WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

ГАДУА НАТИЯ ТОРНИКЕЕВНА

ОСОБЕННОСТИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ СОВРЕМЕННЫХ ШТАММОВ BORDETELLA PERTUSSIS

03.02.03 – микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва – 2012

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный руководитель:

Ведущий научный сотрудник

лаборатории диагностики дифтерийной инфекции

ФБУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского

Доктор медицинских наук  Борисова Ольга Юрьевна

Официальные оппоненты:

Шендеров Борис Аркадьевич доктор медицинских наук, профессор, главный научный сотрудник лаборатории биологии бифидобактерий ФБУ МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека;

Червинец Вячеслав Михайлович доктор медицинских наук, профессор, зав. Кафедрой микробиологии и вирусологии ГБОУ ВПО Тверская государственная медицинская академия Министерство здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Ведущая организация:

ФГБУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И Мечникова РАМН (г. Москва)

Защита состоится «___» ________ 2012 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 208.046.01 в Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского» Федеральной службы по надзору  в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д.10.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д.10.

Автореферат разослан «____» _________________ 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук  О.Ю. Борисова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Коклюш является воздушно-капельной инфекцией, управляемой средствами специфической вакцинопрофилактики. Однако, несмотря на 50-летную массовую иммунизацию детского населения, коклюш до сих пор остается важной причиной младенческой смерти во всем мире и продолжает быть проблемой здравоохранения даже в странах с высоким уровнем охвата профилактическими прививками. Так, во многих странах Европы и Америки с 1990-х годов отмечается рост заболеваемости коклюшем, несмотря на высокий уровень охвата профилактическими прививками, который считается наиболее распространенным среди вакциноуправляемых инфекций. Одной из особенностей коклюшной инфекции в последние годы является рост числа случаев заболевания среди подростков и взрослых (Taranger J., 2001; Cherry J.D., 2005; Celentano L.P., 2005; Diavatopoulos D.A., 2005; Edwаrds K.M., 2005; Ward J.I., 2006; Forsyth K.D., 2007).

Коклюш в России в конце IXX и начале XX века также занимал первое место среди четырех капельных инфекций (коклюш, кори, скарлатины, дифтерии). Снижение заболеваемости отмечалось лишь в 1950-ые годы прошлого столетия и решающую роль в проблеме борьбы с коклюшем сыграла специфическая массовая иммунизация детского населения АКДС-вакциной, которая  в нашей стране впервые была введена в широкую практику в 1958-1960 гг. Специфическая вакцинопрофилактика коклюша на протяжении последних 50 лет привела к резкому снижению заболеваемости, летальности и уменьшению тяжести течения болезни. Однако, несмотря на очевидные успехи проводимой массовой иммунизации детского населения и высокий уровень охвата профилактическими прививками, до настоящего времени сохраняются подъемы и спады заболеваемости, как за счет непривитых, так и привитых лиц увеличилась заболеваемость детей школьного возраста. Регистрируется высокая заболеваемость детей раннего возраста с тяжелым течением заболевания, а также единичные случаи летальных исходов (Лыткина И.Н., 2004; Селезнева Т.С., 2004; Озерецковский Н.А., 2004; Чистякова Г.Г., 2005). Кроме того, учитывая низкую эффективность лабораторной диагностики коклюша, можно полагать, что имеется недовыявление случаев коклюша и существует скрытое течение эпидемического процесса коклюшной инфекции. Все это свидетельствует о продолжающейся циркуляции возбудителя коклюша и, следовательно, существовании риска возникновения заболеваний.

Одной из причин продолжающейся циркуляции возбудителя коклюша является изменение его биологических свойств, как фенотипических, так и генотипических. Молекулярно-генетический мониторинг возбудителя коклюша, проводимый в различных странах на 4 континентах, а также в нашей стране показал, что штаммы B.pertussis подвержены генетической вариабельности, затрагивающей, в первую очередь, гены, кодирующие основные факторы патогенности (Мазурова И.К., 2003; Семенов Б.Ф., 2003; Борисова О.Ю., 2010; Guiso N., 2001; van Loo I.H.M., 2002; Preziozi M.P., 2002; Gzyl A., 2004; Elomaa A., 2005, 2007; Mooi F.R., 2010).

Возбудитель коклюша - Bordetella pertussis (B.pertussis) имеет множество факторов патогенности, однако, основным является коклюшный токсин, который играет ведущую роль в развитии инфекционного процесса (Tamura M., 1982; Hsia J.A., 1984). Коклюшный токсин (КТ) имеет А-В структуру и состоит из А-комплекса (S1 субъединица), обеспечивающего основные изменения в патогенезе коклюшной инфекции, и В-комплекса, состоящего из 5-ти субъединиц S2-S5, который отвечает за связывание токсина с рецепторами мишени и способствует проникновению А-комплекса в клетки хозяина. У возбудителя коклюша продукция всех факторов патогенности находится под контролем двухкомпонентной BvgAS системы регуляции, включающей промоторную область коклюшного токсина, кодируемая регуляторным геном ptxP, экспрессия которого влияет на уровень продукции коклюшного токсина (Mooi F.R., 2010; Mooi F.R., 2009).Кроме того, в развитии инфекции существенное значения имеют и другие факторы патогенности, в первую очередь пертактин, отвечающий за адгезию возбудителя на поверхности слизистой оболочки ротоглотки (Tuomanen E., 1985; Shahin R.D., 1990; Hijnen M., 2004; Hijnen M., 2007). Изменения в генах, ответственных за проявление патогенности возбудителя, его адгезию может привести к появлению штаммов с измененными свойствами и оказать влияние на течение эпидемического и инфекционного процессов, поэтому наблюдение за возбудителем коклюша, за его фенотипическими и молекулярно-генетическими свойствами является актуальным.

Цель исследования - выявление особенностей генотипической изменчивости штаммов B.pertussis, вызывающих заболевание коклюшем на современном этапе эпидемического процесса коклюшной инфекции (2000 – 2010 гг.).

Задачи исследования:

1. Выявить особенности структуры генов ptxА, ptxB, ptxC, ptxD и ptxE, кодирующих S1 субъединицу А-комплекса и S2, S3, S4 и S5 субъединицы В-комплекса коклюшного токсина (КТ), и гена prn, кодирующего пертактин, штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем в 2000 – 2010 гг.

2. Изучить особенности структуры регуляторного гена ptxP, кодирующего промоторную область коклюшного токсина, у современных штаммов B.рertussis и сопоставить со степенью их вирулентности.

3. Оценить динамику распространения штаммов B.pertussis с измененной структурой генов, кодирующих А-, В- комплексы и промоторную область коклюшного токсина и пертактин, на разных этапах эпидемического процесса коклюшной инфекции.

4. Изучить структуру генов (ptxА, ptxB, ptxC, ptxР и prn) штаммов B.pertussis, используемых для производства коклюшного компонента АКДС-вакцины, и провести  сравнительный анализ со структурой этих генов у штаммов B.pertussis,  циркулирующих в России в последние 10 лет.

5. Пополнить музей штаммами современного периода (2005 - 2010 гг.) развития эпидемического процесса коклюшной инфекции.

Научная новизна

Получены новые данные об особенностях структуры семи генов (ptxА, ptxВ, ptxС, ptxD, ptxE, ptxР и prn), кодирующих субъединицы А-В-комплексов и промоторную область коклюшного токсина, а также пертактин штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции и в настоящее время. Выявленные существенные и множественные мутации в структуре этих генов п риводят к изменениям формирования белковых молекул антигенных детерминант (коклюшного токсина и пертактина), а также возможны функциональные изменения уровня продукции коклюшного токсина при мутациях в регуляторном гене.

Впервые показана генетическая структура современной популяции возбудителя коклюша, доминирующее положение в которой занимают штаммы B.pertussis с новыми «невакцинными» аллелями основных генов патогенности (коклюшного токсина и пертактина), а также выявлены новые мутации, приводящие к еще более существенным изменениям структуры и функции основных антигенных детерминант B.pertussis.

Полученные данные свидетельствуют, что формирование популяции штаммов B.pertussis в динамике развития эпидемического процесса коклюшной инфекции идет по пути вытеснения штаммов, содержащих «вакцинные» аллели, характерные для производственных вакцинных штаммов B.pertussis, штаммами с новыми «невакцинными» аллелями генов, кодирующими А-В-комплексы и промоторную область коклюшного токсина и пертактин, что указывает на необходимость продолжения исследований по подбору современных штаммов B.pertussis при производстве новых перспективных вакцинных препаратов.

Практическая значимость

Полученные данные о динамике распространение штаммов B.pertussis с различными аллельными вариантами генов, кодирующих основные факторы патогенности, позволили проследить формирование популяции возбудителя коклюша в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции и создать основы молекулярно-генетического мониторинга возбудителя коклюша в системе эпидемиологического надзора за коклюшной инфекцией.

Пополнена уникальная коллекция штаммов B.pertussis, выделенными от больных коклюшем в различных регионах России, дающая возможность проводить многоплановые исследования возбудителя коклюша с целью слежения за популяцией циркулирующих штаммов и прогнозирования распространения штаммов с различной генетической структурой основных детерминант патогенности возбудителя.

Выявленные особенности структуры генов, кодирующих А-В-комплексы, промоторную область коклюшного токсина и пертактин, послужили основой для определения «мишеней» (нуклеотидных последовательностей), при разработке ускоренного метода лабораторной диагностики коклюша и ускоренных методов молекулярно-генетического мониторинга его возбудителя.

Внедрение результатов работы в практику

Полученные данные о генотипических особенностях структуры штаммов B.pertussis послужили основой патента на изобретение РФ № 2007147797 от 20.02.2009 г.; «Способ и набор для ускоренной диагностики коклюша».

Результаты проведенных исследований нашли применение в лекционном цикле и практических занятиях на курсах повышения квалификации для врачей–бактериологов «Актуальные вопросы современной медицинской микробиологии», проводимых на базе ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора (2004 г.; 2005 г.; 2006 г.; 2009; 2010 гг.); семинаров тематического усовершенствования «Биологические свойства возбудителя коклюша и лабораторная диагностика» для врачей-бактериологов филиалов ФБУЗ ЦГиЭ г. Москвы (2008 г., 2009 г., 2010 г., 2012 г.) и обучающем курсе при подготовке ординаторов ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

Современные молекулярно-генетические методики изучения генотипических особенностей структуры штаммов B.pertussis используются в Референс центре по мониторингу за возбудителями дифтерии и коклюша ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора при проведении микробиологического и молекулярно-генетического мониторинга популяции штаммов возбудителя коклюша, циркулирующих на территории России.

Основные положения, выносимые на защиту:

  1. Произошли существенные мутационные изменения в структуре генов, кодирующих субъединицы А- и В- комплексов КТ и пертактин у штаммов B.pertussis, приводящие к изменениям на аминокислотном уровне иммуногенных областей КТ и пертактина. Впервые у штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем в России, выявлены изменения структуры регуляторного гена ptxР, кодирующего промоторную область КТ. Новый «невакцинный» ptxР3 аллель гена несет мутации, влияющие на уровень продукции КТ.
  2. Установлен состав популяции штаммов B.pertussis, вызывающих заболевание коклюшем на современном этапе эпидемического процесса коклюшной инфекции, - доминируют штаммы с новыми «невакцинными» ptxA1 и ptxС2 аллелями генов, кодирующих S1 и S3 субъединицы КТ, prn2 и prn3 аллелями гена, кодирующим пертактин, обнаружены единичные штаммы с измененной структурой гена ptxВ, кодирующего S2 субъединицу, и с новым «невакцинным» prn9 аллелем гена пертактина.
  3. Показано несоответствие структуры генетических детерминант, кодирующих субъединицы А-В- комплексов и промоторную область КТ и пертактин, штаммов B.pertussis, вызывающих заболевание коклюшем на современном этапе эпидпроцесса коклюшной инфекции, и производственных вакцинных штаммов B.pertussis, входящих в состав АКДС-вакцины.

Апробация работы

Диссертация апробирована на заседании секции Ученого совета «Эпидемиология, микробиология, клиника инфекционных заболеваний» ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, протокол №7 от 8 декабря 2011 г.

Результаты диссертационной работы представлены на конференциях молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире» (пос. Оболенск, Московская обл., 2009, 2010 гг.); Международном форуме по нанотехнологиям (г.Москва, 2009 г.); VIII Конгрессе детских инфекционистов (г.Москва, 2010 г.); II Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (г.Москва, 2010 г.), IV Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (г.Москва, 2012 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 22 научные работы, в том числе 9 статей - в рецензируемых изданиях, 12 работ - в материалах конференций и 1 патент на изобретение.

Объем и структура диссертации

       Диссертационная работа изложена на 135 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, 3 главы собственных исследований, заключение и выводы. Работа иллюстрирована 7 таблицами и 27 рисунками. Список литературы включает 259 источников, в том числе 53 - отечественных и 206 - зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

Штаммы микроорганизмов. Объектами исследования служили 371 штамм B.pertussis, выделенные от больных коклюшем и полученные из бактериологических лабораторий ЛПО и ФБУЗ ЦГиЭ в субъектах Российской Федерации в период 2000-2010 гг., а также штаммы B.pertussis, выделенные от больных коклюшем в 1948-1999 гг. (из коллекции лаборатории диагностики дифтерийной инфекции ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора). Изученные штаммы выделены в различные периоды эпидпроцесса коклюшной инфекции, характеризующиеся различным уровнем заболеваемости и охвата прививками: допрививочный период (1948 – 1959 гг.) и первые 10 лет проведения массовой иммунизации детского населения АКДС-вакциной (1960 – 1969 гг.) (34 штамма); период 1970 – 1989 гг. (60 штаммов); последние 20 лет (1990 – 2010 гг.) (277 штамма). В работу включено три производственных штамма B.pertussis (№№ 475, 267, 305), используемые для производства АКДС-вакцины в России (из коллекции ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздравсоцразвития (ГИСК им. Л.А. Тарасевича).

Микробиологические методы. Источниками выделения B.pertussis были назофарингиальные мазки, полученные при обследовании больных с подозрением на коклюш и коклюшеподобные заболевания. Исследование штаммов проводили согласно «Инструкции по бактериологическому и серологическому исследованиям при коклюше и паракоклюше» (1984 г.). Исследуемый материал засевали на казеиново-угольный агар (КУА) (ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития России), с добавлением 10% крови крупного рогатого скота (КРС). Идентификацию полученных штаммов B.pertussis осуществляли путем оценки их морфологических, тинкториальных и культуральных свойств с последующей сероидентификацией. Серотиповую принадлежность штаммов B.pertussis оценивали в реакции агглютинации с диагностическими коклюшными сыворотками  к агглютиногенам 1, 2, 3 (производства ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития России) согласно инструкции производителя.

Молекулярно-генетические методы. Выделение хромосомной ДНК проводили, согласно (Маниатис Т., 1984 г.) из 72-часовых культур B.pertussis, выращенных на КУА с добавлением 10% крови КРС. Выявление фрагментов генов ptxА, ptxB, ptxC, ptxD, ptxE, и ptxР штаммов B.pertussis осуществляли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), согласно международному протоколу генотипирования штаммов B.pertussis (Mooi F., 1999) в модификациях (van Loo I.H., 2002; Mooi F., 2009). Для постановки ПЦР использовали реактивы фирмы «Fermentas» (Литва) и праймеры, синтезированные в НПФ «Литех» (г. Москва). ПЦР проведена в автоматическом режиме на амплификаторе «Терцик» («ДНК - технология», г. Москва) с последующим анализом продуктов амплификации в 1,8% агарозном геле. Учет результатов осуществляли путем сравнения электрофоретической подвижности ампликонов с подвижностью маркера молекулярных весов DNA Ladder Mix («Fermentas», Литва). Для выявления особенностей структуры гена ptxA применяли метод полиморфизма длин рестрикционных фрагментов амплифицированных продуктов (ПЦР-ПДРФ) (Борисова О.Ю., 2008)  с использованием двух рестриктаз (EheI и BfuI), позволяющий получить характерный рестрикционный профиль, определяющий генотип микроорганизма. Для выявления особенностей структуры гена prn штаммов B.pertussis применяли метод «гнездовой» ПЦР (Muyldermans G., 2004) с использованием двух пар праймеров (C-D для первого раунда и E-D для второго раунда амплификации). Секвенирование фрагментов генов ptxB, ptxC, ptxD, ptxЕ и ptxР осуществляли по методу Сенгэра (Senger et al., 1977) на ABI DNA секвенаторе (Perkin-Elmer Applied Biosystems) с помощью ABI Prism Big Dye terminator cycle sequencing ready reaction kit. Анализ нуклеотидных последовательностей проводили с использованием базы данных EMBL/GenBank на сайте Национального центра биотехнологической информации США (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez).

Вирулентные свойства штаммов B.pertussis изучали в опытах in vivo на мышах при интрацеребральном заражении согласно «Инструкция по отбору, проверке и хранению производственных штаммов коклюшных бактерий» (2009 г.). В опытах использовали мышей – гибридов линии F1. Для исследования использовали культуры 3-4 пассажа на среде Борде-Жангу с кровью. Кратные разведение 48- часовой культуры в опытной дозе вводили интрацеребрально 6-ти мышам и вели наблюдения в течение 14 дней. Животных погибших в первые три дня из опыта исключали. Подсчет результатов проводили по методу Рида и Менча.

Статистическая обработка результатов, анализ данных и программное обеспечение. Статистическую обработку и анализ полученных данных осуществляли по стандартным программам и общепринятым алгоритмам с помощью компьютерных программ Microsoft Office Excel 2003. Компьютерный анализ подбора праймеров проводили с помощью: NCBI Blast2 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) - определение гомологии при изучении секвенсов с соответствующих праймеров; Primer3.0 (http://www-genome.wi.mit.edu) - подбор праймеров и температур их плавления; Oligo 6.31 – основной расчет характеристик ПЦР, возможности образования праймерами дуплексов и вторичных структур. Нуклеотидные последовательности штаммов B.pertussis были сопоставлены с базой данных EMBL/GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez).

Экспериментальные результаты работы получены автором лично и совместно с коллегами из ФРЛДДИ ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора (руководитель лаборатории – д.м.н., профессор Мазурова И.К.). Изучение вирулентных свойств B.pertussis выполнено совместно с коллективом сотрудников лаборатории иммуномодуляторов ФГБУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, г. Москва – к.м.н. Н.С. Захаровой, к.б.н. Н.У. Мерцаловой, к.м.н. Е.М. Зайцевым и А.С. Шинкаревым.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Особенности структуры генов - ptxА, кодирующего S1 субъединицу А-комплекса, ptxВ, ptxС, ptxD и ptxE, кодирующих S2, S3, S4 и S5 субъединицы В-комплекса коклюшного токсина, и гена prn, кодирующего пертактин, штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем в период 2000 2010 годы.

Результаты изучения особенностей молекулярно-генетической структуры генов ptxА, ptxB, ptxC, ptxD, ptxE и prn, кодирующих основные факторы патогенности возбудителя коклюша представлены (табл. 1). У современных штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем выявлены мутационные изменения в структуре этих генов.

При секвенировании фрагментов гена ptxА, кодирующего А-комплекс КТ, у штаммов B.pertussis обнаружены 3 варианта последовательности нуклеотидов, которые, согласно GenBank, соответствовали одному их трех аллелей гена ptxА – ptxА2 (AJ245367), ptxА4 (AJ245368) или ptxА1 (AJ245366) аллелям (табл. 1). Среди них ptxА1 аллель является «невакцинным», ptxА2/ptxА4 - старыми «вакцинными» аллелями, согласно EMBL/GenBank. Наиболее существенные замены произошли у штаммов с новым «невакцинным» ptxА1 аллелем в двух положениях - 204 (А – С) и 684 (G – A), которые приводили к заменам на аминокислотном уровне - G68A и M228I. Эти изменения затрагивают Т- и В-эпитопы КТ, имеющие непрерывные иммунодоминантные структуры, распознаваемые протективными моноклональными mAbs-антителами к этим эпитопам (Mooi F., 2009, 2010). Среди штаммов B.pertussis, выделенных в 2000-2010 годы оказалось, что большинство штаммов 97,7% несут «невакцинный» ptxА1 аллель гена.

При изучении фрагментов гена ptxВ штаммов B.pertussis обнаружено 2 варианта последовательности нуклеотидов (табл.1), из которых вариант 1 соответствовал опубликованной в GenBank последовательности нуклеотидов гена ptxB штамма B.pertussis (М13223), а последовательность нуклеотидов варианта 2 отличалась от варианта 1 в восьми положениях, из которых наиболее существенные замены произошли в двух положениях – 65 (С - G) и 290 (Т – А), приводящие к контрастным заменам на аминокислотном уровне - S22C и V97Glu. При изучении динамики распространения штаммов B.pertussis, оказалось, что в начале этого века в 2007 году появились единичные штаммы в 2,2% случаях с новым «невакцинным» ptxB2 аллелем гена. Следовательно, впервые у штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем в России, показана вариабельность структуры гена ptxB с появлением нуклеотидных контрастных замен, оказывающих влияние на скорость и интенсивность синтеза S2 субъединицы В-комплекса КТ (Алтухов Ю.П., 2003).

По структуре гена ptxC у изученных штаммов B.pertussis также выявлено два варианта последовательности нуклеотидов, которые соответствовали, согласно GenBank, двум аллелям гена ptxC (табл. 1): вариант 1 - «вакцинному» ptxC1 аллелю (М13223), вариант 2 – «невакцинному» ptxC2  аллелю (AJ420987) и различались между собой в одном положении - замена нуклеотида в положении 681 (С – Т), которая является не контрастной и не сопровождается изменениями на аминокислотном уровне S3 субъединицы В-комплекса КТ. Среди штаммов B.pertussis, выделенных в 2000-2010 годы оказалось, что в популяции доминируют штаммы с «невакцинным» ptxC2 аллелем гена в 91,2% случаев. Вместе с тем, согласно по данным литературы, штаммы с этим «невакцинным» аллелем относятся к одному пульс-гель-профилю и вызвали с 1990-х годов прошлого века рост заболеваемости коклюшем в Европейских странах.

При изучении структуры генов ptxD и ptxE штаммов B.pertussis не выявлены изменения в структуре этих генов. Варианты последовательностей нуклеотидов гена ptxD и гена ptxE соответствовали нуклеотидным последовательностям генов ptxD (М13223) и ptxE (М13223), опубликованным в GenBank, т.е. по структуре этих генов популяция циркулирующих штаммов возбудителя коклюша является однородной.

При изучении особенностей структуры гена prn, кодирующего главный адгезин возбудителя – белок пертактин, оказалось, что данный ген является одним из наиболее полиморфных генов. Структура гена prn циркулирующих штаммов соответствовала одному из четырех выявленных аллелей – prn1 (AJ011091), prn3 (AJ011093), prn2 (AJ011092) или prn9 (AJ315611.1), из которых prn1 аллель является «вакцинным» аллелем этого гена, согласно EMBL/GenBank. «Невакцинные» prn2, prn3 и prn9 аллели отличаются от «вакцинного» prn1 аллеля наличием «немолчащих» мутаций в шести положениях – 828, 831, 832, 833, 834 и 836, приводящих к контрастным заменам на аминокислотном уровне - А278F и V297G.

Табл. 1. Положение нуклеотидных замен в различных аллелях генов ptxА, ptxB, ptxC и prn штаммов современной популяции B.pertussis.

Вар-ты нукл. посл-тей

Аллели генов

Положение нуклеотидных замен

Удельный вес штаммов

ген ptxA

204

684

696

Вар. 1

ptxA2

C

G

A

1,5%

Вар. 2

ptxA4

A

G

G

0,8%

Вар. 3

ptxA1

C

A

A

97,7%

ген ptxB

55

65

75

129

252

290

360

510

Вар. 1

ptxB1

C

C

G

T

C

T

T

G

97,8%

Вар. 2

ptxB2

T

G

C

C

T

A

C

A

2,2%

ген ptxC

680

Вар. 1

ptxC1

C

12,6%

Вар. 2

ptxC2

T

87,4%

ген prn

828

831

833

833

834

836

Дополнительная вставка

841-855

856-871

Вар. 1

prn1

T

T

G

C

G

T

2,7%

Вар. 2

prn2

C

C

T

T

C

G

GGCGGCCTCGGTCCC

-

94,0%

Вар. 3

prn3

C

C

T

T

C

G

2,7%

Вар. 4

prn9

C

C

T

Т

С

G

GGCGGCCTCGGTCCC

GGCGGCCTCGGTCCC

0,4%

Последовательность нуклеотидов prn2 аллеля отличается от последовательности нуклеотидов prn3 аллеля наличием вставки дополнительного фрагмента в 15 п.н. в 1 области гена. Нами впервые обнаружены штаммы с другим (третьим) «невакцинным» prn9 аллелем гена, который является «невакцинным» и имеет еще дополнительный фрагмент в 30 п.н. в 1 области гена. Все изменения в prn2, prn3 и prn9 аллелях произошли в 1 и 2 областях Prn белка, которые являются иммуногенными и участвуют в формировании В-клеточного иммунного ответа (Boursaux-Eude C., 1999; Bernard М., 1999; King A.J., 2001).

Таким образом, изучение молекулярно-генетических особенностей структуры штаммов B.pertussis, выделенных с 2000-2010 гг., показало, что в настоящее время в циркулирующей популяции доминируют штаммы с новой генетической структурой - гена ptxA, кодирующего А-комплекс КТ (97,7%); гена ptxС, кодирующего S3 субъединицу В-комплекса КТ (87,4%); гена prn, кодирующего пертактин (97,1%); также появились изменения гена ptxВ, кодирующего S2 субъединицу В-комплекса КТ (2,2%). Изменения в структуре генов ptxD и ptxE, кодирующих S4 и S5 субъединицы В-комплекса КТ, у современных штаммов не обнаружены.

Особенности структуры регуляторного гена ptxP, кодирующего промоторную область коклюшного токсина.

При секвенировании фрагментов гена ptxP у штаммов B.pertussis обнаружено 3 варианта последовательности нуклеотидов, которые различались между собой в двух положениях (–167) и (–65) (рис. 1). Полученные последовательности нуклеотидов полностью соответствовали последовательностям, опубликованным в GenBank, и соответствовали трем аллелям гена ptxР: вариант 1 - «вакцинному» ptxР1 аллелю (М13223), вариант 2 – «невакцинному» ptxР2 аллелю (AJ420987) и вариант 3 – «невакцинному» ptxР3 аллелю (AJ420987).

Рис. 1. Мутации в структуре гена ptxP, кодирующего регуляторную промоторную область коклюшного токсина, штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем.

«Невакцинный» аллель ptxР2 отличается от «вакцинного» ptxР1 аллеля наличием «немолчащей» мутации в (-167) положении (С – Т), приводящей к замене на аминокислотном уровне - Н57Т в промоторе КТ. Другой «невакцинный» ptxР3 аллель характеризуется наличием «немолчащей» мутации в (-65) положении нуклеотидной последовательности, приводящей к замене на аминокислотном уровне - G22Asp в промоторе КТ. Такая замена находится в одном из основных сайтов связывания с димером BvgA, точность присоединения которого на такой сайт и прочность образуемой связи влияет на экспрессию генов ptx и, следовательно, на уровень продукции КТ. При изучении современных штаммов B.pertussis оказалось (рис.2), что 4,0% штаммов B.pertussis имели «вакцинный» ptxР1 аллель гена, 2,7% штаммов - ptxР2 аллель и 93,3% штаммов - «невакцинный» ptxР3 аллель гена.

Рис. 2. Характеристика современных штаммов B.pertussis гена ptxР.

Следовательно, большинство современных штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем в нашей стране, несут новую структуру этого гена – «невакцинный» ptxР3 аллель гена.

С целью сопоставления структуры регуляторного гена ptxР, кодирующего промоторную область КТ, и биологических свойств современных штаммов B.pertussis совместно с сотрудниками института ФГБУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН - к.м.н. Н.С. Захаровой, к.б.н. Н.У. Мерцаловой, к.м.н. Е.М. Зайцевым и А.С. Шинкаревым проведено изучение вирулентных свойств 15 штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем в последние годы. Исследования проводили in vivo на мышах путем их интрацеребрального заражения и последующего расчета LD50. Оказалось, что все штаммы с высокой и один штамм со средней степенью вирулентности несли новый «невакцинный» ptxР3 аллель гена. В то время как среди двух современных слабовирулентных штаммов, LD50 которых значительно превышала критерий оценки слабовирулентности штаммов, один штамм характеризовался новым «невакцинным» ptxР3 аллелем, а другой штамм – старым «вакцинным» ptxР1 аллелем гена. Следовательно, большинство современных штаммов обладают высокой степенью вирулентности, которая объясняется наличием у них значительных мутационных изменений в структуре гена ptxР, кодирующего регуляторную промоторную область КТ, и несут новый «невакцинный» ptxР3 аллель.

Сравнительный анализ структуры генов ptxА, ptxВ, ptxС, ptxР и prn штаммов B. pertussis, используемых для производства коклюшного компонента АКДС-вакцины, и современных штаммов, выделенных от больных коклюшем в России.

При изучении структуры генов, кодирующих А-, В-комплексы, проморную область КТ и пертактин, штаммов B.pertussis, вызывающих заболевания коклюшем на современном этапе, и отечественных производственных вакцинных штаммов (табл. 2), оказалось, что все три вакцинных штамма имели старые «вакцинные» ptxА2/ptxА4 аллели гена, кодирующего S1 субъединицу А-комплекса КТ. В то время как, структура гена ptxA штаммов B.pertussis, вызывающих заболевание коклюшем в последние 10 лет, характеризуется в 97,7% случаях новым «невакцинным» ptxA1 аллелем гена. При изучении структуры генов ptxВ и ptxС, кодирующих субъединицы В-комплекса КТ, у вакцинных и современных штаммов B.pertussis обнаружено, что все три вакцинных штамма B.pertussis несут «вакцинные» ptxВ1 и ptxС1 аллели генов, кодирующих S2 и S3 субъединицы В-комплекса КТ; современная циркулирующая популяция в 87,4% случаев представлена штаммами с новым «невакцинным» ptxС2 аллелем и обнаружено 2 штамма, несущих новый «невакцинный» ptxB2 аллель гена. По структуре гена ptxР, кодирующего промоторную область КТ, выявлено, что из трех вакцинных штаммов, два штамма, выделенных в 1950-х годах, несут старый «вакцинный» ptxР1 аллель гена; один штамм B.pertussis № 475, который введен в состав АКДС-вакцины в конце 1960-х годов, несет уже «невакцинный» ptxР2 аллель этого гена. Современная популяция в 93,3% случаях характеризуется штаммами с другим новым «невакцинным» ptxР3 аллелем гена.

Табл.2. Сравнительный анализ структуры генов ptxА, ptxВ, ptxС, ptxР и prn штаммов B. pertussis, используемых для производства коклюшного компонента АКДС-вакцины, и современных штаммов, выделенных от больных коклюшем в России.

Штаммы B.pertussis

Серотип

Генотип (аллель гена)

ptxA

ptxВ

ptxС

ptxР

prn

вакцинные штаммы

№ 475 (1966 г.)

1.2.3 

ptxA4

ptxB1

ptxС1

ptxР2

рrn1

№ 305 (1956 г.)

1.2.0

ptxA2

ptxB1

ptxС1

ptxР1

рrn1

№ 267 (1956 г.)

1.0.3

ptxA2

ptxB1

ptxС1

ptxР1

рrn1

Штаммы, выделенные от больных коклюшем

2000-2010 гг.

1.2.3

1.2.0 1.0.3

ptxA1-97,7%

ptxA2-1,5%

ptxA4 -0,8%

ptxB1-97,8%

ptxB2-2,2%

ptxС1-12,6%

ptxC2- 87,4%

ptxР1- 4,0% ptxР2 - 2,7%

ptxР3 -93,3%

prn1 - 3,9% prn2 – 94,0% prn3 - 2,7% prn9 – 0,4%

Следовательно, показано несоответствие структуры генетических детерминант, кодирующих субъединицы А-, В- комплексов и промоторную область коклюшного токсина и пертактин, у современных циркулирующих штаммов B.pertussis, вызывающих заболевание коклюшем на современном этапе эпидпроцесса коклюшной инфекции, и производственных штаммов B.pertussis, используемых для АКДС-вакцины.

Распространение штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции, с аллельными вариантами генов ptxА, ptxВ, ptxС, ptxР и prn.

Для оценки динамики формирования современной популяции возбудителя коклюша изучены особенности структуры 5 генов, детерминирующих основные факторы патогенности возбудителя коклюша, у 371 штамма B.pertussis, выделенных от больных коклюшем в России в различные периоды эпидпроцесса коклюшной инфекции.

Анализ динамики распространении штаммов B.pertussis с различной структурой гена ptxА показал (рис. 3), что в допрививочный период (1948 - 1959 гг.) вся циркулирующая популяция характеризовалась старыми «вакцинными» ptxА2/ptxА4 аллелями гена ptxА, кодирующего S1 субъединицу А-комплекса КТ. В конце 1960-х годов в популяции штаммов B.pertussis стали регистрироваться единичные штаммы (9,5%) с новым «невакцинным» ptxА1 аллелем гена. Остальные штаммы несли ptxА4 (38,0%) и ptxА2 (52,5%) аллели гена. В 1970-е годы большинство циркулирующих штаммов имели старые «вакцинные» аллели ptxА гена: 48,4% штаммов - «вакцинный» ptxА4 аллель, 35,5% штаммов - «вакцинный» ptxА2 аллель и 16,1% штаммов характеризовались «невакцинным» ptxА1 аллелем, имеющим значительные мутационные изменения в иммуногенных областях коклюшного токсина.

Рис. 3. Удельный вес штаммов B.pertussis с аллельными вариантами гена ptxА, циркулирующие в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции.

Все изученные штаммы B.pertussis, выделенные в 1980-е и 1990-е гг. (39 штаммов) прошлого столетия и в начале нового столетия 2000-2005 гг. (185 штаммов), имели «невакцинный» ptxА1 аллель гена; 70 (92,1%) штаммов, выделенных в 2006 – 2010 гг., также несли этот аллель гена, т.е. в современной популяции возбудителя коклюша доминируют штаммы с новой генетической структурой, кодирующей А-комплекс КТ.

При изучении распространения штаммов B.pertussis, с различной структурой гена ptxВ, кодирующего S2 субъединицу В-комплекса КТ, оказалось (рис. 4), что вплоть до настоящего времени, т.е. в периоды, охватывающие допрививочный и 50 лет проведения массовой иммунизации детского населения АКДС-вакциной, циркулирующая популяция штаммов B.pertussis, по структуре гена ptxB была однородной.

Рис. 4. Удельный вес штаммов B.pertussis с аллельными вариантами гена ptxВ в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции.

Однако, среди штаммов B.pertussis, выделенных в 2000 - 2010 гг., зарегистрированы 2 (2,2%) штамма B.pertussis, несущие ptxB2 аллель гена с значительными мутационными изменениями в двух положениях, приводящими к заменам на аминокислотном уровне. Следовательно, отмечается начало перестройки циркулирующей популяции штаммов B.pertussis, идущей по пути появления генетической вариабельности и в гене ptxB, кодирующем S2 белок В-комплекса КТ.

При анализе распространения штаммов B.pertussis с различной структурой гена ptxC, кодирующего S3 субъединицу В-комплекса КТ, установлено (рис. 5), что для всех изученных штаммов B.pertussis, выделенных в 1948 – 1959 гг., 1960 – 1969 гг. и в 1970 – 1979 гг., характерным было наличие «вакцинного» ptxC1 аллеля гена. В 1980 – 1999 гг. удельный вес штаммов B.pertussis, несущих ptxC1 аллель, составил 92,0%. Вместе с тем, в начале 1980-х годов в циркулирующей популяции стали регистрировать единичные штаммы (8,0%) с новым «невакцинным» ptxС2 аллелем. В последующие годы удельный вес таких штаммов увеличился.

Так, среди штаммов, выделенных в 2000 – 2005 гг., только 14,0% штаммов несли старый «вакцинный» ptxC1 аллель и 86,0% штаммов характеризовались новым «невакцинным» ptxС2 аллелем гена.

Рис. 5. Удельный вес штаммов B.pertussis с аллельными вариантами гена ptxС, циркулирующие в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции.

Из 60 штаммов, выделенных в 2006 – 2010 гг., 7 (11,7%) штаммов имели ptxC1 аллель и 53 (88,3%) штамма - ptxС2 аллель гена. Следовательно, с 2000 г. в циркулирующей популяции штаммов возбудителя коклюша доминируют штаммы с новым «невакцинным» ptxC2 аллелем гена, кодирующим S3 субъединицу В-комплекса КТ.

По структуре гена ptxP среди изученных штаммов B.pertussis, выделенных в допрививочный период (1948 – 1959 гг.), 71,4% штаммов имели «невакцинный» ptxР2 аллель и 28,6% штаммов - «вакцинный» ptxР1 аллель (рис. 6). В последующие годы отмечается постепенное увеличение удельного веса штаммов с ptxР1 аллелем до 41,7% в 1960-1969 гг. и 70,6% в 1970-1979 гг. и уменьшение удельного веса штаммов с ptxР2 аллелем до 58,3% в 1960-1969 гг. и 29,4% в 1970-1979 гг. В 1980-1989 гг. удельный вес штаммов с ptxР1 аллелем составил 95,0%, а с ptxР2 аллелем снизился до 5,0%. В 1990-1999 гг. впервые зарегистрированы в 11,1% случаев штаммы B.pertussis, несущие новый «невакцинный» ptxР3 аллель гена, имеющий немолчащие мутации, влияющие на уровень продукции коклюшного токсина.

Среди 75 штаммов B.pertussis, выделенных в последние десять лет, большинство (93,3%) штаммов характеризуются «невакцинным» ptxР3 аллелем, 2,7% штаммов - «невакцинным» ptxР2 и 4,0% штаммов - «вакцинным» ptxР1 аллелями гена. Следовательно, в последние десять лет в циркулирующей популяции доминируют штаммы с «невакцинным» ptxР3 аллелем гена, кодирующим промоторную область КТ.

Рис. 6. Удельный вес штаммов B.pertussis с аллельными вариантами гена ptxР, выделенные в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции.

Одним из главных адгезинов возбудителя коклюша является пертактин. Показано (рис. 7), что для всех штаммов B.pertussis допрививочного периода (1948-1959 гг.) характерным было наличие «вакцинного» prn1 аллеля гена. В последующие годы отмечалось постепенное сокращение доли таких штаммов и увеличение удельного веса штаммов с новой генетической структурой. Среди штаммов B.pertussis, выделенных в 1970-е годы, 96,9% штаммов имели «вакцинный» prn1 аллель и 3,1% штаммов – «невакцинный» prn3 аллель гена, которое отличается от «вакцинного» аллеля наличием «немолчащих» мутаций, приводящих к замене на аминокислотном уровне. В 1980-е годы доля штаммов с «невакцинным» prn3 аллелем увеличилась до 31,1%. Вместе с тем, уже к концу 1980-х годов в популяции появились также штаммы с другим «невакцинным» prn2 аллелем гена, имеющим мутационные изменения приводящие к заменам на аминокислотном уровне. Среди штаммов B.pertussis, выделенных в 1990 – 1999 гг., 44,5% штаммов имели «вакцинный» prn1 аллель, 22,2% штаммов – «невакцинный» prn2 аллель и 33,3% штаммов – «невакцинный» prn3 аллель, т.е. значительно увеличилась доля циркулирующих штаммов B.pertussis с «невакцинным» prn2 аллелем гена.

Большинство (97,9%) штаммов B.pertussis, выделенных в начале нового столетия (2000-2005 гг.), характеризовались «невакцинными» prn2 и prn3 аллелями гена пертактина. В 2006 – 2010 гг. у циркулирующих штаммов B.pertussis наблюдается большая гетерогенность «невакцинных» аллелей: 89,5% штаммов характеризуются новым «невакцинным» prn2 аллелем, 5,3% штаммов - «невакцинным» prn3 аллелем и впервые выявлено 1,3% штаммов с другим новым «невакцинным» prn9 аллелем гена, который ранее не регистрировали и характеризуется еще более значительными мутационными изменениями.

Рис. 7. Удельный вес штаммов B.pertussis с аллельными вариантами гена prn, циркулирующие в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции.

Анализ динамики изменчивости штаммов B.pertussis, выделенных в различные периоды эпидпроцесса коклюшной инфекции, позволил проследить формирование популяции возбудителя коклюша, которое идет путем замены штаммов со старыми «вакцинными» аллелями на штаммы, несущие новые «невакцинные» аллели, и происходит поступательно, затрагивая последовательно генетические детерминанты, кодирующие основные факторы патогенности возбудителя (рис. 8).

Рис. 8. Динамика появления штаммов B.pertussis с новыми «невакцинными» аллелями генов, кодирующих А- (ptxA) и В- (ptxC) комплексы коклюшного токсина, его промоторную область (ptxP) и пертактин (prn).

С середины 1960-х годов, т.е. через 10 лет проведения массовой иммунизации, в популяции первыми появились штаммы с новым «невакцинным» аллелем гена А-комплекса КТ. Далее изменения затронули prn ген, отвечающий за адгезию возбудителя к поверхности чувствительного эпителия, с появлением в 1970-е годы штаммов B.pertussis сначала с новым «невакцинным» prn3 аллелем, в 1980-е годы с «невакцинным» prn2 аллелем и в 2000-е годы «невакцинным» prn9 аллелем гена (рис. 8).

В 1990-е – 2000–е годы изменения затронули не только ген, отвечающий за основные патоморфологические процессы в эукариотической клетке (А-комплекс), но и отвечающие за прикрепление его к рецептору и проникновение внутрь клетки (В-комплекс). В середине 1990-х годов были выявлены штаммы B.pertussis, у которых существенные изменения произошли в структуре генетической детерминанты, кодирующей промоторную область КТ, т.е. регуляторную область, влияющую на продукцию основного фактора патогенности возбудителя, что привело к увеличению продукции коклюшного токсина у современных штаммов возбудителя коклюша. Такие изменения расширяют приспособительные возможности возбудителя коклюша, что способствует его адаптации в меняющихся условиях существования, и прежде всего, в условиях длительной массовой иммунизации (Godfroid F., 2005; van Boven M., 2005; Brinig M.M., 2006). Все это свидетельствует о происходящей клональной экспансии штаммов с новой генетической структурой основных факторов патогенности, которая не соответствует генетической структуре производственных штаммов, используемых для производства вакцинных препаратов при профилактике коклюша.

В Ы В О Д Ы

  1. Выявлены существенные мутации в структуре генов современных штаммов B.pertussis приводящие к изменениям на аминокислотном уровне иммуногенных областей Т- и В-эпитопов коклюшного токсина и В-эпитопа пертактина, что может влиять на формирование иммунного ответа.
  2. Впервые у штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем в России, выявлены изменения в структуре регуляторного ptxР гена, кодирующего промоторную область коклюшного токсина, с формированием нового «невакцинного» ptxР3 аллеля, что влияет на уровень продукции коклюшного токсина.
  3. Установлено, что популяция штаммов B.рertussis формируется путем клональной экспансии штаммов с новой генетической структурой основных факторов патогенности - коклюшного токсина и пертактина. Установлен состав популяции штаммов B.pertussis, вызывающих заболевание коклюшем на современном этапе эпидемического процесса коклюшной инфекции – с доминированием штаммов с новыми «невакцинными» аллелями генов - ptxA1 (97,7%), ptxС2 (87,4%) и prn2 (89,5%).
  4. Обнаружено, что среди современных штаммов B.pertussis циркулируют единичные штаммы с еще более существенными и множественными изменениями генетической структуры коклюшного токсина и пертактина – в 2,2% случаях с ptxB2 аллелем и в 1,3% случаях с prn9 аллелем, влияющие на адгезивные свойства возбудителя коклюша. Изменений в структуре детерминант, кодирующих S4 и S5 субъединицы В - комплекса КТ, не обнаружено.
  5. Показано несоответствие структуры генетических детерминант, кодирующих субъединицы А- и В- комплексов коклюшного токсина, его промоторную область и пертактин, у современных циркулирующих штаммов B.pertussis, вызывающих заболевание коклюшем на современном этапе эпидпроцесса коклюшной инфекции, и производственных вакцинных штаммов B.pertussis, входящих в состав АКДС-вакцины.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Продолжение исследований по выявлению генетических изменений в штаммах возбудителя коклюша с целью установления механизмов формирования популяции в различные периоды эпидемического процесса позволяет обосновать замену штаммов при производстве вакцинных препаратов при профилактике коклюша.

Изучение генотипических особенностей структуры штаммов возбудителя коклюша может быть рекомендовано как дополнительный критерий при выборе штаммов для включения в состав профилактических препаратов.

Уникальная коллекция штаммов B.pertussis пополненная штаммами, выделенными от больных коклюшем в современный период эпидемического процесса коклюшной инфекции может быть использована для проведения фундаментальных прикладных исследований посвященных, изучению биологии возбудителя коклюша и слежению за циркулирующей популяции.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Борисова О.Ю. Полиморфизм генов, кодирующих основные факторы патогенности штаммов B.pertussis / Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю., Гадуа Н.Т., Петрова М.С., Герасимова А.Г., Пяева А.П., Скачкова В.Г., Захарова Н.С., Мерцалова Н.У., Мазурова И.К., Алешкин В.А. // Материалы IX Всероссийского съезда эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. – 2007. – том 1. – С. 50 – 51.
  2. Борисова О.Ю. Молекулярно-генетический мониторинг штаммов B.pertussis, выделенных в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции / Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю., Гадуа Н.Т., Мерцалова Н.У., Шинкарев А.С., Захарова Н.С., Пяева А.П., Лыткина И.Н., Требунских И.П., Салова Н.Я., Савинкова В.С., Скачкова В.Г., Мазурова И.К. // Материалы 4-ой международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», 2 – 4 июня 2008 г., Санкт – Петербург. – 2008. – С. 7.
  3. Борисова О.Ю. Молекулярно-генетический метод ускоренного выявления штаммов B.pertussis, обладающих различными ptx генами / Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю., Гадуа Н.Т., Мазурова И.К. // Журнал микробиологии. 2008. № 5. С. 80 83.
  4. Мазурова И.К. Динамика изменчивости основных генов патогенности штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем в г. Москве (1948 2005 гг.) / Мазурова И.К.,  Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю., Гадуа Н.Т., Алешкин В.А. // Журнал молекулярной медицины. 2008. - № 1. С. 40 45.
  5. Мерцалова Н.У. Динамика изменений патогенных свойств штаммов B.pertussis / Мерцалова Н.У., Борисова О.Ю., Шинкарев А.С., Брицина М.В., Озерецковская М.Н., Мазурова И.К., Алешкин В.А., Гадуа Н.Т., Захарова Н.С. // Журнал микробиологии. 2009. - № 6. - С. 7 11.
  6. Борисова О.Ю. Мониторинг штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем в 1948 – 2007 гг. / Борисова О.Ю., Гадуа Н.Т. // Материалы научно-практ. конференции молодых ученых и специалистов НИУ Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире» 21 – 22 апреля 2009 г. (г. Оболенск, Московская область). – 2009. – С. 49 - 51.
  7. Борисова О.Ю. Ускоренный молекулярно-генетический метод выявления возбудителя коклюша / Борисова О.Ю., Гадуа Н.Т., Петрова М.С., Попова О.П., Комбарова С.Ю., Мазурова И.К., Алешкин В.А. // Медицинский альманах. - 2009. - № 2 (7). С. 51 53.
  8. Гадуа Н.Т. Ускоренный молекулярно-генетический метод выявления возбудителя коклюша, основанный на изотермальной амплификационной технологии / Гадуа Н.Т., Борисова О.Ю., Петрова М.С., Попова О.П., Комбарова С.Ю., Мазурова И.К., Алешкин В.А. // Материалы Международного форума по нанотехнологиям «Rusnanotech», 6-8 октября 2009 г. (г. Москва). – 2009. – стр. 851 – 852.
  9. Гадуа Н.Т. Сопоставление генетической структуры штаммов B.pertussis, используемых для производства АКДС-вакцины, и штаммов, выделенных от больных коклюшем на современном этапе эпидемического процесса коклюшной инфекции» / Гадуа Н.Т., Борисова О.Ю. // Материалы научно-практ. конференции молодых ученых и специалистов НИУ Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире» 21 – 22 апреля 2009 г. (г. Оболенск, Московская область). – 2009. – С. 52 - 53.
  10. Борисова О.Ю. Характеристика штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем / Борисова О.Ю., Мазурова И.К., Гадуа Н.Т., Салова Н.Я., Требунских И.П., Скачкова В.Г., Савинкова В.С., Алешкин В.А. // Материалы международной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями», 18 – 20 мая 2010 г., г. Санкт-Петербург). – 2010. – С. 120.
  11. Борисова О.Ю. Особенности коклюшной инфекции в различные периоды эпидемического процесса в г. Москве / Борисова О.Ю., Петрова М.С., Мазурова И.К., Лыткина И.Н., Попова О.П., Гадуа Н.Т., Мерцалова Н.У., Захарова Н.С., Пяева А.П., Салова Н.Я., Требунских И.П., Комбарова С.Ю., Шинкарев А.С., Скачкова В.Г., Савинкова В.С., Алешкин В.А. // Журнал эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2010. - № 4. С. 33 39.
  12. Борисова О.Ю. Прямой ускоренный метод выявления возбудителя коклюша / Борисова О.Ю., Петрова М.С., Гадуа Н.Т., Скачкова В.Г., Савинкова В.С., Попова О.П., Мазурова И.К., Алешкин В.А. // Клиническая лабораторная диагностика. 2010. - № 5. С. 53 55.
  13. Борисова О.Ю. Особенности циркуляции штаммов возбудителя коклюша в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции / Борисова О.Ю., Мазурова И.К., Лыткина И.Н., Гадуа Н.Т., Пяева А.П., Салова Н.Я., Требунских И.П., Алешкин В.А. // Материалы VII Всеросс.научно-практ. конференции с международным участием «Молекулярная диагностика – 2010», 24 – 26 ноября 2010 г. (г. Москва). – 2010. – С. 153 – 154.
  14. Борисова О.Ю. Молекулярно-генетические особенности структуры гена, кодирующего фактор колонизации трахеи штаммов B.pertussis / Борисова О.Ю., Мазурова И.К., Гадуа Н.Т., Салова Н.Я., Требунских И.П., Алешкин В.А. // Журн. Микробиологии 2010. - № 5. С. 11 15.
  15. Борисова О.Ю. Антибиотикорезистентность циркулирующих штаммов B.pertussis. / Борисова О.Ю., Ивашинникова Г.А., Гадуа Н.Т., Рудакова И.А., Мазурова И.К. // Материалы III Ежегодного Всеросс. Конгресса по инфекционным болезням, 28 – 30 марта 2011 г. (г. Москва). – 2011. – С. 54.
  16. Ивашинникова Г.А. Чувствительность штаммов B.pertussis к антибактериальным препаратам. / Ивашинникова Г.А., Борисова О.Ю., Гадуа Н.Т., Рудакова И.А., Мазурова И.К., Алешкин В.А. // Материалы научно-практической конференции молодых ученых Роспотребнадзора, посвященной 90-летию со дня рождения академика РАМН И. Н. Блохиной, 20 -21 апреля 2011 г. (г. Н. Новгород). – 2011 г. – С. 81.
  17. Борисова О.Ю. Особенности структуры генов, кодирующих А- и В-комплексы коклюшного токсина, штаммов B.pertussis. / Борисова О.Ю., Гадуа Н.Т., Салова Н.Я., Требунских И.П., Скачкова В.Г., Панферова Р.А., Ивашинникова Г.А., Рудакова И.А., Мазурова И.К., Алешкин В.А. // Журнал молекулярной медицины. 2012. - № 1. С. 44 48.
  18. Борисова О.Ю. Мультилокусное секвенирование штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем в настоящее время в России / Борисова О.Ю., Ивашинникова Г.А., Гадуа Н.Т., Рудакова И.А., Мазурова И.К. // Материалы IV Ежегодного Всеросс. Конгресса по инфекционным болезням. - 2012. - С. 64.
  19. Ивашинникова Г.А. Характеристика современных штаммов B.pertussis по структуре ptxP гена, кодирующего промоторную область коклюшного токсина / Борисова О.Ю., Гадуа Н.Т., Рудакова И.А., Мазурова И.К. // Материалы IV Ежегодного Всеросс. Конгресса по инфекционным болезням. - 2012 - С. 161.
  20. Борисова О.Ю. Мониторинг штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем в России / Борисова О.Ю., Мазурова И.К., Гадуа Н.Т., Ивашинникова Г.А., Рудакова И.А. // Материалы X съезда Всеросс. научно-практич. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения РФ» 12 – 13 апреля 2012 г. (г. Москва). – 2012. – С. 245.
  21. Борисова О.Ю., Мазурова И.К., Ивашинникова Г.А., Гадуа Н.Т., Рудакова И.А., Салова Н.Я., Требунских И.П., Скачкова В.Г., Панферова Р.А., Mooi F., Алешкин В.А. Характеристика штаммов Bordetella pertussis, выделенных от больных коклюшем в г. Москве, с помощью мультилокусного секвенирования. // Журнал микробиол. 2012. - № 2. С. 28 34.

Изобретения:

  1. Патент РФ № 2007147797 от 20.02.2009, бюлл № 5 Способ и набор для ускоренной диагностики коклюша /Борисова О.Ю., Мазурова И.К., Комбарова С.Ю., Гадуа Н.Т., Петрова М.С., Попова О.П., Алешкин В.А.; заявитель и патентообладатель: ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора. заявка №2007147797/13 от 25.12.2007.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

КТ -  коклюшный токсин

КУА -  казеиново-угольный агар

ЛПО - лечебно-профилактические организации

ПЦР-ПДРФ  -  полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

ПЦР  -  полимеразная цепная реакция

ФБУЗ ЦГиЭ  – федеральное бюджетное учреждение здравоохранения центр гигиены и

  эпидемиологии

ФРЛДДИ  -  Федеральная референс лаборатория диагностики

дифтерийной  инфекции

prn                -  ген пертактина        

ptxA       -  ген, кодирующий  S1 субъединицу коклюшного токсина

ptxB  -  ген, кодирующий  S2 субъединицу коклюшного токсина

ptxC  -  ген, кодирующий  S3 субъединицу коклюшного токсина

ptxD  -  ген, кодирующий  S4 субъединицу коклюшного токсина

ptxE  -  ген, кодирующий  S5 субъединицу коклюшного токсина

ptxP  -  ген, кодирующий  промотурную область коклюшного токсина

Prn - белок пертактин




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.