WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

Никифорова Алёна Игоревна

МОРФОЛОГИЧЕСКИЙ И МОЛЕКУЛЯРНЫЙ АСПЕКТЫ ПОВТОРНОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ ПАРНОЙ КОНЕЧНОСТИ НИЗШИХ ПОЗВОНОЧНЫХ

03.03.05 биология развития, эмбриология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва 2012

Работа выполнена на кафедре эмбриологии Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Голиченков Владимир Александрович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

Григорян Элеонора Норайровна

Институт биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН

кандидат биологических наук

Северцова Елена Алексеевна

кафедра биологической эволюции

Биологического факультета Московского

государственного университета имени М.В. Ломоносова

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова

Минздравсоцразвития России

Защита состоится «17» апреля 2012г. в 15.:30 на заседании диссертационного совета Д 501.001.52 при Московском Государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, д.1, стр.12, биологический факультет МГУ, ауд. М-1.

Факс:8(495)939-17-46; e-mail:dis_kalsov@mail.ru

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Автореферат разослан «  » марта 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук  Е.Н.Калистратова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы исследования

Хорошо известно, что представители двух таксонов низших позвоночных – Urodela (Хвостатые амфибии) и Actinopterygii (Лучеперые рыбы) обладают уникальным потенциалом к регенерации утраченной конечности или только ее фрагмента на протяжении значительного отрезка онтогенеза. Воспроизведение ключевых событий морфогенетических процессов нормального развития конечности Urodela является отличительной особенностью ее регенерации (Goss,1961; Bryant et al., 2002). Поэтому в итоге восстановительного процесса конечность сохраняет черты характерной анатомической организации. Общепринятым считается положение, что повторные регенерации конечности более редукционны, при этом детальных исследований повторных регенерационных процессов конечности Urodela предпринято не было. Проблема реализации морфогенетической программы в серии повторных регенераций конечности связана с вопросом о ширине коридора изменчивости регенерационных морфогенезов, а также установлением пределов морфологической вариабельности восстановленных структур. Самостоятельным направлением в исследовании повторных регенераций конечности Urodela является вопрос об особенностях реализации генетической программы эпиморфной регенерации в серии последовательных ампутацией. Для понимания специфической роли генов, задействованных в контроле эпиморфной регенерации конечности Urodela, необходимо сопоставить точность восстановления структур конечности с количественными и пространственно-временными характеристиками экспрессии генов, регулирующих регенерационный процесс, при первой и повторных регенерациях.

Подобно различным саламандрам и тритонам, многие Actinopterygii способны к эпиморфной регенерации конечностей. Интерес к проблеме регенерации плавников Actinopterygii особенно возрос за последние два десятилетия. Несмотря на это, в настоящее время отсутствуют удобные модели исследования регенерации эндоскелета плавника у Actinopterygii. Кроме того, согласно текущим преставлениям, регенерационные потенции представителей различных семейств таксона ограничены кожной лопастью – дистальным компартментом плавника, несущим костные лучи (Akimenko et al., 2003; Galis et al., 2003; Padhi et al., 2004). В связи с вопросом о пределах восстановительных потенций конечностей Actinopterygii представляется актуальным привлечение новых модельных объектов для исследований регенерации. Особого внимания в данном контексте заслуживают представители филогенетически ранних линий Actinopterygii. Наличие развитого базального отдела парного плавника у представителей данных групп обеспечивает возможность проведения ампутации на проксимальных уровнях, а сложный эндоскелет парных плавников является перспективной моделью для изучения морфологических эффектов регенерации парного плавника лучеперых рыб (в том числе и после повторных ампутаций). В связи со специфичными для каждого из изучаемых таксонов особенностями морфологии и развития эндоскелета конечности, эффект повторных регенераций у Actinopterygii и Urodela может быть различным.

Цели и задачи исследования

Работа, состоит из двух частей, объединенных общей идеей оценки морфологических и генетических эффектов повторных регенерации парной конечности у представителей двух групп низших позвоночных – Urodela и Actinopterygii. И Urodela и Actinopterygii имеют способность к повторным регенерациям, являясь при этом филогенетически далекими таксонами. Таким образом, сравнение повторных регенераций у этих двух таксонов позволяет выявить влияние фактора повторных регенераций, не связанного со специфическими для конкретного таксона особенностями морфогенеза конечности, на характер развития и морфологию регенерата. Целью первой части было исследование повторных регенерационных процессов конечности испанского тритона (Pleurodeles waltl), для этого были поставлены следующие задачи:

- выявление паттерна изменчивости морфологии дистальных отделов скелета задней конечности (плюсны и предплюсны) тритона в ряду повторных регенераций и определение раунда регенерации при котором достигается ее контрастное состояние;

- оценка особенностей формирования дистальных отделов скелета в ходе повторных регенераций, сравнение динамики роста регенератов;

- количественное определение экспрессии генов Dlx-3, Hsc70, Sox9 (вовлеченных в контроль регенерационных процессов) при повторных регенерациях конечности тритона.

Целью второй части было изучение морфологических эффектов восстановления энодоскелета парных плавников низших Actinopterygii. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

- поиск модельных объектов, обладающих возможностью к эффективной регенерации эндоскелета парных плавников;

- морфологическое описание хода регенерации грудного плавника сенегальского многопера (Polypterus senegalus);

- влияние эффекта повторных регенераций на морфологию и развитие эндоскелета грудного плавника сенегальского многопера.

Научная новизна работы

В работе впервые выявлен паттерн изменчивости морфологии дистальных отделов скелета задней конечности Pleurodeles waltl в серии повторных регенераций. Рассмотрено влияние фактора повторных ампутаций на характер морфогенеза конечности. Впервые модель повторной регенерации конечности Urodela была использована для выявления связи между качеством восстановления структур конечности и особенностями реализации генетической программы контроля эпиморфной регенерации конечности.

Впервые исследована регенерация плавников у представителей двух таксонов низших Actinopterygii, показана возможность эффективной регенерации эндоскелета парных плавников в семействе Polypteridae. Впервые описан процесс эпиморфной регенерации грудного плавника многопера. Рассмотрено воздействие повторных ампутаций на ход регенерационного развития эндоскелета грудного плавника многопера.

Теоретическое и практическое значение.

По результатам работы у исследованных групп была выявлена общая тенденция, состоящая в упрощении морфологии конечности в серии повторных регенераций. Знание основного направления, в котором изменяется морфология структур регенерата, позволяет использовать серии регенераций как модель для установления взаимосвязи между морфологическими эффектами повторной регенерации и активностью генов, контролирующих ее ход. Изучение этой взаимосвязи позволяет также подойти к проблеме определения специфических функций генов, вовлеченных в регуляцию процессов эпиморфной регенерации конечности Urodela.

Исследование регенерационных потенций плавников у представителей филогенетически базальных групп Actinopterygii лежат в русле решения фундаментальной проблемы происхождения феномена эпиморфной регенерации конечности низших позвоночных. Выявление факта эффективной регенерации эндоскелета грудного плавника многопера позволяет расширить наши представления о регенерационных лимитах Actinopterygii. Способность многоперов восстанавливать грудной плавник целиком, дает возможность сопоставления регенерации гомологичных структур парной конечности (эндоскелета и скелетной мускулатуры) в двух филогенетически дальних таксонах низших позвоночных – Actinopterygii и Urodela. Отсутствие альтернативных модельных систем среди модельных Teleostei (костистых рыб), придает проблеме регенерации парных плавников Polypteridae особое самостоятельное значение. Практическое значение работы связанно с потенциальной возможностью использования многоперовых рыб в качестве новых модельных систем для решения биомедицинских проблем регенерации скелетных тканей.

Апробация работы и публикации

Материалы и основные положения диссертации доложены на Симпозиуме с международным участием «Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфогенеза» (Москва, 2007), ХV международной конференции «European meeting of PhD students in Evolutionary biology» (Нидерланды, 2009), Международной конференции студентов и аспирантов и молодых ученых "Ломоносов" (Москва, 2010), III Международной конференции «Euro Evo Devo Conference» (Париж, 2010), III Международной конференции «Molecular and Cellular basis of Regeneration and Tissue Repair, EMBO» (Португалия, 2010), Всероссийской, с международным участием, конференции молодых ученых, посвященной 90-летию Уральского государственного университета им. А. М. Горького (Екатеринбург, 2010), XIV международном совещании по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2011). По материалам работы опубликовано две статьи, одна из которых в издании рекомендованном ВАК.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из разделов: «Введение» «Цели и задачи работы», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследования и их обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список литературы», «Приложение». Работа изложена на …. страницах, включает 42 рисунка и 9 таблиц. Список литературы состоит из ……. источников.

Материалы и методы

В работе были использованы следующие виды животных: испанский ребристый тритон – Pleurodeles waltl Michah. (Salamandridae, Urodela), сенегальский многопер – Polypterus senegalus Cuvier, калабарский каламоихт – Erpetoichthys (Calamoichthys) calabaricus Smith (Polypteridae, Actinopterygii), пятнистая панцирная щука – Lepisosteus oculatus Winchell (Lepisosteidae, Actinopterygii).Испанские тритоны были получены и выращены в аквариальной Института биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН. Ювенильные сенегальские многоперы, каламоихты и пятнистые панцирные щуки были приобретены в ООО «Север Аква».

Условия содержания животных и проведения операции

При выполнении операции и содержании животных мы руководствовались положениями нормативных документов и инструктивных материалов рекомендованных Комиссий по биоэтике МГУ имени М.В. Ломоносова, доступных на сайте комиссии – http://www.msu.ru/bioetika.

В работе были задействованы прошедшие метаморфоз молодые тритоны возраста 11 – 14 месяцев, а также личинки тритона 47/48 – 54 стадии развития по Галльену и Дюроше (Gallien and Durocher,1957). Ювенильных многоперов и каламоихтов содержали в условиях постоянной аэрации при температуре воды 25-28°С (dH=10°, pH=6.8–7), панцирных щук – при температуре воды 20 – 25°С.

Все операции, а также манипуляции с животными, приводящие к их стрессу, проводили после предварительного наркотизирования. Животных наркотизировали в водном растворе MS-222 в следующих концентрациях: 1: 1500 – для личинок тритонов, 1:1000 для – молодых тритонов, 1: 4000 – для рыб.

У тритонов ампутировали одну или обе задние конечности на уровне середины голени, так чтобы плоскость ампутации проходила перпендикулярно проксимо-дистальной оси конечности.

Для определения восстановительных потенций плавников у сенегальских многоперов нами были выбраны разные плавники: парные грудные и брюшные, а также хвостовой плавник. Для анализа регенерации плавников разных типов были созданы отдельные группы, проведение двух вариантов ампутаций на одном животном не допускалось. Грудные плавники ампутировали по границе сочленения с поясом конечностей; брюшные – на уровне дистальной трети мясистого основания; у хвостового плавника отрезали часть свободной лопасти, на уровне дистальной трети длины центральных костных лучей. Ампутацию целых плавников или их частей проводили так, чтобы плоскость ампутационного среза проходила перпендикулярно проксимо-дистальной оси плавника.

Ампутацию грудных плавников каламоихтов проводили, так же как у многоперов.

Панцирным щукам ампутировали грудные плавники на разных уровнях: в первом варианте плавники отрезали по месту крепления с поясом конечностей, во втором – на уровне дистальной трети свободной лопасти.

Повторные ампутации

Восстановление эндоскелета конечности при повторных регенерациях было исследовано на двух моделях: на задней конечности тритона и грудном плавнике многопера. Сформированные регенераты конечностей ампутировали повторно по границе с интактным фрагментом. Для тритонов модель повторных регенераций конечности включала 4 повторные регенерации, а для многопера – 2. Оценка динамики первой и четвертой регенерации конечности тритона (темпы достижения стадий и размеры регенератов) построена на анализе последовательных серий цифровых изображении регенератов. Изображения получали при помощи стереомикроскопа МС2-ZOOM соединенного с окулярной камерой DCM130 и программного обеспечения ScopePhoto. На полученных цифровых изображениях измеряли величины размерных характеристик регенератов и ширину интактного основания. Измерения проводили в программе ImageJ.

Гистологические исследования

Описание общей морфологии скелета конечностей дано на основе анализа тотальных препаратов конечностей с применением методик дифференциального выявления хрящевой и костной ткани алциановым голубым и ализариновым красным (Kelly and Bryden, 1983; Rousseaux, 1985). Для гистологических исследований материал фиксировали в жидкости Буэна, отмывали от фиксатора в растворе 70%-ного этанола, проводили через смеси этанола с бутанолом и заливали в парафиновую среду HISTOMIX. Серийные срезы толщиной 4-5 мкм окрашивали гематоксилином Эрлиха, альциановым голубым по Моури, по методу Маллори или Ван-Гизона и заключали в монтирующую среду. Для декальцинации препараты конечностей перед этапом гистологической проводки инкубировали в растворе 14% ЭДТА на PBS. Цифровые изображения препаратов были сделаны с помощью микроскопа Zeiss AxioScopeA1 и камеры AxioCam MRc5 (Carl Zeiss).

Электронномикроскопические исследования

Препараты фиксировали 2,5 % раствором глютарового альдегида, приготовленного на Na-какодилатном буфере, и хранили при +4°C. Дофиксацию проводили 1% OsO4, а затем отмывали в буфере. Материал обезвоживали в серии спиртов восходящей концентрации, доводя до ацетона. После высушивания методом перехода критической точки и напыления ионами золота или платины, препараты исследовали на сканирующих электронных микроскопах CamScam и Jeol JSM межкафедральной лаборатории электронной микроскопии Биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова.

Анализ экспрессии генов при повторных регенерациях конечности тритона

Выделение тотальной РНК из образцов интактной конечности тритона и регенератов проводили методом фенол-хлороформной экстракции (Chomczynski and Sacchi, 1987) c модификациями.Препараты тотальной РНК обрабатывали ДНКазой I (Fermetas) и проводили синтез первой цепи комлементарной ДНК (кДНК). Для проведения реакции обратной транскрипции использовали систему ImProm-IITM Reverse Transcription System (Promega).

Праймеры для полимеразой цепной реакции (ПЦР) подбирали с помощью программ OLIGO.4 и DNASstar и данных NCBI.Синтез праймеров был выполнен в НПФ «Литех».

Реакционные смеси для проведения ПЦР готовили по стандартной схеме. В качестве флуоресцентной краски для ПЦР «в реальном времени» использовали интеркалирующий краситель EvaGReen (Biotium, ImcP), реакции проводили на приборе CFX96 (BioRad). Для определения уровня экспрессии каждого гена ПЦР одновременно проводили в трех повторностях, на трех независимых образцах кДНК. Для нормализации результатов и контроля эффективности реакции использовали образец кДНК, полученный из интактной конечности. Данные ПЦР в реальном времени обрабатывали с помощью программы LinREGPCR (Ramakers et al., 2003). Количественную оценку относительного уровня экспрессии генов рассчитывали по методу Ct, применяя GED-формулу (gene expression’s CT difference) (Schefe et al., 2006). Достоверность различий между группами определяли с помощью t-теста для независимых выборок с использование пакета анализа Statistica 6.0

Результаты исследования и их обсуждение

Исследования повторной регенерации задней конечности тритона

Морфология скелета регенератов, и вариабельность его регенерационного морфогенеза

Паттерн морфологической изменчивости строения плюсны и предплюсны при повторных регенерациях описан на основе анализа морфологии скелетов регенератов после 1-й, 2-й, 3-й и 4-й регенерации. Описание типов аномалий строения скелета регенератов дано относительно организации скелета стопы P. waltl в норме (Рис.1А). В ряду от 1-й к 4-й регенерации количество обособленных тарзалий и метатарзалий в стопе регенератов закономерно снижается. Модальные числа элементов в восстановленных скелетах регенератов приведены в таблице 1. При сравнении 1-й регенерации и одной из трех повторных достоверные отличия по числу восстановленных элементов плюсны и предплюсны выявляются в каждой паре (p<0,05; Манна-Уитни U тест). Уменьшение числа тарзалий предплюсны достигается разными способами, при этом стабильно воспроизводятся следующие четыре варианта (Рис.1Б, Табл.2): 1) внешнее объединение двух и более элементов внутри дистального тарзального ряда – dt+dt; 2) объединение centrale distale и tibiale – ti+cd; 3) объединение элементов медиального ряда centrale и intermedium – c+i; 4) объединение fibulare с крайним элементом дистальной тарзальной серии – fi+td. На фоне общего редукционного характера восстановления скелета стопы тритона, ряд вариантов нарушения морфологии предплюсны связан с противоположной тенденцией к формированию в ней дополнительных индивидуальных элементов (Рис.1.Д-Д3). Возможно несколько вариантов гипервосстановления предплюсны. Наиболее частым является случай формирования дополнительного элемента между fibulare и tarsale distale3 или 4 (mediale, m) (Табл. 2, Рис.1Д, Д1,). Другие варианты появления в предплюсне (extra t, Табл.4.2) дополнительных элементов относительно редки, суммарно их встречаемость после первой регенерации конечности не превышает 3% процентов. К редким аномалиям гипервосстановления предплюсны относятся следующее: 1) дифференцировка дополнительного элемента в преаксиальном луче (Рис.1.Д2); 2) увеличение числа элементов в дистальной серии (Рис.1, Д1,3).

Таким образом, с каждой последующей регенерацией конечности редукционные тенденции восстановления плюсны и предплюсны усиливаются. Гиперморфное восстановление предплюсны происходит только после 1-й регенерации конечности, главным образом за счет формирования элемента в позиции mediale. Крайнее проявление редукции в восстановлении предплюсны связано с уменьшением числа элементов дистальной серии до одного или объединением i+fi (Рис.1В2) и наиболее характерно для 4-й регенерации конечности (Табл.2). В итоге, наиболее контрастное состояние морфологии предплюсны регенератов относительно 1-й регенерации достигается в ходе 4-й.

Нормальный ход развития предплюсны в норме использован в качестве референсной модели, позволяющей оценить особенности формирования данного отдела стопы уже в ходе регенерации. Схема, суммирующая преобразования предплюсны конечности тритона, основана на исследовании гистологических препаратов и представлена на Рис. 2.

Таблица 1. Морфология плюсны и предплюсны P. waltl в норме и при повторных регенерациях конечности.

Мода, (min - max) признака

Число тарзалий

Число метатарзалий

Дополнительные тарзалии

норма

9 (7-9)

5 (4-5)

0

1регенерация, n=75

9 (6-11)

5 (4-5)

0 (0-2)

2регенерация, n=75

7 (5-9)

5 (4-5)

0 (0-1)

3регенерация, n=75

6 (5-9)

4 (3-5)

0

4регенерация, n=59

5 (3-8)

4 (3-5)

0

Приведены наиболее часто встречающиеся значения признаков (моды), для конечности в норме и после регенерации, n – объем выборки.

Таблица 2. Встречаемость аномалий в предплюсне регенератов конечности P.waltl.

Встречаемость аномалий в предплюсне регенератов и нормальной конечности, %

dt+dt

ti+cd

i+c

fi+td

i+fi

m

extra t

3 tds

2 tds

1 tds

норма, n=75

14,6

2,6

0,0

6,6

10,6

0,0

0,0

4,0

0,0

1регенерация,n=75

58,7

2,7

0,0

14,7

20,0

1,3

0,0

12,0

2,7

2регенерация,n=75

61,3

30,7

0,0

41,3

29,3

16,0

0,0

1,3

0,0

3регенерация,n=75

37,3

56,0

1,3

65,3

44,0

10,7

6,7

0,0

0,0

4регенерация,n=59

47,5

45,8

6,8

55,9

27,1

20,3

22,0

0,0

0,0

Серым цветом выделены аномалии, контрастно отличающие 1-2 и 3-4 регенерацию, 3tds, 2tds, 1tds – сокращение числа элементов дистальной серии до трех, двух и одного соответственно, m – дополнительный элемент в позиции mediale, extra t – дополнительный элемента в одном из трех индивидуальных рядов элементов предплюсны, n – объем выборки.

Параллельно с формированием пальцев конечности, происходит образование индивидуальных элементов предплюсны: вначале элементы представлены общими зачатками, в виде обособленных скоплений мезенхимы, затем общими прохордальными элементами, а в финале развития индивидуальными хрящами. На 47 стадии развития по Галльену и Дюроше (Gallien and Durocher,1957), когда у личинки различимы контуры I и II пальцев задней конечности, и между ними имеется небольшая выемка, внутри общей массы скелетогенной мезенхимы обособляется basale commune, и различимы три индивидуальных скопления скелетогенной мезенхимы (Рис. 2А), преаксильное (между tibia и basale commune), медиальное (по центру предплюсны от fibula до basale commune) и простаксиальное (начинается от fibula дугой огибает постаксиальный край до basale commune). В дальнейшем преаксиальный и медиальный лучи полностью обособляются и становятся прохондральными, а от постаксиального скопления отделяется tarsale distale 3 (Рис. 2Б). На этапе формирования IV-го пальца конечности, в общем постаксиальном сгущении дифференцируются tarsale distale 4 и fibulare, параллельно преаксиальный и медиальный проходральный элемент разделяется на centralе distalе и tibiale и centralia и intermedium соответственно (Рис. 2С). В дальнейшем латеральнее fibulare обособляется tarsale distale5 (Рис. 2Г).

Повторное развитие предплюсны в ходе 1-й и 4-й регенерации схоже с ее формированием в норме. Три скопления скелетогенной мезенхимы – преаксиальная, медиальная и постаксиальная ветви - формируются в продолжение элементов зейгоподия. Последующие события дифференцировки элементов внутри общих зачатков в целом повторяют порядок, характерный для нормального развития конечности, Четыре типовых варианта редукции числа элементов предплюсны у регенератов связаны с нарушением

Рисунок 1. Вариабельность морфологии скелета стопы в норме и после регенерации. А строение предплюсны Р.waltl в норме; Б – варианты редукции индивидуальных элементов стопы у регенератов, B - B2 - примеры редукционного восстановления предплюсны Р.waltl; Г- Г2 – примеры естественных вариантов морфологии предплюсны Urodela, Г – Thorius arboreus (Plethodontidae) по Henken and Wake, 1993 с изменениями, Г1- Amphiuma sp. (Amphiumidae) по Schaeffer, 1941 c изменениями, Г2- Necturus sp. (Proteidae) по Schaeffer, 1941 c изменениями; Д-Д3 – варианты гиперморфного восстановления предплюсны Р.waltl.

правильной схемы дифференцировки индивидуальных элементов в общих зачатках. Варианты внешних объедений элементов - dt+dt, ti+cd, c+i и fi+td – следствие нарушения образования границ трех индивидуальных прохордальных лучей. Границы могут вообще не образовываться или проходить в нехарактерных местах. Это уже приводит к нарушению привычной организации ряда элементов, что характерно для постаксиального луча предплюсны и сопряжено с проблемой формирования дополнительных элементов (Рис.1Д). Согласно полученным данным, среди выявленных типов гипервосстановления предплюсны наиболее частым (12% случаев 1-й регенерации) является вариант формирования дополнительного элемента (m-элемента) в позиции mediale, между дистальными таразалиями и fibulare. Гистологические исследования регенератов на этапе завершения дифференцировки индивидуальных элементов предплюсны указывают на то, что дополнительный m-элемент связан происхождением с постаксиальным скоплением скелетогенной мезенхимы (Рис. 2Д-Д3). Его появление обусловлено возможностью дополнительной дифференцировки внутри общей закладки дистальных тарзалей и fibulare. Причем, последнее может быть реализовано в нескольких вариантах. 1-й вариант – m-дополнительный элемент расположен под dt3 (Рис.2Д1), при этом, внешне постаксиальный луч выглядит «расщепленным» на две ветви. Первая ветвь дает dt3 и m-элемент, вторая – dt4 и dt5. В данном случае между отдельными элементами постаксиального луча регенерата и нормальной конечности нет строгой гомологии: m - элемент соответствует «dt4» в норме, а dt4 и dt5 – разделившемуся «dt5». 2-й вариант – m- элемент расположен под dt4, и реализуется как дополнительно дифференцирующийся элемент ряда d3-d4-fi (Рис.2Д2). В данном случае m-элемент не имеет прямого гомолога среди элементов нормальной предплюсны.

Рисунок 2. Формирование предплюсны Р. waltl в норме и в ходе регенерации.

A-Г. Морфологический паттерн формирования предплюсны в ходе онтогенеза тритона; Д1-диффенцировка элементов постаксиланого луча в норме, Д1-Д3 – вариабельность дифференцировки постаксиального луча в ходе регенерационного развития предплюсны

3-й вариант дифференцировки дополнительного элемента, реализуется сходным образом со вторым, однако в этом случае td5 расположена не латеральнее m-элемента, а находится над ним (Рис.2.Д3). Приведенные примеры указывают на вариабельность паттерна дифференцировки постаксиального луча предплюсны в ходе 1-й регенерации. Для 4-й регенерации формирование дополнительных элементов в предплюсне не характерно, но усиливается тенденция к снижению дифференцировок внутри индивидуальных прохордальных лучей. Таким образом, значимым отличием между 1-м и 4-м восстановлением является эффективность дифференцировки отдельных элементов предплюсны внутри общих зачатков, что в итоге и определят морфологические отличия между регенератами.

Уменьшение числа тарзалий предплюсны связано с нарушением нормального паттерна дифференцировки индивидуальных элементов внутри их общих зачатков. Чаше всего нарушения происходят в постаксильном луче, и проявляются в морфологии регенератов как выпадение, редукция или внешнее объединение элементов дистальной тарзальной серии (тип нарушения, dt+dt) (Рис.1Б, Табл.2).Подобные варианты нарушений часто происходят в ходе нормального развития скелета конечности (Табл.2) и были описаны для разных представителей семейства Salamandridae (Zaffaroni et al., 1996; Rienesl and Wagner,1992; Shubin et al.,1995).

Нарушения дифференцировок преаксиального и медиального лучей (соответственно варианты нарушений ti+cd и c+i) проявляются чаше после повторных восстановлений конечности. Подобные отклонения от типичного строения предплюсны Salamandridae описаны для представителей родов Triturus и Taricha (Rienesl and Wagner, 1992; Shubin et al.,1995), а также для Plethodontidae (Henken,1983; Dinsmore and Henken, 1986).

Вариант внешнего объединения fibulare с крайним элементом дистальной тарзальной серии – fi+td, как и аномалии dt+dt, является следствием нарушения нормального паттерна дифференцировки постаксиального луча. У регенератов относительно других вариантов отклонений строения предплюсны данный вариант проявляется относительно реже (Табл.2.) и наиболее характерен для 4-й регенерации конечности. Показано, что схожую морфологию постаксиального одела предплюсны демонстрируют регенераты саламандры Plethodon cinereus (Dinsmore and Henken, 1986). Стандартные варианты нарушения предплюсны у регенератов конечности P. waltl можно определить как отклонения от типичной морфологии предплюсны Salamandridae (Shubin and Wake, 1996). Причем сравнительный анализ строения предплюсны у регенератов P. waltl и других представителей семейства указывает на то, что паттерн индивидуальной изменчивости предплюсны регенератов и вариабельности строения данного отдела в норме перекрываются. Различные проявления редукционной тенденции в регенерации демонстрируют сходство с нормальными вариантами строения предплюсны у Urodela с измененной относительно типичных Salamandridae морфологией скелета задней конечности. Морфологические новшества скелета предплюсны сопровождавшие миниатюризацию безлегочных саламандр семейства Plethodondidae связаны главным образом с редукцией дистальных тарзалий (Alberch, 1983; Henken, 1985; Dinsmore and Henken, 1986). При повторных регенерациях конечности P. waltl схожие мотивы морфологии предплюсны воспроизводятся довольно часто (Рис.1В, Табл.2)

Наиболее ярко редукционные тенденции в восстановлении скелета конечности P. waltl проявлены в 4-й регенерации конечности, в крайнем варианте общее число тарзалий сокращается до трех-четырех (Рис.1В1,2). При этом преаксиальный и медиальный лучи представлены одним элементом, а число дистальных тарзалий сокращается до двух или одной. В некоторых случаях медиальный луч и fibulare формируются объединенными. Подобная морфология предплюсны нетипична для Salamandridae и близких к ним таксонов, однако схожий план строения мезоподия демонстрируют представители групп с редуцированными конечностями (Рис.1.Г2-Г3).

Тенденция к формированию дополнительных элементов в различных сайтах предплюсны противоположна общему редукционному направлению восстановления скелета стопы тритона. В норме подобные имения морфологии предплюсны для испанского тритона не характерны или проявляются значительно реже. Дополнительные элементы встречаются в предплюсне регенератов в разных позициях и обусловлены изменением паттерна дифференцировок индивидуальных элементов внутри независимых зачатков (Рис.2Д1-Д3). Учитывая общий характер морфогенеза предплюсны в норме и при регенерации, происхождение дополнительного элемента в каждом случай можно связать с одним из трех индивидуальных скоплений скелетогенной мезенхимы. Дополнительные элементы встречаются в паттерне нормальной изменчивости предплюсны разных Urodela, и возникают в положениях предплюсны, сходных с описанными для регенератов конечности P.waltl. Случаи их формирования обычно рассматривают как проявление анцестральных мотивов в развитии конечности (Shubin and Wake, 1995; Shubin and Wake, 1996; Vorobyeva, 1999).

Таким образом, общий паттерн изменчивости предплюсны регенератов в серии повторных восстановлений конечности P. waltl охватывает основные варианты естественного разнообразия морфологии предплюсны современных Urodela, а общая редукционная тенденция регенерации отражает основное направление эволюционных преобразовании скелета конечности таксона.

Сравнительная динамика повторных регенерации конечности тритона

Кривые роста средних площадей (S) регенератов (нормированных на ширину интактного основания конечности- Lb) и динамики изменения средних коэффициента Н/L (отношение высоты регенерата к его ширине), отражающего изменение линейных параметров роста регенератов двух группах демонстрируют схожий профиль. (Рис.3). Однако на 46 сутки регенерации проявляются отличия в средних размерах регенератов для 1 и 4 регенерации, что отражают оба графика (межгрупповые статистически значимые отличия выявлены для S/Lb (U тест Манна-Уитни; p<0,05)). Размерные отличия регенератов в зависимости от номера регенерации сохраняются и на более поздних этапах их роста (прослежено до 74 суток регенерации), при этом в каждом из случаев межгрупповые различия статистически значимы (U тест Манна-Уитни; p<0,05). Из сравнения динамики 1-й и 4-й регенерации конечности следует, что повторные ампутации не вызывают замедления темпов регенерации конечности. Достижение регенератами ключевых стадий в ходе первого и четвертого восстановления происходит в сходные сроки. Анализ динамики средних значений размерных характеристик 1-й и 4-й регенераций конечности не выявил статистически значимых различий между регенератами до наступления стадии «роста», то есть различия появляются уже после этапа формирования внутренних структур конечности.

Рисунок 3 Динамика изменения размерных характеристик регенератов конечности P. waltl в ходе 1-й и 4-й регенерации.

Анализ экспрессии Hsc70, Sox9, Dlx-3 в ходе 1-й и 4-й регенерации конечности тритона

Согласно нашим данным, консервативные элементы программы развития эндоскелета парной конечности тритона воспроизводятся при повторных регенерациях конечности, однако, при этом эффективность восстановления эндоскелета в целом снижается. Достигаемое в результате первой и четвертой регенерации контрастное состояние морфологии дистальных отделов скелета конечности позволяет использовать модель повторных регенераций для выявления возможной взаимосвязи морфологических эффектов регенерации с активностью генов, вовлеченных в этот процесс. Для того чтобы охарактеризовать особенности реализации генетической программы развития в 1-й и 4-й регенерации, был проведен количественный анализ экспрессии генов Dlx-3, Hsc70 и Sox9 методом ПЦР «в реальном времени» на стадии «бластемы», а также на этапе начала дифференцировок индивидуальных элементов дистальных отделов скелета (стадия «зачатки пальцев»). В качестве референтых генов использовали Ef1 и Gapdh.

Hsc70 является представителем одного из семейств генов теплового шока, гены данной группы кодируют специфический набор белков, вовлеченных в обеспечение адаптации клетки к различным стрессовым факторам, а также в поддержание нормального клеточного метаболизма. Вовлечение различных членов семейства генов теплового шока в регуляцию регенерации конечности низших позвоночных показано в ряде исследований (Tawk et al,, 2000; Lvesque et al., 2005). В работе был использован Hsc70 P. waltl как представитнль Hsр/Hsc70 семейства. Hsc70 у P. waltl не является специфичным для процесса регенерации, однако мы предположили вовлечение Нsc70 в контроль регенерационного процесса, учитывая основные функции его ортологов у других организмов. Согласно нашим данным, Нsc70 транскрибируется в регенератах конечности тритона, причем уровень транскрипции мРНК Нsc70 у регенератов повышен относительно тканей интактной конечности. На исследованных стадиях регенерации, начиная  со стадии «бластемы», Нsc70 характеризуется высокой процессивностью (Рис.4, Рис.5). Таким образом, продукт Нsc70 вовлечен в процесс регенерации конечности P. waltl, однако детальное определение его функции требует дальнейших исследований. На стадиях «бластемы» и «зачатков пальцев» средние показатели количества мРНК в регенератах после первой и четвертой ампутации конечности оказались близкими, т.е. статистически достоверных различий между двумя группами выявлено не было (t-тест для независимых выборок, p > 0,05). Таким образом, согласно нашей оценке, при повторных регенерациях конечности тритона уровень экспрессии гена Нsc70 не снижается.

Гены семейства Sox кодируют транскрипционные факторы, принимающие участие в контроле генетической программы развития скелетных тканей позвоночных (Crombrugghe et al., 2001). Предполагается, что данный ген играет ключевую роль в процессе конденсации скелетогенной мезенхимы, и таким образом, вовлечен в контроль ранних событий хондрогенеза (Deng et al.,1999).

Рисунок 4. Уровни экспрессии мРНК Sox9, Hsc70, Dlx-3 на стадии «бластемы» в ходе 1-й и 4-й регенерации конечности тритона. Показатели экспрессии мРНК генов в тканях регенератов даны относительно интактной конечности. Величина столбца в гистограмме показывает насколько экспрессия гена на данной стадии регенерации превышает его уровень экспрессии в интактной конечности (экспрессия в интактной конечности взята за 100%). А – при Ef1 в качестве рефентного гена, Б – при Gapgh качестве рефентного гена Приведено среднее значение уровня экспрессии мРНК для трех независимых образов с планками стандартного отклонения.

Рисунок5. Уровни экспрессии мРНК Sox9, Hsc70, Dlx-3 на стадии «зачатки пальцев» в ходе 1-й и 4-й регенерации конечности тритона. Показатели экспрессии мРНК генов в тканях регенератов даны относительно интактной конечности. Величина столбца в гистограмме показывает, насколько экспрессия гена на данной стадии регенерации превышает его уровень экспрессии в интактной конечности (экспрессия в интактной конечности взята за 100%). А – при Ef1 в качестве рефентного гена, Б – при Gapgh качестве рефентного гена. Приведено среднее значение уровня экспрессии мРНК для трех независимых образов с планками стандартного отклонения

Показано, что Sox9 экспрессируется в регенерационной бластеме хвоста Urodela, еще до начала внешнего проявления хондрогенеза (Schnapp et al., 2005). Мы обнаружили экспрессию Sox9 в бластеме конечности P. waltl., вероятно связанную с появлением в ней линии хондрогенных клеточных предшественников. Однако достоверной разницы между уровнем экспрессии Sox9 в бластеме после первой и четвертой ампутации конечности обнаружено не было.Так как Sox9 считается маркером ранних событий дифференцировки хрящевой ткани, высокий уровень экспрессии мРНК Sox9 на более поздних стадиях регенерации оказался неожиданным. Однако на стадии «зачатков палацев» постаксильный компартмент скелета конечности представлен мезенхимой, а формирование хрящей четвертого-пятого пальца только начинается. Поэтому можно предположить, что сохранение высокой процессивности Sox9 на данном этапе регенерации связано с процессами дифференцировки хряща постаксиального компартмента скелета конечности регенератов. Тем не менее, не исключено, что Sox9 вовлечен в контроль событий регенерационного процесса, не связанных с процессом хондрогенеза (Crombrugghe et al., 2001).

Dlx-3 является представителем гомеобокс-содержащих генов семейства Dlx, кодирующих многофункциональные транскрипционные факторы. Предполагается, что одна из возможных функций данного гена может быть связана с обеспечением необходимого пролиферативного статуса мезенхимны почки конечности (Mullen et al., 1996) Помимо этого, известно, что в ходе эмбрионального развития мышей экспрессия Dlx-3 связана с развитием костной ткани, а именно с регуляцией остеогенных дифференцировок (Наssan et al., 2004). Таким образом, Dlx-3 непосредственно или опосредованно должен быть вовлечен в контроль развития скелетных структур. Согласно нашим данным, Dlx-3 экспрессируется в ходе регенерации конечности P. watl. Достоверной разницы между уровнем экспрессий Dlx-3 в регенератах после первой и четвертой ампутации конечности обнаружено не было.

Таким образом, согласно нашим результатам, эффект повторных ампутаций не отразился на изменении уровня экспрессии трех функционально различных генов, принадлежащих к иерархически разным системам контроля регенерационного процесса. Однако это не исключает, что иные компоненты генетической регуляции регенерации конечности чувствительны к фактору повторных регенераций. Анализ экспрессии бльшего числа генов при повторных регенерациях конечности может выявить ассоциации между изменениями на уровне морфологии регенератов и на уровне генетического контроля регенерации.

Исследования регенерации плавников низших Actinopterygii

Регенерация плавников у представителей Polypteridea (многоперовых) и Lepisosteidae (панцирниковых) была исследована нами впервые. Согласно результатам исследования, представители двух групп низших Actinopterygii обладают различными регенерационными потенциями. Многоперовые рыбы способны регенерировать как фрагмент кожной лопасти, восстанавливая каждый индивидуальный костный луч, так и практически полностью удаленный грудной плавник, вместе с дифференцированным эндоскелетом. Данная черта объединяет многоперовых рыб и хвостатых амфибий. Панцирные щуки не способны к эффективному восстановлению плавников при проксимальных ампутациях, но регенерируют фрагменты дистальной лопасти. Таким образом, их регенерационные возможности ограничены экзоскелетом также как у многих Teleostei (костистых рыб). На данный момент многоперовые рыбы – единственные представители Actinopterygii, у которых обнаружена способность к восстановлению исходной структуры эндоскелета плавника при регенерации. Полученные нами данные расширяют представление о регенерационных лимитах Actinopterygii

Регенерация грудных плавников Polypteridae и парных конечностей и Urodela основана на единых принципах эпиморфной регенерации. Традиционные разделение процесса регенерации конечности хвостатых амфибий на ряд индивидуальных этапов регенерации – заживления раны, образования регенерационной бластемы, дифференцировки и роста регенерата, применимо и к модели регенерации грудного плавника многопера (Рис.6).

Образование эндоскелета плавника происходит на стадии развития плавниковой пластинки (Рис.6Ж). Эндоскелет закладывается в основании регенерата в виде единого

Рисунок 6. Ранние события регенерации грудного плавника P. senegalus. А – начало эпителизации раневой поверхности, первые часы регенерации, Б, В – завершение эпителизации раневой поверхности, 24 часа после ампутации; Г, Д – формирование регенерационной бластемы; Е – начало формирования дистальной пластинки - зачатка кожной лопасти плавника; Ж,3,И – стадия плавниковой пластинки - начало формирования скелетных структур грудного плавника, на сколах регенератов различимы тяжи актинотрихий (З) в, и дифференцирующиеся хондроциты в основании плавника (И).

общего предшественника (проходального диска), далее внутри него происходит обособление индивидуальных элементов. Формирование эндоскелета можно представить следующим образом (Рис.7): внутри прохордального диска выделяются свободные от хряща участки (Рис.7А); постепенно таких участков становится больше, а их размеры увеличиваются; индивидуальные скелетные элементы образуются в местах сохранения прохордальной ткани (Рис.7Б); исходно между элементами отсутствуют границы; процесс формирования эндоскелета плавника завершается окончательным разделением индивидуальных элементов и его последующей оссификацией (Рис.7 В-Г).

Рисунок 7. Формирование эндоскелета грудного плавника P.senegalus при регенерации. А, Б – образование «свободных зон» в прохордальном диске; В – основные элементы эндоскелета дифференцированны; Г – сформированный эндоскелет регенерата Стрелками отмечены области декомпозиции хрящевого матрикса.

Таблица 4. Морфология скелета грудных плавников P. senegalus в норме и при регенерации.

Мода, (min - max) признака

Число медиальных радиалий

Число базальных элементов

Число костных лучей

Число радиалий Y-образной формы

Число неполных радиалий

Норма, n=30

16 (12-19)

3

25 (29-39)

0 (0-2)

0 (0-1)

1регенерация, n=30

11 (7-14)

3 (1-3)

26 (16-35)

1 (0-5)

0 (0-3)

2регенерация, n=30

9 (7-13)

2 (1-3)

18 (15-30)

1 (0-2)

0 (0-1)

Приведены наиболее часто встречающиеся значения признаков (моды) для интактных грудных плавников P. senegalus и их регенератов (n-объем выборки).

Рисунок 8. Морфология скелета грудных плавников P. senegalus в норме и после регенерации. А – эндоскелет грудного плавника в норме представлен тремя индивидуальными базальными элементами, рядами удлиненных медиальных радиалей и округлых элементов; Б-Г – варианты восстановления эндоскелета грудных плавников; Д – морфология эндоскелета Polyodon spathula, по Davis et al.,2007 c изменениями.

Анализ строения регенератов грудных плавников многоперов указывает на сохранение исходной структурной сложности и характерных особенностей его эндо- и экзоскелета (Рис.8А-В). Однако, как правило, регенераты несут меньшее по сравнению с нормой число отдельных скелетных элементов. Различия нарастают при повторных регенерациях. (Табл.4). Сравнительный анализ морфологии эндоскелета грудных плавников многопера в норме и после регенерации указывает на то, что некоторые варианты нарушений эндоскелета регенератов встречаются и у интактных особей. Это формирование укороченных или нестандартных медиальных радиальных элементов Y- или U-образной формы (Табл.4). Другие нарушения, связанные с редукцией и уменьшением числа элементов базального отдела эндоскелета, в норме не проявляются, и могут считаться следствием специфики регенерационного развития эндоскелета (Табл.4). При отсутствии дифференцировки одного из краевых элементов базального отдела, исходный план организации эндоскелета сохраняется, хотя уникальное трибазальное состояние при этом не воспроизводится (Рис.8Г). При повторных регенерациях, когда редукционные тенденции выражены ярче, может происходить редукция базального отдела в целом. В этом случае изменяется общий план организации эндоскелета грудного плавника. В крайнем варианте редукции базального отдела редуцируется центральный базальный элемент, которых в норме служит основанием для медиальных радиалий (Рис.8Г). В отсутствии центральной базалии внутренние медиальные радиалии формируются, но, как правило, в меньшем числе. В ситуации, когда удлиненные радиальные элементы доминируют в эндоскелете, его общий план приобретает сходство с организацией эндоскелета грудных плавников представителей эволюционно более поздних таксонов лучеперых. (Рис.8 Г, Д).

Описанные нарушения морфологии эндоскелета грудного плавника ассоциированы с нарушением нормального паттерна дифференцировки индивидуальных элементов в прохордальном диске (Рис.9). В ходе регенерации эндоскелет грудного плавника также образуется в виде единого предшественника, внутри которого затем происходит обособление индивидуальных элементов. Регенерационный паттерн дифференцировок более вариабелен: медиальные радиальные элементы могут обособляться до дифференцировки краевых базалий (Рис.8Б); протяженность области закладки медиальных радиалий индивидуально варьирует; нижнее положение границы образования их проксимальных концов не фиксировано на уровне трети длинны прохордальной пластинки (Рис.7А, Рис.9). Смещение границы образования свободных зон в проксимальные области проходального диска создает условия для редукции центрального базального элемента (Рис.9). Данная тенденция усиливается в ходе повторных регенераций. Соответственно, утрата характерного трибазального состояния наиболее ярко проявляется в морфологии эндоскелета после его повторного восстановления. Формирование нестандартных Y-образных медиальных радиалей возможно в норме, но в эндоскелете регенератов они появляются чаще. Предполагаемая причина их возникновения - нарушение пространственного паттерна формирования свободных зон, разделяющих медиальные радиалии (Рис.9). В норме область образования свободных зон лежит в дистальной трети пластинка. Верхняя граница этих зон распространяется до дистального края пластинки. Чем больше свободных зон, тем, соответственно, больше дифференцируется медиальных радиалий в эндоскелете. Когда у регенератов область формирования свободных зон смещена проксимально, в дистальных отделах прохордальной пластинки сохраняется широкая полоска проходальной ткани. Если первоначально свободных зон было сформировано мало, а их распространение в дистальном направлении относительно слабое, то новые свободные зоны формируются независимо дистально в полоске прохордальной ткани, независимо от ряда первичных свободных зон. При формировании дополнительной свободной зоны между двумя исходными, медиальная радиаль формируется раздвоенной на дистальном конце.

Рисунок 9. Формирование эндоскелета грудного плавника Р. senegalus в ходе регенерации и в норме. Верхний ряд: схема формирование эндоскелета в норме (по Jandzic and Cerny, 2010): эндоскелет многопера закладывается в виде проходального диска, в котором первыми дифференцируются краевые базальные элементы; далее в дистальной трети диска обособляются медиальные радиалии. Нижний ряд: регенерационное развитие эндоскелета плавника (стрелкой отмечена область формирования дополнительных свободных зон).

При редукции базального отдела эндоскелет регенератов плавников многопера напоминает эндоскелет грудных плавников представителей таксонов, появившихся в эволюции Actinopterygii значительно позднее (Нельсон,2009). Учитывая, что редукционный тренд четко прослеживается в морфологии эндоскелета грудного плавника в ряду от низших лучеперых к костистым рыбам, можно провести соответствующие параллели между направлением изменения морфологии регенератов и эволюционными преобразованиями плавников лучеперых. Однако в данном случае нельзя утверждать, что потеря трибазального состояния у регенератов отражает эволюционную тенденцию лучеперых, поскольку не имеется доказательств того, что трибазальное состояние является эволюционно исходным для лучеперых рыб. Многоперовые, с одной стороны, сохранили ряд анцестальных черт организации и занимают наиболее базальное положение в системе лучеперых, однако с другой стороны, приобрели много специализированных черт (Нельсон, 2009; Helfman et a1, 2009). Особый тип грудного плавника Polypteridae с развитой мясистой лопастью и сложным стенобазальным эндоскелетом мог стать одной из специализаций в эволюционной истории таксона. С учетом такой альтернативы, редукционные изменения могут быть рассмотрены как возвращение к эволюционно исходному состоянию морфологии эндоскелета плавника лучеперых в типовом варианте.

Выводы:

1. Консервативные элементы индивидуальной программы развития эндоскелета парной конечности низших позвоночных воспроизводятся при повторных регенерациях конечности у тритона и многопера, при этом изменчивость морфологии эндоскелета регенератов превышает ее вариабельность в норме. У тритона общий паттерн изменчивости предплюсны в серии повторных восстановлений конечности охватывает основные варианты естественного разнообразия морфологии предплюсны современных Urodela.

2. Основной эффект повторных ампутаций конечности проявляется в усилении редукционной тенденции при ее регенерации.

У тритона уменьшение числа элементов предплюсны связано с нарушением нормального паттерна дифференцировки индивидуальных элементов внутри их общих зачатков. Чаше всего нарушения происходят в постаксильном тяже скелетогенной мезенхимы, и проявляются как выпадение, редукция или внешнее объединение элементов дистальной тарзальной серии.

У многопера аномалии морфологии эндоскелета грудного плавника ассоциированы с нарушением типичного пространственного паттерна дифференцировки индивидуальных элементов в прохордальном диске. При смешении границы образования медиальных лучей в проксимальные области проходального диска происходит редукция центрального базального элемента грудного плавника.

3. В ходе анализа эффекта повторных регенераций у тритона, не выявлено статистически достоверных изменений уровня экспрессии генов Dlx-3, Hsc70, Sox9, принадлежащих к иерархически разным системам контроля регенерационного процесса. Таким образом, не отмечено связи различий морфологии регенератов в 1 и 4 регенерациях с изменением уровня экспрессии данных генов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Никифорова А.И. Голиченков В.А. Особенности репаративного восстановления плавников многоперовых рыб (Polypteridae, Actinopterygii) // Онтогенез. 2012. Т 43. №2.С. 136-142.

Никифорова А.И., Жожикашвили А.С. Pectoral fin regeneration in Polypterus senegalus with some comments about regenerative limits of the ray-finned fish // Молодой ученый 2012.Т 1. №2. С.81-85.

Жожикашвили А.С., Никифорова А.И. 2011 Регенерация плавников сенегальского многопера (Polypterus senegalus) в аспекте проблемы происхождения эпиморфной регенерации лучеперых рыб // Тезисы докладов и лекций XIV международного совещания по эволюционной физиологии, Санкт-Петербург, 24-26 октября 2011г. – Спб.: ВВМ. С 76.

Жожикашвили А.С., Никифорова А.И. 2010 Регенерация грудных плавников у сенегальского многопера (Polypterus senegalus Cuvier) // Тезисы докладов XVII международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010», секция «Биология». М.: МАКС Пресс. С.137.

Девяткин А.А, Жожикашвили А.С., Никифорова А.И. 2010 Регенерация грудных плавников сенегальского многопёра (Polypterus senegalus): основные этапы процесса и особенности строения регенератов // Материалы Всероссийской, с международным участием, конференции молодых ученых, посвященной 90-летию Уральского государственного университета им. А.М.Горького. Екатеринбург: АМБ.С. 28 - 29.

Nikiforova A., Deviatkin A., Zhozhikashvily A. Pectoral fin regeneration in the ancient actinopterygiаn fish Polypterus as a new model for studying appendages regeneration in vertebrates// Molecular and Cellular basis of Regeneration and Tissue Repair, EMBO (Sesimbra, Portugal, September 2010). P.148.

Scobeyeva V., Nikiforova A., Zhozhikashvily A. Polypterus pectoral fins regeneration and evolution of pectoral fin development in actinopterygian fishes// EED 2010 conference (Paris, France, July 2010). P.253.

Nikiforova A. Formation of ancestral marks in newt hindlimb skeleton during epimorphic regeneration// EED 2010 conference (Paris, France, July 2010). P.227.

Nikiforova A. 2009 Newt hindlimb regeneration as model for reconstruction of Urodela limbs evolution //Proceed of XV EMPSEB (Schoorl, the Netherlands, August 2009). P. 49.

Никифорова А.И., Соколов А.Ю., Бурлакова О.В., Голиченков В.А. 2007 Нарушения формирования дистальных отделов конечности тритона при регенерационных морфогенезах // Материалы Симпозиума с международным участием «Клеточные и эволюционные аспекты морфогенеза» (Москва, ИБР, Октябрь 2007).Р.23 - 24.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.