WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

Тухватулин

Амир Ильдарович

Молекулярная и биологическая характеристика лиганда рецептора NOD1, выделенного из Neisseria meningitidis

03.02.03 – микробиология

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ

на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2011

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации ( ФГБУ "НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи" Минздравсоцразвития России)

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Логунов Денис Юрьевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук

Грубер Ирина Мироновна

доктор биологических наук, профессор

Наровлянский Александр Наумович

 

 

Ведущая организация: 

ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России

Защита диссертации состоится «2» декабря 2011 года в 11.00 часов на заседании

диссертационного совета Д 208.130.01 ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи»

Минздравсоцразвития России (123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д.18)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан  «27» октября  2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор  Русакова Е.В. 

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение принципов распознавания патогенов клетками макроорганизма, а также молекулярных  механизмов активации последующих иммунных реакций, остается актуальной задачей до настоящего времени. Важным событием позволившим сделать значительный шаг в понимании этих  механизмов стало открытие около 20 лет назад первых представителей паттерн-распознающих рецепторов. Было установлено, что эти рецепторы, в отличие от Т- и В-клеточных рецепторов адаптивного иммунитета, узнают не уникальные эпитопы антигенов, а определенные высококонсервативные молекулярные структуры (паттерны) (pathogen-associated molecular patterns (PAMPs)), находящиеся в составе клеток патогенных организмов (Medzhitov R, et al., 2000).

       К настоящему моменту, у человека идентифицировано пять семейств паттерн-распознающих рецепторов: Toll-подобные рецепторы,  лектиновые рецепторы С-типа, RIG-подобные рецепторы, NOD-подобные рецепторы, фикколины, а также пентраксины и коллектины, относимые к суперсемейству лектиновых рецепторов С-типа (Ковальчук Л.В. с соавт., 2011).

       Связывание лигандов (PAMPs) с паттерн-распознающими рецепторами приводит к запуску внутриклеточных сигнальных каскадов, приводящих, в конечном итоге, к активации ряда транскрипционных факторов (AP-1, NF-kB, IRF 3,5,7 и др.),  определяющих развитие тех или иных реакций иммунной системы. Среди перечисленных транскрипционных факторов NF-kB играет одну из ключевых ролей в развитии реакций как врожденного, так и приобретенного иммунитета (Baeuerle P.A., et al., 1994).

       Одними из наиболее важных типов PRR в распознавании бактериальных патогенов являются представители семейства Toll-подобных и NOD-рецепторов. Лигандами мембраносвязанных Toll-подобных рецепторов являются молекулы различной химической природы и структуры, такие, как липополисахарид (ЛПС) грамотрицательных бактерий, флагеллин, бактериальные липопептиды, бактериальная и вирусная ДНК и другие.

       На сегодняшний день получено множество данных, доказывающих участие данных рецепторов в целом спектре иммунных реакций:  усилении фагоцитоза, секреции антибактериальных пептидов, процессинге и презентации антигена дендритными клетками, активации зрелых T-клеток, пролиферации и созревания В-клеток во время инфекции, прямой активации B клеток памяти и последующей продукции антител, в том числе IgG, и других (Palm N.W., et al., 2009).

       Cпособность лигандов Toll-подобных рецепторов запускать различные реакции иммунной системы позволяет использовать данные молекулы в качестве различных молекулярных адъювантов, средств немедленной защиты против инфекции и др. (Vijay-Kumar M., et al., 2008,  Kaisho T., et al., 2002).

Лигандами цитозольных NOD рецепторов являются различные молекулы, представляющие собой фрагменты пептидогликана грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Было показано, что минимальным фрагментом пептидогликана достаточным для активации NOD1-рецептора, является дипептид D-Glu-mDAP (iE-DAP), присутствующий в составе клеточной стенки большинства грамотрицательных бактерий: Neisseria meningitidis, Escherichia coli, Shigella  flexneri,  Salmonella typhimurium и др. (Girardin S.E.et al., 2003). Однако вклад других аминокислот и моносахаридов, входящих в состав пептидогликана бактерий различных видов в активацию NOD1-рецептора на сегодняшний день мало изучен. Кроме того, по сравнению с Toll-подобными значение NOD рецепторов в формировании защитных иммунных реакций и протективного иммунитета описано в значительно меньшей степени (Kobayashi K.S, et al., 2005).

Еще меньше данных получено при изучении совместного функционирования Toll-подобных и NOD рецепторов в распознавании целого патогенного микроорганизма и определение вклада того или иного типа паттерн-распознающего рецептора в формировании полноценного протективного иммунитета организма.

Изучение совместного функционирования мембраносвязанных Toll-подобных и цитозольных NOD рецепторов позволит не только идентифицировать фундаментальные механизмы функционирования данных рецепторов, необходимые для формирования полноценного протективного иммунитета, но и предоставит возможность создания на основе композиций лигандов паттерн-распознающих рецепторов целого спектра иммунобиологических препаратов: эффективных средств немедленной защиты от инфекции; молекулярных адъювантов, в составе вакцин нового поколения и многих др.

Цель работы: Изучение NF-kB-активирующей способности NOD рецептора 1, а также его роли в индукции иммунных реакций, включая участие в формировании антибактериального иммунитета совместно с Toll-подобными рецепторами.

В процессе выполнения работ предстояло решить следующие задачи:

  1. Провести анализ различных видов бактерий с целью выявления наиболее эффективного продуцента лиганда NOD1 рецептора.
  2. Разработать технологию очистки лиганда NOD1 рецептора из наиболее эффективного бактериального штамма-продуцента.
  3. Идентифицировать первичную структуру лиганда NOD1 рецептора выделенного из бактериального штамма-продуцента.
  4. Провести сравнительный анализ NF-kB активирующей способности лиганда NOD1 рецептора, выделенного из бактериального штамма-продуцента с другими        лигандами NOD1 рецептора с различной структурой в условиях in vitro.
  5. Определить влияние совместной стимуляции NOD1 и Toll-подобных рецепторов на уровень активности транскрипционного фактора NF-kB в условиях in vitro и in vivo.
  6. Определить влияние совместной стимуляции NOD1 рецептора и Toll-подобного рецептора 5 на уровень секреции цитокинов в условиях in vivo.
  7. Определить влияние совместной активации NOD1 и Toll-подобного рецептора 5 на формирование антибактериального иммунитета в условиях in vivo.

Научная новизна

- впервые из бактерии Neisseria meningitidis серогруппы В, была выделена молекула-лиганд  NOD1 рецептора и идентифицирована ее первичная структура.

- впервые был проведен сравнительный анализ NF-kB активирующей способности лиганда NOD1 рецептора выделенного Neisseria meningitidis серогруппы В с другими лигандами NOD1 рецептора с различной структурой в условиях in vitro, а также впервые были определены характеристики (интенсивность, кинетика) NOD1-опосредованной активации NF-kB в условиях in vivo.

- впервые были определены различия в способности лигандов NOD1 и Toll-подобных рецепторов активировать NF-kB в условиях in vitro и in vivo.

- впервые было показано, что последовательная стимуляция NOD1 и TLR5 рецепторов приводит к эффекту повышения (потенцирования) активации NF-kB по сравнению с изолированной стимуляцией данных паттерн-распознающих рецепторов в условиях in vitro и in vivo. Была показана зависимость данного эффекта от последовательности стимуляции указанных паттерн-распознающих рецепторов.

- в условиях in vivo впервые было показано, что последовательная стимуляция NOD1 и TLR5 рецепторов приводит также к повышению (потенцированию) уровней секреции цитокинов в периферической крови и тканях тонкого кишечника.

- впервые показано, что по сравнению с изолированной стимуляцией NOD1 и TLR5 рецепторов, последовательная стимуляция данных рецепторов увеличивает на 50% выживаемость животных при инфекции летальными дозами Salmonella typhimurium

Практическая значимость. Работа представляет не только научный интерес, заключающийся в более глубоком понимании механизма распознавания патогенов врожденной иммунной системой организма хозяина и последующем формировании иммунных реакций, но и в перспективе может иметь практическое применение. Полученные данные, показывающие эффект усиления реакций иммунного ответа организма при введении сочетаний лигандов паттерн-распознающих рецепторов, принадлежащих к различным семействам, могут быть использованы при создании многокомпонентных молекулярных адъювантов.  Данные адъюванты могут применяться в составе более эффективных вакцин нового поколения совместно с протективными антигенами, обладающими, в том числе низкой иммуногенностью (например, капсульным полисахаридов Neisseria meningitidis серогруппы В).

Результаты, полученные в данной работе, также могут быть использованы в применении комбинаций лигандов паттерн-распознающих рецепторов в качестве средств немедленной защиты от патогенных микроорганизмов.

Отдельные положения работы включены в Методические рекомендации «Использование тест-системы на основе эукариотических клеток человека линии HEK293-hNOD1 для определения биологической активности лигандов NOD1 рецептора». М.-2011, утвержденные на Совете по внедрению научных достижений в практику ФГБУ "НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи" Минздравсоцразвития России, протокол №15 от 14.07.11.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на IV Всероссийском симпозиуме «Белки и пептиды», (Казань, 2009г.), а также Всероссийском форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» имени академика В.И.Иоффе, (Санкт-Петербург, 2011г.).

Апробация диссертации состоялась на совместном заседании отдела «Генетики и молекулярной биологии бактерий» и отдела «Медицинской микробиологии» 16 июня 2011 г. ФГБУ "НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи" Минздравсоцразвития России.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 3 в журналах, рекомендованных ВАК РФ и 2 статьи в сборниках Всероссийских конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 146 страницах машинописного текста и включает Введение и 4 главы: «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследований», «Обсуждение результатов», Выводы, Список используемой литературы (228 источников, из которых 9 отечественных и 219 иностранных). Работа содержит 3 таблицы и 30 рисунков.

Основные положения выносимые на защиту.

Для изучения NF-kB-активирующей способности NOD рецептора 1, а также его роли в индукции иммунных реакций необходимо было выбрать наиболее эффективный бактериальный продуцент лиганда NOD1 рецептора. При выбранном термическом способе разрушения бактерий различных видов наибольшую NOD1-опосредованную активацию NF-kB показал  штамм 591 (B:NT:P1.1,2) Neisseria meningitidis. Данный микроорганизм был выбран в качестве наиболее эффективного продуцента лиганда NOD1 рецептора для последующей очистки, идентификации первичной структуры и характеристики биологических свойств исследуемой молекулы.

В работе было показано, что последовательная стимуляция NOD и TLR рецепторов по сравнению с изолированной стимуляцией данных рецепторов приводит к эффекту повышения (потенцирования) уровня активации NF-kB в условиях in vitro и in vivo, а также вызывает повышенные уровни секреции цитокинов в периферической крови и тканях тонкого кишечника.

На модели инфекции мышей летальными дозами Salmonella typhimurium было показано, что животные, которым последовательно вводились лиганды NOD1 и TLR5 рецепторов, характеризовались повышенной выживаемостью по сравнению с животными, получавших инъекции индивидуальных лигандов данных рецепторов.

Полученные данные описывают значение совместного участия различных паттерн-распознающих рецепторов врождённого иммунитета в формировании эффективных защитных реакций организма и являются существенными для понимания одного из принципов функционирования иммунной системы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в период с 2007 по 2011 годы в лаборатории молекулярной биотехнологии ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития РФ. Препаративное наращивание культуры менингококков штаммов 591 (B:NT:P1.1,2), 270 (B:NT:P1.1.3), 63 (A:4:1.9),а также типирование проводилось совместно с сотрудниками группы по изучению условно патогенной микрофлоры лаборатории хламидиоза ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития РФ. Эксперименты по изучению влияния изолированной и совместной стимуляции NOD1 и TLR5 рецепторов на уровень активности NF-kB в условиях in vitro и in vivo были выполнены совместно с сотрудниками лаборатории д.б.н., проф. А.В. Гудкова, Roswell Park Cancer Institute, Buffalo NY.

В работе были использованы:

- штаммы Neisseria meningitidis 591 (B:NT:P1.1,2), 270 (B:NT:P1.1.3), 63 (A:4:1.9) были любезно предоставлены д.м.н., проф. Н.Н. Костюковой; штамм О3 Yersinia enterocolitica и C53 Salmonella typhimurium были любезно предоставлены д.б.н. С.А. Ермолаевой, д.б.н. В.И. Пушкаревой и к.б.н. Л.Н. Нестеренко, д.б.н., проф. Ю.М. Романовой.

- лабораторные штаммы Escherichia coli DH5; клеточные линии HEK293-hNOD1 (клетки эмбриональной почки человека, содержащие ген b-галактозидазы под контролем NF-kB-зависимого промотора и экспрессирующие NOD1 рецептор); HCT116 (аденокарцинома толстого кишечника человека), LIM1215 (карцинома толстого кишечника человека), THP-1 (острого моноцитарного лейкоза человека) были любезно предоставлены д.б.н., проф. А.В. Гудковым (Roswell Park Cancer Institute, Buffalo NY).

- плазмидный вектор pLRV-NF-kB-Luc, содержащий ген люциферазы под контролем NF-kB –зависимого элемента. Вектор был любезно предоставлен д.б.н., проф. А.В. Гудковым (Roswell Park Cancer Institute, Buffalo NY).

- коммерческие препараты специфических эндодезоксирибонуклеаз и других ферментов фирм "Fermentas MBI" (Литва), "Promega" (США) и «NEBioLabs» (США). Синтез праймеров был выполнен в ООО «Синтол».

- эксперименты по определению уровня активации NF-kB в условиях in vivo проводились с использованием самок трансгенных мышей BALB/c-Tg(NFkB-RE -luc[Oslo])-Xen (Caliper Life Sciences, США) весом 18–20 г, содержащих в геноме репортерный ген люциферазы светлячка (из pGL3-Basic Vector, Promega, США) под экспрессионным контролем NF-kB-зависимого промотора, состоящего из трех NF-kB-связывающих участков в промоторе гена легкой цепи Ig. Эксперименты по определению выживаемости мышей в условиях пероральной инфекции S.typhimurium проводились на самках весом 18–20 г линии BALB/c.

- все генно-инженерные манипуляции проводились по стандартным методам, изложенным в Maniatis et al. (1982). Анализ активности транскрипционного фактора NF-kB в клетках проводили спектрофотометрически по реакции на -галактозидазу, щелочную фосфатазу (SEAP) и методом иммуноблоттинга. Анализ выживаемости в клетках проводили по реакции с субстратом МТТ, окраской клеток метиленовым голубым; анализ экспрессии цитокинов проводили при помощи проточного цитофлюориметра с использованием коммерческого набора FlowCytomix BenderMedsystems (Австрия).

- статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами с использованием программного обеспечения Microsoft Excel.

В работе использованы материалы, полученные лично автором, а также в соавторстве с к.б.н. Д.Ю. Логуновым, к.б.н. Е.А. Черентаевой, к.б.н. Д.В. Щебляковым, н.с. П.В. Куданом, м.н.с. Н.М. Артемичевой – сотрудниками лаборатории молекулярной биотехнологии, д.б.н., проф. А.Ф. Мороз, к.б.н. А.А. Аджиевой – сотрудниками группы по изучению условно патогенной микрофлоры лаборатории хламидиоза, д.м.н., проф. Н.Н. Костюковой ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздравсоцразвития РФ; И.И. Гитлиным, М.П. Анточ, А.В. Гудковым  – сотрудниками Roswell Park Cancer Institute, Buffalo NY, которым выражаю глубокую благодарность за помощь и поддержку.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

  Анализ способности различных грамотрицательных бактерий активировать транскрипционный фактор NF-kB в результате взаимодействия с NOD1 рецептором.

Для проведения экспериментов, связанных с изучением участия NOD1 рецептора в роли в индукции иммунных реакций, необходимо было на первом этапе определить наиболее оптимальный штамм-продуцент грамотрицательной бактерии, способный максимально эффективно активировать NF-kB, взаимодействуя с NOD1 рецептором, а также выделение лиганда NOD1 рецептора из которого было бы наиболее простым и технологичным.

Для выполнения поставленной задачи был проведен скрининговый эксперимент, в котором была определена способность различных грамотрицательных бактерий активировать NF-kB NOD1-зависимым способом. Для разрушения бактериальных клеток и выделения из них лиганда NOD1 рецептора использовался наиболее простой и технологичный способ термической обработки. В эксперименте использовались инактивированные нагреванием образцы культуральной бактериальной среды, в которой выращивались бактерии Yersinia enterocolitica, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Neisseria meningitidis.

Для определения NOD1-зависимой NF-kB активирующей способности грамотрицательных бактерий использовалась клеточная линия эмбрионального почечного эпителия человека HEK293-hNOD1, экспрессирующая только NOD1 рецептор. Для контроля активации NF-kB методом лентивирусной трансфекции в указанные клетки был введен ген b-галактозидазы под контролем NF-kB-зависимого промотора.

После добавления анализируемых образцов бактерий проводили измерение активности NF-kB в клетках. В качестве положительного контроля активации NF-kB использовали ФНО-α (фактор некроза опухоли альфа). В качестве отрицательного контроля использовали клетки к которым добавляли образцы интактной бактериальной культуральной среды.

Результаты проведенного эксперимента  (см. рис.1) свидетельствуют, что среди инактивированных нагреванием образцов культуральной среды, содержащие выращенные  вышеперечисленные грамотрицательные бактерии, наибольшую NOD1-опосредованную активацию NF-kB вызывает образец среды, содержащий Neisseria meningitidis.

Рисунок 1. Измерение активности транскрипционного фактора NF-kB в клетках HEK293-hNOD1, экспрессирующих NOD1 рецептор после добавления к ним инактивированных нагреванием образцов культуральной среды, содержащих Yersinia enterocolitica, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Neisseria meningitidis (А).  Определение выживаемости клеток HEK293-hNOD1 после обработки их анализируемыми образцами (Б).  Данные по каждой точке являются результатом трех независимых экспериментов.

       На следующем этапе работы предстояло определить наиболее эффективный штамм-продуцент Neisseria meningitidis, образец которого, способен максимально эффективно активировать NF-kB, взаимодействуя с NOD1 рецептором

Анализ способности менингококков различных серогрупп активировать транскрипционный фактор NF-kB в результате взаимодействия с NOD1 рецептором.

Для поиска наиболее оптимального штамма-продуцента Neisseria meningitidis было выбрано несколько штаммов менингококка, принадлежащих к различным сорогруппам  591 (B:NT:P1.1,2), 270 (B:NT:P1.1.3), 63 (A:4:1.9). Для определения NOD1-зависимой NF-kB активирующей способности штаммов Neisseria meningitidis использовалась клеточная линия HEK293-hNOD1.Указанные клетки обрабатывали инактивированными нагреванием образцами бактериальной культуральной среды BHI (Brain-Heart Infusion) содержащей один из трех штаммов менингококка (591,270,63).  После чего проводили измерение активности NF-kB в клетках.

Основываясь на полученных данных (см. рис 2), обработка клеток образцами культуральной среды BHI содержащих менингококки штаммов 591,270 и 63, приводила к достоверному (р<0,05) увеличению уровня NF-kB-зависимой экспрессии -галактозидазы. При этом наибольшую NF-kB активирующую способность показал штамм 591, принадлежащий к серогруппе В.

Рисунок 2. Измерение активности транскрипционного фактора NF-kB в клетках HEK293-hNOD1, экспрессирующих NOD1 рецептор (А).  Определение выживаемости клеток HEK293-hNOD1  после обработки их анализируемыми образцами (Б).  Данные по каждой точке являются результатом трех независимых экспериментов.

Таким образом, среди анализируемых штаммов Neisseria meningitidis 591 штамм, относящийся к серогруппе В, показал наибольшую эффективность NOD1-зависимой активации NF-kB и был выбран в качестве наиболее оптимального штамма-продуцента для последующего выделения, очистки и идентификации фрагмента бактерии, являющегося лигандом NOD1 рецептора.

Выделение и очистка молекулы, способной активировать транскрипционный фактор NF-kB при взаимодействии с NOD рецептором 1.

Для идентификации структуры лиганда NOD1 рецептора  в составе менингококка  591 штамма была разработана методика выделения и очистки данной молекулы при постадийном контроле NOD1-зависимой NF-kB-активирующей способности получаемых очищенных образцов. На первом этапе инактивированный нагреванием образец бактериальной среды BHI, содержащий менингококк штамма 591, подвергался центрифугированию для удаления клеточного дебриса. Затем, супернатант был очищен от наиболее  гидрофобных молекул и крупных белков путем фенол-хлороформенной экстракции с нагреванием и перемешиванием фенол-водной смеси при 70C в течении 30мин. На следующем этапе проводилось удаление из полученной водной фазы остальных молекул с высокой молекулярной массой методом тангенциальной ультрафильтрации (Millipore, USA) c использованием фильтра, пропускающего глобулярные белки массой не более 30 КДа.

       После проведения предварительной очистки, образец, содержащий лиганд NOD1 рецептора,  был подвергнут хроматографическому разделению с использованием жидкостного хроматографа Bioalliance 2796 (Waters, США). Было разработано три последовательных метода очистки, основанных на принципах обращеннофазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Разделение веществ проводилось на основании существующей разницы в гидрофобных/гидрофильных свойствах молекул, находящихся в анализируемой смеси. В ходе первых двух методов очистки хроматографическое разделение проводилось на хроматографической колонке Symmetry С18 Column  4.6мм x 75мм, с диаметром частиц 5 мкм (Waters, США). Для проведения заключительного третьего этапа  хроматографического разделения была использована колонка Synergi Hygro-RP (Phenomenex, USA) 3мм х 250мм с диаметром частиц в 4мкм, обладающая более высокой эффективностью разделения. Детектирование  веществ проводилась по интенсивности оптического поглощения молекул с использованием спектрофотометрического детектора 2487 (Waters, США) для волн в 205 и 280 нм. На заключительном этапе очистки для достижения большей чувствительности регистрации разделяемых веществ помимо спектрофотометрического детектора использовался масс-спектрометрический детектор QSTAR Elite (Applied Biosystems/MDS SCIEX, США). В качестве полярного растворителя использовали высокоочищенную деионизированную (mQ) воду, в качестве элюирующего неполярного агента был использован ацетонитрил.

В результате последовательного проведения трех методов хроматографической очистки был получен хроматографически чистый образец, содержащий лиганд NOD1 рецептора. Полученный образец затем был подвергнут масс-спектрометрическому анализу для определения компонентного состава, по результатам которого было обнаружено присутствие единственного однозарядного иона с массой 851.171 Да (см.рис.3).

Рисунок 3. Масс-спектр хроматографически очищенного образца, содержащего лиганд NOD1 рецетпора. Ось абсцисс отношение массы к заряду анализируемых ионов. Ось ординат   количество зарегистрированных ионов за 1 с.

Таким образом, в результате трех последовательных хроматографических методов разделения был получен образец, содержащий лиганд NOD1 рецептора хроматографической и масс-спектрометрической чистоты.

На даном этапе была проведена верификация присутствия идентифицированной молекулы, в анализируемом образце с регистрируемой биологической активностью. Для этого был использован контрольный отрицательный образец интактной культуральной среды BHI. Данный образец прошел вышеперечисленные стадии очистки, после чего был подвергнут масс-спектрометрическому анализу. По результатам анализа в очищенном образце интактной культуральной среды BHI молекула с идентифицированной массой не регистрировалась.  Дополнительно был подобран метод химической модификации анализируемой молекулы, позволяющий ингибировать биологическую активность образца. Так, обработка анализируемого образца содержащего лиганд NOD1 рецептора бромной водой (реагента селективно взаимодействующего с ненасыщенными углеродными связями и фенольными группами молекул) приводило к исчезновению из спектра зарегистрированного сигнала при одновременной утрате образцом биологической активности, что также коственно подтверждает связь между биологической активностью и присутствием идентифицированной молекулы в анализируемом образце.

Полученный образец был подвергнут дальнейшему масс-спектрометрическому анализу для определения первичной структуры исследуемой молекулы. 

Идентификация первичной структуры фрагмента менингококка серогруппы В, являющегося лигандом NOD1 рецептора.

После проведения трехстадийной хроматографической очистки образца содержащего лиганд NOD1 рецептора выделенного из N.meningitidis серогруппы В была проведена идентификация первичной структуры данной молекулы. Общий алгоритм проведения идентификации первичной структуры анализируемой молекулы изображен на рисунке 4.

Рисунок 4. Алгоритм проведения процедуры идентификации первичной структуры молекулы, являющейся лигандом NOD1 рецептора.

Для идентификации структуры анализируемой молекулы на первом этапе  масс-спектрометрического анализа была определена ее точная молекулярная масса, которая составила 850,353Да (измерение было проведено с использованием внутренних стандартов масс: CsI и CsCl)

После этого, ионы анализируемого вещества были подвергнуты диссоциации посредством столкновений с нейтральными молекулами азота. Полученные данные позволили провести секвенирование пептидной части молекулы с использованием програмного обеспечения Protein Pilot (Applied Biosystems/MDS SCIEX, США). По результатам проведенного анализа был идентифицирован пептидный фрагмент, представленный последовательностью остатков аланина, глутаминовой и диаминопимелиновой кислот. 

Для идентификации небелковой части молекулы методом псевдо-МС3 (изучение продуктов фрагментации ионов, полученных путем предварительной фрагментации иона анализируемой молекулы  в интерфейсе ионизации при атмосферном давлении) были изучены пути распада основных фрагментов иона анализируемой молекулы, что позволило определить точные массы нейтральных групп, связанных с отщеплением отдельных структурных единиц (групп атомов) молекулы. Используя полученные данные, а также вышеуказанное  програмное обеспечение, были определены и отобраны наиболее вероятные брутто-формулы оставшейся небелковой части молекулы. Сравнение спектров фрагментации с контрольными молекулами N-ацетилглюкозамина и анализируемого вещества в идентичных условиях позволило подтвердить наличие остатка N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты в составе лиганда NOD1 рецетпора. В результате проведения всех стадий масс-спектрометрического анализа была определена первичная структура лиганда NOD1, выделенного из менингококка 591 штамма серогруппы В (см. рисунок 5) -N-ацетил-D-глюкозамин (ангидрид) N-ацетилмурамил- L-Ala-D-Glu-M-Dap (GM-TriDAP)

Рисунок 5.  Определенная первичная структура лиганда NOD1, выделенного из менингококка 591 штамма серогруппы В: N-ацетил-D-глюкозамин (GlcNAc) N-ацетилмурамил (MurNAc) -трипептида L-Ala-D-Glu-M-Dap (GM-TriDAP). Брутто формула молекулы С34H54N6O19. Молекулярный вес = 850.3444 Да; отклонение от теоретической массы  равно 10ppm.

Сравнительный анализ NF-kB активирующей способности лиганда NOD1 рецептора выделенного из N. meningitidis с другими молекулами различной структуры в условиях in vitro.

После идентификации первичной структуры лиганда NOD1 рецептора выделенного из N.meningitidis штамма 591 принадлежащего к серогруппе В на следующем этапе работы необходимо было изучить NF-kB активирующую способность данной молекулы в условиях in vitro, сравнив ее с другими лигандами NOD1 рецептора, имеющими различную химическую структуру.

Известно, что ключевой последовательностью, необходимой и достаточной для активации NOD1 рецептора, является дипептид D-Glu-mDAP присутствующий в структуре грамотрицательных бактерий (Girard R. et al., 2003).  Участие других аминокислот и моносахаридов,  входящих в состав структурных молекул пептидогликана грамотрицательных бактерий, в процессе распознавания NOD1 рецептором остается не до конца выясненным.

Для измерения активности NF-kB к клеточной линии HEK293hNOD1 добавляли различные по структуре лиганды NOD1 рецептора: химически синтезированный дипептид D-Glu-mDAP, трипептид L-Ala-D-Glu-L-mDAP (Tri-DAP), трипептид ковалентно связанный с моносахаридом MurNAc-L-Ala-D-Glu-L-mDAP (M-Tri-DAP), а также идентифицированный трипептид ковалентно связанный с дисахаридом  GlcNAc-MurNAc-L-Ala-D-Glu-L-mDAP (GM-Tri-DAP), полученный из Neisseria meningitidis штамма 591.

Как видно из рисунка 6, добавление дипептида D-Glu-mDAP  приводило к достоверному повышению NF-kB-зависимой активации экспрессии гена -галактозидазы лишь при максимальных концентрациях (1-10мкг/мл), тогда как производные данной молекулы  с бльшим молекулярным весом Tri-DAP, M-Tri-DAP и GM-Tri-DAP, , вызывали достоверное увеличение NF-kB-зависимой экспрессии гена -галактозидазы при более низких концентрациях (от 0,5мкг/мл).  При этом NF-kB активирующая способность данных лигандов NOD1 рецептора (Tri-DAP, M-Tri-DAP и GM-Tri-DAP)  структура которых отличается содержанием сахаридов GlcNAc и MurNAc была одинакова.

Рис.6 Измерение активности транскрипционного фактора NF-kB в клетках  экспрессирующих рецептор NOD1 - HEK293hNOD1.

Таким образом, по результатам данного эксперимента было показано, что увеличение аминокислотной последовательности в структуре лиганда NOD1 рецептора приводит к  достоверному увеличению NF-kB-активирующей способности молекулы по сравнению с основной последовательностью D-Glu-mDAP, тогда как присутствие в составе молекулы моносахаридов не влияет на дальнейшее увеличение активности лигандов NOD1 рецептора. Кроме того, было показано, что молекула лиганда NOD1 рецептора, выделенного из N.meningitidis штамма 591, обладает сходной NF-kB активирующей способностью, что и синтетические лиганды, имеющие в своей структуре трипептидный фрагмент L-Ala-D-Glu-L-mDAP.

Сравнительный анализ NF-kB активирующей способности лигандов NOD1 и TLR рецепторов в условиях in vitro.

Для сравнения NF-kB активирующей способности NOD1 и TLR рецепторов в условиях in vitro, была использована клеточная линия  острого моноцитарного лейкоза человека (THP-1) в норме одновременно экспрессирующая NOD1, а также большинство типов TLR рецепторов. Для сравнения NF-kB активрующей способности были выбраны наиболее изученные типы Toll-подобных рецепторов, лигандами которых являются молекулы бактериального происхождения – TLR2,4,5,6. Клетки данной линии обрабатывали GM-Tri-DAP (лиганд NOD1), а также синтетическим диациллипопептидом R-Pam2 (лиганд TLR2), ЛПС E.coli (лиганд TLR4) и флагеллином (лиганд TLR5) в различных концентрациях. Затем после 18 часов проводилось измерение активности NF-kB по экспрессии щелочной фосфатазы, ген которой был введен в геном клеток под транскрипционным контролем NF-kB-зависимого элемента

Рисунок 7. Измерение уровня активности транскрипционного фактора NF-kB в клетках  THP-1.В качестве отрицательного контроля (К-) использовались интактные клетки.

Результаты эксперимента показывают (см. рис. 7), что каждый из используемых лигандов дозозависимым способом приводит к активации транскрипционного фактора NF-kB.

При этом, лиганд NOD1 рецептора - GM-Tri-DAP - вызывает сравнимый с лигандами TLR2,4,5 уровень активации NF-kB, но в концентрациях в 10-100 раз превышающих таковую диациллипопептида R-Pam2, ЛПС и флагеллина. По результатам проведенного эксперимента можно сделать вывод, что лиганды NOD1 рецептора обладают меньшей NF-kB активирующей способностью по сравнению с лигандами Toll-подобных рецепторов (TLR2,4,5), по крайней мере, при использованном пути доставки.

Определение влияния совместной стимуляции NOD1 и TLR рецепторов на уровень активации NF-kB в условиях in vitro.

Известно, что в условиях in vivo в ходе развивающейся инфекции присутствие патогенного микроорганизма детектируется сразу несколькими паттерн-распознающими рецепторами относящимися, в том числе и к разным семействам (Rasmussen S.B. et al, 2009). Таким образом, можно предположить, что каждый из участвующих в распознавании структур патогена паттерн-распознающий рецептор будет вносить свой вклад в индукцию развития иммунных реакций посредством активации собственного набора транскрипционных факторов.

Задача следующего эксперимента заключалась в определении влияния совместной стимуляции нескольких паттерн-распознающих рецепторов, принадлежащих к различным семействам (NOD1 и  TLR2,4,5) на уровень активации транскрипционного фактора NF-kB по сравнению с изолированной стимуляцией данных рецепторов. Для этого, к клеткам линии THP-1 проводилось однократное добавление препаратов GM-Tri-DAP, ЛПС, R-Pam2 и флагеллина в концентрации 1мкг/мл, а также совместное в трех схемах: 1) одновременное добавление лигандов NOD и TLR рецепторов, 2) добавление  лиганда NOD1 рецептора за 2 часа до добавления лиганда TLR, 3) добавление лиганда TLR рецептора за 2 часа до добавления лиганда NOD1.

Рисунок 8. Измерение уровня активации NF-kB в клетках линии THP-1 при изолированной и совместной (одновременной и последовательной) стимуляции NOD1 и TLR2,4,5.

Как видно из рисунка 8 при совместном добавлении лигандов  NOD1 и одного из TLR рецепторов наблюдается повышение уровня активации NF-kB по сравнению с изолированным добавлением лигандов. При этом наибольший (потенциирующий) эффект (более чем в 2,5 раза) наблюдался при совместной стимуляции NOD1 и TLR5 рецепторов.  Данный тип Toll-подобного рецептора был выбран для дальнейшего изучения роли совместной активации паттерн-распознающих рецепторов различных семейств в формировании иммунных реакций.

Для подтверждения идентифицированного эффекта повышения уровня активации NF-kB в ответ на совместную стимуляцию NOD1 и TLR5 рецепторов, эксперимент был проведен на  клеточных линиях эпителия карциномы прямой кишки человека (HCT116 и LIM1215) в норме одновременно экспрессирующих оба типа рецепторов (NOD1 и TLR5). Клетки данных линий обрабатывали лигандами NOD1 (GM-Tri-DAP) и TLR5 (флагеллином) рецепторов в концентрации 100нг/мл. Затем после 8 часов проводилось измерение активности NF-kB по экспрессии люциферазы, ген которой был введен в геном клеток под транскрипционным контролем NF-kB-зависимого элемента.

Рисунок 9. Измерение уровня активации NF-kB в клетках линии HCT116 и LIM1215 при индивидуальном, одновременном и последовательном (через 2 часа) добавлении лигандов NOD1 и TLR5 рецепторов  (GM-Tri-DAP и флагеллина).

Как видно из рисунка 9 лишь при последовательном добавлении данных лигандов  наблюдается повышение уровня активации NF-kB по сравнению с изолированным добавлением лигандов. При этом, наибольший потенциирующий эффект достигался в случае добавления к клеткам лиганда NOD1 рецептора, а затем через 2 часа лиганда TLR5. Данный феномен может быть объяснен показанным ранее фактом преимущественной экспрессии  TLR5 рецептора на базальной стороне клеток кишечника (Gewirtz A.T. 2001). Таким образом, стимуляция соответствующими лигандами NOD1, а затем TLR5 рецепторов иммитирует последовательность активации данных рецепторов в случае реальной бактериальной инвазии, что может обеспечивать повышенный уровнь активации NF-kB.

Влияние совместной стимуляции NOD1 и TLR5 рецепторов на уровень активации NF-kB в условиях in vivo.

На следующем этапе нашей работы предстояло определить, существует ли идентифицированный эффект потенциирования уровня активации NF-kB при последовательной стимуляции NOD1 и TLR5 рецепторов в условиях in vivo.

Для изучения поставленного вопроса, нами были использованы трансгенные мыши линии Balb/C, в геном которых встроен репортерный ген люциферазы под контролем NF-kB зависимого промотора. Используемая система позволяет измерять степень активации NF-kB (в том числе прижизненно в реальном времени) в различных органах мышей по интенсивности люминисцентного свечения после введения животным лигандов паттерн-распознающих рецепторов (Carlsen H. et al. 2002).

Вышеописанным трансгенным мышам проводилось изолированное введение GM-Tri-DAP  и флагеллина в дозе 200мкг/мышь и 1мкг/мышь, соответственно. Кроме того, третьей группе мышей проводилось последовательное введение лигандов NOD1 и TLR5 рецепторов, в схеме обеспечивающей эффект потенцирования уровня активации NF-kB.

Через 2,4,6,8,10 часов после последнего введения лиганда производился забор органов мышей (см. рисунок 10).

Рисунок 10. Измерение уровня активности транскрипционного фактора NF-kB в образцах гомогенатов органов мышей после введения лигандов NOD1 и TLR5 рецепторов. Черные столбцы активность NF-kB в органах контрольных мышей, которым вводили раствор фосфатного буфера (ФСБ);  красные столбцы - активность NF-kB в органах мышей, которым вводили флагеллин в концентрации 1мкг/мышь; зеленые столбцы активность NF-kB в органах мышей, которым вводили GM-Tri-DAP  (200мкг/мышь); синие столбцы - активность NF-kB в органах мышей, которым вводили  сначала GM-Tri-DAP (200мкг/мышь), а затем через 2 часа флагеллин в концентрации 1мкг/мышь.

По результатам представленного эксперимента можно заключить, что идентифицированный в условиях in vitro эффект потенцирования уровня активации NF-kB в ответ на последовательную стимуляцию NOD1 и TLR5 рецепторов сохраняется и условиях in vivo. Кроме того идентифицированный эффект является органоспецифичным (максимальный повышение активации NF-kB наблюдается лишь в тонком и толстом кишечнике). Данный факт позволяет сделать предположение о том, что повышенный уровень активации NF-kB возможно играет важную роль в формировании иммунных реакций в вышеперечисленных органах.

Влияние эффекта усиления активации NF-kB при последовательной стимуляции NOD1 и TLR5 рецепторов на уровень секреции цитокинов и хемокинов в сыворотке периферической крови и гомогенате тонкого и толстого кишечника.

На следующем этапе работы необходимо было определить, способен ли повышенный уровень активации NF-kB, вызванный последовательной стимуляцией NOD1 и TLR5 рецепторов, приводить к бльшему выбросу цитокинов в условиях in vivo по сравнению с изолированной стимуляцией указанных рецепторов.

Для выполнения поставленной задачи нам был проанализирован спектр экспрессии 19 хемокинов и цитокинов (ИЛ-1a,2,4,5,6,10,12p70,13,17,18,21, 22,27, ИФН-, ФНО-, CXCL1/KC, MCP-3, MCP-1, MIP-1, MIP-1, RANTES, GM-CSF) в организме животных (мышей) в ответ на изолированное и последовательное введение лигандов NOD1 и TLR5 рецепторов в схеме, приводящей к эффекту потенциирования уровня активации NF-kB. Концентрация цитокинов определялась с использованием набора FlowCytomix BenderMedsystems (США) в сыворотке периферической крови животных, а также в образцах тонкого и толстого кишечника, в которых  наблюдался наибольший эффект потенциирования уровня активации NF-kB при последовательной стимуляции NOD1 и TLR5 рецепторов. На рисунках 11 и 12 представлены данные для цитокинов, концентрация которых была повышена в ответ на последовательное введение лигандов NOD1 и TLR5 по сравнению с изолированным введением какого-либо из лигандов паттерн-распознающих рецепторов в сыворотке крови и гомогенате тонкого кишечника, соответственно.

Рис. 11. Определение концентрации интерлейкина-6 в сыворотках периферической крови мышей, при изолированном внутримышечном введении им фосфатно-солевого буфера (ФСБ), флагеллина (1мкг/мышь), GM-Tri-DAP (200мкг/мышь), а также последовательном введении GM-Tri-DAP (200мкг/мышь) через 2 часа после введения флагеллина (1мкг/мышь). После введения мышам линии BALB/C указанных лигандов паттерн-распознающих рецепторов или фосфатно-солевого буфера, через 2,4,6,8 часов отбирали кровь для приготавливления сыворотки. Полученные образцы сыворотки использовали для определения концентрации цитокинов. Каждая точка представляет собой среднее значение, полученное от трех образцов (мышей).

Рис.12. Определение концентрации цитокинов в гомогенате тонкого кишечника мышей при изолированном внутримышечном введении им фосфатно-солевого буфера (ФСБ), флагеллина (1мкг/мышь), GM-Tri-DAP (200мкг/мышь), а также последовательном введении GM-Tri-DAP (200мкг/мышь) через 2 часа после введения флагеллина (1мкг/мышь). После введения мышам линии BALB/C указанных лигандов паттерн-распознающих рецепторов или фосфатно-солевого буфера, через 2 часа после последней инъекции был произведен отбор образца тонкого кишечника (соответствующий отделу тощей кишки), который затем был использован для получения гомогената в котором проводилось определение концентрации цитокинов.

По результатам данного эксперимента было показано, что повышенный уровень активации NF-kB, вызванный последовательной стимуляцией NOD1 и TLR5 рецепторов, способен приводить к повышению ряда цитокинов как непосредственно в ткани тонкого кишечника, так и в периферической крови животного. При этом ранее было показано, что все идентифицированные цитокины (ИЛ-5,6,13,21) принимают ключевое участие в развитии адаптивного иммунного ответа по Th2-типу (Mosmann T. et al., 1996).

Влияние эффекта усиления активации NF-kB при последовательной стимуляции NOD1 и TLR5 на формирование протективного иммунитета к летальным дозам Salmonella typhimurium в условиях in vivo.

На заключительном этапе нашего исследования предстояло определить способен ли повышенный уровень активации NF-kB в кишечнике животных, вызванный последовательной стимуляцией NOD1 и TLR5 рецепторов, повысить эффективность иммунной защиты животных против инфекции энтеропатогенным микроорганизмом вызывающим патологический процесс, проникая через эпителий кишечника.

Для этого мыши линии BalB/C, были перорально инфицированы S. typhimurium в дозе 106 КОЕ/мышь. За 9 часов до заражения животных производилось однократное введение изолированных препаратов GM-Tri-DAP и флагеллина,  а также совместное введение данных лигандов в схеме вызывающей повышенный уровень активации NF-kB.  На рисунке 13 представлены диаграммы изменения среднего веса по группе и выживаемости мышей, участвующих в эксперименте.

Рисунок 13. Диаграмма среднего веса (А) и выживаемости (Б) мышей линии Balb/C. K-  - контрольная группа мышей перорально зараженных Salmonella  typhimurium в дозе 1х106 КОЕ/мышь; флагеллин 1мкг/мышь группа мышей которым за 9 часов до перорального заражения Salmonella  typhimurium в дозе 5х106 КОЕ/мышь внутримышечно вводили  флагеллин в концентрации 1мкг/мышь; GM-Tri-DAP  200мкг/мышь + флагеллин 1мкг/мышь группа мышей которым за 11 часов до перорального заражения Salmonella  typhimurium в дозе 5х106 КОЕ/мышь внутримышечно вводили GM-Tri-DAP  200мкг/мышь в концентрации 200мкг/мышь, а через 2 часа (за 9 часов до заражения) тем же животным вводили флагеллин в концентрации 1мкг/мышь; GM-Tri-DAP  200мкг/мышь группа мышей которым за 9 часов до перорального заражения Salmonella  typhimurium в дозе 5х106 КОЕ/мышь внутримышечно вводили  GM-Tri-DAP  200мкг/мышь в концентрации 200мкг/мышь.

В результате эксперимента было установлено, что повышенные относительно контрольной группы животных показатели выживаемости (до 80%) были получены только в группе животных, получивших последовательную инъекцию флагеллина в дозе 1мкг/мышь через 2 часа после введения  GM-Tri-DAP  (200мкг/мышь). Кроме того, мыши данной группы показали меньшую потерю веса среди остальных групп в ходе всего периода наблюдения.

Таким образом, результаты эксперимента доказывают, что последовательная стимуляция NOD1 и TLR5 рецепторов, приводящая к эффекту потенциирования уровня активации NF-kB в тонком и толстом кишечнике формирует протективный иммунитет животных при инфекции энтеропатогенным видом бактерий.

Полученные в результате работы данные описывают сочетанную работу различных паттерн-распознающих рецепторов врождённого иммунитета и определяют один из принципов функционирования иммунной системы при котором поэтапное распознавание структур патогенного микроорганизма в процессе его инвазии необходимо для формирования наиболее эффективного противоинфекционного иммунитета.

ВЫВОДЫ

  1. Показано, что среди проанализированных видов бактерий наиболее эффективным продуцентом лиганда NOD1 рецептора является 591 (B:NT:P1.1,2)  штамм Neisseria meningitidis.
  2. Разработана технология очистки лиганда NOD1 рецептора, выделенного из наиболее эффективного бактериального штамма-продуцента - Neisseria meningitidis.
  3. Идентифицирована первичная структура лиганда NOD1 рецептора выделенного из Neisseria meningitidis, являющаяся фрагментом пептидогликана бактерии: N-ацетил-D-глюкозамин N-ацетилмурамил- L-Ala-D-Glu-M-Dap (GM-TriDAP). 
  4. Показано, что лиганд NOD1 рецетпора – GM-Tri-DAP, выделенный из Neisseria meningitidis обладает сравнимой NF-kB активирующей способностью с синтетическими лигандами, имеющими в своей структуре трипептид L-Ala-D-Glu-L-mDAP.
  5. Впервые показано, что последовательная стимуляция NOD1 и TLR5 рецепторов приводит к эффекту потенциирования (повышения до 4 раз) уровня активации транскрипционного фактора NF-kB в условиях in vitro и in vivo по сравнению с изолированной стимуляцией данных рецепторов.
  6. Впервые показано, что последовательная стимуляция NOD1 и TLR5 рецепторов, приводит к эффекту потенциирования (повышения до 6 раз) уровней секреции ИЛ-5,6,13,21 в условиях in vivo (в периферической крови и тканях тонкого кишечника животных).
  7. Впервые показано, что последовательная стимуляция NOD1 и TLR5 рецепторов на 50% увеличивает выживаемость животных при инфекции летальными дозами Salmonella typhimurium по сравнению с изолированной стимуляцией данных рецепторов.


СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Тухватулин, А. И., Логунов, Д. Ю., Гитлин, И. И., Шмаров, М. М., Кудан, П. В., Аджиева, А. А., Моро,з А. Ф., Костюкова, Н. Н., Бурделя, Л. Г., Народицкий, Б. С., Гинцбур,г А. Л., Гудков, А. В. Изучение способности лигандов рецептора NOD1 активировать транскрипционный фактор NF-kB в условиях in vitro и in vivo./ Acta naturae. – 2011. –  ТОМ 3. – № 1 (8) . – C. 69-77

2. Тухватулин, А.И., Логунов, Д.Ю., Щербинин, Д.Н., Шмаров, М.М., Народицкий, Б.С., Гудков, А.В., Гинцбург, А.Л. TOLL-подобные рецепторы и их адапторные молекулы / Биохимия. –2010. –том 75. –вып. 9. –C. 1224 – 1243.

3. Щебляков, Д. В., Логунов, Д. Ю., Тухватулин, А. И., Шмаров, М. М., Народицкий, Б. С., Гинцбург, А. Л. Тoлл-подобные рецепторы (TLR) и их

значение в опухолевой прогрессии/ Acta naturae. –2010. –ТОМ 2. – № 3 (6) . – C.28-37

4. А.И.Тухватулин, Д.Ю.Логунов, М.М.Шмаров, Н.Н.Костюкова, А.Ф.Мороз, Б.С.Народицкий, А.Л.Гинцбург.

Лиганд NOD рецептора 1, полученный из Neisseria meningitidis серогруппы В. Его структура и биологические свойства in vitro и in vivo. / Материалы XIV-го Всероссийского форума с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» имени академика В.И.Иоффе. –Санкт-Петербург. –2011г.

5. Тухватулин, А.И. Логунов, Д.Ю., Шмаров, М.М., Костюкова, Н.Н., Мороз, А.Ф. Народицкий, Б.С. Поиск эффективных молекулярных адъювантов, с использованием эукариотической тест-системы созданной на основе клеток, экспрессирующих различный набор Толл-подобных рецепторов / Материалы IV Российского симпозиума «Белки и пептиды». –Казань. –2009г.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.