WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

На правах рукописи

Cоломадин Илья Николаевич

Механизмы токсического действия бета-амилоидных пептидов на эритроциты и клетки мозга

03.01.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Пущино 2012

Работа выполнена в лаборатории метаболического моделирования и биоинформатики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институте теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук, г. Пущино

Научный консультант: доктор биологических наук, в.н.с.

Косенко Елена Александровна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Мошков Дмитрий Алексеевич (зав. лаб. ультраструктуры нейрона Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук, г. Пущино) доктор медицинских наук Дудченко Александр Максимович (зав. лаб. функциональной геномики и липидомики Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» Российской академии медицинских наук, Москва)

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А.

Овчинникова Российской академии наук

Защита состоится « »____________ 2012 в ____ на заседании совета Д 208.135.02 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Федеральном государственном бюджетном учреждении "Гематологический научный центр" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 125167, Москва, Новый Зыковский проезд, д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ ГНЦ Минздравсоцразвития Российской Федерации по адресу: 125167, Москва, Новый Зыковский проезд, д. 4.

Автореферат разослан «____»____________20

Ученый секретарь диссертационного совета, к.м.н. Зыбунова Елена Евгеньевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования Открытие принципов строения белков и установления их структуры помогло понять многие механизмы функционирования этих молекул в клетке. В то же время сейчас известны белки, поведение которых в растворе не укладывается в рамки существующих теорий. Вещества, являющиеся необходимыми компонентами клеток, под влиянием неизвестных факторов начинают изменять свою молекулярную структуру, образуя олигомеры, агрегаты, фибриллы, и накапливаются в клетках и межклеточном пространстве. Состояния, возникающие при этом, называются амилоидозами.

Одно из заболеваний, ассоциирующееся с накоплением амилоидных пептидов в мозге, – болезнь Альцгеймера (БА), которая настигает человека в пожилом и старческом возрасте. Множество современных данных указывает на то, что БА не является исключительно болезнью мозга, и поддерживают концепцию о том, что БА является системным заболеванием (Gibson, Huang, 2002). Действительно, амилоидные пептиды в значительных количествах накапливаются в сосудах мозга, вызывая окислительный стресс (Zhu et al., 2007), повреждение эндотелия капилляров, уменьшают скорость кровотока и снабжение мозга глюкозой и кислородом (Aliev et al., 2003). Наиболее важным фактором в оксигенации является способность эритроцитов к переносу кислорода, которая, в свою очередь, зависит от энергетического и антиоксидантного статуса эритроцитов (Brewer et al., 1974). Поскольку эритроциты находятся в постоянном контакте с амилоидными пептидами, локализованными в сосудах мозга, мы предположили, что такое взаимодействие может приводить к изменению метаболизма и антиоксидантного статуса клеток.

Другим немаловажным последствием нарушения утилизации глюкозы мозгом in vivo является чрезмерное накопление токсинов, в частности, аммиака (Otsuka et al., 1990; Norberg, Siesi, 1976; Folbergrov et al., 1974), который, согласно современной концепции, является одним из нейротоксинов, способным вызывать характерные симптомы БА и влиять на ее прогрессию (Robinson, 2000; Hoyer, 1991; Hoyer, Nitsch, Oesterreich, 1990;

Hoyer, Oesterreich, Wagner, 1988; Hoyer, 1994). В мозге аммиак детоксицируется исключительно в реакции с участием глутаминсинтетазы (ГС) (Cooper, Plum, 1987). Следует подчеркнуть, что, связывая внеклеточный глутамат с аммиаком, ГС не только участвует в обезвреживании аммиака в мозге, но и защищает нейроны от экзайтотоксичности. Важная роль, которую играет ГС в мозге, обуславливает необходимость в точных знаниях об изменении активности этого фермента в мозге пациентов с БА. Однако, из-за нестабильности ГС в аутопсических тканях в настоящее время невозможно достоверно оценить вклад этого фермента в детоксикацию аммиака и развитие экзайтотоксичности в мозге пациентов с БА. Это же относится к ферментам – антиоксидантам, которые также быстро подвергаются посмертной деградации и модификации (Jia et al., 2006; Barton et al., 1993).

Именно поэтому экспериментальные результаты, полученные разными авторами, являются во многом противоречивыми, требующими дополнительных исследований с использованием методов быстрой фиксации тканей в эксперименте. Для уточнения действия A пептидов на активность ферментов утилизации аммиака и антиокислительную систему клеток мозга, установления механизмов токсического действия на клетки-транспортеры кислорода – эритроциты была проделана представленная ниже работа.

Цель работы:

изучение механизмов токсического действия бета-амилоидных пептидов (А) на клетки человека и животных in vitro и in vivo.

Задачи исследования:

Соответственно цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучение биохимических характеристик гликолиза, пентозофосфатного пути, антиоксидантного статуса эритроцитов при их взаимодействии с бета-амилоидными пептидами in vitro:

а) Определить содержание АТФ и активность некоторых ферментов гликолиза б) Определить активность Na/K-ATФ-азы в) Определить активность каталазы, глутатионредуктазы, глутатионпероксидазы, супероксиддисмутазы г) Определить изменения в количестве восстановленной и окисленной форм глутатиона д) Определить состояние асимметрии липидов в мембранах ж) Определить морфологическое состояние и степень лизиса клеток 2. Используя метод быстрой фиксации тканей, определить активность ферментов обмена аммиака и ферментов антиокислительной защиты в разных отделах мозга крыс после однократного церебрального введения амилоидных пептидов:

а) Измерить активность антиокислительных ферментов: каталазы, глутатионредуктазы, глутатионпероксидазы, супероксиддисмутазы б) Определить активность глутаминсинтетазы Научная новизна В работе впервые раскрываются механизмы токсического действия бета–амилоидных пептидов на эритроциты. Описаны изменения в антиоксидантной системе эритроцита, в ее ферментативной части и системе глутатиона, изменения в метаболизме клеток и структуре мембраны. В экспериментах с введением бета-амилоидных пептидов в мозг изучено действие A пептидов на активность ферментов утилизации аммиака и антиокислительную систему клеток мозга.

Практическая значимость Работа посвящена фундаментальной проблеме роли амилоидных пептидов в организме и действии их на клетки. Результаты работы могут быть использованы при разработке стратегии лечения нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера.

Положения, выносимые на защиту:

1. После церебрального введения амилоидных пептидов животным происходит снижение активности ферментов антиоксидантов, что вызывает развитие окислительного стресса.

2. Уменьшается активность фермента глутаминсинтетазы и других ферментов обмена аммиака, вызывая накопление этого нейротоксина.

3. Амилоидные пептиды при инкубации с эритроцитами in vitro проявляют выраженный токсический эффект в концентрациях от 1 мкмоль/л.

4. Амилоидные пептиды при взаимодействии с эритроцитами вызывают нарушения метаболизма, ионного баланса и антиокислительной системы.

5. Нарушается асимметрия мембраны эритроцита, фосфатидилсерин накапливается на внешней поверхности мембраны, что в организме является сигналом к элиминированию клеток из кровяного русла.

Апробация работы Основные результаты работы докладывались на международных и российских конференциях:

1. Международная конференция «Свободные радикалы, антиоксиданты и старение», Астрахань, 202. Международная конференция «Нейроспецифические метаболиты и энзимологические основы деятельности ЦНС», Пенза, 203. XI,XII,XIV,XV Пущинских школах – конференциях молодых ученых «Биология – наука XXI века» Пущино, 2007,2008,2010,2011.

Публикации По теме диссертации опубликовано 18 научных работ, из них 7 в ведущих рецензируемых журналах.

Структура и объём работы Диссертация изложена на 99 страницах машинописного текста, состоит из введения, пяти глав, выводов, 27 рисунков и библиографического списка, содержащего 233 наименования на русском и иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Методы Все эксперименты были выполнены на двухгодовалых (старых) животных, самцах крыс линии Вистар, выращенных в питомнике-виварии Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН г. Пущино. Условия содержания были стандартными.

Коммерческий А растворяли в бидистиллированной воде до конечной концентрации 15 мкмоль/л и для перевода его в агрегированное состояние инкубировали при 37°С в течение 4 - 24 ч. Об образовании агрегатов судили по появлению характерного пика в спектре флуоресценции тиофлавина Т при 490 нм (LeVine, 1999).

С помощью стереотаксического аппарата производили точное погружение канюли в отдельные области головного мозга на основе координат, приведенных в атласах головного мозга крысы. Введение А осуществляла Муганцева Е. в лаборатории системной организации нейронов.

Контрольным животным вводился нетоксичный пептид с обратной последовательностью (35-25).

Декапитацию крыс проводили через 7, 14 и 30 дней после введения амилоида. В течение 7-10 сек. отбирали кровь животного, в течение 20-сек. выделяли отделы головного мозга: мозжечок, кору, стриатум, гиппокамп. Ткань мозга очищали от кровеносных сосудов и белого вещества.

Все операции проводили при +4С. Из выделенных отделов мозга получали митохондрии и цитоплазматическую фракцию (Kosenko et al., 2001).

Концентрацию белка определяли по методу Lowry (Lowry et al., 1951). Всего в экспериментах участвовало 40 животных.

Эритроциты человека получали из крови десяти здоровых доноров мужского пола, возрастом от 22 до 30 лет, отбор которой производили натощак, используя в качестве антикоагулянта 130мМ цитрата натрия. Кровь пропускали через колонку, заполненную -целлюлозой и гемикристаллинцеллюлозой. Подсчет клеток проводили в камере Горяева.

Определенное число клеток инкубировали с бета – амилоидным пептидом в средах переменного состава. После чего эритроциты осаждали и подвергали лизису в 50мМ триэтаноламиновом буфере (pH 7,4), или получали из них кислые экстракты, в которых проводили определение содержания метаболитов. В микроскопических исследованиях эритроцита использовали световой микроскоп «Carl Zeiss» при увеличении x1600 и x2400.

Определение активности ферментов проводили спектрофотометрическими и флуориметрическими методами. Активность лактатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.27) определяли по снижению поглощения НАДН (Vanderlinde, 1985). Активность каталазы (КФ 1.11.1.6) определяли в реакции с перекисью водорода по снижению величины поглощения при 2нм (Aebi, 1984). Активность супероксиддисмутазы (СОД) (КФ 1.15.1.1) измеряли по снижению скорости восстановления п-нитротетразолиевого синего в ксантин-ксантиноксидазной системе при 550 нм (25°С) (Beauchamp, Fridovich, 1971). Активность глутатионредуктазы (КФ 1.6.4.2) определяли по окислению НАДФН в присутствии глутатиона при 340 нм (37С) (Spooner, Delides, Goldberg, 1981). Активность глутатионпероксидазы (КФ 1.11.1.9) определяли по убыли НАДФН при 340 нм в сопряженной с глутатионредуктазой реакции (Lawrence, Burk, 1976). Определение активности Na+/K+-АТФ-азы (КФ 3.6.3.9) проводили по высвобождению фосфатных групп при оуабаин-чувствительном гидролизе АТФ (Baginski, Pappas, Marie, 1974). Активность глутаминсинтетазы (КФ 6.3.1.2) определяли по количеству АДФ, образуемому из АТФ (Meister, 1985) при сочетанном действии пируваткиназы и лактатдегидрогеназы. Активность аспартатаминотрансферазы (КФ 2.6.1.1) в цитоплазматической фракции определяли по снижению светопоглощения при окислении НАДН.

Активность фосфофруктокиназы (КФ 2.7.1.11) измеряли по окислению НАДН в сочетанной с лактатдегидрогеназой и пируваткиназой реакции при 340 нм и 37С. Количество глутатиона определяли по методу Anderson (Anderson, 1985). Определение инверсии фосфатидилсерина проводили по методу Boas (Boas, Forman, Beutler, 1998) с модификациями.

Для определения концентрации АТФ использовали кислые экстракты эритроцитов. Концентрацию АТФ определяли по увеличению флуоресценции при образовании НАДФН при 25°С.

Экспериментальные данные обрабатывались в пакете программ Prizm, достоверность отличий между средними определяли с использование tкритерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Влияние А25-35 на активность ферментов-антиоксидантов в разных отделах мозга старых крыс in vivo Исследования показали (рис. 1), что через 14 дней после введения А происходило достоверное снижение активности каталазы в цитоплазматических фракциях, полученных из гиппокампа и коры мозга, на 30 и 35% соответственно. Активность СОД уменьшалась на 30% только в цитоплазме мозжечка (рис.2), активность глутатионредуктазы уменьшалась в коре мозга – на 27%, и наблюдалась тенденция к уменьшению активности глутатионпероксидазы во всех изучаемых отделах мозга.

Рис. 1. Активность каталазы в цитоплазматических фракциях, полученных из коры мозга и гиппокампа крыс через 14 дней после введения А25-35.

Агрегированный 24 часа А25-35 вводили в желудочки мозга однократно в дозе 22,5 нмоль/желудочек. * - P<0,05.

Следует отметить, что мозжечок - это наименее уязвимый отдел мозга при БА и в нем не обнаруживаются ни бляшки, содержащие агрегированные А, ни нейроны c признаками нейродегенерации, ни активированная микроглия (Selkoe, 1989). Достоверное уменьшение активности СОД в мозжечке, наблюдаемое после введения А in vivo старым животным, повидимому, связано с возрастным ограничением возможности клеток противостоять прооксидантному действию А (Schubert et al., 1995), которое, проявляется в А-стимулированном образовании Н2О2 (Behl et al., 1994) и NO-радикала (Hartell, Suh, 2000), ингибирующих СОД in vivo и in vitro (Kosenko et al., 1998; Fridovich, 2006).

Рис.2 Активность СОД в цитоплазматических фракциях, полученных из коры мозга и гиппокампа старых крыс через 14 дней после введения А25-35.

Крысам возрастом около 20 месяцев однократно внутрь желудочков мозга вводили бета – амилоидный пептид в концентрации 22,5нмоль/желудочек, * - P<0,05.

Влияние А25-35 на активность СОД в митохондриях коры мозга Изменения активности СОД в митохондриях, выделенных из коры мозга старых крыс через 14 суток после однократного введения агрегированного А, показаны на рис 3. Видно, что общая активность СОД в митохондриях снижается на 38%.

В митохондриях существует 2 изоформы СОД – Mn+2-СОД, локализованная в матриксе митохондрий, и Cu+2/Zn+2-СОД, расположенная в межмембранном пространстве. В митохондриях неокортекса старых животных мы наблюдали снижение активности Mn+2-СОД на 90% по сравнению с контролем (рис.3). Эти результаты позволяют предположить, что А проникает через мембрану митохондрий и, прямо, связывая металлы, находящиеся в активном центре СОД (Curtain et al., 2001), или непрямо, посредством активных кислородных метаболитов (АКМ) (Schubert et al., 1995), тормозят митохондриальную СОД, способствуя развитию окислительного стресса в митохондриях и усилению амилоидоза сосудов мозга (Esposito et al., 2006).

Рис. 3. Активность СОД в митохондриях, полученных из коры мозга старых крыс через 14 дней после введения А25-35. Крысам возрастом около месяцев однократно внутрь желудочков мозга вводили бета – амилоидный пептид в концентрации 22,5 нмоль/желудочек,***-P<0,001.

Глутаминсинтетаза, возможный вклад в токсическое действие А С традиционной точки зрения глутаминсинтетаза (ГС) является единственным ферментом, участвующим в детоксикации аммиака в мозге (Cooper, Plum, 1987). Было обнаружено (рис. 4), что активность ГС почти в равной степени (около 20%) достоверно уменьшается во всех исследуемых отделах мозга: неокортексе, гиппокампе, мозжечке, что означает, что уровень аммония под действием А25-35 in vivo может увеличиваться в разных отделах мозга животных. Драматическое уменьшение активности фермента было также обнаружено в неокортексе (Smith et al, 1991), и в астроцитах височной коры пациентов (Robinson, 2000). Совместно с литературными данными, наши данные находятся в полном соответствии с тем фактом, что мозг пациентов с БА высвобождает в оттекающую кровь значительное количество аммиака (Hoyer, Nitsch, Oesterreich, 1990), и указывают на повреждение его детоксикации в реакции, катализируемой ГС.

Уменьшение активности ГС также приводит к повреждению функции глутамат-глутаминового цикла (ГГЦ). Оба нарушения являются фатальными для организма, так как вместе либо каждый в отдельности вызывают изменение в настроении, поведении, способствуют бессоннице, смятению, амнезии (Kircheis et al., 2002a).

Рис. 4. Активность глутаминсинтетазы в цитоплазматических пробах, полученных из коры мозга и гиппокампа и мозжечка старых крыс через дней после введения А25-35. (Условия как в рис. 3), * - P<0,05.

Поскольку все эти поведенческие нарушения характерны для пациентов с БА, они могут возникать из-за уменьшения активности ГС, приводящего к повреждению ГГЦ и детоксикации аммония (Robinson, 2000).

Конечно, нарушение обмена аммония не является причиной возникновения БА, но его значительное накопление в мозге больных может вызывать характерные симптомы БА и влиять на ее прогрессию (Robinson, 2000; Hoyer, 1991).

Токсическое действие А пептидов на эритроциты Изменение формы эритроцитов При инкубации эритроцитов с А25-35 было обнаружено, что со временем клетки собираются в отдельные агрегаты (рис.5).

Рис. 5. Фотография препарата эритроцитов, сделанная после их инкубации с А25-35. х1600. Эритроциты (15 х 107 клеток в 1 мл) инкубировали в течение 4 ч. при 25оС с А25-35 (2) (25мкМ, агрегирован 2 часа при 37С). Контролем (1) служили эритроциты, инкубированные с нетоксичным А35-25.

Изменяется также форма эритроцитов – через 4 часа инкубации все эритроциты теряют обычную дисковидную форму и у них образуются шиповидные выросты на мембране (рис.5).

В процессе инкубации часть клеток разрушалась. Лизис не наблюдался при использовании А25-35 в концентрации менее 1мкмоль/л. При увеличении концентрации А25-35 до величины 5 мкмоль/л, степень лизиса возрастала до 20%, а максимальный лизис (75%) наблюдался при увеличении концентрации А25-35 в среде инкубации до 25 мкмоль/л. (рис. 6), причем в присутствии глюкозы в среде инкубации (Рис 7) степень лизиса значительно тормозилась.

1амилоидный пептид 25- пептид 35-0 5 10 15 20 25 концентрация амилоида, мкМ Рис. 6. Лизис эритроцитов человека под действием А 25-35.

Эритроциты (15 х 107 клеток в 1 мл) инкубировали в течение 4 час при 25оС с разными концентрациями А25-35 (агрегирован 2часа при 37С) в среде, содержащей 0.9% NaCl. Контролем служили эритроциты, инкубированные с нетоксичным А35-25. После инкубации пробы центрифугировали 2 мин при 4000g и +4°С, и степень лизиса эритроцитов оценивали по поглощению свободного гемоглобина в супернатанте при 540нм.

Нарушение ионного баланса в эритроците, изменение активности Na+/K+-АТФазы степень лизиса,% Поскольку при взаимодействии с клетками амилоидные пептиды могут образовывать каналы, проницаемые для ионов (Henry, 2002), можно предполагать, что при этом активируется вход ионов натрия внутрь клеток и выход ионов К+ наружу. В этих условиях следует ожидать активацию Na+/K+-АТФ-азы, которая отвечает за регуляцию ионного градиента (Esmann, 1992).

0 30 60 90 1время, мин.

Рис.7. Зависимость степени лизиса эритроцитов человека от времени инкубации с А25-35. Эритроциты в количестве 30х107 клеток/мл инкубировали в течение разного времени при 25°С с 5мкМ А25-(агрегирован 2часа при 37С) в среде, содержащей либо не содержащей глюкозу. 1 – среда без глюкозы. 2 – среда с 5мM глюкозой. 3 – контроль, инкубация эритроцитов с 5мкМ пептид 35-25. После инкубации пробы центрифугировали 2 мин при 4000g и +4°С. Степень лизиса эритроцитов оценивали по поглощению свободного гемоглобина в супернатанте при 540нм.

Изменение активности Na+/K+-АТФазы в эритроцитах под действием А25-35 в инкубационной среде, не содержащей глюкозу, показано на рисунке 8. Видно, что при добавлении А25-35 к эритроцитам происходит постепенное увеличение активности фермента, которое достигает максимума (двукратное увеличение) к 10 минуте инкубации, но затем происходит постепенное снижение активности, и к концу инкубационного периода активность Na+/K+-АТФазы оказывается ниже, чем в начальный период инкубации (рис.8).

степень лизиса, % Можно видеть также (рис. 8), что момент начала лизиса соответствует началу активации Na+/K+-АТФазы. При удвоении активности Na+/K+АТФазы происходит замедление лизиса («плато»), затем при снижении активности лизис возобновляется и достигает максимальной степени к концу инкубации, когда активность фермента резко снижена. Эти данные дают возможность предположить, что степень А 25-35-стимулируемого лизиса может зависеть от метаболического/энергетического состояния эритроцитов, главным образом от гликолиза. Исследования, проведенные с применением ингибитора Na+/K+-АТФазы – уабаина, показали, что количество лизированных клеток при сочетанном действии А25-35 и уабаина увеличивается почти в 2,5 раза по сравнению с количеством клеток, лизирующихся в присутствии одного А25-35 (рисунок не показан).

Аналогичные результаты были получены с применением ингибитора гликолиза фтористым натрием (рис не показан).

20 активность Na+/K+ АТФазы степень лизиса 0 0 10 20 время, мин.

Рис. 8. Изменение активности Na+/K+–АТФазы в мембранах эритроцитов человека после инкубации с А25-35 (5мкмоль/л, агрегирован 2часа при 37С). Среда инкубации без глюкозы, количество клеток 30х107/мл.

В свою очередь, резкое снижение активности Na+/K+-АТФазы, соответствующее максимальной степени лизиса эритроцитов (см. рис. 8) при их инкубации с А25-35, может быть связано со снижением эндогенного содержания АТФ в клетках. Действительно, инкубация с А25-35 вызывала плавное снижение концентрации АТФ в эритроцитах, и через 20 мин в активность Na /K АТФазы, мкмоль/мин.*мг + + степень лизиса,% клетках оставался почти половинный его уровень, тогда как в контроле содержание АТФ во времени не менялось (рисунок не показан).

По-видимому, цитотоксическое действие А25-35 не является тканеспецифичным. В частности, было показано, что добавление А25-35 к культуре нейронов вызывало быстрое снижение активности Na+/K+-АТФазы, которое продолжалось в течение нескольких часов и коррелировало со степенью дегенерации нейронов (Mark et al., 1995). Таким образом, данные, представленные здесь, совместно с литературными данными свидетельствуют о том, что Na+/K+-АТФ-аза может играть важную роль не только в патогенезе дегенерации нейронов, но и в повреждении периферических тканей и клеток и поддерживают гипотезу о том, что БА является системным заболеванием (Blass et al., 1985).

Метаболизм эритроцита при действии А, ферменты гликолиза и пентозофосфатного пути Как уже было сказано, анаэробный гликолиз является основным источником АТФ в эритроцитах, и один из возможных механизмов, приводящих к уменьшению его концентрации, может быть связан с изменением активности гликолитических ферментов.

Но мы обнаружили, что активность растворимых ферментов гексокиназы (ГК), пируваткиназы (ПК) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) не изменялась под действием А25-35 ни в одном из указанных временных периодах инкубации, которая проводилась в среде, не содержащей глюкозу, и в присутствии глюкозы. Однако А25-35 оказывал отчетливый ингибирующий эффект на фосфофруктокиназу (ФФК), связанную с мембраной (рис. 9). Видно, что при инкубации эритроцитов с А25-35 в среде, не содержащей глюкозу, наблюдается очень быстрое достоверное снижение активности фермента, так что к 10 минуте инкубации активность уменьшается почти в 2 раза, тогда как в среде с глюкозой активность ФФК в этот период времени не меняется.

Однако защитное действие глюкозы заканчивалось к 15 минуте инкубации и с этого времени активность ФФК остается сниженной в одинаковой степени (150%) на обеих средах инкубации. Хорошо известно, что этот фермент обратимо связан с внутренней стороны мембраны с белком полосы 3 ( Sola-Penna, 2005). Показано, что инкубация А25-35 пептидов с эритроцитами приводит к каспазо-зависимому разрушению белка полосы 3, и транспортера глюкозы (Kay, 1985) и появлению на клеточной поверхности антигенов старения (Kay, 1991). Резкое падение активности ФФК, повидимому, может быть связано с нарушением транспорта глюкозы в эритроциты из-за А25-35-опосредованного разрушения переносчика глюкозы. Ингибирование транспорта глюкозы в эритроциты приводит не только к нарушению гликолиза, но и пентозофосфатного пути (ПФП) (Goffe Le et al., 2002), поставляющего НАДФН для регенерации восстановленного глутатиона (GSH), который необходим для обезвреживания перекиси водорода в глутатионпероксидазной (ГП) реакции (Lei, 2002).

Изменение антиоксидантной системы эритроцитов при действии А Проверка сказанного выше предположения показала, что активность ГП в эритроцитах при их инкубации с А25-35 в среде, содержащей глюкозу, не меняется в течение всего периода инкубации, но достоверно снижается и достигает максимального торможения к концу инкубационного периода (31%) в среде, не содержащей глюкозу.

Рис. 9. Изменение активности фосфофруктокиназы в лизатах эритроцитов человека после инкубации с амилоидом 25-35 (5мкмоль/л, агрегирован 2часа, 37оС) среда инкубации с глюкозой и без, количество клеток 30х107/мл. 1 – среда инкубации без с глюкозой, 2 – среда инкубации без глюкозы.

Внесение в среду инкубации меркаптосукцината, ингибитора ГП, двукратно усиливает А25-35-индуцируемый лизис эритроцитов, инкубированных в среде, не содержащей глюкозу, и недостоверно усиливает лизис клеток в присутствии глюкозы (рисунок не показан). Эти результаты согласуются с установившимся в литературе мнением о роли антиоксидантной системы в разрушении перекиси водорода и сохранении целостности мембран различных клеток (Dumaswala et al., 1999).

Накопление перекиси водорода в эритроцитах особенно опасно, поскольку под ее воздействием образуется метгемоглобин, неспособный переносить кислород к тканям (Duda, 1998). Было обнаружено, что концентрация GSH в эритроцитах при их контакте с А быстро уменьшается, и через час в клетках остается около 40% от необходимого физиологического уровня (рис. 10), что приводит к резкому (в 2,3 раза за 30 минут) снижению отношения GSH/GSSG, торможению разрушения перекиси водорода, развитию окислительного стресса, повреждению и преждевременному старению клеток.

Рис. 10. Изменение количества глутатиона в лизатах эритроцитов, полученных после инкубации эритроцитов человека с А25-35. (Конечная концентрация 5 мкмоль/л, агрегирован 24 часа при 37оС), среда без глюкозы, количество клеток = 30*107/мл.

Нарушение асимметрии мембраны эритроцита при действии А.

В поврежденных или старых эритроцитах происходит нарушение асимметрии липидов в мембране, в результате чего фосфатидилсерин (ФС), обращенный вовнутрь полноценной клетки, перемещается на наружную поверхность мембраны. Используя флуоресциинизотиоцианат (ФИТЦ), конъюгированный с аннексином, способным связываться с ФС, мы показали, что через 30 мин после взаимодействия с А25-35 в общей популяции клеток появляется около 20% клеток с инвертированным ФС.

Наши данные, полученные in vitro, хорошо согласуются с данными литературы, показывающими, что для эритроцитов пациентов с БА характерно ускоренное старение (Bosman et al., 1991). Таким образом, ускорение процесса старения эритроцитов пациентов с БА может быть опосредовано нарушениями энергетического обмена и антиоксидантного статуса эритроцитов, возникающими при контакте эритроцитов с А пептидами, накопившимися в стенках кровеносных сосудов.

На основании полученных результатов была составлена схема токсического действия А – пептидов на эритроциты (Рис.11).

Первым звеном цепи повреждений является взаимодействие А с мембранами с образованием неспецифически - проницаемых пор.

Рис. 11. Схема токсического действия бета-амилоидных пептидов на эритроциты человека.

Это приводит к нарушению ионного баланса в эритроците и активации Na+/K+–АТФ-азы, приводящей к снижению количества АТФ в клетке.

Изменяется структура мембраны, по–видимому, из-за нарушения ионного баланса клетки и повреждения цитоскелета. Снижается активность мембранносвязанного фермента фосфофруктокиназы, что дополнительно приводит к снижению количества АТФ. Помимо этого, в клетке снижается количество восстановленной формы глутатиона и увеличивается содержание окисленной его формы, что приводит к окислительному повреждению эритроцитов и неспособности их противостоять окислительному стрессу.

Нарушается асимметрия мембраны эритроцита. ФС инвертирует на поверхность клеток, что является сигналом к запуску каскада гибели эритроцита.

В заключение можно сказать, что действие А–пептидов на эритроциты многофакторное, включает в себя окислительное и метаболическое повреждение, нарушение асимметрии фосфолипидов в мембране, что в конечном итоге приводит к ускоренной, преждевременной гибели клеток.

ВЫВОДЫ:

1. Бета – амилоидные пептиды оказывают неспецифическое повреждающее действие на ткани и клетки животных и человека, приводящее к их гибели.

2. После церебрального введения животным бета-амилоидных пептидов снижается активность ферментов-антиоксидантов, что приводит к развитию окислительного стресса.

3. После церебрального введения животным бета-амилоидных пептидов уменьшается активность глутаминсинтетазы, что приводит к увеличению концентрации нейротоксина - аммиака.

4. При контакте с эритроцитами человека и животных бетаамилоидные пептиды вызывают нарушение энергетического обмена и способствуют развитию окислительного стресса, тем самым стимулируют процесс старения эритроцитов и гибель клеток.

5. При действии бета-амилоидных пептидов на эритроциты происходит нарушение асимметрии фосфолипидов в мембране, характеризующееся инверсией фосфатидилсерина на внешнюю поверхность мембраны эритроцита.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ 1. Кaминский Ю.Г., Венедиктова Н.И., Маров Н.В., Соломадин И.Н., Kосенко Е.А. Влияние бета-амилоидных пептидов на активность ферментов обмена перекиси водорода в мозге крысы. Нейрохимия, 2007, 24(1), 30-2. Kosenko E., Kaminsky Y., Solomadin I., Marov N., Venediktova N., Felipo V., Montoliu C. Acute ammonia neurotoxicity in vivo involves increase in cytoplasmic protein P53 without alterations in other markers of apoptosis. J.

Neurochem. Res. 2007, 85(11), 2491-243. Venediktova N.I., Kosenko E.A., Marov N.V., Solomadin I.N., Kaminsky Y.G. Lack of alterations in brain markers of apoptosis but increase in p53 in acute ammonia neurotoxicity. J. Biol. Chem. Phys. 2007, 7, 87-4. Каминский Ю.Г., Венедиктова Н.И., Соломадин И.Н., Маров Н.В., Косенко Е.А. Протеолитические ферменты в митохондриях, ядрах, лизосомах и цитозоле неокортекса, мозжечка и гиппокампа после введения бета-амилоида крысам. Биол. Мембраны 2007 24, №5, 413-423.

5. Соломадин И.Н., Косенко Е.А., Каминский Ю.Г. Токсические эффекты бета амилоидного пептида25-35 и фуллерена С60 на эритроциты.

Известия РАН,серия биологическая 2008, N. 4, 507–512.

6. Е. А. Косенко, И. Н. Соломадин, Н. В. Маров, Н. И. Венедиктова, А. С. Погосян, Ю. Г. Каминский Роль гликолиза и антиокислительных ферментов в токсическом действии -амилоидного пептида А25–35 на эритроциты. Биоорг.химия 2008, 34 (5): 654-67. Е. А. Косенко, И. Н. Соломадин, Ю. Г. Каминский Влияние амилоидного пептида А25–35 и фуллерена С60 на активность ферментов в эритроцитах. Биоорг.химия 2009, 35 (2): 172-18. Косенко Е.А., Соломадин И.Н., Маров Н.В., Каминский Ю.Г.

Новое об аммиаке. Поли(АДФ-рибозо)полимераза и НАД-синтетаза в клеточных ядрах мозга при гипераммониемии. Науч. форум «Мир людей с ограниченными возможностями». Москва, 16-18 октября 2006 г. М., 2006, с.

9. Соломадин И.Н., Маров Н.В., Косенко Е.А., Каминский Ю.Г.

Болезнь Альцгеймера. Протеолитические ферменты в клетках мозга и крови.

Науч. форум «Мир людей с ограниченными возможностями». Москва, 16-октября 2006 г. М., 2006, с. 10. Соломадин И.Н., Маров Н.В., Косенко Е.А., Венедиктова Н.И., Каминский Ю.Г. Ферменты обмена перекиси водорода в мозге крысы при действии бета-амилоидных пептидов. Матер. межд. конф. «Свободные радикалы, антиоксиданты и старение». Астрахань, 1-3 ноября 2006 г.

Астрахань, 2006, с. 110-114.

11. Косенко Е.А., Соломадин И.Н., Маров Н.В., Венедиктова Н.И., Погосян А.С., Подольский И.Я., Муганцева Е.А., Каминский Ю.Г.

Фрагментация ДНК и факторы апоптоза в мозге крыс после введения бетаамилоида и в клетках крови от пациентов с болезнью Альцгеймера. Конф.

«Нейроспецифические метаболиты и энзимологические основы деятельности ЦНС». Пенза, 25-27 сентября 2006 г. Пенза, 2006, с. 74-12. Соломадин И.Н., Маров Н.В., Венедиктова Н.И., Каминский Ю.Г.

Окислительный обмен в эритроцитах человека и крысы при старении, болезни Альцгеймера и других нейродегенеративных заболеваниях. Х Всерос. Мед.-биол. конф. «Фундаментальная и клиническая медицина». С.Петерберг, 2007, с. 422-423.

13. Каминский Ю.Г., Косенко Е.А., Погосян А.С., Венедиктова Н.И., Соломадин И.Н., Маров Н.В., Мальцев А.В. Энергетический и окислительный обмен в эритроцитах человека при старении, болезни Альцгеймера и других нейродегенеративных заболеваниях. Альманах «Геронтология и гериатрия» 2007, 7, 84-14. Каминский Ю.Г., Венедиктова Н.И., Соломадин И.Н., Маров Н.В., Косенко Е.А. Про-окислительные, антиокислительные и протеолитические ферменты в митохондриях, ядрах, лизосомах и цитозоле отделов мозга крыс при введении бета-амилоидов in vivo. ХХ съезд Физиологического общества им. И.П.Павлова, Москва, 4-8 июня 2007 г. М., 2007, № 0415. Соломадин И.Н., Венедиктова Н.И., Маров Н.В., Каминский Ю.Г., Косенко Е.А. Эритротоксичность бета-амилоида 25-35. XI межд.

Пущинская школа-конф. молодых ученых «Биология XXI века». 29 октября – 2 ноября 2007 г, Пущино. Тез. докл. Пущино, 2007, с. 16. Соломадин И.Н., Маров Н.В., Венедиктова Н.И., Косенко Е.А., Каминский Ю.Г. Действие бета-амилоида 25-35 на ферменты в эритроцитах.

XI межд. Пущинская школа-конф. молодых ученых «Биология XXI века». октября – 2 ноября 2007 г, Пущино. Тез. докл. Пущино, 2007, с. 117. Соломадин И.Н., Маров Н.В., Венедиктова Н.В., Косенко Е.А., Каминский Ю.Г Пути гибели эритроцитов при действии бета-амилоидного пептида. XII межд. Пущинская школа-конф. молодых ученых «Биология XXI века». 10-14 ноября 2008г, Пущино. Тез. докл. Пущино, 2008, с. 105.

18. Соломадин И.Н., Тихонова Л.А., Косенко Е.А. Механизмы цитотоксического действия бета-амилоидных пептидов. XV Пущинская школа-конф. молодых ученых «Биология XXI века». 18-21 апреля г, Пущино.

Тез. докл. Пущино, 2011, с. 192.




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.