WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 
                1.   На правах рукописи
                  1. Алешукина Анна Валентиновна

ОТНОШЕНИЯ МИКРОБ-ХОЗЯИН В БИОТОПАХ ТОЛСТОЙ КИШКИ ПРИ  ДИСБАКТЕРИОЗАХ

03.02.03 – микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

  Москва - 2012

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Ростовский научно-исследовательский институт микробиологии и паразитологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный консультант:

Доктор медицинских наук, старший научный сотрудник, заместитель директора по научно-производственной деятельности ФБУН РостовНИИ микробиологии и паразитологии Роспотребнадзора

  Яговкин Эдуард Александрович

Официальные оппоненты:

академик РАЕН и РАМТН, доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией генетики вирулентности бактерии НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи

  Бондаренко Виктор Михайлович

профессор кафедры клинической фармакологии, бактериологии, аллергологии и иммунологии ИПДО Ставропольская государственная медицинская академия, доктор медицинских наук

Алиева Елена Васильевна

профессор, доктор медицинских наук, заведующая кафедрой микробиологии ГБОУ ВПО "Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И.Пирогова" Минздравсоцразвития России

  Кафарская Людмила Ивановна 

Ведущая организация:  ФГУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» (г.Саратов).

Защита диссертации состоится «___»______________201___ г. в _____часов на заседании диссертационного совета Д 208.046.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского» Роспотребнадзора по адресу: 125212, г. Москва, ул.Адмирала Макарова, д.10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского» Роспотребнадзора по адресу 125212, г.Москва, ул.Адмирала Макарова, д.10.

Автореферат разослан «____»_______________2012г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук  О.Ю.Борисова

              1. ОБЩАЯ  ХАРАКТЕРИСТИКА  РАБОТЫ


              2. Актуальность проблемы

Организм человека и микроорганизмы, заселяющие его, составляют единую экологическую систему. Одним из проявлений возможных нарушений этой системы являются микроэкологические изменения в биотопах кишечника, наступающие под влиянием разных факторов (облучение, стрессы, переохлаждение и перегрев, использование различных лекарственных препаратов и др.). Особое место, в этой связи, занимают антибиотики, включаемые в схемы лечения людей с различной инфекционной и соматической патологией (Шендеров Б.А,, 1998; Маянский А.Н., 1999; Барановский А.Ю. с соавт., 2008; Sullivan A. et al, 2001). Дисбактериозы ассоциированы с проявлением многих инфекционных и соматических заболеваний, способствуя хроническому течению патологических воспалительных процессов различной локализации, включая желудочно-кишечный тракт (Воробьев А.А. с соавт., 1998; Бондаренко В.М., 2011). 

Вопросам дисбактериоза кишечника посвящено много обзоров в современной отечественной и зарубежной литературе. Изучены изменения состава микрофлоры, биологические особенности условно-патогенных микроорганизмов, способы коррекции дисбактериозов при различной соматической и инфекционной патологии, взаимосвязь дисбактериозов с развитием вторичных иммунодефицитов (Борисова А.М. с соавт.,1997; Банников В.К. с соавт.,1997; Минушкин О.Н. с соавт., 1999; Васильев В.Г.с соавт., 2006;  Бондаренко В.М., Мацулевич Т.В., 2007). Сведения о взаимоотношениях симбиотической микрофлоры кишечника и неспецифического звена иммунитета освещают проблему на организменном уровне. В тоже время, о связи дисбиотических нарушений с изменениями клеточного и гуморального природного иммунитета в различных биотопах кишечника известно крайне недостаточно (Хавкин А.И., 2003; Е.И.Ткаченко, Успенский Ю.П., 2004 и др.). Отмечена корреляция между транслокацией ЛПС грамотрицательных бактерий из просвета кишечника в системный кровоток и развитием полиорганной патологии, включая атеросклероз (Бондаренко В.М., Рябиченко Л.В., 2010; Лиходед В.Г. с соавт., 2009). Отсутствие четких данных о патогенезе дисбиотических нарушений существенно влияет на результаты их эффективной коррекции. Известно, что основным методом лечения и профилактики дисбактериозов в практическом здравоохранении остается использование пробиотиков (Воробьев А.А. с соавт., 1997; Шендеров Б.А., 1998; Минушкин О.Н. с соавт., 1999; Хорошилова Н.В., 2003; Амерханова А.М.,2009; Бондаренко В.М., 2010; Алешкин А.В., 2011 и др.). Однако, такая  коррекция не всегда эффективна. Поэтому разработаны  схемы коррекции дисбиотических состояний, включающие энтеросорбцию, энтеропротекцию, селективную деконтаминацию кишечника, коррекцию моторно-секреторной функции желудочно-кишечного тракта, функциональное питание и коррекцию аутохтонной микрофлоры (Хергет Х.Ф. с соавт., 1997; Гриневич Е.Б. с соавт., 2003; Бондаренко В.М., Мацулевич Т.В., 2007). В схему включают также иммунобиологические препараты (Горская Е.М.с соавт., 1995; Лебедев В.В. с соавт. 2003; Соболева С. В. с соавт., 2009; В.В.Чернин  с соавт., 2011).

Таким образом, качественное и количественное состояние микрофлоры различных биотопов кишечника является важным звеном системы, поддерживающей нормальный гомеостаз организма. Несмотря на значительные успехи в изучении механизмов различных дисбиотических нарушений желудочно-кишечного тракта многие вопросы остаются малоизученными. Это касается недостаточности наших знаний о клеточных и молекулярных процессах, в том числе иммунологических, проявляющихся на местном уровне при дисбактериозе толстой кишки различного генеза, особенно при воздействии антибиотических препаратов, широкое использование которых является важной составной частью лечения инфекционных и соматических заболеваний. Остаются также малоизученными механизмы количественного и качественного изменения биологических свойств индигенной микробиоты толстой кишки и условно-патогенных микроорганизмов в процессе развития дисбактериозов. Изучение этих механизмов является актуальным, так как получение новых знаний в этой области и методов их коррекции обеспечит снижение отрицательного воздействия на макроорганизм дисбиотических состояний и будет способствовать оздоровлению населения, особенно детей разного возраста.

Цель исследования - выявление закономерностей изменения микрофлоры и специфических и неспецифических факторов иммунитета, осуществляющих местную защиту пищеварительного тракта, и разработка патогенетически обоснованных схем коррекции и профилактики дисбактериозов кишечника. 

Задачи исследования:

  1. Изучить основные закономерности изменений нормальной микрофлоры кишечника при дисбактериозах, обусловленных применением антибиотиков у людей и в эксперименте на лабораторных животных.
  2. Проследить за изменением показателей местного и общего иммунитета, продукцией цитокинов в динамике экспериментального лекарственного дисбактериоза на мышах.
  3. На модели экспериментального лекарственного дисбактериоза оценить характер изменений аллергических показателей и уровня ЛПС грамотрицательных энтеробактерий и аутоантигенов слизистой кишечной стенки (реакция лейкоцитолиза, определение иммуннокомпетентных клеток в собственной пластинке кишечника и в селезенке мышей с дисбактериозом методом простого радиального гемолиза и популяционным уровнем в кишечнике дрожжевых грибов рода Candida.
  4. Разработать клинические и микробиологические критерии оценки взаимоотношений «микроб-хозяин» при дисбиозах и предложить алгоритм диагностики и коррекции микроэкологических нарушений кишечника.
  5. Воссоздать экспериментально вероятный механизм снижения лактазной активности кишечной палочки при глубинном культивировании и изучить корреляцию между снижением лактазной активности эшерихий  и полисахаридазной недостаточностью при дисбактериозе кишечника.
  6. Экспериментально обосновать возможность использования иммунобиологических препаратов нового поколения (НМП), полученных из иммунного молозива, для коррекции дисбактериозов кишечника.

Научная новизна исследования.

Впервые при экспериментальном дисбиозе, обусловленном введением антибиотиков лабораторным животным, выявлены особенности микробиоты толстой кишки, отражающие микробиологические, иммунологические и биологические аспекты взаимоотношений микроб-хозяин.

В эксперименте установлено, что по мере развития дисбиоза кишечника  биотоп толстой кишки колонизируют патогенезированные штаммы условно-патогенных микроорганизмов, обладающие различными протеолитическими факторами патогенности и  персистентными свойствами, в том числе, АЛА, АКА, «АИА» и АИгА, а также эшерихии со сниженной лактазной активностью, особенно, при их транслокации в другие биотопы. Выявлено, что колонизация биотопов ферментативно-активной лактазопозитивной субпопуляцией эшерихий способствует увеличению биологически активных веществ в просвете кишечника.

Впервые экспериментально показано, что при дисбактериозе в кишечнике повышается уровень провоспалительных цитокинов, обуславливая местные воспалительные реакции, а по мере уменьшения дисбиотических нарушений в кишечнике имеет место снижение уровня провоспалительных цитокинов.

Обнаружено, что при экспериментальном дисбиозе кишечника на локальном уровне развиваются процессы аутоаллергизации за счет антигенной общности  липополисахаридов грамотрицательных бактерий и  аутоантигенов слизистой кишечной стенки.

Впервые показано, что аллергические проявления при дисбактериозах коррелируют как с типом вскармливания, так и с проявлениями  антиэндотоксиновых реакций иммунитета на местном уровне.

Впервые установлено, что у детей раннего возраста  дисфункции кишечника и развитие дисбиоза могут быть связаны с наличием ротавирусной инфекции, которая сопровождается снижением активности фермента лактазы в кишечнике. Накопление лактозы и повышение содержания лактозоотрицательных энтеробактерий, связано, по-видимому, с развитием у микроорганизмов процессов ретроградного биохимического ингибирования лактазной активности, развивающегося на фоне высокой концентрации конечных продуктов ферментации лактозы.

Экспериментально установлен новый механизм лечебно-профилактического действия лактоглобулинов против условно-патогенных бактерий путем их воздействия на цитокиновую систему макроорганизма и выявлено иммуномодулирующее действие  нативных низкомолекулярных пептидов, полученных из иммунного молозивного сырья.

Представлена модель развития дисбиоза кишечника с позиции усиления транслокации ЛПС условно-патогенных энтеробактерий из просвета кишечника в подслизистую и системный кровоток, срыва антиэдотоксической иммунной защиты и развития цитокинового дисбаланса.

Теоретическая значимость работы.

На экспериментальной модели лекарственного дисбиоза кишечника показан один из вероятных механизмов развития микроэкологических нарушений в биотопах кишечника с позиции усиления транслокации эндотоксина грамотрицательных бактерий из просвета кишечника в слизистую оболочку с прорывом в лимфу и системный кровоток, ведущей к аутосенсибилизации макроорганизма.

Проведенные исследования служат теоретическим обоснованием использования лактоглобулина против условно-патогенных бактерий и сальмонелл и низкомолекулярных пептидов молозивного происхождения для профилактики и коррекции местных воспалительных реакций через инициацию цитокинового каскада, приводящего к усилению Т-клеточной защиты  кишечника.

Практическая  значимость работы.

Практическая значимость исследования определяется оптимизацией диагностики и проводимой коррекции дисбиотических нарушений в кишечнике у людей разных возрастных категорий на основе комплексного клинико-лабораторного обследования с использованием подходов в изучении изменений свойств микроорганизмов и состояния местной иммунной защиты.

Предложен препарат низкомолекулярных пептидов молозивного происхождения, обладающий интерферон-стимулирующей и бифидогенной активностью, который может быть использован для профилактики дисбиозов кишечника при антибиотикотерапии.

Внедрение результатов исследования

Полученные результаты положены в основу Медицинской технологии «Технология диагностики местных метаболических и иммунологических изменений при дисбактериозах кишечника», разработанной автором совместно с д.м.н. Терновской Л.Н., к.б.н. Голошва Е.В.,  к.б.н. Гапон М.Н (Регистрационное удостоверение № ФС-006/264-У от 25.08.2006г).

Проведены доклинические испытания препарата НМП в эксперименте. Оформлен и направлен на экспертизу проект пакета документов для разрешения проведения 1 этапа клинических испытаний препарата НМП молозивного происхождения: Отчет о проведении доклинических испытаний; Брошюра для исследователя и Проект протокола клинических испытаний на ограниченном контингенте добровольцев.

Патенты на изобретения (в соавторстве)

  1. Патент на изобретение № 2202609 Российская Федерация МПК C12N1/20 // (C12N1/20, C12R1:225), Заявка №2000125959/13 от 12.10.2000, опубликовано 20.04.2003, бюл. №11/ Питательная среда для выделения лактобактерий.
  2. Патент на изобретение № 2299237 Российская Федерация МПК C12N1/14, C12R1/72, Заявка №2005116458/13 от 30.05.2005, опубликовано 20.05.2007, бюл. №14/ Питательная среда для выделения грибов рода Candida.
  3. Патент на изобретение № 23 38197 Российская Федерация МПК G01N 33/53, Заявка №2006128806/15 от 08.08.2006, опубликовано 10.11.2008, бюл. №31/  Способ диагностики степени выраженности дисбактериоза кишечника.
  4. Патент на изобретение № 2409678 Российская Федерация МПК C12P21/00, C07K 1/43, Заявка №2009132802/10 от 31.08.2009, опубликовано 20.01.2011, бюл. №2/ Способ получения низкомолекулярных пептидов, обладающих интерферон-стимулирующей активностью.

Результаты проведенных исследований послужили основой для лекций и практических занятий в рамках специального курса «Медицинская микробиология» и элективного курса «Патогенные бактерии в природных экосистемах» для студентов и магистров факультета биологических наук Южного федерального университета в виде учебных пособий:

  1. Симбионтная микрофлора желудочно-кишечного тракта человека. Дисбактериоз и его коррекция./ Алешукина А.В., Патрушева Е.В., Голошва Е.В. /Методические указания к занятиям по медицинской микробиологии ДО и ОЗО РГУ. -  Ростов – на – Дону: Издательство РГУ. -  2000. -  22с.
  2. Алешукина А.В. Медицинская микробиология Учебное пособие для ВУЗов.- Ростов-на-Дону: Издательство «Феникс». -  2003. -  472с.
  3. Алешукина А.В. Учебно-методическое пособие (электронный вариант) для студентов очно-заочного образования к курсу по выбору «Патогенные бактерии в природных экосистемах» - Ростов-на-Дону : официальный сайт ЮФУ. - 2009.- 48с.

Основные положения, выносимые на защиту:

  1. При дисбактериозах кишечника на фоне снижение колонизирующей способности облигатных симбиотических микроорганизмов происходит потенциирование патогенности условно-патогенных микроорганизмов и их транслокация в несвойственные биотопы организма хозяина.
  2. Одним из механизмов снижения лактазной активности эшерихий может быть подавление ее активности  избытком лактозы, что приводит к накоплению неполных метаболитов, снижению рН кишечного содержимого и ретроградному ингибированию лактазной активности эшерихий.
  3. Микроэкологические нарушения при дисбиозах функционируют по типу хронического воспалительного очага с той особенностью взаимоотношений микроба и хозяина, что в качестве доминирующих инфекционных агентов выступают эндогенные условно-патогенные энтеробактерии и лактозонегативные эшерихии, а в качестве основного антигена при этом действует липополисахарид, который связывается с клетками  макроорганизма, что является причиной аутосенсибилизации при дисбактериозе кишечника.
  4. Основные изменения иммунных механизмов при дисбактериозах происходят на локальном уровне: после введения антибиотика индуцируется  цитокиновый каскад;  затем продукция провоспалительных цитокинов увеличивается в связи с повышением содержания ЛПС УПЭБ; стимулируется выработка антиэдотоксиновых антител. При  усилении транслокации ЛПС из просвета кишечника избыток цитокинов действует эндокринно, активируя антиэндотоксиновые механизмы в организме в целом.
  5. Механизм профилактического  действия НМП молозивного происхождения связан с введением в кишечник параллельно с антибиотиком ИЛ-1, который стимулирует в биотопе врожденный иммунитет и  через активацию ИНФ- влияет на Т-клеточный иммунитет, тем самым сдерживая рост УПМ,  уменьшает «эндотоксиновую агрессию». Содержащаяся в препарате лактоза повышает количество бифидобактерий, что также способствует снижению содержания УПЭБ, стафилококков и кандид.

Апробация работы 

Диссертация апробирована на заседании Ученого совета ФБУН РостовНИИ микробиологии и паразитологии Роспотребнадзора, протокол №7  от 27.12.2010 г.

Основные результаты исследовании  диссертации доложены и обсуждены на 23 российских и международных конференциях, в том числе:  3-й Международной конференции «Актуальные вопросы разработки и производства диагностических питательных сред и тест-систем»  (Махачкала, 2001); VIII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002); Международной научно-практической конференции памяти Г.И.Гончаровой «Пробиотические микрокроорганизмы-современное состояние вопроса и перспективы использования» (Москва, 2002); Международной конференции «Новые технологии в экспериментальной биологии и медицине»  (Ростов-на-Дону, 2007); II Международной научной конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины»  (Ростов-на-Дону,  2008); Международной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями»  (Санкт-Петербург, 2010); Научно-практических конференциях  VI, VII,VIII, IX, X, XI, XII, XIII ,XIV «Кашкинские чтения» (Санкт-Петербург, 2003-2011); III научно-практической междисциплинарной конференции «Микроэкология человека и антимикробная терапия» (Железноводск, 2011).

Публикации

Основное содержание работы отражено в 58 научных публикаций:  в том числе в 15 статей, рекомендованных ВАК РФ, в других изданиях – 1, в материалах конференций - 35, в патентах на изобретение РФ – 4, в учебных пособиях – 3.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на  289  страницах основного текста, содержит 59 рисунка  и 57 таблицы. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов,  5 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы из 382 наименований, в том числе 97 зарубежных и 285 отечественных работ  и приложения.

        1. ОСНОВНОЕ  СОДЕРЖАНИЕ  РАБОТЫ

Материалы и методы.

Материалы. На базе лаборатории микробиологии и разработки ИБП ФБУН «РостовНИИ микробиологии и паразитологии»  был изучен состав микрофлоры кишечника амбулаторно у 1160 человек в возрасте 20-50 лет, перенесших ЗППП и получавших курс антибиотиков широкого спектра действия за 1-2 месяца до обследования. В качестве контрольной группы условно здоровых людей были обследованы сотрудники фирмы ООО «Ростовский водоканал» (199 человек). Были изучены микрофлора кишечника и карты развития ребенка у 323 детей в возрасте от 1 мес. до 3 лет, обратившихся амбулаторно  в ФБУН «РостовНИИ микробиологии и паразитологии» за консультативной помощью.

Прочие объекты и объем исследований представлены в таблице 1. 

Таблица 1. Объекты и объем исследования

  1. Наименование и количество культур микроорганизмов, выделенных при исследованиях на дисбиоз кишечника

Наименование культур микроорганизмов

От  людей с дисбиозами кишечника и условно-здоровых людей 

От  животных при экспериментальном дисбиозе

Bifidobacterium sp Lactobacterium sp.

Escherisсhia coli

Klebsiella sp.

Enterobacter sp.

Proteus sp.

Staphylococcus sp.

Candida sp.

76

280

884

64

58

392  

116

175

66

100

223

62

46

92

-

-

  1. Биологические среды и живые клетки

Наименование

Объем

Печень, селезенка, почка мыши,

Полиморфно - ядерные лейкоциты  крови

  Кровь  мышей 

Супернатанты фекалий  мышей

Смывы  с пристеночного слоя кишечника

Суспензии:

толстой кишки 

селезенки мышей

сыворотки  крови мышей

сыворотки  крови  кроликов 

30 проб

100проб

50проб

540проб

300проб

54проб

54проб

100проб

36проб

При изучении колонизирующей активности симбиотических микроорганизмов в качестве тест-культур были взяты стандартные штаммы микроорганизмов: Сorynebacterium xerosis № 181, Micrococcus luteus var. lysodeikticus (штамм 2665), Shigella sonnei S-form, Klebsiella pneumoniae 211, Proteus vulgaris 21, Proteus mirabilis 115, Staphylococcus aureus 209Р, Salmonella typhimurium 307, Escherichia coli M-17. Штаммы были получены из государственной коллекции патогенных микроорганизмов ГНИИСК им. Л.А.Тарасевича.

Животные. В экспериментальных разделах работы были использованы лабораторные нелинейные животные, полученные в виварии ФБУН «РостовНИИ микробиологии и паразитологи»: белые мыши обоего пола массой 12-14г(1040 штук) для воспроизведения экспериментального дисбактериоза кишечника. Белые мыши массой 16-18г (30штук). Кролики – самцы породы «Шиншилла» весом 2,5 кг (12 штук) НМП; морские свинки обоего пола весом 300 г (6 штук)  при оценке иммуногенности, токсичности и безопасности НМП.

Тестируемые иммунобиологические препараты. Биологические свойства были изучены у Низкомолекулярных пептидов молозивного происхождения  (6 экспериментальных серий); Лактоглобулин против условно-патогенных бактерий и сальмонелл, полученный методом спиртового осаждения. ЛСР-002636/08  (6 серий); Лактоглобулин против условно патогенных бактерий и сальмонелл, полученный методом мембранной фильтрации ЛСР-002636/08 (дополнение № 1 к ПР 0189776-02-061) (6 серий); «Трансфер-Фактор» “Transfer FactorTM” фирма “4 Life Research L.C.” США (1 серия).

Питательные среды.  В работе использовали  стандартные питательные среды производства  НПО «Питательные среды» (Махачкала) и отдела питательных сред ФБУН «РостовНИИ микробиологии и паразитологии» Роспотребнадзора.

Микробиологические методы Определение количественного и качественного состава микрофлоры фекалий при дисбиозе, у людей и при экспериментальном лекарственном дисбактериозе у животных изучали в соответствии с методическими рекомендациями «Бактериологическая диагностика дисбактериоза кишечника (Москва, 1991).

Для исследования мукозной микрофлоры отрезок кишечника длиной 5-7 см трижды промывали фосфатно-солевым буферным раствором (рН=7,2), затем отрезок весом 1г гомогенизировали в ступке с кварцевым песком и переносили в физиологический раствор (рН=7,2). Характер изменений микрофлоры определяли по указанной выше методике. Исследование стерильности желчи и крови проводили в соответствии с МР «Методы бактериологического исследования в клинической микробиологии» (Москва, 1983). Выделенные чистые культуры микроорганизмов идентифицировали по тинкториальным, морфологическим, биохимическим и культуральным свойствам в соответствии с рекомендациями Берджи (1997).

Изучение адгезивной активности исследуемых штаммов производили в соответствии с методикой Брилис В.И. с соавт. (1986). Антагонистическую активность нормальных эубионтов изучали с использованием стандартных тест-штаммов методом отсроченного антагонизма (Биргер М.О., 1982). Персистентные характеристики (АЛА, «АИА», АКА, АИгА) у выделенных культур изучены в соответствии с рекомендациями (Брудастов Ю.А., 1992;  Бухарин О.В. с соавт., 1999; 2004). Способность к колонизации у микроорганизмов оценивали по определению муцинолитической активности, протеолитической (казеинолитической активности). Для этого  получали супернатант суточной бульонной культуры испытуемого штамма, который вносили в лунки (диаметр 4мм), пробитые в 1% агаре «Дифко» (США) с соответствующим субстратом (муцин, казеин), инкубировали при 37°С - 24 ч  и при 6° С – 24 часа во влажной камере. Затем остаточный муцин проявляли 1% спиртово-водным раствором кармина, а казеинолитическую активность – 0,1 N раствором HCl.

Иммунологические методы. Для получения копрофильтратов (супернатантов) 1 г фекалий гомогенизировали, а затем суспензировали в изотоническом растворе натрия хлорида в соотношении 1:10. После центрифугирования при 1500 об/мин.-20 мин надосадочную жидкость (копрофильтрат) отбирали в отдельную емкость и подвергали дальнейшим исследованиям. Определение в копрофильтратах лизоцима проводили в  соответствии с МР  (Бухарин О.В., с соавт.1979). Количество муцина, комплемента и энтерокиназы оценивали общепринятыми методами (Кюнкрикова И.Е, 2000; Фримель Г., 1985, Горская Е.М., с соавт., 1994) . Определение специфических антител к ЛПС грамотрицательных энтеробактерий и комплексному антигену кишечной стенки в биологических средах у животных проводили с помощью  РПГА (Биргер М.О., 1982). Определение  ИАК в собственной пластинке толстого кишечника и в селезенке мышей проводили методом простого радиального гемолиза (Алексеева И.А. с соавт., 1980).  Иммуноглобулины разных классов к ЛПС грамотрицательных энтеробактерий в супернатантах людей обнаруживали методом ИФА (Алешукина А.В., 1998). Цитокины (ИЛ-1, ИЛ-6, ИНФ-) тестировали методом ИФА с использованием стандартных тест-систем («Про-контур», С-П; «Вектор-Бест», Новосибирск; AbDSerotec, Canada; PharMingen, USA; «БиоХимМак», Москва). Постановку реакции лейкоцитолиза и РТМЛ осуществляли общепринятыми методами (Вельтищев Ю.В. с соавт., 1979, Матышева Н.Н., 2000). Феномен Шварцмана  оценивали по отношению к ЛПС грамотрицательных энтеробактерий и комплексному антигену кишечной стенки (Блюгер А.Ф. с соавт., 1980).

Экспериментальные методы. Дизайн основной модели лекарственного дисбиоза кишечника разработан Терновской Л.Н с сотр. (1998 - 1999 гг). Экспериментальный дисбактериоз вызывали путем внутрибрюшинного вве­дения антибиотиков (гентамицина, ципрофлоксацина, цефазолина) в лечебной дозе однократно ежедневно белым беспородным мышам (масса 12-14 г) в течение 5 суток. Взятие исследуемого материала (сыворотки крови, супернатанты фекалий, суспензии кишечных стенок, фекалии и т.д.) проводили на 3,10,17,24 сутки после окончания введения препаратов. Параллельно изучению качественно-количественных изменений состава микрофлоры кишечника с использованием дифференциально-диагностических сред, определяли содержание антиэндотоксиновых антител, антител ккомплексному антигену кишечной стенки мышей, цитокинов, муцина, лизоцима, комплемента, энтерокиназы и т.д. в смывах со слизистой оболочки и в копрофильтратах.





Для характеристики иммунобиологических препаратов (ИБП) использовали дизайн постановки экспериментального лекарственного дисбиоза кишечника (гентамицин), проводя коррекцию нарушений со стороны микро - и макроорганизмов разными иммунобиологическими препаратами. Для каждого ИБП формировалась отдельная группа подопытных мышей. Препараты давались ежедневно в суточной дозе per os в двух вариантах:

  • лечебно-профилактический вариант (ИБП вводили начиная со 2 суток параллельно с антибиотиком и в течение 10 суток);
  • лечебный вариант (ИБП вводили начиная с 3 суток после окончания курса антибиотика в течение 7 суток).

Биологическое изучение препарата НМП на экспериментальных животных проводили, руководствуясь Федеральным законом о лекарственных средствах от 12.04.2010г. №61-ФЗ, РД 42-28-8-89 «Доклинические испытания новых медицинских иммунобиологических препаратов и правилами лабораторной практики в Российской Федерации №263 от 19.06.03г.

Статистическая обработка результатов. Математическую обработку данных проводили с помощью компьютерной программы SPSS 8.0 for Windows для вычисления средних значений и среднеквадратических ошибок, а также сравнения данных вариационных рядов с помощью параметрических методов. Достоверность различий определяли на основании критерия Стьюдента (Боярский А.Я. с соавт., 1985).

Изучение колонизирующей способности лактобацилл, эшерихий и УПЭБ, выделенных от людей с дисбактериозами кишечника и от мышей при экспериментальном лекарственном дисбиозе кишечника выполнено совместно с коллективом сотрудников лаборатории микробиологии и разработки ИБП ФБУН «Ростов НИИ микробиологии и паразитологии» под руководством главного научного сотрудника, д.м.н. Терновской Л.Н., а также с ассистентом кафедры биохимии и микробиологии факультета биологических наук Южного федерального университета к.б.н. Патрушевой Е.В.  Подбор  людей с дисбиозами осуществлялся при амбулаторном приеме главным научным сотрудником, д.м.н. Терновской Л.Н. Изучение лактазной недостаточности и определение ротавирусов у детей проводили совместно с сотрудниками ФБУН «Ростов НИИ микробиологии и паразитологии» к.б.н. Голошва Е.В. и  к.м.н. Колпаковым С.А. Комплексный антиген кишечной стенки был получен по оригинальной методике старшим научным сотрудником лаборатории медицинской паразитологии и иммунологии ФБУН «Ростов НИИ микробиологии и паразитологии», к.б.н. Нагорным С.А. Исследование биологических характеристик препарата НМП выполнено совместно с сотрудниками лаборатории иммунохимии и биотехнологии ФБУН «РостовНИИ микробиологии и паразитологии» под руководством заместителя директора института по научно-производственной деятельности, д.м.н.  Яговкина Э.А. и руководителя лаборатории, к.б.н. Вачаева Б.Ф. Патоморфологические исследования органов экспериментальных животных при определении токсичности и реактогенности препарата НМП проводили совместно с руководителем патологоанатомической лаборатории ГУЗ Ростовской области «Патологоанатомическое бюро»,филиал в г.Ростове-на-Дону, к.м.н. Кириченко Ю.Г.

          1. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ  И  ИХ  ОБСУЖДЕНИЕ

Микроэкологические нарушения в биотопах кишечника у мышей с экспериментальным дисбиозом.

Было обнаружено, что в биотопах кишечника при экспериментальных дисбиозах, обусловленных разными антибиотиками широкого спектра действия, происходят однотипные нарушения в составе микрофлоры, связанные с уменьшением содержания облигатных микроорганизмов и повышением количества УПМ. Щадящим действием по отношению к микрофлоре просветного уровня обладали в убывающей последовательности: ципрофлоксацин→ цефазолин→ гентамицин. В  мукозном и просветном уровнях кишечника  при экспериментальных дисбиозах, обусловленных разными антибиотиками,  происходили синхронные количественные изменения состава микроорганизмов с тенденцией к транслокации факультативных представителей из просветного уровня в более глубокие слои (пристеночный→мукозный уровень кишечника), а также в другие биотопы организма → желчный пузырь и кровь. Наиболее показательными изменениями собственной микрофлоры характеризовалась модель дисбиотических нарушений при применении гентамицина, дизайн которой использовали в качестве базового для последующих исследований качественно-количественных нарушений симбионтов, а также для изучения ряда иммунных показателей (Рис.1 А,Б,В,Г). 

После отмены антибиотиков у экспериментальных животных изменения состава микрофлоры в биотопах кишечника начинались  снижением содержания облигатных симбиотических микроорганизмов (бифидобактерий, лактобацилл и лактозопозитивной кишечной палочки) (Рис.1 А и 1Б). Умеренные изменения содержания этих микроорганизмов  были соотносимы с Д- I степени (в соответствии с критериями ОСТ 2003). Начиная с 6 суток после отмены антибиотиков, изменения состава микрофлоры усугублялись за счет нарастания количества эшерихий со сниженной лактазной активностью и УПМ  на фоне сохраняющегося снижения содержания бифидо- и лактобактерий с транслокацией симбионтов в другие биотопы пищеварительного тракта сначала в мукозный слой (Рис.1 В,Г.), затем -  в желчный пузырь . Бактериемия была зафиксирована с 10 суток после отмены антибиотиков (Рис. 2). Стойкое снижение содержания облигатных симбионтов, увеличение ассоциаций УПМ  (Д- II-Д-III) продолжались на  10-17 сутки после отмены антибиотиков. Для биотопов кишечника было характерно разнообразие представителей рода Staphylococcus, рода Proteus  и семейства Enterobacteriacae. В содержимом желчного пузыря и в крови высевались (в порядке убывания частоты встречаемости): E.coli СЛА, Enterobacter spp., Proteus spp., Klebsiella spp.  Было отслежено распространение доминирующих транслокантов. E.coli со сниженной лактазной активностью выделялись из следующих биотопов: на 3 сутки после отмены антибиотиков – из пристеночного слоя слизистой тонкой кишки и желчного пузыря; на 10 сутки – из желчи и слизистой  желчного пузыря; на 17-24 сутки - из желчного пузыря и крови. Аналогичные тенденции транслокации в нетипичные биотопы у мышей были обнаружены для Enterobacter spp., Proteus spp., Klebsiella spp. соответственно на 6-10 сутки - в мукозный уровень и желчный пузырь, на 17-24 сутки - в желчный пузырь и кровь.

Степень выраженности дисбиотических нарушений коррелировала с клиническими изменениями состояния животных. При декомпенсированном дисбиозе в 100% случаев было зафиксировано ухудшение состояния шерстяного покрова, снижение аппетита, разжижение фекалий. При более легких вариантах нарушения состава микрофлоры кишечника – клинические изменения были менее выражены или отсутствовали вообще.

Рисунок 1 А,Б,В,Г.. Изменение состава микрофлоры в биотопах толстой кишки у мышей при экспериментальном дисбиозе, обусловленном гентамицином.

Рисунок 2. Изоляты микроорганизмов из разных биотопов при экспериментальном дисбиозе кишечника (гентамицин).

Отсроченные наблюдения изменений состава микрофлоры кишечника после проведения курса гентамицина показали, что у экспериментальных животных на 28-32 сутки происходила в целом самостоятельная нормализация показателей. Уже на 28 сутки после отмены препарата количество лактобацилл и бифидобактерий было сопоставимо  с исходным уровнем, на 28 –30 сутки происходило снижение содержания УПМ и эшерихий с измененной лактазной активностью. К 32 суткам была отмечена нормализация количества дрожжевых грибов рода Candida. У выделенных симбионтов были изучены колонизирующие свойства и определены критерии персистенции.

При экспериментальном дисбиозе кишечника произошло умеренное усиление антагонистической активности бифидобактерий; при этом было зафиксировано увеличение частоты встречаемости изолятов, характеризующихся средней и высокой  муциназной, казеинолитической и лизоцим - продуцирующей активностью. Казеинолитическая и лизоцим – продуцирующая активности при дисбиозе были более выражены у изолятов мукозного слоя. Бифидобактерии у интактных животных изначально обладали выраженными персистентными свойствами, что предопределено их важной ролью в колонизационной резистентности. Усиление в совокупности колонизирующей способности и  персистентных свойств у бифидобактерий при дисбиозах кишечника, по-видимому, носит компенсаторный характер для поддержания равновесия в биотопах на фоне снижения  количества этих микроорганизмов. Лактобациллы при  дисбиозе у мышей обладали низкой адгезивностью и антагонистической активностью. У изолятов обоих биотопов толстого кишечника при дисбиозе было зафиксировано увеличение муциназной активности. Частота встречаемости протеолитически активных лактобактерий при дисбиозе в обоих биотопах была снижена.

        Эшерихии НЛА  были слабо  потенциально патогенными, однако  среди этих изолятов также отмечено повышение встречаемости штаммов с высокими АЛА, АКА, АИгА, казеинолитической и муциназной способностями по сравнению с культурами от интактных животных. Для эшерихий НЛА было обнаружено повышение АЛА и АКА среди штаммов, выделенных из нетипичных для них биотопов. Эшерихии СЛА (сниженная лактазная активность) по сравнению с эшерихиями НЛА при дисбиозах характеризовались сниженной  антагонистической активностью. Для эшерихий СЛА при смене биотопа кишечника или при транслокации их через кишечный барьер в целом было характерно усиление ферментативной активности. Однако в отношении E.coli СЛА была выявлена изначально более высокая ферментативная активность по отношению к муцину, лизоциму и комплементу. Протеолитическая активность и АИгА по частоте встречаемости коррелировали между собой.  Эшерихии СЛА по своей потенциальной патогенности занимали промежуточное положение между УПЭБ и эшерихиями НЛА и  сохраняли тенденции усиления ферментативной активности у изолятов, выделенных из несвойственных им биотопов. Подобное проявление патогенности позволяет отнести эшерихии СЛА, изолированные из внекишечных биотопов  к разряду условно-патогенных микроорганизмов. Условно патогенные энтеробактерии  обладали изначально высокими муциназной, казеинолитической, АЛА, АКА и АИгА, которые при дисбиотических нарушениях усиливались  вне зависимо от биотопа, из которого были выделены культуры. Была прослежена корреляция казеинолитической активности всех представителей энтеробактерий и антииммуноглобулиновой активности.

       Факт обнаружения у большинства УПЭБ АКА и АЛА со средними и высокими значениями указывает на существенную патогенетическую роль этих факторов в развитии дисбиоза кишечника. Самый распространенный признак был АКА, который оказался характерным для большинства культур клебсиелл, цитробактеров и энтеробактеров. АЛА регистрировалась менее часто и была обнаружена у клебсиелл, цитробактеров и энтеробактеров.        Что касается способности инактивировать бактерицидный компонент  интерферона («АИА»), то наибольшей активностью обладали эшерихии СЛА и цитробактеры.

Увеличение количества УПМ в кишечнике и повышение патогенности закономерно способствовали изменениям количества факторов неспецифической и специфической защиты, которые по сути проявлялись  выраженной воспалительной реакцией на местном уровне. Подтверждением этому служило увеличение содержания муцина, лизоцима, комплемента, ИНФ- и антиэндотоксиновых антител в биотопах толстого кишечника. Особенно это было очевидным при субкомпенсированном  и декомпенсированном вариантах дисбиоза. Нарастание муцинолитической активности у представителей симбионтной микрофлоры, повышение уровня антиэндотоксиновых антител, увеличение содержания ИНФ- могут быть расценены как неблагоприятный признак и наличие тенденции к хронизации воспалительного процесса с аутоиммунным компонентом. В целом усиление ферментативной активности симбиотических микроорганизмов коррелирует с повышением содержания в просвете кишечника субстратов, что может быть использовано в качестве диагностического и прогностического критерия стадии развития дисбиотических нарушений.

Изменение иммунных показателей на местном уровне при экспериментальном дисбиозе и явление аутосенсибилизации.

Нами была выявлена активация или снижение фагоцитарных процессов ПЯЛ крови, совпадающие по срокам  со сменой биотопов УПЭБ. Патрушевой Е.В., Голошва Е.В., Терновской Л.Н. и др. (2000-2005гг.), когда были отмечены изменения кислород-зависимых бактерицидных систем перитонеальных макрофагов, которые по  срокам наблюдения также совпадали с транслокацией грамотрицательных энтеробактерий через кишечный барьер. Снижение активности профессиональных фагоцитов отмечалось синхронно с исчезновением этих микроорганизмов из крови. Что свидетельствует о временном характере данных иммунных изменений на системном - организменном уровне.  Увеличение суммарного лизоцима, относящегося к кислород-независимым бактерицидным системам, определялось в супернатантах фекалий в процессе дисбиоза кишечника при использовании всех испытуемых антибиотиков и коррелировало со степенью выраженности качественно-количественных изменений состава микрофлоры. Мобилизация всех бактерицидных систем при дисбиозе предназначена для локализации начинающегося воспалительного процесса на местном уровне в кишечнике. Определение количества лизоцима в копрофильтратах может быть использовано в качестве оценки степеней дисбиоза кишечника у людей.

При экспериментальном лекарственном дисбиозе кишечника, обусловленном применением антибиотиков разных групп, происходили однотипные изменения ППН не только по отношению к ЛПС энтеробактерий, но и к КАгКС. Результаты реакции лейкоцитолиза коррелировали с данными реакции торможения миграции лейкоцитов по отношению к обоим тестируемым антигенам, что свидетельствовало об аллергическом - аутоиммунном компоненте. Появление местных геморрагико-некротических изменений в месте введения тестируемых антигенов и длительное сохранение проявлений феномена Санарелли-Шварцмана, а также нарастание уровня антител к ЛПС и КАгКС с преобладанием Ig класса М в поздние сроки наблюдения являются экспериментальным подтверждением  наличия аутоиммунного процесса при дисбактериозе кишечника.

Была выявлена тесная корреляционная связь изменений титров антител к ЛПС грамотрицательных энтеробактерий и КАгКС (+0,8±0,2). Содержание IgM в супернатантах фекалий достоверно превышало исходный уровень в 65±3,0% проб к обоим антиге­нам. Количество IgM находилось в обратной корреляционной зависимости от общего ко­личества антител (-0,7±0,3). Уровень общих антител в мукозном слое был изначально на порядок выше, чем в супернатантах фекалий, и составлял в контрольной группе 1:200х1:2 по отношению к обоим антигенам.  При дисбиозе были зафиксированы синхронные изменения титров  антител не только по отношению к обоим тестируемым антигенам, но и  по отношению к титрам, определенным в копрофильтратах. Пики подъемов показателей приходились соответственно на 3 (1:380-1:1600) и 18 (1:300-1:1600) сутки. А спады показателей отмечены на 10 день (1:250 – 1:500).  В пристеночном уровне было отмечено другое распределение приоритетов действия препаратов (в порядке убывания выраженности): ципрофлоксацин→гентамицин→ цефазолин.

Аналогичная картина наблюдалась и при определения соотношения макроглобулиновых  и микроглобулиновых фракций иммуноглобулинов в супернатантах фекалий в процессе экспериментального дисбактериоза. Было отмечено, что повышение содержания IgM в пробах было зафиксировано на 3-6 сутки от окончания курса антибиотиков, что коррелировало с повышением количества эшерихий со сниженной ферментативной активностью при оценке микрофлоры кишечника. Второй пик повышения содержания макроглобулиновых фракций иммуноглобулинов коррелировал с повышением содержания эшерихий СЛА и УПЭБ в фекалиях животных и был зафиксирован на 17 сутки наблюдения.

Полученные результаты повышения анти-ЛПС-антител в просвете толстой кишки, коррелирующего с нарастанием количества грамотрицательных энтеробактерий в фекалиях, свидетельствуют, что  напряженность антиэндотоксинового иммунитета при дисбиозе в основном была сосредоточена на уровне биотопов толстой кишки, т.к. уровень общих антител к обоим антигенам в сыворотках крови в процессе экспериментального дисбиоза был ниже диагностически значимого и находился в тех же значениях, что и в контрольной группе животных (0-1:10). В дни эксперимента с зафиксированной  транслокацией энтеробактерий в кровь титры общих анти-ЛПС-антител крови не повышались и было обнаружено только повышение содержания макроглобулиновых фракций, специфичных к обоим тестируемым антигенам: в 2-3 раза для ЛПС и 2-4 раза для КАгКС. Динамика выявления анти-ЛПСантител в разных биотопах при экспериментальном дисбиозе, обусловленном гентамицином представлена на  (Рис. 3).

Рисунок 3. Изменение уровня антител к ЛПС в супернатантах фекалий, смывах с мукозного слоя и в сыворотках крови экспериментальных животных (гентамицин).

Стимуляция активности ИАК в селезенке, сенсибилизированных к ЛПС и КАгКС, была зафиксирована по срокам наблюдения одновременно с транслокацией симбиотических грамотрицательных энтеробактерий в несвойственные им биотопы (на 10 -17 сут.), что свидетельствовало о подключении иммунологических реакций на системно-организменном уровне. Последовательное изменение ППН,  показателей РТМЛ, титров антиэндотоксиновых антител, динамики соотношений макроглобулиновых фракций Ig, содержания ИАК в стенке толстого кишечника происходило сначала (на 3-6 сутки наблюдения) по отношению к ЛПС, затем (на 6-11 сутки) - по отношению к КАгКС, что  свидетельствовало в пользу инфекционно-аутоаллергического механизма развития воспаления при экспериментальном дисбиозе кишечника. Сводные показатели аллергизации в разных биотопах в эксперименте представлены в таблице 2.

Таблица 2. Сводные данные показателей аллергизации ЛПС и КАгКС у мышей с экспериментальным дисбиозом кишечника, обусловленным гентамицином

Исходный уровень

Показатели при экспериментальном дисбактериозе

Средний титр анти-ЛПС-антител,  (М х m)

1:10х1,5

1:200х1,5*

Средний титр антител к КАгКС, (М х m)

1:10х1,5

1:100х1,5*

Удельный вес макроглобулиновых фракций (ЛПС), %

10±1,9

61,2±3,8*

Удельный вес макроглобулиновых фракций (КАгКС), %

10±1,9

56,7±3,6*

ППН (ЛПС), %

10±1,9

66,8±4,0*

ППН (КАгКС),%

10±1,9

62,7±3,8*

РТМЛ (ЛПС), %

69,0±7,3

36,5±2,8*

РТМЛ (КАгКС), %

61,1±7,7

46,5±3,0*

Иммуноактивные клетки селезенки (ЛПС), %

16,0±3,7

82,0±1,8*

Иммуноактивные клетки  селезенки (КАгКС), %

15,3±3,6

81,5±1,8*

Иммуноактивные клетки толстой кишки (ЛПС), %

12,0±3,7

67,5±4,0*

Иммуноактивные клетки  толстой кишки (КАгКС), %

8, 7±2,8

52,5±3,4*

Феномен Санарелли-Шварцмана (ЛПС)

Некроз фиксирован со 2 суток по 24 сутки после отмены антибиотиков

Феномен Санарелли-Шварцмана (КАгКС)

Некроз фиксирован с 3 суток по 24 сутки после отмены антибиотиков

*- различия  достоверны (p< 0,05)

Полученные экспериментальные данные синхронных изменений инфекционно-аллергического характера позволили использовать ЛПС грамотрицательных энтеробактерий для оценки  аутоиммунных процессов в проведении исследований у людей с дисбиозами кишечника.

В серии экспериментов было изучено изменение содержания в просвете кишечника у мышей провоспалительных  цитокинов: ИЛ-1, ИЛ-6 и ИНФ-.  В отличие от предыдущей серии экспериментов, кроме исходного уровня состояния микрофлоры кишечника и содержания цитокинов в супернатантах фекалий оценивались  изменения  этих параметров на 2 сутки от начала введения гентамицина. Было обнаружено, что при отсутствии качественно-количественных нарушений со стороны собственной микрофлоры биотопа в супернатантах было выявлено достоверное повышение количества ИНФ- (в  4,1 раза), в то время как количество ИЛ-1 и ИЛ-6 достоверно снизилось (в 3,01 и 3 раза соответственно). Такие результаты могут свидетельствовать о том, что при парентеральном способе введения гентамицина в суточной дозе уже в ранние сроки происходило системное изменение уровня цитокинов. Индуктором для цитокинов, вероятно, выступал антибиотик. Для исключения влияния повреждающего фактора (внутрибрюшинной манипуляции) у контрольной группы животных, получивших только манипуляцию с изотоническим раствором хлорида  натрия, провели аналогичные  исследования по определению цитокинового уровня в супернатантах фекалий и исследованию микрофлоры кишечника.  Результаты изменения уровня цитокинов и состава микробиоты достоверно не отличались от данных исходного уровня. При повышении содержания в просвете кишечника УПЭБ и E.coli СЛА  с 6 суток после отмены антибиотика было отмечено последовательное  повышение ИЛ-1β ИНФ-γ ИЛ-6 с достоверным превышением исходных показателей (Рис. 4) .

Было целесообразно оценить изменение уровня цитокинов в супернатантах фекалий у животных с экспериментальным дисбактериозом кишечника особенно в сроки,  когда были зафиксированы микроорганизмы кишечника в содержимом желчного пузыря и крови – т.е. на 10 и 17 сутки после отмены антибиотика. Именно в эти дни была отмечена повышенная продукция ИЛ-1 и ИЛ-6 (в 10 и 2 раза соответственно). Повышение уровня ИНФ- и ИЛ-6 на поздних сроках экспериментального дисбиоза кишечника может быть расценено как неблагоприятный признак для исхода процесса с развитием аутоиммунных нарушений при дисбактериозах.

Рисунок 4. « Цитокиновый каскад» при экспериментальном дисбиозе кишечника у мышей

        При дисбактериозе кишечника с преобладанием УПЭБ происходящая перегрузка ЛПС может вызывать гиперпродукцию провоспалительных цитокинов. При этом на местном уровне основную роль выполняют цитокины семейства ИЛ-1, которые ответственны за все последовательные этапы развития адекватного ответа на внедрение патогена, обеспечение локализации и удаления микроорганизмов, а затем восстановления поврежденной структуры тканей, где бы ни развивалась воспалительная реакция. В случае несостоятельности местных защитных реакций воспаление продолжает развиваться, происходит снижение колонизационной резистентности организма и как следствие - транслокация УПЭБ и эшерихий через кишечный барьер при  дисбактериозах, при этом возрастает синтез цитокинов, они попадают в циркуляцию и их действие проявляется на уже системном уровне, что проявляется в системной воспалительной реакции или в виде острофазного ответа на уровне организма. В этом случае ИЛ-1 оказывает влияние практически на все органы и системы организма, участвующие в регуляции гомеостаза и обеспечивает их включение в организацию и регуляцию единой защитной реакции. Обычно ИЛ-1 обеспечивает «сигнал тревоги», означающий, что настало время влючать все резервы  для борьбы с внедрившимся патогеном. При дисбиозах с массивным поступлением ЛПС грамотрицательных энтеробактерий ИЛ-1 участвует в регулировании антиэндотоксинового иммунитета на местном и системном уровнях.

Изменения колонизирующей активности микрофлоры кишечника у людей с дисбиозами.

Основные изменения микрофлоры кишечника у людей, получавших антибиотики широкого спектра действия характеризовались: достоверным снижением содержания бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий НЛА (облигатная группа симбиотических микроорганизмов); достоверным повышением содержания эшерихий СЛА, условно-патогенных энтеробактерий, стафилококков и дрожжеподобных грибов рода Candida (факультативная группа симбиотических микроорганизмов); достоверным учащением выявления транзиторных золотистых стафилококков, повышением количества гемолитических эшерихий и кокковых форм.

Проведенные исследования показали усиление колонизирующей способности бифидобактерий при дисбиотических нарушениях. По сравнению с культурами условно-здоровых людей произошло повышение антагонистической активности к тестируемым патогенным микроорганизмам в 2,5-6,4 раза; по отношению к тестируемым условно-патогенным бактериям-3,2-7,0 раз; по отношению к эшерихиям – в 2,6 раза. Было зафиксировано повышение лизоцим- продуцирующей способности в 20 раз; повышение АЛА до 100%.        В количественном отношении лактобациллы при дисбиозах кишечника изменялись чаще, чем бифидобактерии. У практически здоровых людей был обнаружен более разнообразный видовой состав лактобактерий. При дисбиозах  происходило увеличение количества лактобактерий, обычно выявляемых из других биотопов (таких как L.salivarius ). По данным Голошва Е.В., Терновской Л.Н. с соавт. (1999, 2005 гг) лактобактерии здоровых людей обладали более высокой адгезивной активностью по сравнению с культурами от людей с дисбиотическими нарушениями.  Адгезирующая активность непосредственно к клеткам (в равной степени эритроцитам, эпителиоцитам и т.д.) считается несвойственной для лактобацилл. Более существенной является способность у лактобацилл образовывать лизоцим,  слизистые секреты и т.д., способствующие агрегации молочнокислых бактерий в «биологическую пленку», свободно располагающуюся между криптами кишечной стенки. В наших исследованиях антагонистическая активность лактобацилл здоровых людей по отношению к условно патогенным микроорганизмам  была ниже чем у изолятов от людей с дисбиозами кишечника. Представляется, что дисбиотические изменения, т.е. качественно-количественные сдвиги в микрофлоре, изменения рН, изменение метаболических процессов и т.д. стимулируют потенциальную антагонистическую активность лактобацилл по отношению к УПЭБ, а также по отношению к представителям собственной микрофлоры (E.coli), компенсаторно усиливая, таким образом, колонизационную резистентность макроорганизма. Антагонистическая способность по отношению к облигатно патогенным микроорганизмам (шигеллам) в обеих группах оставалась стабильно высокой. Факторы персистенции (АЛА, “АИА”, АКА, АИгА) при дисбактериозах кишечника изменялись для эшерихий и для условно патогенных энтеробактерий. Для эшерихий эти показатели изменялись вне зависимости от  лактазной активности этих микроорганизмов. Было отмечено снижение частоты выявления эшерихий, обладающих выраженной АЛА и АКА, в тоже время частота встречаемости АИгА и “АИА” активностей увеличивалась. АЛА, АКА, АИгА эшерихий СЛА коррелировали по частоте выявления высоко - и низкоактивных культур в прямой тесной взаимосвязи с аналогичными признаками УПЭБ (0,8 ±0.2). В отношении “антиинтерфероновой” активности в этих сопоставляемых группах была обнаружена обратная корреляция (-0,7±0,3). Казеинолитическая активность эшерихий НЛА при дисбиозах оставалась стабильной. Для эшерихий СЛА и УПЭБ при дисбиозах было отмечено снижение частоты выявления протеолитически активных культур; Казеинолитическая активность всех энтеробактерий коррелировала с антииммуноглобулиновой активностью (0,8 ±0.2). При дисбиозах кишечника в этой группе изолятов по сравнению с аналогичными бактериями у условно-здоровых людей отмечено снижение частоты выявляемости штаммов, обладающих муциназной активностью.

При дисбиозах кишечника слабо изученными остаются микроскопические грибы. В наших исследованиях мы оценивали не только их количество, но были охарактеризованы таксономические и биологические свойства.  По количеству выявляемых Candida spp. 38.7±1,5% всех случаев дисбиозов могли быть расценены как инвазивный кандидоз кишечника. Candida nonalbicans выделялись в 77,4±1,3%, а  C.albicans - в  22,6±1,3% случаев.  Среди Candida nonalbicans чаще всего регистрировались: C.crusei (30,1±1,4%);  C. brumptii (13±1,0%). Адгезивная способность Candida spp., выделенных из фекалий людей с дисбиозами кишечника была низкой вне зависимости от количества микромицетов в 1 г исследуемого материала. Филаментация Candida spp. в 100% коррелировала с адгезивностью  и также не зависела от количества определяемых микромицетов. Антагонистическая активность  Candida spp., выделенных в количестве превышающем статистическую норму, была выявлена по отношению ко всем тест-штаммам Антагонистическая активность Candida spp. возрастала  параллельно с изменением содержания микромицетов в содержимом кишечника. При этом усиливались лизоцим-продуцирующая, муколитическая и казеинолитическая способности Candida spp.  АИгА также имела тенденцию к повышению. АКА была стабильно высокой в  обеих группах Candida spp. В целом колонизирующая способность Candida spp. возрастала при увеличении их содержания в  исследуемом материале.

Аллергия и дисбактериоз у детей. Основными причинами развития дисбиотических изменений у детей до 1 года были нарушения со стороны питания малышей: раннее искусственное вскармливание,  переход (часто необоснованный) с естественного вскармливания на искусственное, быстрое и раннее введение прикормов, беспорядочная необоснованная смена  смесей для вскармливания, «свободное (по требованию)» вскармливание, использование для питания малышей неадаптированных к детскому пищеварению «взрослых» продуктов и т.д. Анализ историй развития детей, обследованных на дисбиоз кишечника, показал высокую частоту встречаемости неврологической патологии пери - и постнатального периода, увеличение частоты встречаемости жалоб на  проявления атопического дерматита у этих детей и распространенность среди данного контингента дисбиотических нарушений в кишечном биотопе. Многофакторный анализ показал наличие взаимосвязи этих признаков с использованием рангового коэффициента конкордации. Значимость коэффициента конкордации проверена на основе критерия Пирсона (α=0,05, ν=6), что свидетельствовало о сильной связи между рассматриваемыми признаками.

В супернатантах фекалий  детей были обнаружено увеличение содержания различных классов иммуноглобулинов,  специфичных ЛПС грамотрицательных энтеробактерий, аналогичное результатам, полученным у взрослых людей. Была выявлена зависимость повышения титров антиэндотоксиновых антител от степени выраженности дисбиотических нарушений. Уровень антиэндотоксиновых антител у детей раннего возраста (1-6 мес.) зависел от  типа вскармливания. Аллергизация у детей коррелировала с качественно-количественными изменениями состава микрофлоры кишечника и повышением уровня антиэндотоксиновых антител классов IgE и IgM на фоне снижения содержания IgA. При этом, чем выше был уровень анти-ЛПС-антител классов Е и М,  тем чаще встречаются аллергические проявления у детей (0,8±0,2).         Ассоциативные дисбиотические нарушения на фоне снижения пассивной иммунизации детей молоком матери приводят к более стойким  изменениям местного антиэндотоксинового иммунитета, которые, по всей видимости, являются причиной длительно сохраняющихся аллергических проявлений у детей (о чем свидетельствует высокий процент атопического дерматита у детей старше 1 года с Д-III).        Коррекция нарушений микрофлоры у детей без учета данных анамнеза и дополнительных обследований  и назначений специалистов (невролога, гастроэнтеролога, иммунолога, аллерголога) была практически неэффективна, что не исключало (а в некоторых случаях являлось причиной) развитие воспалительных процессов в желудочно-кишечном тракте.  У обследованных детей раннего возраста  в 86,4±3,3% – 100% прослеживалась взаимосвязь:  стрессорные реакции→нарушение моторики кишечника → воспалительные реакции в кишечнике + нарушения состава микрофлоры→ наличие  атопического дерматита.  Принципиальным, на наш взгляд, является обнаружение основной причины неврологических расстройств и ее устранение, в противном случае эффективность лечения каждого составляющего  цепочки будет минимальная и непродолжительная.

            1. Индивидуальный подход в коррекции дисбиотических нарушений в кишечнике

1. Увеличение спектра изучаемых микроорганизмов Проведенные многофакторные  исследования содержания ротавирусов в копрофильтратах и состава микрофлоры показали, что у людей, обследовавшихся по поводу дисбактериоза кишечника, был выявлен высокий уровень содержания ротавирусов в копрофильтратах (93,6±2,3%). При высоком и средневысоком содержании ротавирусов в копрофильтратах было обнаружено увеличение частоты встречаемости субкомпенсированных и декомпенсированных вариантов дисбиотических нарушений (70,4-88% положительных проб).  У обследованых людей на дисбиоз кишечника были выделены  сальмонеллы и шигеллы (соответственно 0,35±0,25% и 0,35±0,16%), которые по ряду критериев (полиантибиотикорезистентность, снижение чувствительности к бактериофагам, нарастание устойчивости к УФ-облучению и дезинфекционным средствам, высокие показатели АЛА) характеризовались, как штаммы от бактерионосителей, вероятно, внутрибольничного происхождения.

У людей с дисбактериозами обнаружение  представителей рода Staphylococcus распределилось следующим образом: Staphylococcus aureus составляли 23,2±1,3% случаев; Staphylococcus epidermidis, выявляемые свыше статистической нормы lg 4 КОЕ/г –37,4±1,5% случаев. Преобладание эпидермальных стафилококков у людей с дисбиозами кишечника является закономерным.  S. epidermidis характеризуется слабой вирулентностью и их чаще наблюдают у пациентов со сниженным иммунитетом. В группе стафилококков,  отнесенных к S. aureus, было выявлено варьирование основных критериев дифференциации. По признаку пигментообразования 72±4,3%  могли быть отнесены  к S aureus; по способности разжижать желатин-68,5±4,4% культур; по способности редуцировать маннит-70,2±4,3%; по лецитовителазной активности – 64,8±4,5%. Плазмокоагулирующей способностью обладали 100% штаммов. Все признаки идентификации одномоментно были зафиксированы у 62,2±4,6% (69 культур). Остальные культуры могут быть отнесены к Staphylococcus  Intermedius. 

2. Использование косвенных способов диагностики степени выраженности дисбиозов для  уточнения индивидуальной схемы коррекции состояния микрофлоры

       Оценка напряженности антиэндотоксинового иммунитета в кишечнике в более ранние сроки позволит проводить энтеросорбцию. Диагностическая иммунноферментная тест-система для определения анти-ЛПС-антител, принадлежащих к разным классам иммуноглобулинов, позволила провести анализ ответной иммунологической реакции на местном уровне у людей с разными степенями дисбиозов кишечника. Установлена корреляционная зависимость между содержанием антиэндотоксических антител в копрофильтратах и степенью выраженности дисбиозов кишечника, определяемой бактериологическим методом. При этом отслеживалась тенденция, которая может быть использована как диагностический критерий – титры  выявляемых классов иммуноглобулинов нарастали с увеличением степени дисбиозов и находились в диапазоне изменения титров при легких степенях –от 0 до 1:150; при средне-тяжелых вариантах –1:200-1:400 и при тяжелых- свыше 1:400. Наиболее показательными оказались данные, полученные при исследовании антител к ЛПС, относящихся к классам А и Е. Предложенный способ диагностики является существенным дополнением к микробиологическому исследованию особенно в раннем определении субкомпенсированных и декомпенсированных вариантов дисбиозов кишечника.

Определение энтерокиназы в копрофильтратах как экспресс-тест степеней выраженности дисбиоза кишечника. Как показали исследования, была обнаружена прямая тесная корреляционная взаимосвязь между степенью выраженности дисбиозов и количеством энтерокиназы в копрофильтратах. Для  Д        - I  содержание энтерокиназы находилось в пределах от 20 до 100 мкг/мл; для Д- II- от 100 до 300 мкг/мл; для  Д-III – от 350 и выше мкг/мл. По сравнению с количеством энтерокиназы у практически здоровых людей (до 20 мкг/мл) отмечено достоверное повышение энтерокиназы при дисбактериозах в зависимости от степени: соответственно в 5, 15, 20 и выше раз. Частота выявления этого признака у людей с дисбактериозами кишечника колебалась в пределах 85-95%, что  позволяет использовать данный критерий в диагностических, терапевтических и прогностических целях.

Изучение содержания муцина в копрофильтратах позволяет оценить выраженность воспалительной реакции в кишечнике. Для  Д- I диапазон количества муцина определен как 1-5 мкг/мл (в 4-х крестовой системе  +,++); для Д- II- 6-10 мкг/мл (соответственно +++); для  Д- III- свыше 11 мкг/мл (соответственно ++++). По сравнению с содержанием муцина в копрофильтратах практически здоровых людей (до 1 мкг/мл) при дисбактериозах кишечника  происходило увеличение содержания муцина соответственно в 5, 10 и более раз. Так же обнаружено, что частота выявления признака при определении количества муцина в копрофильтратах людей с дисбактериозами колеблется в приделах 81-92%  исследованных образцов, что делает возможным использовать данный критерий для ранней, ориентировочной диагностики степени тяжести нарушений, прогнозирования течения, а также для назначения адекватной коррекции.

Определение содержания лизоцима в копрофильтратах экспресс-метод диагностики дисбактериоза кишечника. Полученные данные свидетельствовали, что у людей с Д- I  содержание лизоцима в  1 мл копрофильтрата  определялось в пределах 1,9±0,05 мкг (соответственно в 1 г испражнений - 39,4±1,2 мкг). Совпадение признака в разных пробах составляло - 82,4±1,3%.  При Д-II - количество лизоцима находилось в пределах - 2,67±0,1мкг/мл (54,2±1,3 мкг/г) - совпадение признака 88,6±1,1%; при Д - III - количество лизоцима находилось в пределах- 6,0±0,27 мкг/мл (120,5±4,1мкг/г) - совпадение признака 86,9±1,2%.        У условно- здоровых людей показатели распределились следующим образом: - количество лизоцима находилось в пределах - 1,2±0,01мкг/мл (21,1±0,2 мкг/г) - совпадение признака 83,7±1,3%. Была отмечена достоверная  разница показаний количества лизоцима в копрофильтратах условно-здоровых людей и людей с дисбиозами кишечника, что может служить диагностическим критерием и использовано как экспресс-метод.

К  вопросу о снижении лактазной способности эшерихий при дисбиозах кишечника и лактазной недостаточности у детей.

Лактазная недостаточность у детей и изменение микрофлоры кишечника. Сопоставление  результатов обследования на дисбиоз кишечника  детей  с зафиксированной лактазной недостаточностью  и  группы детей, у которых показатели лактозы в копрофильтратах были в пределах возрастной нормы, выявило следующее: снижение содержания бифидобактерий было обнаружено в обеих группах детей в 100% случаев. У детей с лактазной недостаточностью достоверно были зафиксированы: снижение содержания лактобактерий (23,9±2,9% и 53,9±3,4% соответственно); повышение количества эшерихий СЛА и частоты выявления УПЭБ (23,9±2,9% и 58,7±3,4% соответственно); повышение частоты случаев с увеличением количества патогенных стафилококков (14,1±2,4% и 52±3,4% соответственно); увеличение высеваемости дрожжеподобных грибов рода Candida (10,7±2,1% и 26,3±3,0% соответственно). Ротавирусы были обнаружены в 68,5±3,2% случаев. Наиболее часто ротавирусная инфекция при этом выявлялась у детей 1мес.-6 мес. (76,7±2,9% от всех положительных проб).

Экспериментальное обоснование появления эшерихий со сниженной лактазной активностью при дисбиозах кишечника. Изменение лактазной активности  E.coli M-17 в процессе глубинного культивирования.

Для выявления возможного механизма снижения лактазной активности эшерихий при дисбиозах были проведены серии  глубинного культивирования E.coli M-17 в присутствии селективных доз антибиотиков (гентамицина, цефазолина, ципрофлоксацина). Было установлено, что вне зависимости от используемого препарата и разных условий аэрирования культуры по сравнению с вариантами без препаратов, происходило появление, а затем увеличение частоты встречаемости клонов E.coli M-17, обладающих сниженной лактазной активностью в начале и в середине стационарной фазы роста. При культивировании эшерихий с нормальной лактазной активностью, выделенных от людей с дисбиозами кишечника,  в различных условиях аэрирования  в присутствии селективных доз гентамицина было выявлено снижение способности к ферментации лактозы.

В процессе глубинного культивирования при использовании лактозы в качестве основного субстрата вне зависимости от условий аэрирования срабатывал в полной мере механизм регуляции работы лактозного оперона: при наличие в среде лактозы (лаг-фаза, фаза экспоненциального роста и начало стационарной фазы роста) E.coli M-17 использовала лактазу, накапливая в клетке глюкозу, которая в свою очередь в достаточном количестве ингибировала работу фермента и уже в стационарной фазе роста культуры начинали появляться клоны E.coli M-17 со сниженной лактазной способностью. Фаза угнетения роста культуры без притока субстрата показывала также отсутствие лактазной активности эшерихий, задействовав двойную отрицательную обратную связь: чем меньше субстрата, тем меньше производится фермента. Влияние антибиотиков проявилось в существенном  ингибировании роста E.coli M-17, усиленном метаболизме субстрата и соответственно в более ранней по сравнению с контрольной серией эксперимента, «потере» лактазной способности. На основании данных литературы и собственных исследований, предложена схема одного из вероятных механизмов появления эшерихий СЛА при дисбиозах кишечника (Рис.5). Лактазная недостаточность (вне зависимости от первопричины) сопровождается  увеличение субстрата провоцирует ретроградное биохимическое ингибирование лактазной способности облигатных симбиотических микроорганизмов - эшерихий на фоне высокой концентрации продуктов ферментации лактозы. Повышенное содержание лактозы приводит к усилению роста факультативных представителей микрофлоры, которые обладают лактазной способностью и на которых продукты ферментации лактозы облигатных микроорганизмов не оказывают влияния, т.к. являются видоспецифичными.

Рисунок 5. Ретроградное ингибирование лактазной активности микроорганизмов и лактазная недостаточность повышением содержания лактозы в толстом кишечнике.

При этом условно-патогенные микроорганизмы получают популяционное преимущество, в то время как лактазная активность эшерихий снижается.

Экспериментальные подходы к получению и изучению биологических свойств низкомолекулярных пептидов

В ФБУН «РостовНИИ микробиологии и паразитологии» Роспотребнадзора развернуто производство медицинского иммунобиологического препарата для лечения и профилактики острых кишечных инфекций «Лактоглобулин против условно-патогенных бактерий и сальмонелл коровий сухой для перорального применения» (регистрационное удостоверение № ЛСР-002636/08 от 09.04.2008; Промышленный регламент № ПР 01898776-02-06). В дополнение к существующей технологии получения лактоглобулина нами был разработан и запатентован способ получения из иммунной сыворотки коров препарат, содержащий низкомолекулярные пептиды (НМП) с молекулярной массой до 15 кДа. (Патент на изобретение № 2409678 от 21.01.2011). Нативный препарат НМП содержал 3±0,5 мг/мл белков, 25±0,5мг/мл углеводов, преимущественно лактозу. Проведенные доклинические исследования на экспериментальных животных НМП, в том числе с применением патоморфологических и гистохимических методов, установили его  нетоксичность и безопасность.

Как показали проведенные исследования, НМП представляют собой биологически активную субстанцию. Основной механизм действия - индукция выработки интерферона-гамма,  опосредующего стимуляцию Т-клеточного иммунитета. Одним из действующих веществ НМП является ИЛ-1 , стимулирующий «цитокиновый каскад»: ИЛ-1  → ИНФ-→ ИЛ-6. Бифидостимулирующий эффект НМП (за счет лактозы в составе препарата) делает метаболическое преимущество этих симбиотических микроорганизмов очевидным и способствует снижению рН среды кишечника - важной составляющей антагонизма симбионтов. В эксперименте показано, что стимуляция Т-клеточного звена иммунной системы при использовании НМП и повышение содержания антагонистически активных бифидо - и  лактобактерий приводят к снижению содержания эшерихий СЛА, условно-патогенных микроорганизмов (энтеробактерий, стафилококков и дрожжеподобных грибов рода Candida) (Табл.3,4)

Опосредованное НМП уменьшение содержания УПМ и непосредственное перераспределение по влиянием НМП провоспалительных цитокинов приводят в конечном итоге снижению воспаления и нормализации состава микрофлоры биотопа.

Таблица 3.  Микрофлора мышей при дисбактериозе с коррекцией иммунобиологическими препаратами

Группы микроорганизмов

Изменение состава микрофлоры в эксперименте lgКОЕ/г

Исходный фон

Дисбиоз, обусловленный гентамицином

Коррекция дисбиоза низкомолекулярными пептидами

Bifidobacterium sp.

9

7

9,5*

Lactobacillus sp.

6

6,52

7*

E.coli СФА

0

7,0

2,5*

УПЭБ

0

5,44

1*

Proteus spp.

2

4,2

0*

Staphylococcus spp.

2

5,84

2*

Candida spp.

2

3

0*

*  различия  достоверны (p< 0,05)

Таблица 4.  Некоторые иммунологические показатели при экспериментальном дисбиозе и коррекции иммунобиологическими препаратами.

Тестируемые показатели

Сопоставляемые группы экспериментальных животных

Исходный фон

Дисбиоз, обусловленный гентамицином

Коррекция дисбиоза низкомолекулярными пептидами

ИЛ-1 пг/мл

100

620

956*

ИЛ-6 пг/мл

75

116

28*

ИФН- пг/мл

120

658

225*

Средний титр анти-ЛПС - антител

1:10

1:200

1:66*

Удельный вес макроглобулиновых фракций (%)

0

61

0*

ППН (ЛПС) %

10

66,8

28,9*

ППН (КАгКС)%

0

62,7

26,1*

*- различия  достоверны (p< 0,05)

Показатели аутосенсибилизации ЛПС грамотрицательных энтеробактерий и комплексным антигеном кишечной стенки мышей (титры общих антител, специфичных тестируемым антигенам, содержание макроглобулиновых фракций, ППН) достоверно снижались при коррекции дисбиотических нарушений. Более эффективно действие НМП было зафиксировано при профилактическом использовании препарата параллельно с антибиотиком.

        1. Дисбиоз с позиции усиления транслокации ЛПС и срыва иммунной антиэдотоксиновой защиты

Известно, что плод в утробе матери - стерильный. Контакт микрофлоры и новорожденного ребенка осуществляется в родовых путях, с кожных покровов матери и из молочных ходов при кормлении.  Однако при достаточно массивном обсеменении микроорганизмами буквально после рождения ребенок не только не заболевает, но продолжает при таком контакте развиваться и расти. В отличие от гнотобионтов (рожденных от стерильных матерей и в стерильных условиях),  плод теплокровных животных и человека еще внутриутробно имел контакт не с самими микроорганизмами, а с их антигенами. Основными фигурантами при этом были пептидогликаны и липополисахариды, поставщиками которых были симбионты микрофлоры матери. Незначительного антигенного раздражения оказывается достаточно, чтобы запустить механизмы врожденного иммунитета, задействовав при этом  «Толл-рецепторы», систему цитокинов, макрофагально-фагоцитарное звено, популяцию иммунокомпетентных клеток и систему комплемента. Помимо механизмов врожденного иммунитета на данном этапе формируются основы иммунологической толерантности по отношению к собственной микрофлоре. Либо по типу  «запредельного торможения» -  по отношению к пептидогликанам грамположительных симбиотических микроорганизмов; либо по типу «антигенной мимикрии» или «эклипсных антигенов» - к ЛПС грамотрицательных бактерий.

Таким образом, в процессе онтогенеза макроорганизм взаимодействует с различными микроорганизмами и их антигенами. Иммунный ответ может зависеть от их качественно-количественных характеристик. Наиболее значимыми антигенами являются эндотоксины (липополисахариды грамотрицательных энтеробактерий). С одной стороны – это важные иммуногены, в малых концентрациях оказывающие иммуномодулирующий эффект. В то же время в больших концентрациях ЛПС запускают мощные механизмы иммунопатологии, которые имеют место и при дисбактериозах кишечника. С этих позиций на основании собственных исследований и данных литературы нами предложен один из патогенетических механизмов развития дисбиоза кишечника и его коррекции с позиции «эндотоксиновой агрессии» (Рис. 6).

Полученные данные свидетельствуют, что при дисбиозах кишечника, обусловленных комплексным воздействием стрессорных факторов основного заболевания и введением ксенобиотиков, основной механизм развития патогенеза был связан с гиперчувствительностью (тип III), опосредованной иммунными комплексами. Основными фигурантами патологических аллергических реакций в данном случае могут выступать ЦИК

Рисунок 6.  Дисбиоз и его коррекция с позиции усиления транслокации ЛПС и срыва антиэндотоксиновой защиты

(циркулирующие иммунные комплексы) анти-ЛПС-антитела + ЛПС грамотрицательных энтеробактерий.

При дисбиозах макроорганизм в течение длительного времени подвергается воздействию избыточного количества антигена (ЛПС). Связывание этого антигена с образующимися специфическими антителами в кишечнике приводит к формированию нерастворимых комплексов, способных вызывать острую воспалительную реакцию (усиление муцинообразования, увеличение содержания лизоцима и комплемента, и т.д.).

ЦИК связывают комплемент, анафилатоксины С3а и С5а индуцируют высвобождение тучными клетками медиаторов, повышающих сосудистую проницаемость. Анафилотоксины, одновременно действующие как хемоаттрактанты, секретируемые тучными клетками, обуславливают приток ПЯЛ. При  фагоцитозе иммунных комплексов, лейкоциты высвобождают содержимое своих гранул (усиление фагоцитарной реакции ПЯЛ, повышение количества лизоцима). Высвобождаемые ПЯЛ протеолитические ферменты (нейтральные протеиназы, коллагиназы), кининобразующие ферменты, поликатионные белки и активные формы кислорода и азота вызывают повреждение микробиопленки, местное повреждение тканей и усиливают воспалительную реакцию в кишечнике. Повышенное содержание биологически активных веществ в биотопах кишечника провоцирует стимуляцию факторов агрессии симбиотической микрофлоры (усиление колонизирующей способности за счет экспрессии факторов патогенности-персистенции).

Особенности эволюционно сложившихся взаимоотношений ЛПС, пептидогликана и других поверхностных антигенов микроорганизмов-симбионтов и макроорганизма приводят к тому, что при дисбиозах в кишечнике создаются предпосылки к развитию аутоаллергических процессов (феномен Санарелли-Шварцмана, РТМЛ фиксируются синхронно в отношении ЛПС грамотрицательных энтеробактерий и КАгКС; повышение содержания макроглобулиновых фракций иммуноглобулинов, специфичных обоим тестируемым антигенам в поздние сроки наблюдения в эксперименте и т.д.). Усиление прессинга иммунной системы в биотопах кишечника приводит к активизации патогенного потенциала микрофлоры, что при условиях ее транслокации через кишечный барьер усиливает для нее колонизационное преимущество.

Захваченные макрофагами нерастворимые комплексы не могут метаболизироваться за короткое время и поэтому остаются источником постоянного активирующего стимула, который вызывает высвобождение цитокинов ИЛ-1 и ФНО, а также высвобождение активных форм кислорода и оксида азота, что еще больше усиливает повреждение тканей. В свою очередь активация ИЛ-1 β вызывает «каскад цитокинов» - ИНФ-γ, а затем ИЛ-6, призванных усилить воспалительную реакцию в биотопе и по возможности ее ограничить. Они в свою очередь определяют дифференцировку 0-Т хелперов (преформирование Т- хелперов I и III типов), обеспечивающих развитие клеточного антибактериального иммунологического ответа и иммунологической толерантности. Однако переизбыток ИНФ-γ и ИЛ-6 в то же время может способствовать усилению аллергизации и хронизации воспалительного процесса.

Известно, что последствия образования циркулирующих иммунных комплексов in vivo определяются не только абсолютным количеством антигена и антител, но также их количественным соотношением, от которого зависит природа комплексов и их распределение в организме. При избытке антител или небольшом избытке антигена комплексы быстро преципитируют и обнаруживают тенденцию к локализации в месте введения антигена, процесс локализуется в кишечнике. При избытке ЛПС образуются растворимые комплексы. Эти комплексы, содержащие С3b, связываются посредством иммунного прилипания с рецепторами комплемента и инактивируются в печени. В случае дефектов системы выведения комплексов из кровотока, в случае перегрузки этой системы иммунные комплексы циркулируют в крови и откладываются в почках (пиелонефриты, гломерулонефриты), суставах (аллергические полиартриты), коже (аллергические дерматиты), вызывая распространенный патологический процесс. Уменьшение количества ЛПС в кишечнике при коррекции дисбиотических  состояний (проведение энтеросорбции, использование самоэлиминирующихся бацилл-антагонистов, лактоглобулинов, КИПов и т.д.) приводит к стойкому снижению аллергических проявлений. Это является безусловным доказательством роли ЛПС и антиэндотоксинового иммунитета в целом для развития аллергических процессов.

A priori, исходя из обнаружения ИЛ-1 в составе низкомолекулярных пептидов, полученных из иммунной лактосыворотки, можно было предугадать эффект коррекции дисбиотических нарушений при проведении антибиотикотерапии в эксперименте. Через цитокиновый каскад «ИЛ-1→ ИНФ-» происходила стимуляция Т-клеточного иммунитета в кишечнике, уменьшалось содержание ЛПС грамотрицательных энтеробактерий, снижалась выработка анти-ЛПС-антител, механизм развития гиперчувствительности замедленного типа не развивался (о чем свидетельствует отсутствие в случае использования НМП выработки ИЛ-6 или резкое снижение его количества). Происходило снижение ППН и содержания в копрофильтратах макроглобулиновых фракций антител, специфичных ЛПС. Механизм действия лактоглобулинов, содержащих анти-ЛПС-антитела, в свете изучения уровня цитокинов в копрофильтратах («цитокиновый каскад»: ИЛ-1→ ИНФ- → ИЛ-6) представляется в основном в уменьшении  количества ЛПС, его нейтрализации. Вследствие этого происходило снижение выработки всех тестируемых цитокинов,  уменьшение воспаления в кишечнике и снижение показателей аутоалергизации макроорганизма.

ВЫВОДЫ

  1. Применение антибиотиков широкого спектра действия в эксперименте  приводит к  умеренным изменениям гомеостатического равновесия, выраженные в стимуляции выработки ИНФ- на локальном уровне. Качественно-количественные нарушения состава собственной микрофлоры кишечника наступают впоследствии и при этом  связаны с увеличением количества E.coli со сниженной лактазной активностью, УПЭБ, стафилококков и грибов рода Candida на фоне угнетения роста  и снижения колонизирующей способности лактобацилл и бифидобактерий.
  2. Дисбиотические нарушения сопровождаются увеличением количества ИАК в стенке толстой кишки и общего содержания иммуноглобулинов к ЛПС энтеробактерий, количества муцина, энтерокиназы, комплемента и лизоцима на местном уровне синхронно в биотопах кишечника. Усиление воспалительной реакции организма коррелирует со степенями выраженности дисбиоза. Повышение содержания биологически активных субстанций в просвете кишечника приводит к активизации ферментативных систем симбиотических микроорганизмов, что способствует усугублению дисбаланса защитных сил организма на локальном уровне при компенсированных вариантах дисбиоза и на системном уровне при декомпенсированных вариантах.
  3. Транслокация симбиотических микроорганизмов через кишечную стенку сопровождается стимуляцией выработки провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ИНФ- , ИЛ-6) в просвете кишечника, действующих эндокринно, что подтверждается стимуляцией фагоцитоза ПЯЛ и увеличением количества ИАК в  селезенке.
  4. Сенсибилизация макроорганизма при дисбиотических нарушениях происходит синхронно ЛПС энтеробактерий и комплексным антигеном кишечной стенки и сочетается с количественными изменениями микрофлоры кишечника. Длительно сохраняющиеся критерии аллергизации макроорганизма (ППН, РТМЛ и феномен Санарелли-Шварцмана) по отношению к обоим антигенам в совокупности с нарастанием к концу срока наблюдения содержания цитокинов ИНФ- и ИЛ-6, а также преобладанием макроглобулиновых фракций Ig в просвете кишечника является неблагоприятным признаком течения дисбактериоза и свидетельством наличия аутоаллергического компонента.
  5. У людей с дисбиозами кишечника, обусловленными применением антибиотиков широкого спектра действия, происходило увеличение содержания E.coli со сниженной ферментативной активностью, УПЭБ, грибов рода Candida, стафилококков на фоне снижения содержания лактобацилл и бифидобактерий. При этом колонизирующая способность облигатных представителей снижалась, а факультативных микроорганизмов повышалась.
  6. Одним из механизмов появления лактозонегативных эшерихий при дисбактериозах кишечника, сопровождающихся лактазной недостаточностью разного генеза (вследствие перенесенной ротавирусной инфекции, функциональной недостаточности ферментативных систем организма, соматической патологии и др.), может быть ретроградное биохимическое ингибирование действия фермента.
  7. Низкомолекулярные пептиды могут быть получены из иммунного молозива путем фильтрации иммунной лактосыворотки на мембранных волокнах. Препарат нетоксичен, обладает выраженной интерферон-стимулирующей активностью и при энтеральном применении оказывает профилактическое и лечебное действие при коррекции дисбактериоза кишечника, обусловленного антибиотиками. Препарат НМП способствует улучшению состояния микрофлоры кишечника,стимулирует Т-клеточное звено иммунной зашиты за счет инициации цитокинового каскада: ИЛ-1 → ИНФ-.
  8. Позитивный эффект лактоглобулинов (уменьшение содержания УПЭБ в кишечнике и снижение концентрации ЛПС энтеробактерий) сочетается со снижением уровня ИЛ-6 на фоне высокого содержания ИНФ-, активирующего Т-клеточную защиту. Антиэндотоксиновый эффект лактоглобулинов в целом оказывал десенсибилизирующее действие, характеризующиеся снижением соотношения макроглобулиновых фракций и уменьшением ППН.
  9. Предложен и обоснован один из патогенетических механизмов развития дисбиоза кишечника и его коррекции с позиции усиления транслокации ЛПС из просвета кишечника во внутреннюю среду макроорганизма, проявления цитокинового дисбаланса и срыва иммунной антиэдотоксиновой защиты

Практические рекомендации

  1. Комплексная оценка перинатальных неврологических нарушений, типа вскармливания,  аллергических кожных проявлений в сочетании с выраженностью антиэндотоксиновых реакций иммунитета на локальном уровне, проводимая у детей раннего возраста служит базой для назначения индивидуального и эффективного курса коррегирующего лечения.
  2. Повышение ферментативной активности (муцинолитической активности, АЛА, АКА, АИгА) симбиотических микроорганизмов по отношению к биологически активным веществам в просвете кишечника при дисбиозах рекомендуем  использовать, как критерий  воспалительной реакции в биотопе.
  3.   В качестве дополнительного критерия при проведении эффективной индивидуальной  коррекции с назначением иммуномодуляторов мы рекомендуем проводить комплексный анализ изменениий цитокинового профиля по соотношению провоспалительных цитокинов (ИНФ- : ИЛ-1: ИЛ-6), содержания иммуноглобулинов разных классов, специфичных ЛПС энтеробактерий в супернатантах фекалий людей и степени выраженности дисбиоза кишечника, позволяющих  определить тяжесть  нарушений  иммунного статуса на локальном  уровне.
  4. Использование определения в супернатантах фекалий титров антител к ЛПС грамотрицательных энтеробактерий, относящихся к разным классам иммуноглобулинов, тестирование количества лизоцима, количества энтерокиназы и муцина рекомендуем для оценки степени дисбиоза кишечника в более ранние сроки  (экспресс-диагностика) и в качестве дополнения к классическому бактериологическому методу.
  5. Расширение спектра исследования представителей микробиоты кишечника служит уточнению кинического диагноза при этом выявление ротавирусов, сальмонелл, шигелл и S. aureus должно расцениваться как инфекционное заболевание вне зависимости от степени выраженности клинических проявлений с соответствующей последующей схемой этиологического лечения.
  6. При лактазной недостаточности у детей раннего возраста рекомендуем проводить исследование на выявление кишечных вирусов, вызывающих дисахаридазную недостаточность для уточнения причины ферментативного дисбаланса и назначения адекватного противовирусного лечения. В случаях обнаружения ротавирусов в кишечном содержимом у детей раннего возраста  может быть рекомендовано определение степени выраженности лактазной недостаточности для выбора тактики назначения  диетотерапии.
  7. Препараты НМП и лактоглобулины рекомендуем для профилактики дисбиоза кишечника при параллельном  использовании иммунобиологических препаратов и антибиотиков.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1.Алешукина А.В. Адгезивная активность эритроцитов мышей в динамике экспериментального дисбактериоза. / Алешукина А.В., Голошва Е.В. // Материалы конференции «Актуальные вопросы биологии и медицины», Нальчик. - 1999. - С. 6 - 7.

2. Алешукина А.В. Изменение уровня антител к аутоаллергенам в динамике экспериментального дисбактериоза. / Алешукина А.В., Патрушева Е.В., Терновская Л.Н. // Материалы конференции «Актуальные вопросы биологии и медицины», Нальчик. - 1999. - С. 7 - 8.

3.Голошва Е.В.  Антагонистическая и адгезивная активность лактобактерий, выделенных от людей с дисбактериозом кишечника / Голошва Е.В., Алешукина А.В., Терновская Л.Н. // Материалы конференции «Актуальные вопросы биологии и медицины», Нальчик. - 1999. - С. 33 - 34.

  1. Голошва Е.В. Некоторые особенности состава микрофлоры кишечника при дисбактериозах у взрослых людей./ Голошва Е.В., Терновская Л.Н., Алешукина А.В. //Материалы конференции «Актуальные вопросы биологии и медицины», Нальчик. - 1999. - С. 36 - 37.
  2. Патрушева Е.В. Изменение аутофлоры мышей при экспериментальном дисбактериозе и его коррекции иммунобиологическими препаратами. / Патрушева Е.В., Алешукина А.В., Голошва Е.В., Морозова Н.Е., Терновская Л.Н. //Материалы конференции «Актуальные вопросы биологии и медицины», Нальчик. - 1999. - С. 87 - 88.
  3. Голошва Е.В. Адгезивная активность эшерихий, выделенных от людей с дисбактериозом кишечника. / Голошва Е.В., Алешукина А.В., Терновская Л.Н. // Материалы конференции 90-летию РНИИМП  «Актуальные вопросы инфекционной патологии», Ростов – на – Дону. - 1999. - С. 19.
  4. Голошва Е.В. Персистентные характеристики эшерихий, выделенных от людей с дисбактериозом кишечника. / Голошва Е.В., Терновская Л.Н., Алешукина А.В. // Материалы конференции 90-летию РНИИМП  «Актуальные вопросы инфекционной патологии», Ростов – на – Дону. - 1999. -  С. 20.
  5. Терновская Л.Н. Антагонистическая активность эшерихий, выделенных от людей с дисбактериозом  кишечника. / Терновская Л.Н., Голошва Е.В., Алешукина А.В // Материалы конференции 90-летию РНИИМП  «Актуальные вопросы инфекционной патологии», Ростов – на – Дону. - 1999. - С. 21.
  6. Алешукина А.В. Показатели аллергизации организма в динамике экспериментального дисбактериоза и коррекции его лактоглобулином. / Алешукина А.В., Патрушева Е.В., Терновская Л.Н. // Материалы конференции 90-летию РНИИМП  «Актуальные вопросы инфекционной патологии», Ростов – на – Дону. - 1999. - С. 22.
  7. Патрушева Е.В. Состояние кислородзависимых бактерицидных систем клеток кишечника и макрофагов при экспериментальном дисбактериозе и его коррекции препаратом «Нарине». / Патрушева Е.В., Алешукина А.В., Терновская Л.Н. // Материалы конференции 90-летию РНИИМП  «Актуальные вопросы инфекционной патологии», Ростов – на – Дону. - 1999. - С. 23.
  8. Патрушева Е.В. Неспецифические факторы защиты организма в процессе экспериментального дисбактериоза. / Патрушева Е.В., Алешукина А.В.,  Терновская Л.Н. // Материалы Российской научной конференции «Факторы клеточного и гуморального. иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях», Челябинск. - 2000. - С.4 - 5.
  9. Алешукина А.В. Персистентные характеристики условно-патогенных энтеробактерий, выделенных из различных эпитопов при экспериментальном дисбактериозе кишечника. / Алешукина А.В., Патрушева Е.В., Голошва Е.В., Черкашина Н.Е. // Материалы конференции «Современные проблемы эпидемиологии, диагностики и лечения инфекционных и аллергических заболеваний», Казань. - 2000. - С. 12 - 13.
  10. Алешукина А.В. Показатели аутосенсибилизации при экспериментальном дисбактериозе и его коррекции иммунобиологическими препаратами. / Алешукина А.В., Патрушева Е.В., Голошва Е.В., Морозова Н.Е., Терновская Л.Н. // Материалы конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических. препаратов», Уфа. - 2000. - С. 209 - 211.
  11. Голошва Е.В. Влияние иммунобиологических препаратов на персистентные характеристики  представителей нормальной микрофлоры при дисбактериозе у людей. / Голошва Е.В., Алешукина А.В., Терновская Л.Н. // Материалы конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических. препаратов», Уфа. - 2000. - С. 211 - 213.
  12. Алешукина А.В. Опыт использования питательной среды ГТ-1 для диагностики дисбактериоза. / Алешукина А.В., Голошва Е.В., Гапон М.Н., Тришина А.А., Типинкина В.В., Брагина Л.Е. и др. //Материалы конференции «Новые технологии в медицине», Саратов. - 2001. - С. 17.
  13. Алешукина А.В. Модификация среды для выделения лактобактерий. / Алешукина А.В., Голошва Е.В., Гапон М.Н., Тришина А.А. //Материалы конференции «Новые технологии в медицине», Саратов. - 2001. - С. 19.
  14. Типинкина В.В. Использование гидролизата молозивного творога для видовой идентификации бифидобактерий. / Типинкина В.В., Алешукина А.В. // Материалы 3-й Международной конференции «Актуальные вопросы разработки и производства диагностических питательных сред и тест-систем», Махачкала. - 2001. - С. 10.
  15. Алешукина А.В. Эффективность использования питательной среды для диагностики дисбактериоза кишечника. / Алешукина А.В., Гайворонская С.А., Солдатова Л.В., Рыжкова Э.А., Золотилина Н.Г., Брагина Л.Е. и др. // Материалы 3-й Международной конференции «Актуальные вопросы разработки и производства диагностических питательных сред и тест-систем», Махачкала. - 2001. - С. 32 - 33.
  16. Алешукина А.В. Питательная среда для выращивания и дифференциации лактобактерий. / Алешукина А.В., Голошва Е.В., Гапон М.Н., Терновская Л.Н., Гайворонская С.А., Солдатова Л.В., и др. //. Материалы 3-й Международной конференции «Актуальные вопросы разработки и производства диагностических питательных сред и тест-систем», Махачкала. - 2001. - С. 19 - 20.
  17. Алешукина А.В. Видовой состав лактобактерий, выделенных от людей с дисбактериозами кишечника. / Материалы VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва. - 2002. - С. 127 - 128.
  18. Алешукина А.В. Использование модифицированной среды для определения каталазной активности у лактобактерий. / Материалы VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва. - 2002. - С. 128 - 129.
  19. Голошва Е.В. Роль кислородзависимых бактерицидных систем фагоцитов в поддержании колонизационной резистентности организма. / Голошва Е.В., Алешукина А.В. // Материалы VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва. - 2002. - С.160 - 161.
  20. Голошва Е.В. Персистентные характеристики энтеробактерий, выделенных в динамике экспериментального дисбактериоза. / Голошва Е.В., Алешукина А.В.,  Терновская Л.Н. // Материалы VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва. - 2002. - С.161 - 162.
  21. Терновская Л.Н. .Влияние эубиотических препаратов на активность кислородзависимых бактерицидных систем эпителиоидных клеток кишечника. / Терновская Л.Н., Алешукина А.В., Голошва Е.В., Патрушева Е.В. // Материалы Международной научно-практической конференции памяти Г.И.Гончаровой «Пробиотические. микроорганизмы-современное  состояние вопроса и перспективы использования», Москва. - 2002. -  С. 29.
  22. Алешукина А.В. Антииммуноглобулиновая активность бифидобактерий у мышей в процессе экспериментального дисбактериоза. // Материалы Международной научно-практической конференции памяти Г.И.Гончаровой «Пробиотические. микроорганизмы-современное  состояние вопроса и перспективы использования», Москва. - 2002. - С. 29-30.
  23. Алешукина А.В. Колонизирующая способность лактобактерий, выделенных от людей с дисбактериозами кишечника. /Алешукина А.В., Е.В.Голошва //  Известия ВУЗов, Северо-Кавказский регион (естественные науки). - 2003. - №1. - С. 97 - 99.
  24. Алешукина А.В. Роль Candida sp. В развитии гнойно-воспалительных процессов и дисбактериозов кишечника у амбулаторных больных. // Проблемы медицинской  микологии. - 2004. - т. 6. - №2. - С. 56.
  25. Алешукина А.В. Биологические свойства Candida sp., выделенных у людей с дисбактериозами кишечника. /Алешукина А.В., Лисовская А.М.  // Проблемы медицинской микологии. - 2005. - т.7. - №2. - С. 79 - 80.
  26. Алешукина А.В. Питательная среда для выделения грибов рода Candida. /Алешукина А.В., Лисовская А.М.  // Проблемы медицинской микологии. - 2005. - т.7. - №2. - С. 95.
  27. Губрий Ю.В. Культивирование E.coli в присутствии антибиотиков различных групп./ Губрий Ю.В., Алешукина А.В.  // Материалы  71-й конференции КГМУ и сессии Центрально - Черноземного научного центра РАМН, Курск. - 2006. - Т.2 . - С. 222.
  28. Лисовская А.М.  Чувствительность к антимикотическим препаратам дрожжеподобных грибов рода Candida. /Лисовская А.М, Глинщикова А.А., Алешукина А.В. // Материалы  71-й конференции КГМУ и сессии Центрально - Черноземного научного центра РАМН, Курск. - 2006. - Т.2 . - С. 242.
  29. Алешукина А.В. Практическое использование модифицированной питательной среды для выделения Candida sp. / Алешукина А.В., Лисовская А.М. // Проблемы медицинской микологии. - 2006. - т.8. - №2. - С. 16.
  30. Лисовская А.М. Изучение биологических свойств дрожжеподобных грибов рода Candida sp., выделенных из различных локусов у амбулаторных больных. /Лисовская А.М., Алешукина А.В. // Проблемы медицинской микологии. - 2006. - т.8. - №2. - С. 57.
  31. Алешукина А.В. Аутоаллергизация мышей в процессе экспериментального дисбактериоза кишечника. // Известия ВУЗов Северно-Кавказский регион (естественные науки). - 2007. - №1. - С. 61-64.
  32. Алешукина А.В. Алгоритм исследования дисбактериоза кишечника. // Материалы Международной конференции «Новые технологии в экспериментальной биологии и медицине», Ростов – на – Дону. - 2007. - С. 111.
  33. Алешукина А.В. Колонизирующая способность Candida sp. при дисбактериозах кишечника. // Проблемы медицинской микологии. - 2007. - т.9. - №2. С. 37.
  34. Алешукина А.В. Использование базы данных для диагностических и научных целей. / II Международная научная конференция «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины», Ростов – на – Дону. - 2008. - С. 88.
  35. Алешукина А.В. Использование питательной среды Канди-селект для выделения и идентификации Candida spp.// Проблемы медицинской микологии. - 2008. - т. 10. - №2. - С. 25.
  36. Алешукина А.В. Ассоциации бактерий и микроскопических грибов с ротавирусами при дисбиозах кишечника у людей. / Алешукина А.В., Колпаков С.Л., Колпакова Е.П.// Материалы конференции «Научное  обеспечение противоэпидемической защиты населения», посвященной 90-летию Нижегородского НИИЭМ, Нижний Новгород. - 2009. - С. 203 - 205.
  37. Алешукина А.В. Иммуномодулирующее действие низкомолекулярных пептидов коровьего молозива. /Алешукина А.В., Вачаев Б.Ф., Юрьева И.Л., Яцкий А.Н. // Аллергология и иммунология. - 2009. - т.10. - №2. - С. 301.
  38. Алешукина А.В. Колонизирующая способность Candida sp. при дисбиозах кишечника. // Проблемы медицинской микологии. - 2009. - т.11. - №2. - С. 25 - 29.
  39. Алешукина А.В. Цитокиновый профиль в кишечнике при ассоциациях вирусов, бактерий и Candida sp. //  Проблемы медицинской микологии. - 2009. - т.11. - №2. - С. 52 - 53.
  40. Алешукина А.В. Изменения содержания муцина и энтерокиназы при экспериментальном лекарственном дисбиозе кишечника. /Материалы конференции, посвященной 100-летию РостовНИИМП «Актуальные вопросы инфекционной патологии», Ростов – на – Дону. - 2009. - С. 323 - 327.
  41. Голошва Е.В., Обнаружение возбудителей кишечных инфекций у детей при исследовании дисбиоза кишечника. / Голошва Е.В., Алешукина А.В.,  Колпаков С.А., Колпакова Е.П., Забурденко А.А. // Материалы II Всероссийской научно-практической дистанционной интернет-конференции «Окружающая среда и здоровье населения» ГОУ ВПО КГМУ, Курск: КГМУ. - 2010. – 1 СД.
  42. Голошва Е.В., Алешукина А.В. Аденовирусы и Candida sp. у детей раннего возраста при дисбиозе кишечника. /Голошва Е.В., Алешукина А.В.// Проблемы медицинской микологии. - 2010. - т.12 - №2. - С. 78.
  43. Алешукина А.В. Возбудители кишечных инфекций у детей, обследованных на дисбиоз. / Алешукина А.В., Голошва Е.В., Колпаков С.А., Колпакова Е.П., Забурденко А.А // Материалы международной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями», Санкт-Петербург. - 2010 . -С. 92.
  44. Алешукина А.В. Комплексный способ диагностики степени выраженности дисбактериоза кишечника.  // Клиническая лабораторная диагностика. - 2010. - № 11. - С. 48 - 51.
  45. Согомонян М.Е. К вопросу о механизме действия лактоглобулина. /Согомонян М.Е., Яцкий А.Н., Четверик Н.С., Алешукина А.В.,  Голошва Е.В., Юрьева И.Л. / Материалы IV Международной конференции “Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины”, Ростов – на – Дону. – 2011. - С. 33.
  46. Яцкий А.Н. Низкомолекулярные пептиды молозивного происхождения. /Яцкий А.Н., Алешукина А.В., Вачаев Б.Ф., Яговкин Э.А., Юрьева И.Л. /Материалы IV Международной конференции “Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины”, Ростов н/Дон. - 2011. - С. 40 - 41.
  47. Алешукина А.В. Аллергические дерматиты и Candida sp. у детей с дисбиозами кишечника. /Алешукина А.В., Голошва Е.В. // Ж. Проблемы медицинской микологии. -  т.13. - №2. - С. 59 - 40.
  48. Голошва Е.В. Лактазная недостаточность у детей с латентной ротавирусной инфекцией. /Голошва Е.В., Алешукина А.В., Колпаков С.А., Колпакова Е.П. и др. // Журнал Инфектологии. Приложение. - Том № 4. - №3. - 2011. - С. 40.

Изобретения

  1. Патент на изобретение № 2202609 Российская Федерация МПК C12N1/20 // (C12N1/20, C12R1:225), Заявка №2000125959/13 от 12.10.2000, опубликовано 20.04.2003, бюл. №11/ Питательная среда для выделения лактобактерий // Терновская Л.Н., Алешукина А.В., Голошва Е.В., Черкашина Н.Е., Калинина Т.Э., Гапон М.Н.; заявитель и патентообладатель Ростовский научно-исследовательский институт микробиологии и паразитологии.
  2. Патент на изобретение № 2299237 Российская Федерация МПК C12N1/14, C12R1/72, Заявка №2005116458/13 от 30.05.2005, опубликовано 20.05.2007, бюл. №14/ Питательная среда для выделения грибов рода Candida // Терновская Л.Н., Алешукина А.В., Голошва Е.В., Семченко К.Г., Лисовская А.М.; заявитель и патентообладатель ФГУН «Ростовский научно-исследовательский институт микробиологии и паразитологии».
  3. Патент на изобретение № 23 38197 Российская Федерация МПК G01N 33/53, Заявка №2006128806/15 от 08.08.2006, опубликовано 10.11.2008, бюл. №31/  Способ диагностики степени выраженности дисбактериоза кишечника // Алешукина А.В.; заявитель и патентообладатель ФГУН «Ростовский научно-исследовательский институт микробиологии и паразитологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
  4. Патент на изобретение № 2409678 Российская Федерация МПК C12P21/00, C07K 1/43, Заявка №2009132802/10 от 31.08.2009, опубликовано 20.01.2011, бюл. №2/ Способ получения низкомолекулярных пептидов, обладающих интерферон-стимулирующей активностью // Алешукина А.В., Вачаев Б.Ф., Яговкин Э.А., Юрьева И.Л., Яцкий А.Н.; заявитель и патентообладатель ФГУН «Ростовский научно-исследовательский институт микробиологии и паразитологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Учебные пособия

  1. Симбионтная микрофлора желудочно-кишечного тракта человека. Дисбактериоз и его коррекция./ Алешукина А.В., Патрушева Е.В., Голошва Е.В. /Методические указания к занятиям по медицинской микробиологии ДО и ОЗО РГУ. -  Ростов – на – Дону: Издательство РГУ. -  2000. -  22с.
  2. Алешукина А.В. Медицинская микробиология Учебное пособие для ВУЗов.- Ростов-на-Дону: Издательство «Феникс». -  2003. -  472с.
  3. Алешукина А.В. Учебно-методическое пособие (электронный вариант) для студентов очно-заочного образования к курсу по выбору «Патогенные бактерии в природных экосистемах» - Ростов-на-Дону : официальный сайт ЮФУ. - 2009.- 48с.
      1. Список сокращений

АЛА – антилизоцимная активность

«АИА»- «антиинтерфероновая» активность

АИгА - антиимуноглобулиновая активность

АКА – антикомплементарная активность

Д-1 – дисбиоз I степени

Д- II – дисбиоз II степени

Д- III – дисбиоз III степени

ИАК- иммунноактивные клетки

ИЛ-1 – Интерлейкин – 1

ИЛ-6- Интерлейкин-6

ИНФ- - Интерферон-

ИФА -  иммунно-ферментный анализ

К-  комплемент

КАгКС – комплексный антиген кишечной стенки мышей

Л-  лизоцим

ЛПС –  липополисахарид

МФ- макрофаги

НМП-  низкомолекулярные пептиды

ППН – показатель повреждаемости нейтрофилов в реакции лейкоцитолиза

ПЯЛ - полиморфно-ядерные лейкоциты

РТМЛ - реакция торможения миграции лейкоцитов

УПМ -  условно патогенные микроорганизмы

УПЭБ - условно патогенных энтеробактерии

ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы Эшерихии СЛА - эшерихии со сниженной лактазной активностью

Эшерихии НЛА - эшерихии с неизмененной (нормальной) лактазной активностью

BB-бифидобактерии

Ec- эшерихии

IgA - иммуноглобулины класса А

IgG-иммуноглобулины класса G

IgE- иммуноглобулины класса Е

IgM- иммуноглобулины класса М

LB- лактобациллы






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.