В., Потапова О.В., Зайковская А.В., Шестопалов А.М. //Вестник НГУ.- 2008. – Т.6.- выпуск 3 – ч.2.- С. 3-10.
  5. Изучение патогенности штаммов вируса гриппа птиц H5N1 субтипа, выделенных на территории Российской Феде-рации, на мышиной модели / Шестопалов А.М., Шаршов К.А., Зайковская А.В., Рассадкин Ю.Н., Дроздов И.Г., Шкурупий В.А., Потапова О.В., Лузгина Н.Г// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2008. – Т.145.- №9.- С. 317-320.
  6. Структурные изменения в лимфоидных органах мышей, инфици-рованных вирусом гриппа птиц H5N1-субтипа A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 / Потапова О.В., Шкурупий В.А., ЛузгинаН.Г., Шестопалов А.М., Дроздов И.Г, Одарченко И.В. //Бюллетень СО РАН .- 2008.- №5. - С. 174-178.
  7. Изучить патогенез птичьего гриппа, обусловленного штаммами вируса H5N1, выделенными на территории России, с целью разработки средств и способов его профилактитки и лечения у млекопи-тающих / Потапова О.В., Шкурупий В.А., Лузгина Н.Г. // Материалы итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП по приоритетным направлениям развития НТК России за 2007-2012годы». - Москва, 2008.- С. 237-238.
  8. Структурно-функциональные изменения в органах иммуногенеза у мышей, инфицированных вирусом гриппа H5N1 / Потапова О.В., Одарченко И.В., Шкурупий В.А., Лузгина Н.Г., Шестопалов А.М. // Материалы III Съезда Российского общества патологоанатомов. - Самара, 26–30 мая 2009 г. – С. 429-431.
  9. Структурные изменения в паренхиме почек мышей, инфицированных вирусом гриппа птиц H5N1-субтипа A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 / Черданцева Л.А., Потапова О.В., Шкурупий В.А., Шестопалов А.М. // Материалы III Съезда Российского общества патологоанатомов. – Самара, 26–30 мая 2009 г. – С. 550-552.
  10. Патоморфогенез проявлений птичьего гриппа в легких и печени мышей и при его профилактике модифицированным декстраном / Шкурупий В.А., Потапова О.В., Лузгина Н.Г., Шестопалов А.М., Шестопалова Л.В.// Материалы III Съезда Российского общества патологоанатомов. – Самара, 26-30 мая 2009 г. – С. 577-579.
  11. Молекулярно-клеточные основы патоморфогенеза гриппа птиц субтипа H5N1 у млекопитающих в эксперименте / Потапова О.В., Шкурупий В.А., Шестовалов А.М., Шаркова Т.В. // IV Всероссийская научно-практическая конференция «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» . - Новосибирск, 2009. – С. 192.
  12. Регенераторно-пластические процессы в печени млекопитающих при гриппе птиц А/Н5N1 и его профилактике модифицированным декстраном / Шаркова Т.В., Потапова О.В., Шкурупий В.А., Шестопалов А.М. // IV Всероссийская научно-практическая конференция «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов». - Новосибирск, 2009. – С. 289.
  13. Структурные изменения в головном мозге мышей, инфицированных вирусом гриппа А/Н5N1 / Потапова О.В., Шкурупий В.А., Шаркова Т.В., Шестопалов А.М.// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. –2009 - №12 – 3 С. 53-55.
  14. Исследование профилактической эффективности окисленного декстрана и патоморфологических процессов в легких мышей при гриппе птиц А/H5N1/ Потапова О.В., Шкурупий В.А., Шаркова Т.В., Троицкий А.В., Лузгина Н.Г., Шестопалов А.М. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2010. – Т.150.- №12.- С. 650-653.
  15. Морфофункциональные особенности легочных макрофагов у мышей оппозитных линий CBA и C57Bl/6g / О.В. Потапова, Л.А. Черданцева, Т.В. Шаркова, В.А. Шкурупий, Н.Г. Лузгина, А.В. Ковнер // Фундаментальные исследования. – 2010. – № 10. – С. 34–39.
  16. Morphofunctional Characteristics of the Immune System in CBA and C57Bl/6g Mice/ V.A. Shkurupiy , V.O. Tkachev , O.V. Potapova, N.G.Luzgina // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. – 2010 – Vol.150. – N 6. – Р. 725-728.
  17. Функциональная активность легочных макрофагов мышей, инфицированных вирусом гриппа А/ H5N1 / А.В. Ковнер, О.В. Потапова // XLIX Международная научная студенческая конференция «Студент и научно-технический прогресс» – 2011. – С. 28.
  18. Особенности фибробластических процессов в легких мышей оппозитных линий СВА и С57Вl/6g при гриппе А/Н5N1/ Аникина А.Г., Потапова О.В., Шкурупий В.А., Шестопалов А.М. // Материалы V Всероссийской научно-практической конферен-ции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов». – Новосибирск, 2011. – С. 11-12.
  19. Механизмы клеточной гибели в морфогенезе гриппа А/Н5N1 у млекопитающих/ Потапова О.В., Шкурупий В.А., Шаркова Т.В., Черданцева Л.А., Шестопалов А.М. //Материалы V Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов». – Новосибирск, 2011. – С. 181-182.
  20. Структурные изменения в головном мозге мышей при гриппе А/ Шаркова Т.В., Потапова О.В., Шкурупий В.А., Шестопалов А.М. // Материалы V Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов». – Новосибирск, 2011. – С. 245-246.
  21. Морфофункциональные изменения эндотелиоцитов сосудов легких при гриппе А/H5N1 у млекопитающих / А.В. Ковнер, А.Г. Аникина, О.В. Потапова // IV Международная научная конференция студентов и молодых ученых «Клинические и теоретические аспекты современной медицины» - 2012. – С. 49–50.
  22. Структурно-функциональные изменения легочных макрофагов и легких мышей, инфицированных вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 / А.В. Ковнер, А.Г. Аникина, О.В. Потапова, Т.В. Шаркова, Л.А. Черданцева, В.А. Шкурупий, А.М. Шестопалов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2012. – № 2. – С. 196–199.
  23. Морфофункциональная характеристика фибробластов и особенности фиброгенеза в легких мышей, инфицированных вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05/ Аникина А.Г., Потапова О.В., Шкурупий В.А. //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2012. – Т.154.- № 9.- С. 346-349.
  24. Морфофункциональные изменения эндотелиоцитов сосудов легких при гриппе А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 у мышей / А.В.Ковнер, О.В.Потапова, В.А.Шкурупий // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2012. – № Т.154. - №10. – С.472-475.

Патенты

  1. Способ получения диальдегиддекстрана / Шкурупий В.А., Троицкий А.В., Потапова О.В., Лузгина Н.Г. // Евразийский патент №011717 (№ 200801376,) ЕАПВ 28.04.2009.

Автор благодарит сотрудников лаборатории отдела зоонозных инфекций и гриппа ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (Кольцово) под руководством Шестопалова А.М. за ведение совместного эксперимента.

Список СОКРАЩЕНИЙ

IFN – интерферон

IL – интерлейкин

eNOS – эндотелиальнаям синтаза оксида азота

iNOS – индуцибельная синтаза оксида азота

TNF – фактор некроза опухолей

TRAIL – TNF-related apoptosis-inducing ligand

ВГ – вирус(ы) гриппа

ДАД – диальдегиддекстран

ИФА – иммуноферментный анализ

ИГХ – иммуногистохимический

МЛД50 – мышиная летальная доза, при применении которой погибает 50% мышей

СПЖ – средняя продолжительность жизни

 





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.