WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

ИВАНОВ Максим Андреевич

МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ПИРИМИДИНОВЫЕ РИБОНУКЛЕОЗИДЫ – ИНГИБИТОРЫ РЕПЛИКАЦИИ РНК-СОДЕРЖАЩИХ ВИРУСОВ

03.01.03 - Молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

Москва 2012

Работа выполнена в Лаборатории молекулярных основ действия

физиологически активных соединений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук.

Научный руководитель:        кандидат химических наук, старший научный сотрудник  Лаборатории молекулярных основ действия физиологически активных соединений Л.А. Александрова

Официальные оппоненты:        доктор химических наук, профессор, заведующая Лабораторией химии нуклеиновых кислот Химического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального

образования науки Московского государственного университета им М.В. Ломоносова. Т.С. Орецкая.

доктор химических наук, ведущий научный сотрудник Лаборатории стереохимии ферментативных реакций  Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук. Э.Н. Тимофеев.

                               

Ведущая организация:        Федеральное государственное бюджетное учреждение российской академии медицинских наук «Научно-исследовательский Институт  по изысканию новых антибиотиков имени Г.Ф.Гаузе». РАМН.         

Защита диссертации состоится «____» _____________ 2012 г. в _____ часов на заседании диссертационного Совета Д 002.235.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИМБ им. В.А. Энгельгардта РАН (119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32)

Автореферат разослан «____» _____________ 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного Совета

кандидат химических наук                                                                А.М. Крицын

       Список использованных сокращений:

БПН – бициклический пиримидиновый нуклеозид;

ФПН – фуранопиримидиновый нуклеозид;

HCV – вирус гепатита С;

BVDV – вирус диареи крупного рогатого скота;

EC50 – эфективная концентрация (мкM), подавляющая репликацию вируса на 50%;

СС50 – доза препарата, вызывающая гибель 50% неинфицированных клеток;

IS – индекс селективности (отношение CC50 к EC50);

Pd[PPh3]4 – тетракис(трифенилфосфин)палладий (0);

Протонная губка -1,8-бис(диметиламино)нафталин;

NHC - N4-гидроксицитидин;

Аda – Адамантан;

СDI – N,N-карбонилдиимидазол.

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность работы. Проблема создания эффективных противовирусных средств по-прежнему актуальна. Выявление соединений, способных подавлять репликацию вирусов, не затрагивая процессов жизнедеятельности клеток организма–хозяина, является достаточно сложной задачей. Строгая направленность действия  - один из основных критериев в отборе соединений с противовирусной активностью. Модифицированные нуклеозиды удовлетворяют данным требованиям и являются «популярными» объектами исследований. Мишенями их действия могут выступать ферменты: ДНК- и РНК-полимеразы, синтазы, киназы и др, участвующие в метаболизме нуклеозидов, нуклеотидов и нуклеиновых кислот, в том числе. К настоящему времени на основе модифицированных нуклеозидов создано несколько десятков эффективных препаратов для терапии вирусных заболеваний.

Одним из наиболее распространенных и опасных заболеваний человека является гепатит С, вызываемый соответствующим  вирусом (HCV). К настоящему времени известно несколько аналогов нуклеозидов, ингибирующих репликацию HCV в культуре клеток, однако пока единственным разрешенным лекарственным препаратом нуклеозидной природы, применяемым в терапии гепатита С, остается препарат широкого спектра действия - рибавирин (Virazole®), который, несмотря на его достаточно высокую токсичность, используется в комбинации с интерфероном . Таким образом, создание новых соединений, эффективно подавляющих репликацию HCV, является весьма актуальной задачей.

Целью работы явился синтез и изучение свойств потенциальных ингибиторов HCV, BVDV и вирусов оспы на основе нуклеозидов, модифицированных как по нуклеиновому основанию, так и по углеводному остатку.

В ходе исследования решались следующие задачи:

- разработка рациональных методов синтеза трех классов модифицированных нуклеозидов: бициклических фурано- и пирролопиримидиновых рибонуклеозидов, производных N4-гидроксицитидина, производных 4’-фторрибонуклеозидов пиримидинового ряда;

- испытание полученных соединений в качестве потенциальных ингибиторов репликации вирусов: HCV в системе репликона, BVDV в инфицированных клетках коронарных сосудов теленка и вирусов семейства оспы в культурах клеток Vero и МК-2;

- синтез трифосфатов указанных выше модифицированных нуклеозидов;

- исследование субстратных и ингибиторных свойств нуклеозид трифосфатов в отношении нуклеотид-зависимых ферментов HCV .

Научная новизна и практическая значимость работы. Оптимизированы разработанные ранее методы получения модифицированных нуклеозидов. Впервые синтезированы фуранопиримидиновые нуклеозиды рибо-ряда, отработана одностадийная методика получения БПН; разработан удобный метод синтеза пирролопиримидиновых нуклеозидов. Модифицирована схема синтеза 4’-фтор-2’,3’-О-изопропилиденуридина с увеличением общего выхода с 19% до 37%. Впервые проведен химический синтез трифосфатов БПН. Осуществлен дизайн и синтез депо-форм 4’-фторуридина. В ходе работы синтезировано 31 новое соединение, структура которых подтверждена данными УФ- и ЯМР-спектроскопии.Проведенная модификация методик имеет практическую значимость, поскольку существенно упрощает синтезы биологическиактивных нуклеозидов. Среди синтезированных производных нуклеозидов выявлены ингибиторы репликации in vitro вирусов гепатита С, бычьей диареи и оспы. Показано, что трифосфат 4’-фторуридина является эффективным ингибитором РНК-полимеразы HCV и субстратом хеликазной и NTPазной реакций, катализируемой ферментом NS3 HCV, полученные данные внесут определенный вклад в создание новых противовирусных препаратов. 

Апробация работы. Отдельные части работы докладывались на конференции: XVII International Roundtable on Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids (Bern, Switzerland, 2006 г.); Humboldt-kolleg conference: Technologies and threats of the 21st century (Chisinau, Moldova, 2006 г); International Conference for Young Scientists and Ph.D. Students on Molecular Biology and Genetics (Kiev, Ukraine, 2007 г.); International conference Biocatalysis-2007 (Moscow - St.Peterburg, Russian Federation, 2007 г.); XVIII International Roundtable on Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids (Kioto, Japan 2008 г.); XIX International Roundtable on Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids (Lyon, France, 2010 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей и 7 тезисов.

Объем диссертации. Диссертация изложена на ____ страницах и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения полученных результатов, экспериментальной части и выводов. Материал иллюстрирован ____ таблицами, ____ рисунками и ____ схемами. Список цитированной литературы включает ____ наименований.

Работа выполнена при финансовой поддержке грантами Российского фонда фундаментальных исследований (№№ 05-04-49492, 08-04-00549, и ОФИ-М 11-04-12035), Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», Международного научно-технического центра (№1989).

Содержание работы

Как указывалось выше, к настоящему времени единственным утвержденным анти-HCV препаратом нуклеозидной природы является рибавирин (в комбинации с интерфероном α). Среди наиболее привлекательных мишеней действия противогепатитных агентов можно выделить два неструктурных белка: РНК-зависимые ферменты HCV – РНК-зависимую РНК-полимеразу (белок NS5B) и протеиназу/хеликазу/NTPаза (NS3). В настоящее время известно значительное число ингибиторов данных ферментов, в том числе и нуклеозидной природы. Однако эффективность этих соединений или невелика, или они токсичны, поэтому создание новых ингибиторов ферментов HCV по прежнему актуально.

В последние годы синтезировано значительное число бициклических производных пиримидиновых 2’-дезоксинуклеозидов и изучена их противовирусная активность [McGuigan C., et al, J. Med. Chem. 1999, 42, 4479; Sienaert R., et al, J. Antimicrob. Chemotherapy. 2002, 50, 5]. В инфицированных культурах клеток эти соединения эффективно подавляли репликацию ДНК-содержащего вируса варицелла-зостер, значительно превышая активность антигерпетического препарата ганцикловира. Наилучшую активность проявил 3-(дезокси--D-рибофуранозил)-6-p-пентилфенил-2,3-дигидрофурано[2,3-d]пиримидин-2-он. Его EC50 по отношению к вирусу варицелла зостер составляло менее 1 нM и значение IS примерно 106 [Luoni G., et al, BioOrg. Med. Chem. Lett. 2005, 15, 3791].

В то же время анализ литературных данных показал, что бициклические рибонуклеозиды подобного типа практически не описаны. Представлялось целесообразным осуществить синтез ряда новых бициклических фурано- и пирроло[2,3-d]пиримидиновых рибонуклеозидов для проверки их активности как ингибиторов репликации вируса гепатита С в системе HCV-репликона и вируса диареи крупного рогатого скота (BVDV), являющегося суррогатной моделью HCV. Для изучения взаимодействия полученных нуклеозидов с нуклеотид-зависимыми ферментами HCV (белков NS5B и NS3) был произведен синтез соответствующих 5’-O-трифосфатов.

Получение 6-замещенных 3-(-D-рибофуранозил)-2,3-дигидрофурано[2,3-d]пиримидин-2-онов (3a)-(3g). На схеме 1 представлены методы получения ФПН, апробированные в данной работе. Первоначально применялись схемы, описанные в работе К. МкГьюгана [McGuigan C., et al, J. Med. Chem. 1999, 42, 4479] (методы А и В). Ключевыми стадиями синтеза являлись замещение йода на алкин при катализе Pd(0) и CuI и последующая циклизация полученного (5-алкинил)уридина (2) в присутствии избытка CuI и Et3N с образованием соответствующего ФПН (3). Этот синтез можно проводить как с выделением промежуточного алкинированного нуклеозида (метод В), так и без его выделения.

Метод Б (гетерогенный катализ), предложенный Толстиковым [Толстиков Г.А., и др., Известия АН. Сер. Хим. 1993, 596] выгодно отличается от метода А, поскольку 10% Pd/C (палладий на угле) значительно дешевле Pd[PPh3]4, причем процесс можно проводить в одну стадию. Если при синтезе по методу А реакция проходила при температуре 70С примерно за сутки, то по методу Б для полного превращения исходного вещества было достаточно 1.5 часа. Оптимальным растворителем в методе Б оказался ацетонитрил.

Схема 1.

(2): R= a) C6H13, b) C10H21, c) C12H25, d) C6H5;

(3): R = a) C6H13, b) C10H21, c) C12H25, d) C6H5, e) C5H11, f) CH2OC(C6H5)3; g); CH2OH

Метод А: (i), затем(ii), Метод Б: (iii), Метод В: (2), (iv). i: DMF, 1-алкин, Pd(PPh3)2CI2, CuI, Et3N, 20C, 18 ч; ii: CuI, Et3N, 70C, 5 ч; iii: Pd/C, CuI (кат.), CH3CN, Et3N, кипячение 1.5 ч; iv: CuI (кат.), MeOH, Et3N, кипячение; v: 95% CH3COOH, 37 C, 12 ч.

Таким образом, наиболее удобным и экономичным оказался метод Б. Выходы одностадийной реакции по Толстикову превышали таковые по методам А и В на 15%. В результате нами был синтезирован широкий набор ФПН.

Следующим этапом работы явился синтез пирролопиримидиновых нуклеозидов, который проводился в соответствии со схемой 2. В работе [Janeba Z., et al, J. Med. Chem. 2005, 48, 4690] замещение кислорода в фуранозном цикле фуранопиримидиновых ациклических нуклеозидов на NH-группу проводили нагреванием в запаянных ампулах с NH3/MeOH. Нами было обнаружено, что такое замещение можно проводить в водном растворе при комнатной температуре, что методологически значительно проще и безопаснее.

i: 25% водный NH3, MeOH, 20C, 24 ч; ii: 40% водный NH2CH3, MeOH, 20C, 24 ч.

Синтез N7-метилпирроло[2,3-d]пиримидинового нуклеозида (5) осуществляли взаимодействием ФПН (3) c N-метиламином в водно-метанольном растворе при комнатной температуре (схема 2). В данном случае реакция протекала значительно медленнее, чем при получении нуклеозида (4), выход соединения (5) составил 52%. Структура синтезированных соединений подтверждена УФ-, 1Н- и 13С-ЯМР-спектрами.

Ниже приведены 1Н-ЯМР фрагменты спектров 5-тетрадецинилуридина (2c) (Рис 1) и полученного из него фуранопиримидина 3-(-D-рибофуранозил)-6-додецил-2,3-дигидрофурано-[2,3-d]пиримидин-2-она (3c) (Рис 2).

В спектре соединения () присутствуют характерные сигналы 5-замещенного пиримидинового основания: 11.50 м.д. (синглет) протона NH-группы и 8.13 м.д. (синглет) протона при 6-ом атоме углерода. В спектре () указанные сигналы не наблюдаются; однако, присутствует синглет протона Н4 при 8.77 м.д., принадлежащий пиримидиновому циклу, и синглет Н5 при 6.40 м.д., принадлежащий менее электронодефицитному фурановому кольцу. Представляет интерес расположение сигналов ОН-групп рибозного фрагмента 5-тетрадецинилуридина (2c): 5.31 м.д. (1Н, д, 2-ОН), 5.10 м.д. (1Н, т, 5-ОН), 4.99 м.д. (1Н, д, 3-ОН) и 3-(-D-Рибофуранозил)-6-додецил-2,3-дигидрофурано-[2,3-d]-2-она (3c): 5.46 м.д. (1Н, д, 5-ОН), 5.19 м.д. (1Н, т, 5-ОН), 4.97 м.д. (1Н, д, 3-ОН). Такая последовательность сигналов  необычна. Как правило, 2-ОН группа находится в слабом поле (слева) относительно  3-ОН и 5-ОН групп. Сигнал 5-ОН группы расположен в сильном поле (справа) и между ними сигнал 3-ОН. Обычно, в отсутствие обьемных заместителей в положениях 5 и 6 пиримидинового кольца, основание занимает чаще анти-положение, в котором кислород при 2-ом атоме углерода не «нависает» над углеводным остатком. Однако, в случае наших соединений, объемный заместитель при С6 и фурановый цикл вероятно разворачивают пиримидиновое основание в син-положение. В результате О2-группа пиримидинового основания оказывает влияние на 5’-углеродный атом углеводного остатка и, как следствие, уменьшает электронную плотность на атоме водорода 5’-гидроксила.

Рис 1. Фрагмент 1Н-ЯМР спектра. 5-Тетрадецинилуридин ().

Рис 2. Фрагмент 1Н-ЯМР спектра. 3-(-D-Рибофуранозил)-6-додецил-2,3-дигидрофурано-[2,3-d]-2-она (3c).

Ингибирование репликации HCV и BVDV фурано- и пирроло[2,3-d] пиримидиновыми нуклеозидами. Фурано- и пирролопиримидиновые нуклеозиды были испытаны в нашей лаборатории как потенциальные ингибиторы репликации HCV в системе репликона вируса HCV по методу [Lohmann V., et al, Science. 1999, 285, 110]. Испытания на вирусе BVDV проведены в НПО "Вектор" по методу [Baker R.O., // Antiviral Res. 2003, 57, 13]. Вирус BVDV относится, как и HCV, к флавивирусам и имеет сходную репликацию в клетке. Соединения (3a), (3c - ), (4) и (5) оказались неактивны в системе репликона вируса HCV и не обладали цитотоксичностью в концентрации до 500 мкМ в культуре гепатоцитов человека Huh7. Лишь бициклический нуклеозид (3b), содержащий протяженный алкильный заместитель (R = C10H21), проявил умеренную анти-HCV-активность (ЕC5025 мкМ) в отсутствие заметной токсичности (СС50>500 мкM). Следует отметить, что известные в литературе ингибиторы репликации HCV - 2’-метил- и 4’-азидоцитидины обладали на порядок более высокой активностью в системе репликона HCV [Klumpp K., et al, Biol. Chem. J. 2006, 281, 3793]. Тот же 3-(-D-рибофуранозил)-6-децил-2,3-дигидрофуро-[2,3-d]пиримидин-2-он (3b) эффективно (ЕC50 1.9 мкМ) подавлял репликацию BVDV в культуре клеток коронарных сосудов теленка. На рис. 3 представлены результаты типичного эксперимента по проверке активности соединений (2b) и (3b) по отношению к BVDV. Как можно видеть, в этой системе исходный для синтеза (3b) 5-додецинилуридин (2b) продемонстрировал на порядок меньшую активность и значительную токсичность.

Рис.3. Данные типичного эксперимента по проверке активности соединений против BVDV, штамм БТ-1 в культуре клеток коронарных сосудов теленка. Данные анализиро-вали с помощью программы SoftMax (версия 4.0, Molecular Devices, Menlo Park, USA)

(1) и (2) - активность и токсичность 3b , (3) и (4) -- активность и токсичность 2b, соответственно.

Синтез 5-трифосфатов фурано- и пирроло[2,3-d]пиримидиновых нуклеозидов. Механизм противовирусного действия большинства аналогов нуклеозидов включает их превращение в нуклеозид 5’-трифосфаты при действии нуклеозид- и нуклеотидкиназ с дальнейшим встраиванием в 3’-конец вирусной ДНК или РНК, что приводит к ингибированию репликации вируса [De Clercq E., Biochim. Biophys. Acta. 2002, 1587, 258]. ДНК- и РНК-полимеразы клеток эукариот и вирусов обладают различной субстратной специфичностью и сродством к модифицированным нуклеозид трифосфатам. Это обстоятельство является одним из основных факторов, обеспечивающих избирательность антивирусного действия аналогов нуклеотидов, что, в конечном счете, делает перспективным синтез новых терапевтически значимых соединений этого класса [De Clercq E., Nat. Rev. Drug Discov. 2002, 1(1), 13]. Поэтому представлялось целесообразным синтезировать ряд 5-O-трифосфатов полученных нуклеозидов для исследования их субстратной специфичности в отношении нуклеотид-зависимых ферментов HCV (Схема 3).

Схема 3.

(3), (7): R = C6H13 (a); CH2OH (g).

i: 1) POCl3, протонная губка, (EtO)3PO, 4C, 1 ч, 2) (Bu3NH)2H2P2O7, DMF, 20C, 20 мин.

При синтезе 5-O-трифосфатов (6), (7a), (7g) и (8) бициклических нуклеозидов (схема 3) мы столкнулись с определенными трудностями, так как нуклеозиды (3)-(5) - довольно лабильные соединения. Ранее химический синтез подобных соединений в литературе описан не был. Фосфорилирование нуклеозида (3a) с помощью POCl3 в триэтилфосфате привело к разрушению гетероциклического основания. Мы синтезировали трифосфаты (7a), (7g) и (8) действием POCl3 в триэтилфосфате в присутствии «протонной губки» (1,8-бис(диметиламино)нафталина) с последующей конденсацией с трибутиламмониевой солью пирофосфорной кислоты по методу, разработанному Т.Ковач [Kovacs T., Otvos, L. Tetrahedron Lett. 1988, 29, 4525]. Выходы составляли 514%. Даже в столь мягких условиях получить трифосфат (6) пирролопиримидинового нуклеозида (4) нам не удалось.

В результате были синтезированы трифосфаты нуклеозидов с выходами: 8% для (7a); 14% для (7e); 5% для (8). Структура синтезированных соединений была подтверждена УФ-, 1Н- и 31P-ЯМР-спектрами. В 31Р – спектрах соединений (7a), (7g) и (8) наблюдаются три сигнала Pβ, Pα и Pγ в диапазоне (-22 м.д) – (-8 м.д.), характерные для трифосфатной группы.

Субстратные свойства 5-О-трифосфатов фурано- и пирроло[2,3-d] пиримидиновых нуклеозидов по отношению к ферментам НСV: NS5B и NS3. Субстратные свойства трифосфатов (7a), (7g) и (8) были изучены в нашей лаборатории по отношению к РНК-зависимой РНК-полимеразе (белок NS5B) и NTP-зависимой NTP-азе / хеликазе (белок NS3 [Locatell G.A., et al, J. Mol. Biol. 2001, 313, 683;  Borowski P., et al, Antiviral Res. 2002, 55, 397]). Реакции элонгации, катализируемые РНК-зависимой РНК-полимеразой HCV, проводили по методу [Maag D., et al, J. Biol. Chem. 2001, 276, 46094], используя в качестве праймер-матричного комплекса самокомплементарный рибоолигонуклеотид.

Было показано, что РНК-полимераза HCV не способна включать монофосфатный остаток синтезированных бициклических нуклеотидов в состав праймера. В то же время данный фермент проявлял высокую активность по отношению к контрольному 4’-азидоуридин-5’-трифосфату (Рис. 4).

  5GCAUGGGCCC3

3CCCGGGUACG5

Рис.4. Элонгация праймера в присутствии ATP (1-3), ATP и UTP (4-6), ATP и 4’N3UTP (7-9), ATP и соединение (7a) (10-12). Концентрация субстратов составляла 20 (1, 4, 7, 10), 50 (2, 5, 8, 11) и 100 мкМ (3, 6, 9, 12). Концентрации ATP в пробах 4-12 100 мкМ. М – исходный олигонуклеотид. Над гелем – структура праймера

Другим ферментом HCV, субстратами которого могут выступать рибо- и 2’-дезоксинуклеозид-5’-трифосфаты, является белок NS3, обладающий тремя видами активности – сериновой протеиназы, РНК-хеликазы и NTP-азы. Для характеристики субстратных свойств аналогов NTP трифосфаты (7a), (7g) и (8) были инкубированы с белком NS3. Было показано, что все три трифосфата являются эффективными субстратами NTP-азы, лишь немного уступая природному UTP.

Суммируя приведенные данные, можно сделать заключение, что ингибирование репликации HCV бициклическими фурано- и пирролопиримидиновыми нуклеозидами не связано с ингибированием нуклеотидзависимых ферментов HCV: белков NS5B (РНК-зависимой РНК-полимеразы) и NS3 (NTP-зависимой РНК-хеликазы).

Cинтез и биологическая активность производных N4-гидроксицитидина. В 2003 году появилось сообщение о том, что N4-гидросицитидин (NHC, 9) и его 2’-фторпроизводное проявляют высокую противовирусную активность. Гидроксицитидин подавлял репликацию вируса атипичной пневмонии SARS [Barnard D.L., et al,  Antivir. Chem. Chemother. 2004, 15, 15], а также ряда флавивирусов, к которым относятся вирусы BVDV и HCV [Stuyver L.J., et al, Antimicrob. Agents and Chemother. 2003, 47, 244]. Представлялось целесообразным провести синтез ряда новых производных NHC и проверить их действие в культурах клеток, инфицированных HCV, и различными вариантами вирусов оспы.

Схема 4.

i: BzCl, Py; ii: PivCl, Py; iii: имидазолид адамантилкарбоновой кислоты, DMF, CDI; iv: имидазолид трифенилуксусной кислоты, DMF.

Было предположено, что введение в NHC молекулу гидрофобных групп ацильного типа может улучшить проникновение полученных производных внутрь клетки.

Синтез N4-ацильных производных NHC (10-13) проводили в соответствии со схемой 5. Конденсировали NHC (9) в пиридине при 0С с небольшим избытком соответствующего ацилхлорида или имидазолида трифенилуксусной или адамантилкарбоновой кислот. Ранее было показано [Mertes M.P., et al, Chem. Commun. 1968, 33, 3304], что введение заместителей в N4-положение гетероциклического основания N4-гидрокси-6-азацитидина приводило к образованию только О-модифицированных производных. Как и предполагалось, реакционная способность гидроксила при атоме азота NHC за счет -эффекта оказалась значительно выше, чем у гидроксильных групп рибозы. Структура соединений (10 13) подтверждена УФ и 1Н-ЯМР-спектрами.

N4-Гидроксицитидин (9) и его N4-О-пивалоильное производное (11) были испытаны в нашей лаборатории как потенциальные ингибиторы репликации HCV в системе репликона. Активность (9) оказалось невысокой (ЕС50 = 18 мкМ), при этом он проявлял цитотоксичность в концентрации 100 мкМ в культуре гепатоцитов человека Huh7. N4-О-Пивалоильное производное (11) оказалось в 3 раза менее активно (ЕС50 = 50 мкМ) и в те же 3 раза менее токсично (СС50 = 320 мкМ).

Таблица 1. Антивирусная активность и цитотоксичность

производных NHC (9,10 -13) на культурах клеток Vero и МК-2.

Соединение

Клеточная культура

СС50 мкМ

VV

MPV

CPV

EC50 мкМ

IS

EC50 мкМ

IS

EC50 мкМ

IS

9

Vero

50

8,9

5,6

10,1

5

14

3,6

MK-2

77

15,1

5,1

5

15,3

13,9

5,76

10

Vero

165

4,1

40,2

7,9

20,7

19,7

8,4

MK-2

275

2,7

102

2,3

118

4,8

57,5

11

Vero

175

2,6

67

8,4

21

18

9,7

MK-2

480

4,7

103

2,6

186

6,7

77

12

Vero

31

6,7

4,7

4,6

6,7

5

6,2

MK-2

102

7,3

13,1

11,4

8,9

31,6

3,2

13

Vero

23

1,3

17,7

2,9

8,2

6,4

3,6

MK-2

47

1,4

34

4

11,7

22,5

2,1

Цидофавир

Vero

360

44,1

8,1

37,6

9,5

47,7

7,5

MK-2

360

83,5

4,3

112,2

3

298,7

1,2

VV – вирус осповакцины, MPV – вирус оспы мышей, CPV – вирус оспы коров

Известно, что вирус оспы содержит широкий набор ферментов, катализирующих процессы синтеза ДНК, РНК и белков [Knipe D.M., Fields virology, 2007, 2911]. В литературе сообщается, что рибопроизводные нуклеозидов подавляют репликацию вирусов семейства оспы [Kane M. E., Shuman S. J. Virol. 1995, 69, 6352; Baker R.O., et al, Antiviral. Res., 2003, 57, 13].

Изучение противовируснрго действия NHC (9) и его производных (10 13) было проведено в культурах Vero и МК-2, инфицированных вирусами семейства оспы. Было установлено, что NHC (9) эффективно подавлял репликацию вирусов оспы человека (ЕC50 = 1,26 мкМ). Ацильные производные NHC (10 - 13) наряду с незамещенным NHC (9) исследовали как ингибиторы репликации вирусов оспы коров, мышей и вируса осповакциниы (Табл. 1). Противовирусные свойства N4-(О-ацил)-NHC (10 - 13) оказались значительно лучше, чем у исходного NHC (9) и известного противооспенного препарата цидофавира для трех штаммов вируса семейства оспы. Синтезированные соединения оказались малотоксичными для культур клеток Vero и МК-2, их токсичность заметно ниже, чем у NHC (9), а антивирусная эффективность выше, в особенности у N4-(О-бензоил)-гидроксицитидина (10) и N4-(О-пивалоил)-гидроксицитидина (11).

 

Концентрация мкг/мл

Рис.5. Данные типичного эксперимента проверки активности соединения (10) против различных видов вируса оспы  в культуре клеток МК-2. Данные приведены для одного цикла репликации. (1) активность соединения против вируса оспы коров (CPV), (2) – оспы мышей (MPV), (3) – вируса осповакцины (VV), (4) – токсичность.

Синтез и биологическая активность пиримидиновых 4-фторнуклеозидов и 5-трифосфата 4-фторуридина. В последнее время осуществлены синтезы рибонуклеозидов, подавляющих репликацию вируса гепатита С в системе репликона in vitro, среди которых одним из наиболее эффективных оказался 4’-азидоцитидин (14), (ЕС50 = 1.28 мкМ) [Klumpp K., et al, J. Biol. Chem. 2006, 28].

В работах [Clark J. L., et al, J. Med. Chem. 2005, 48, 5504;  Meier C., et al, J. Med. Chem. 1999, 42, 1615] показано, что нуклеозиды содержащие фтор в углеводном остатке хорошо фосфорилируются клеточными киназами и могут быть субстратами ДНК- и РНК-полимераз. Последовательное фосфорилирование нуклеозидов приводит к их 5'-трифосфатам с дальнейшим встраиванием последних в 3'-конец вирусной ДНК или РНК, что приводит к ингибированию репликации вируса.

В 70-х годах 20-го века были синтезированы производные 4’-F-нуклеозидов [Owen G. R., et al, J. Org. Chem.1976, 41, 3010]. Однако противовирусные свойства полученных соединений не исследовались. Поэтому в рамках диссертационной работы был проведен синтез производных 4’-фторпиримидиновых нуклеозидов, а также 5’-O-трифосфата 4’-фторуридина для изучения взаимодействия последнего с теми же нуклеотид-зависимыми ферментами HCV, что и в первой части работы.

Синтез 4-фтор-2,3-О-изопропилиденуридина. Синтез пиримидиновых 4’-F-нуклеозидов осуществляли исходя, из 4’-фтор-2’,3’-О-изопропилиденуридина (19), полученному из 1-(5-дезокси--D-эритро-пент-4-ен-фуранозил)урацила (15) по методу описанному в работе [Owen G. R., et al, J. Org. Chem.1976, 41, 3010] (Схема 5). Ключевой стадией при синтезе 4’-фторпроизводных нуклеозидов является введение псевдогалогена JF по двойной связи 4’,5’-ненасыщенного соединения.

Схема 5

i: AgF, I2, CH2CI2, 20C, 30 мин; ii: NaN3, DMF, 105C, 17ч; iii:1) NOBF4, CH3CN, 0C, 20 мин; 2) 20C, 45 мин; 3) DEAE-целлюлоза (HCO3-), 20C, 15 ч.

Цепь превращений  (17) (18) (19) с приемлемым выходом осуществить не удалось. На стадии получения 2,5’-ангидро производного (18) выход продукта составил не более 10%, что связано, по-видимому, с лабильностью N-гликозидной связи фторпроизводного (18). Это подтверждалось присутствием до 60% урацила в реакционной смеси. Поэтому для разложения избытка нитрозонийтетрафторбората была использована водно-спиртовая смесь, содержащая DEAE-целлюлозу в (HCO3-) форме. Процесс проводили, используя избыток смолы в большом объеме водного спирта, в течение длительного времени (15 ч), что привело к неожиданному результату - гидролизу связи между 5’-углеродом и кислородом пиримидинового кольца соединения (18). В результате соединение (19) было получено без выделения промежуточного 2,5’-ангидро производного (18). Целевое вещество очищали на колонке с силикагелем. В результате выход составил 37 %, исходя из 1-(5-дезокси--D-эритро-пент-4-ен-фуранозил)урацила (15) против 19% в работе [Owen G. R., et al, J. Org. Chem.1976, 41, 3010].

Синтез 5-O-ацетилированных пиримидиновых 4-фторнуклеозидов. Как было отмечено выше, N-гликозидная связь в 4’-фтор замещенных нуклеозидах весьма лабильна, однако известно, что модификации 2’,3’- или 5’-гидроксильных групп углеводного остатка значительно повышают стабильность 4’-фторнуклеозидов. Ацетильная группа легко гидролизуется клеточными эстеразами [Yung N. C., et al, J. Am. Chem. Soc. 1961, 83, 4060], что позволяет исследовать активность соединений (24 - 26) в культуре клеток. Поэтому для изучения их биологических свойств представлялось целесообразным получить их 5’-О-ацетильные производные (Схема 6).

Для синтеза 4’-фтор-2’,3’-О-изопропилиденцитидина (21) (Схема 6) 4’-фтор-2’,3’-О-изопропилиденуридин (19) ацетилировали, используя уксусный ангидрид в пиридине. Защищенный нуклеозид (20) превращали в соответствующий триазолид, в результате аммонолиза которого получали 2’,3’-О-изопропилиденцитидин (21) [Divakar K. J., Reese C.B., J. Chem. Soc. 1982, 1, 1171]. Последний ацетилировали и удаляли изопропилиденовую группу действием муравьиной кислоты с образованием целевого 5’-O-ацетил-4’-фторцитидина (25). Взаимодействие 4’-фтор-2’,3’-О-изопропилиден-5’-О-ацетилцитидина (22) с гидроксиламином в разбавленных водных растворах с удовлетворительным выходом привело к защищенному N4-гидрокси-производному 4’-фторцитидина, из которого после деблокирования 2’,3’-цис-диольной группы НСООН и был синтезирован целевой 5’-O-ацетил-4’-фтор-N4-гидроксицитидин (26).

Схема 6.

i: Ac2O, Py, 20С, 72 ч; ii: 90% НСООН, 20С, 1.5 ч; iii: триазол, 4-ClPhOPOCl2, Py, 20С, 96 ч; iv: 34% водный NH3, диоксан, 20С, 3 ч; v: диэтилацеталь N,N-диметилформамида, DMF, 20С, 2.5 ч; vi: 1) Ас2О, Py, 20С, 18 ч; 2) н-BuOH-H2O-AcOH, 5:3:2, 20С, 5 ч; vii: водный NH2OH•HCI, NaOH до рН 5.2, 37С, 24 ч.

       Структура синтезированных соединений подтверждена УФ-, 1Н- и 13С-ЯМР-спектрами. Полученные соединения (24-26) оказались стабильными в PBS в течение

> 60 ч.

Для подтверждения -D-структуры полученных 4’-фторнуклеозидов мы опирались на величину констант J3’,F и J1’,F ЯМР 1Н спектров, равных 11.5 и 0 Гц как указано в работе [Owen G. R., et al, J. Org. Chem. 1976, 41, 3010].

Для всех полученных 4’-фторнуклеозидов константа J3’,F мало отличалась от указанного значения и являлась подтверждением как наличия фтора в молекуле, так и

-D-конфигурации (схема 7). В качестве примера приведен фрагмент спектра 4’-фтор-2’,3’-О-изопропилиденцитидина (21). Однако в случае некоторых соединений многочисленность пиков в ЯМР 1Н спектрах не позволяло достоверно выделить константы спин-спинового взаимодействия 19F – 1H.

       Рис 6.  Фрагмент 1Н-ЯМР спектра 4’-фтор-2’,3’-О-изопропилиденцитидина (21).

Иная картина наблюдалась в 13С спектрах 4’-фторнуклеозидов, интерпретация которых не представляла трудностей. Константы спин-спинового взаимодействия 19F - 13С значительно больше по величине и изменяются в определенных пределах при однотипных структурных изменениях:  JС4’,F 230.27 - 236.1 Гц;  JС5’,F’ 35.3 - 38.3 Гц;  JС3’,F’ 20.0 - 22.6 Гц. Таким образом, 13С – спектры позволили контролировать неизменность базовой фторсодержащей структуры нуклеозида в ходе синтеза, а так же выяснять влияние атома фтора на смещение электронной плотности в молекуле.

Ингибирование репликации HCV 5-О-ацетилированными 4-фторурнуклеозидами. Нуклеозиды были испытаны как потенциальные ингибиторы репликации HCV в системе репликона вируса HCV [Lohmann V., et al, Science 1999, 285, 110]. Цитотоксическое действие в культуре гепатоцитов человека Huh7, определенное по методу [Klumpp K., et al, J. Biol. Chem. 2006, 281, 3793], в исследуемом диапазоне концентраций (до 500 мкМ) не отмечено ни для одного из синтезированных 5’-ацетильных производных 4’-F-нуклеозидов (24), (25) и (26). Соединения (25) и (26) оказались неактивными в этой системе, нуклеозид (24) проявил умеренную анти-HCV-активность (ЕC50 2 мкМ), то есть в 10 раз ниже, чем у 4’-азидоцитидина (ЕC50 0,2 мкМ).

Синтез 5-О-трифосфата 4-фторуридина. Для синтеза 5’-О-трифосфата 4’-фторуридина (29) была выбрана классическая схема, заключающаяся в конденсации нуклеозида (19) с фосфо-трис-триазолидом по методу [Дяткина Н.Б. et al, Биоорган. Химия 1987, 13, 1366] и последующим удалении изопропилиденовой защиты действием 90% НСООН, что позволило получить нуклеозид-5’-монофосфат (28) (Схема 7). Соединение (28) после активации карбонилдиимидазолом вводили в реакцию с трет-бутиламмонийной солью пирофосфорной кислоты в DMF согласно работе  [Hoard D.E., Ott .G.D. J. Amer. Chem. Soc. 1965, 87, 1785].

Схема 7.

i: фосфо-трис-триазолид, CH3CN, 20С, 1 ч; ii: 90% НСООН, 20С, 1.5 ч; iii: 1) CDI, Bu3N, DMF, 20С, 40 мин; 2) (Bu3NH)2H2P2O7, DMF, 20С, 24 ч.

Таким образом, целевой 5’-О-трифосфат 4’-фторуридина (29) был получен с суммарным выходом 9.7%, считая на нуклеозид (19) (Схема 7).

Субстратные свойства 5-О-трифосфата 4-фторуридина в отношении  нуклеотид зависимых ферментов HCV. Действие трифосфата (29) исследовали в нашей лаборатории с ферментами HCV, перечисленными в первой части работы. Ингибирование реакции элонгации, катализируемое РНК-зависимой РНК-полимеразой HCV, проводили по методу [Козлов М.В., и др., Биохимия. 2009, 74, 1028], используя поли(А)/олиго(U) в качестве праймер-матричного комплекса. Трифосфат (29) оказался эффективным ингибитором фермента с величиной ЕC50 2 мкМ. Значение ЕC50, найденное для трифосфата 4’-азидоуридина (контроль) в этом эксперименте, было 0.2 мкМ, что совпадает с данными работы [Perrone P., J. Med. Chem. 2007, 50, 1840].

При исследовании действия трифосфата (29) на хеликазу/NТРазу NS3 было показано, что данное соединение является полноценным субстратом NТРазной реакции, катализируемой этим ферментом (степень гидролиза близка к таковой для АТР), и не ингибирует хеликазную активность. Это позволило исследовать его способность заменять АТР в качестве активатора (кофактора) хеликазной реакции. Мы  продемонстрировали, что трифосфат (29) действительно способен к частичной активации NS3-хеликазы, хотя и  несколько слабее, чем АТР.

 

Рис. 7. Ингибирование РНК-зависимой РНК-полимеразы 5’-О-трифосфатами (1) 4’-азидоуридина и (2) 4’-фторуридина (29).

Таким образом, противовирусная активность 5’-О-ацетил-4’-фторнуклеозидов (24 - 26) в культуре клеток может быть обусловлена их превращением в соответствующие нуклеозид трифосфаты и последующим ингибированием РНК-зависимой РНК-полимеразы HCV.

Выводы:

1. Модифицированы методы синтеза четырех типов соединений: фурано- и пирроло[2,3-d]пиримидиновых нуклеозидов; производных пиримидиновых 4’-фторнуклеозидов, а также N4-гидроксицитидина.

2. Методами химического трифосфорилирования впервые получены 5’-О-трифосфаты бициклических пиримидиновых нуклеозидов и 4’-фторуридина.

3. Среди синтезированных производных нуклеозидов выявлены ингибиторы репликации in vitro вирусов гепатита С (в системе клеточного репликона HCV) и бычьей диареи (3-(-D-рибофуранозил)-6-децил-2,3-дигидрофуро-[2,3-d]пиримидин-2-он, 5’-О-ацетил-4’-F-уридин) и оспы (N4-(О-пивалоил)-гидроксицитидин и N4-(О-бензоил)-гидроксицитидин).

4. Показано, что трифосфат 4’-фторуридина является эффективным ингибитором РНК-полимеразы вируса HCV, субстратом NTPазной и хеликазной реакций, катализируемой белком NS3 HCV (NTP-зависимой РНК-хеликазой), в то время, как трифосфаты бициклических фурано- и пирролопиримидиновых нуклеозидов не ингибируют эти ферменты.

Основное содержание работы отражено в следующих публикациях:        

  1. Ivanov M.A., Antonova E.V., Maksimov A.V., Pigusova L.K., Belanov E.F., Aleksandrova L.A. «New N4-hydroxycytidine derivatives: synthesis and antiviral activity». // Collect. Czech. Chem. Commun., 2006, v. 71, № 7, р. 1099-1106.
  1. Alexandrova L.A., Ivanov M.A., Victorova L.S., and Kukhanova M.K. «Furano- and pyrrolo[2,3-d]pyrimidine ribonucleosides and their 5’-O-triphosphates: synthesis and enzymatic activity.» // Nucleosides  Nucleotides & Nucleic Acids, 2007, v. 26, №8-9, p. 1083-1086.
  1. Голубева Н.А., Иванов А.В., Иванов М.А., Батюнина О.А., Шипицын А.В., Туницкая В.Л., Александрова Л.А. «Новые аналоги нуклеозидов и их 5’-трифосфаты: синтез и биологические свойства.» // Вестник Московского Университета, серия «Химия», 2008,  №2, с. 112-117.
  1. Иванов М.А., Иванов А.В., Красницкая И.А., Смирнова О.А., Карпенко И.Л., Беланов Е.Ф., Прасолов В.С., Туницкая В.Л., Александрова Л.А. «Новые фурано- и пирроло[2,3-d] пиримидиновые нуклеозиды и их 5’-трифосфаты: синтез и биологические свойства.» // Биоорган. Химия, 2008, т.  34, № 5, с. 661-670.
  1. Иванов М.А., Людва Г.С., Муковня А.В., Кочетков С.Н., Туницкая В.Л., Александрова Л.А. «Cинтез и биологические свойства пиримидиновых 4’-фторнуклеозидов и 5’-трифосфата 4’-фторуридина.» // Биоорган. Хим., 2010, т. 36, № 4, с. 1–9.

Тезисы

1 Ivanov M.A., Alexandrova L.A. «Furo- and pyrrolo[2,3-d]pyrimidine nucleosides and their 5’-O-triphosphates: synthesis, antiviral properties and enzymatic activity» IRT-XVII XVII International Roundtable on Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids. (Bern, Switzerland,  2006 г.)  Conference book, DCB of University.

2. Ivanov M.A., Alexandrova L.A., «Furo- and pyrrolo[2,3-d]pyrimidine nucleosides and their 5’-O-triphosphates: synthesis, antiviral properties and enzymatic activity.» Humboldt-kolleg conference: Technologies and threats of the 21st century. (Chisinau, Moldova, 2006 г.) Аbstracts book, p. 55.

3. Ivanov M.A., Tunitskaya V.L., Ivanov A.V., Krasnitskaya I.A., Alexandrova L.A. «Synthesis and biological properties of furrano- and pyrrolo[2,3-d]pyrimidine nucleosides and their 5’-O-triphosphates.» Conference for young scientist, PhD students and students on molecular biology and genetics. (Kyiv, Ukraine, 2007 г.) Аbstracts book, p.125.

5. Golubeva N.A., Ivanov A.V., Ivanov M.A., Batyunina O.A., Shipitsyn A.V., Tunitskaya V.L., Alexandrova L.A. «Novel ribonucleoside analogues and their 5’-O-triphosphates: synthesis, antiviral activity and substrate properties towards hepatitis C virus RNA-polymerase and RNA helicase/NTPase.» International conference Biocatalysis-2007. (Moscow - St.Peterburg, Russian Federation, 2007 г.) Аbstracts book, p. 79-80.

  1. Ivanov A.V., Smirnova O.A., Golubeva N.A., Ivanov M.A., Tunitskaya V.L., Shipitsyn A.V., Alexandrova L.A. «Base-modified ribonucleosides as potential anti-HCV virus agents.» Nucleic Acids Res. Symposium Series, 2008, v. 52, с. 619-620.
  1. Ivanov M.A., Alexandrova L.A. «4’-Fluoronucleoside derivatives: synthesis and biological activity.» // Наука и инновации в модернизации России и развитии мира (Ред. Т. Илларионова) 2010, с. 207-212.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты №№ 05-04-49492, 08-04-00549), Программы фундаментальных исследований Президиума РАН, "По молекулярной и клеточной биологии", МНТЦ (грант №1989).







© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.