WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


На правах рукописи

СТЕЛЬМАШУК ЕЛЕНА ВИКТОРОВНА

МЕХАНИЗМЫ ПОВРЕЖДЕНИЯ И ЗАЩИТА НЕЙРОНОВ ГОЛОВНОГО МОЗГА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ МОДЕЛИРОВАНИИ ИШЕМИИ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении "Научный центр неврологии" Российской академии медицинских наук

Научный консультант:

доктор биологических наук Хаспеков Леонид Георгиевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Александрова Мария Анатольевна (лаб. экспериментальной нейробиологии ФГБУН Институт биологии разватия им. Н.К. Кольцова РАН, зав. лабораторией) доктор биологических наук, профессор Савельев Сергей Вячеславович (отдел эмбриологии ФГБУ "Научно-исследовательский институт морфологии человека" РАМН, зав. отделом) доктор биологических наук, профессор Поляков Владимир Юрьевич (отдел электронной микроскопии НИИ физико-химической биологии им. А.Н.

Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, зав. отделом)

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии Российской академии наук

Защита состоится "__" _________ 2012 г. в __ ч. на заседании диссертационного совета (Д 001.004.01) Федерального государственного бюджетного учреждения "Научно-исследовательский институт морфологии человека" Российской академии медицинских наук.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ "Научноисследовательский институт морфологии человека" РАМН по адресу: 117418, г.

Москва, ул. Цюрупы, д. 3.

Автореферат разослан "__" ________________ 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук Л.П. Михайлова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность темы Рост распространенности сосудистых заболеваний привел к увеличению частоты нарушений мозгового кровообращения, являющихся причиной смертности и инвалидизации трудоспособного населения (Суслина, Пирадов, 2008). Один из путей решения проблемы снижения повреждений и смертности от инсультов - изучение механизмов ишемии с помощью моделирования ее повреждающих факторов на животных и культивированных нейронах.

При нарушении кровоснабжения головного мозга возникает одновременный дефицит глюкозы и кислорода. Истощение запасов глюкозы ведет к снижению скорости гликолиза и, как следствие, к уменьшению поступления пирувата в цикл трикарбоновых кислот, протекающий в митохондриях, и к снижению генерации ими ATP. В результате кислородного голодания митохондрии клеток мозга в процессе окислительного фосфорилирования не могут эффективно использовать имеющиеся запасы энергетических субстратов, что ведет к накоплению лактата и развитию ацидоза (Katsura, et al., 1992), который является одним из факторов, повреждающих нейроны (Yermolaieva et al., 2004; Xiang et al., 2004; Xiong et al., 2004). Однако полной ясности в вопросе о характере влияния ацидоза на развитие гибели нейронов при ишемии пока нет.

В многочисленных исследованиях показано, что одним из важных патогенетических факторов повреждения нейронов при энергетическом дефиците является гиперстимуляция глутаматных рецепторов, связанная с внеклеточным накоплением глутамата, происходящим в результате нарушения энергозависимого обратного захвата глутамата нервными и глиальными клетками, а также активации митохондриальной глутаминазы (Huang and Hertz, 1994; Lipton, 1999; Guo et al., 2009). Гиперактивированные глутаматные рецепторы длительно удерживают в открытом состоянии управляемые ими ионные каналы, через которые в нейрон начинают избыточно поступать ионы Na+ и Са2+ и выходить в межклеточное пространство ионы К+. Деполяризация мембраны приводит к открытию потенциал-зависимых Са2+-каналов. Именно повышение внутриклеточной концентрации Са2+ запускает сложный каскад процессов, повреждающих нейроны при ряде патологических состояний головного мозга (Matute, 2010) и, в частности, в результате цитотоксического действия возбуждающих аминокислот (Choi, 1985). Избыток Са2+ накапливается в митохондриях, нарушая их нормальное функционирование (Isaev et al., 1994;

Dirnagl et al., 1999; Kunz et al., 2010). Деструктивный эффект при нарушении ионного баланса в клетках и межклеточной среде в периоды кислородоглюкозного дефицита и реперфузии усугубляется тем, что во время ишемии и в постишемический период снижается активность Na+/K+-ATPазы – важнейшей системы поддержания в клетках ионного гомеостаза (Kaur and Arora, 1994;

Mrsi-Pelci et al., 2004). Исходя из этого, мы предположили возможность индукции толерантности нейронов к составляющим ишемического повреждения - апоптотическому стимулу и окислительному стрессу - транзиторным ингибированием Na+/K+-ATPазы.

Как глюкозная, так и кислородо-глюкозная депривация сопровождаются снижением активности антиоксидантных систем (Homi et al., 2002; Singh et al., 2004; Jung et al., 2009), что в период реперфузии приводит к повышению образования свободных радикалов (Dirnagl et al., 1995; McGowan et al., 2006;

Hernndez-Fonseca et al., 2008) и развитию окислительного стресса, который является важным патогенетическим фактором, усиливающим ишемическое повреждение нейронов. Известно, что митохондриальная цепь транспорта электронов является основным источником активных форм кислорода (АФК), которые даже в условиях нормального метаболизма генерируются митохондриями, а при кальциевой перегрузке, вызываемой ишемией и гипогликемией, их образование может значительно возрастать в результате снижения активности митохондриальных антиоксидантов (Homi et al., 2002, Singh et al., 2004; Jung et al., 2009). Поэтому исследование роли митохондрий в развитии окислительного стресса и защите от него в периоды кислородного и глюкозного дефицита, а также при реперфузии является особо актуальным.

Особое внимание необходимо уделить поиску и тестированию антиоксидантов, направленных в митохондрии для удаления избытка свободных радикалов.

Важным направлением в исследовании ишемического и гипогликемического повреждения нейронов является изучение возможности использования нейронами отличных от глюкозы энергетических субстратов и в первую очередь глутамина, так как его концентрация, по сравнению с другими аминокислотами, в головном мозге довольно высока (Ашмарин с соавт. 1999), и он способен утилизироваться митохондриями (Peng et al., 2007). В настоящее время значение альтернативных глюкозе и пирувату энергетических субстратов в поддержании ионного баланса нейронов в патологических условиях мало изучено, а сохранение функциональной активности (мембранного потенциала) митохондрий с помощью глутамина до наших исследований прямо показано не было. Этот пробел был в значительной степени восполнен данной диссертационной работой. Таким образом, выяснение значения митохондрий, кальциевой перегрузки нейронов при патологических состояниях головного мозга, их взаимосвязи и взаимозависимости является актуальным направлением исследования и требует использования различных экспериментальных моделей.

Это позволит выделить ключевые звенья в механизмах повреждения нейронов и прогнозировать возможности фармакологической коррекции ишемических нейродеструктивных процессов.

Наряду с исследованием патогенетических процессов во взрослом организме, связанных с энергетическим дефицитом, для развивающегося мозга существует такая проблема, как пренатальная гипоксия. Нейроны развивающегося мозга значительно отличаются от зрелых нейронов отсутствием или низкой экспрессией рецепторов к возбуждающим медиаторам, а также незрелостью систем антиоксидантной защиты и поддержания ионного гомеостаза. Механизмы развития повреждений в зрелых и незрелых нейронах также могут существенно различаться. Так, при гипоксии/ишемии мозга новорожденных крыс апоптотическая гибель нейронов происходит в значительной степени с участием апоптоз-индуцирующего фактора, тогда как у взрослых животных апоптоз развивается по пути, связанному с активацией каспаз (Zhu et al., 2003). Однако знания о чувствительности нейронов различной нейрохимической зрелости к повреждающим факторам ишемии были отрывочны и фрагментарны, что требовало дальнейшего исследования.

Особый интерес представляет вопрос сопоставления морфологических и функциональных изменений митохондрий, а также их обратимости при энергетическом голодании.

Исходя из многоплановости повреждения нейронов при ишемии, ясно, что нельзя создать универсальный нейропротектор, поэтому поиск новых веществ с нейропротекторной активностью, которая реализуется в основных звеньях каскада повреждения нейронов (окислительный стресс, глутаматная токсичность, повреждение митохондрий), особо актуален. В работе исследовалось нескольких потенциальных нейропротекторов с сопоставлением их влияния на выживаемость нейронов при моделировании повреждающих факторов ишемии in vitro и in vivo.

Целью исследования явилось изучение внутриклеточных механизмов ишемических нейродеструктивных процессов, выяснение роли митохондрий, ионов кальция и цинка, глутамина, снижения активности Na+/K+-АТРазы и проверка возможности эффективной защиты нейронов с помощью белковопептидных комплексов и матохондриально-адресованных антиоксидантов.

Задачи исследования 1. Изучить и сопоставить морфологические ультраструктурные изменения митохондрий с их функциональным состоянием в культивированных зернистых нейронах мозжечка крыс при глюкозной депривации.

2. Выявить зависимость выживаемости зернистых нейронов мозжечка при действии глутамата, глюкозной депривации, окислительного стресса и ацидоза от сроков культивирования.

3. Исследовать роль митохондрий в изменении концентрации свободного внутриклеточного кальция при глюкозной депривации.

4. Выявить в культивированных нейронах механизм инициации окислительного стресса, вызванного паракватом (ингибиторный анализ).

5. Выяснить механизм гибели зернистых нейронов при закислении среды культивирования (ацидозе) путем сопоставления изменения уровня внутриклеточного кальция, цинка, функциональной активности митохондрий и экспрессии кислоточувствительных каналов, проницаемых для ионов Са2+.

6. Исследовать роль глутамина в гибели нейронов, вызванной глюкозной депривацией, ацидозом, окислительным стрессом, а также митохондриальными ингибиторами (химическая гипоксия).

7. Изучить влияние умеренной транзиторной блокады Na+/K+-ATPазы на выживаемость нейронов при действии окислительного стресса и индуктора апоптоза стауроспорина.

8. Исследовать внутриклеточную локализацию нового класса антиоксидантов и влияние предполагаемых нейропротекторов на выживаемость нейронов при действии повреждающих факторов ишемии in vitro (окислительный стресс и глутаматная токсичность) и на объем зоны повреждения при моделировании ишемии in vivo (фотоиндуцированный тромбоз или компрессионная ишемия).

Научная новизна исследования. Изучены внутриклеточные механизмы, ведущие к гибели нейронов при ишемии, на основе моделирования в глионейрональных культурах ее повреждающих факторов: цитотоксичности глутамата, ацидоза, окислительного стресса, глюкозной депривации, выявлении роли митохондрий, глутамина, ионов кальция и цинка и сопоставлении полученных данных in vitro и in vivo.

В результате работы получены новые фундаментальные данные, раскрывающие механизмы ишемических нейродеструктивных процессов и свидетельствующие об их тесной взаимосвязи с дисфункцией митохондрий и нарушением ионного баланса нейронов.

Впервые установлено, что глутамат и глюкозная депривация культивированных зернистых нейронов мозжечка ведут к кальцийзависимому падению мембранного потенциала митохондрий этих клеток, которое при часовой глюкозной депривации было обратимым.

При сопоставлении функциональной активности и ультраструктуры митохондрий нейронов впервые выявлено, что часовая глюкозная депривация ведет к снижению мембранного потенциала у всей популяции митохондрий, однако их морфология варьирует от полностью интактных до органелл с конденсированным матриксом или с локальными набуханиями и потерей крист.

Впервые показано, что кальциевая перегрузка и снижение мембранного потенциала митохондрий при глюкозной депривации более выражено в зрелых зернистых нейронах, культивированных 7 суток.

Обнаружено, что ингибирование митохондриальных функций (белковых комплексов цепи переноса электронов или АТРсинтазы, разобщение дыхания и фосфорилирования) в период глюкозной депривации увеличивает кальциевую перегрузку цитоплазмы, но снижает уровень АФК культивированных нейронов.

Выявлено, что в условиях глюкозной депривации глутамин поддерживает мембранный потенциал митохондрий нейронов и препятствует клеточной гибели, но потенцирует ее, если причиной повреждения нейронов является нарушение функционирования митохондрий.

Открыт новый механизм гибели нейронов при закислении среды культивирования. Незрелые зернистые нейроны мозжечка in vitro характеризуются низким уровнем экспрессии кислоточувствительных каналов (ASIC 1a), поэтому внеклеточный ацидоз сопровождается не повышением уровня внутриклеточного кальция в этих клетках, а его снижением.

Токсическое действие ацидоза на такие культуры обусловлено повышением в цитоплазме нейронов уровня свободного цинка, что вызывает ингибирование первого комплекса дыхательной цепи митохондрий и развитие окислительного стресса.

Впервые показано, что шунтирование первого комплекса цепи переноса электронов митохондрий менадионом при действии параквата оказывает нейропротекторный эффект.

Фармакологическое прекондиционирование (умеренная транзиторная блокада Na+/K+-ATPазы) препятствует гибели нейронов, вызванной окислительным стрессом и индуктором апоптоза стауроспорином;

Белковый комплекс целлекс, аналог фактора роста нервов ГК-2 и новый класс митохондриально-адресованных антиоксиданов SkQ проявляют выраженные нейропротекторные свойства при моделировании ишемии in vitro и in vivo, повышая выживаемость культур и уменьшая объем зоны повреждения головного мозга.

Научно-практическое значение работы Представленные данные оригинальны и приоритетны, они расширяют представления фундаментальной нейробиологии как о внутриклеточных механизмах ишемического повреждения мозга, так и возможностях повышения ишемической толерантности ЦНС. В ходе работы обнаружен новый механизм развития гибели незрелых нейронов, вызванной внеклеточным ацидозом, показана возможность обратимости процесса деэнергизации митохондрий при глюкозной депривации. Полученные в работе экспериментальные данные и теоретические выводы могут быть использованы в курсах лекций по клеточной биологии, цитологии, патофизиологии при обучении студентов биологических и медицинских специальностей.

Показанная эффективная коррекция ишемических повреждений белковым комплексом целлекс, пептидным аналогом фактора роста нервов ГК-2, митохондриально-аднесованными антиоксидантами семейства SkQ является экспериментальным обоснованием возможности практического применения исследованных нейропротекторов.

Основные положения, выносимые на защиту 1. Выживаемость зернистых нейронов при моделировании повреждающих факторов ишемии in vitro зависит от сроков культивирования: при глюкозной депривации и токсическом действии, опосредованном гиперактивацией глутаматных рецепторов, гибнет больший процент зрелых клеток-зерен, а при окислительном стрессе и ацидозе — незрелых.

2. При глюкозной депривации в культивированных зернистых нейронах мозжечка происходит увеличение внутриклеточной концентрации ионов кальция и падение мембранного потенциала митохондрий, которое не всегда сопровождается необратимым изменением их ультраструктуры. Деэнергизация большинства митохондрий является обратимой при короткой (1 ч) глюкозной депривации. Ингибирование комплексов цепи переноса электронов митохондрий в период глюкозной депривации увеличивает кальциевую перегрузку цитоплазмы нейронов. Глутамин в условиях глюкозной депривации поддерживает мембранный потенциал митохондрий нейронов и препятствует их гибели, но потенцирует ее при нарушении функционирования митохондрий.

3. Нейроцитотоксическое действие ацидоза и параквата на культивированные зернистые нейроны мозжечка происходит с нарушением функционирования комплекса 1 цепи переноса электронов митохондрий, которое может корректироваться шунтированием этого комплекса менадионом.

Гибель зернистых нейронов мозжечка при ацидозе происходит в результате повышения уровня цитоплазматического цинка.

4. Повысить выживаемость нейронов можно путем применения нейропротекторов - аналогов факторов роста или митохондриальноадресованными антиоксидантами, которые действуют на такие повреждающие факторы ишемии, как глутаматная токсичность или окислительный стресс.

Апробация диссертационного материала Основные положения диссертации были представлены на 2м съезде биохимического общества РАН (Пущино, 1997), 3й международной конференции «Колосовские чтения 97» (Санкт-Петербург, 1997), 33м международном конгрессе физиологических наук (Санкт-Петербург, 1997), Международной конференции «Функциональная нейроморфология.

Фундаментальные и прикладные исследования» (Минск, 2001), 2й – 6й Всероссийских конференциях с международным участием «Гипоксия:

механизмы, адаптация коррекция» (Москва, 1997, 2002, 2005, 2008, 2011), на 2м и 3м конгрессах по патофизиологии (Москва, 2000, 2004), Конференции «Пластичность и структурно-функциональная взаимосвязь коры и подкорковых образований мозга» (Москва, 2003), Конференции по проблеме «Механизмы синаптической передачи» (Москва, 2004), Международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 2005), Всероссийских научных конференциях с международным участием НИИ мозга и НЦН РАМН по проблеме «Структурно-функциональные и нейрохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга» (Москва, 1999, 2000, 2005, 2006, 2007, 2008, 2010), 5й Международной конференции по функциональной нейроморфологии «Колосовские чтения – 2006» (Санкт-Петербург, 2006), ХХ и ХХI съездах физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007;

Калуга, 2010), Научном конгрессе «Бехтерев – основоположник нейронаук:

творческое наследие, история и современность» (Казань, 2007), Конференции с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (Санкт-Петербург, 2008), 2м международном форуме по нанотехнологиям, научно-техническая секция "Нанотехнологии в медицине: иммунологичекие препараты и адресная доставка лекарств" (Москва, 2009), VI и VII Международных междисциплинарных конгрессах «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 2010, 2011), X конгрессе международной ассоциации морфологов (Ярославль, 2010), межлабораторной конференции отдела исследований мозга НЦН РАМН (2009, 2011), научной конференции НЦН РАМН (2010), семинаре кафедры клеточной биологии и гистологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова (2012).

Внедрение в практику Результаты исследования используются в учебном процессе при чтении лекций на кафедре клеточной биологии и гистологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, научно-исследовательской работе и при обучении студентов и аспирантов в лаборатории структуры и функции митохондрий НИИ Физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, внедрены в практику исследований лаборатории ишемических повреждений мозга ФГБУ «НИИ общей патологии и патофизиологии» РАМН.

Конкретное личное участие автора в получении результатов Автору принадлежит определяющая роль в выработке цели исследования, постановке задач и обосновании путей их достижения, проведен анализ 5источников литературы. Основная часть экспериментов, анализ и статистическая обработка результатов и формулировка на их основе выводов о механизмах повреждения нейронов выполнены лично автором.

По теме диссертации опубликовано 73 работы, в том числе 27 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ (15 в отечественных и 12 в зарубежных).

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 280 страницах, построена по традиционному плану и состоит из 7 глав: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования, обсуждение, выводы и список литературы, включающий 535 источников. Работа иллюстрирована рисунками: диаграммами, фотографиями, схемами.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В работе использовали диссоциированные монослойные культуры (3-4 и 7-8 суток in vitro, DIV) клеток мозжечка 7-8-суточных крыс Вистар, полученных методом ферментно-механической диссоциации (Викторов с соавт., 1990, Лозиер с соавт., 2012). Конечная плотность клеток на субстрате 3-5 х103 клеток на мм2. На 2е сутки культивирования концентрацию К+ в среде повышали до мМ, что оказывает трофическое действие на культивированные зернистые нейроны (КЗН) (Favaron et al., 1993). Для сравнения использовались диссоциированные культуры гиппокампа и новой коры (10-12 DIV) 17-18суточных крысиных эмбрионов, выращенные в тех же условиях в бессывороточной нейробазальной среде с добавкой В-27 (Brewer, 1995).

Прижизненное наблюдение проводили с помощью инвертированного микроскопа (“Olympus”, Япония) и высокочувствительной цифровой камеры CC12. Воздействия веществ на культуры мозжечка выполнялись в сбалансированном солевом растворе, содержащем (в мМ): 154 NaCl, 25 KCl, 2,CaCl, 1 MgCl 3,6 NaHCO, 0,35 Na HPO, 5,6 глюкозы, 10 HEPES (pH 7,2-7,4).

2 2 3 2 В исследовании было использовано свыше 2500 культур.

Ишемию головного мозга in vivo моделировали на 150 самцах массой 150-200 г под хлоралгидратным наркозом с помощью фотоиндуцированного тромбоза (Watson et al., 1985) или компрессии (40 мм рт. ст., 15 мин) участка коры головного мозга тефлоновым стержнем (Rosenorn and Diemer, 1982;

Барсков и Викторов, 1994). Эксперименты на животных проводились совместно с к.м.н. Барсковым И.В. и д.б.н. Романовой Г.А. Ишемию in vitro моделировали с помощью факторов ишемического повреждения: эксайтотоксичности глутамата (Glu, 25-100 мкМ, 15 мин или 24 ч) и NMDA (50 мкМ, 15 мин), окислительного стресса, инициированного воздействием параквата (75-2мкМ, 24 ч), или перекиси водорода (100 и 150 мкМ, 20 мин), химической гипоксии, вызванной путем нарушения клеточного дыхания ингибиторами цепи транспорта электронов митохондрий ротеноном (0,1-5 мкM, 2 ч), 3-НПА (1 мM, 20 ч), антимицином (0,1 мкM, 90 мин) азидом натрия (1 мМ, 9 ч), глюкозной депривацией (ГД, 1-3, 24 ч, в растворе без глюкозы), закислением среды инкубации (30 мин, 3, 24 ч), индуктором апоптоза стауроспорином (100 нМ, ч) или сочетанным воздействием различных повреждающих факторов.

Культуры фиксировали 5 мин, смесью спирта, формалина и ледяной уксусной кислоты в отношении 7:2:1 (ФСУ), соответственно (Лилли, 1969), и окрашивали 2-5% трипановым синим или ванадиевым гематоксилином (Викторов, 1990). Выживаемость КЗН определяли подсчетом количества интактных и поврежденных КЗН (темноокрашенных пикнотических ядер) или МТТ-методом по интенсивности превращения тетразолиум бромида в формазан. Для определения объема очага ишемического повреждения мозг экспериментальных животных фиксировали 24 ч фиксатором ФСУ на 7е сутки после операции, резали на вибратоме NVSLM1 World Precision Instruments с шагом 100 мкм, окрашивали 0,2% раствором метиленового синего, сканировали на слайд-приставке сканера Epson perfection V100 PHOTO. Площадь ишемического повреждения измеряли с помощью программы анализа компьютерного изображения «Image J» в мм2, объем очага вычисляли по формуле цилиндра. Достоверность различий определяли по t-критерию Стьюдента или ANOVA (Bonferroni post test) и представляли в виде M±S.E.M.

Защитный эффект нейропротекторов соотносили по коэффициенту эффективности защиты (КЭЗ) по формуле: КЭЗ(%)= 100х(V -V )/V, где V - Е о о o объем очага ишемического повреждения без коррекции, V - объем очага Е ишемического повреждения с лечением.

Мембранный потенциал митохондрий ( ) определяли с помощью m окрашивания родамином 123 (Р123, 5 мкг/мл, 10 мин) или эфиром тетраметил родамина (ТМРЭ, 0,1-0,2 мкМ, 15 мин) (Johnson et al., 1981). Определение внутриклеточных концентраций Са2+ и Zn2+ проводили при помощи флуоресцентных красителей Fluo-3 (или 4) AM и FluoZin-3 АМ (5 мкМ, мин), cоответственно. Электронную микроскопию проводили по стандартной методике (Боголепов, 1976; Скибо, 1988) совместно с д.б.н. Р.Э. Узбековым.

Количественная полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (ПЦР, Quantitative real-time PCR) экспрессии мРНК ASIC1a проводилась как описано в статье Прусса с соавторами (Pruss et al., 2008) совместно с Д. Фрайер и Ф. Мергенталером.

Работа с лабораторными животными проводилась в соответствии с приказом Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977 г. Протокол исследования, выполняемого в рамках диссертационной работы, одобрен этическим комитетом ФГБУ «Научный центр неврологии» РАМН (протокол № 05/10 от 05.05.10).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Диссоциированные культуры зернистых нейронов мозжечка как объект исследования механизмов ишемического повреждения нейронов Нейронная популяция культур, полученных из мозжечка 7-8-суточных крыс, располагается на астроцитарном подслое и состоит практически из одного типа нейронов – зернистых клеток, которые можно легко идентифицировать как на светооптическом, так и на ультраструктурном уровнях как небольшие округлые или овальные нейроны, большую часть тела которых занимает ядро, окруженное тонким ободком цитоплазмы, утолщающимся в местах отхождения отростков (рис. 1). Об этом свидетельствуют не только полученные нами данные, но и результаты работ других исследователей, показавших с помощью иммуноцитохимических методов, что нейронная популяция в таких культурах содержит до 95% зернистых нейронов (Gallo et al., 1982; McCaslin, Morgan, 1987), которые не только морфологически идентичны, но и нейрохимически гомогенны. Известно, что зернистые нейроны мозжечка являются как глутаматцептивными, так и глутаматергическими (Shepherd, 1979; Stone, 1979;





Levi et al., 1988). Было показано, что у КЗН мозжечка NMDA-рецепторы экспрессируются между 5м и 8м сутками in vitro (Frandsen Рис. 1. Ультраструктура зернистого нейрона and Schousboe, 1990).

мозжечка в культуре (7 DIV). Масштаб: А - 2 мкм, Поскольку глутамат Б — 0,2 мкм.

играет исключительно важную роль в ишемическом повреждении головного мозга, культивированные зернистые нейроны мозжечка, которые вырабатывают Glu и экспрессируют Glu рецепторы, а также морфологически и нейрохимически однородны, являются удобной и адекватной моделью для исследования клеточных и молекулярных механизмов церебральной ишемии.

Рис. 2. Токсическое действие Glu на КЗН в различные сроки культивирования. Живые культуры, светлое поле. Стрелками обозначены ядра погибших нейронов. Масштаб мкм. * - р<0,05 по сравнению с контролем без Glu, для каждого столбца, n=45.

Исследование механизмов патологических процессов, вызываемых ишемическим повреждением культивированных нейронов Механизмы цитотоксического повреждения нейронов глутаматом Степень цитотоксического эффекта Glu зависела от уровня морфохимической дифференцировки КЗН (рис. 2).

После обработки токсичеcкой дозой глутамата (100 мкМ) в течение 24х часов в среде культивирования, почти все Рис. 3. Уровень внутриклеточного кальция в зернистых нейронах в контроле (А) и при действии нейроны в зрелых культурах глутамата (100 мкМ, 15 мин, Б). Живые культуры, (7-8 DIV) погибали (выживает DIV. Масштаб 15 мкм. Уровень флуоресценции Fluo 3 в только 6,0±0,8% КЗН), в зрелых (7-8 DIV, В) или незрелых (3-4 DIV, Г) КЗН. *- р<0,01, n =90. незрелых культурах (3-4 DIV) КЗН практически не повреждались (выживаемость 96±3%), даже при 1 мМ Glu 24 ч выживало 90±3%.

Концентрация внутриклеточного кальция ([Ca2+] ), измеренная с i использованием флуоресцентного зонда Fluo-3, повышается при действии в течение 60 мин 100 мкМ Glu, как в молодых, так и зрелых КЗН (рис. 3). Однако относительное повышение [Ca2+] в зрелых нейронах было i почти в 2 раза выше, чем в незрелых (на 121+15 и 62+6%, соответственно). В соответствии с этим для сравнительного исследования Рис. 4. Живые зернистые нейроны, 8 DIV. А и В - нейроцитотоксичности нами контроль, Б и Г после действия глутамата (100 мкМ, 15 мин), А и Б - свечение Р123 в митохондриях были выбраны эти сроки зернистых нейронов, митохондрии без потенциала на использования зрелых и мембране указаны стрелками. В и Г - фазовый незрелых КЗН.

контраст тех же клеток, соответственно. Масштаб 10 мкм.

Зрелые КЗН мозжечка быстро реагируют на кратковременное, воздействие токсических доз Glu. В норме митохондрии КЗН активно накапливают Р123. Однако 15-минутное воздействие 100 мкМ Glu в 7-8-суточных культурах ослабляет накопление родамина митохондриями и инициирует отек цитоплазмы нейронов, видимый в фазовом контрасте (рис. 4). Блокада канала, управляемого NMDA подтипом Glu рецепторов, селективным Рис. 5. Ультраструктурные изменения зернистого неконкурентным нейрона мозжечка (7 DIV) при действии глутамата антагонистом МК-801 ((50 мкМ, 15 мин). Видны конденсированные мкМ) полностью митохондрии (указаны треугольниками), предотвращала падение m митохондрии с отеком (стрелки), набухшие и цитоплазматический отек цистерны ЭПР и аппарата Гольджи (стрелки с чертой сверху). Масштаб А - 0,4 мкм, Б, В -0,2 мкм. КЗН, вызываемые Glu. С другой стороны, ингибирование транспорта избытка Ca2+ в митохондрии рутениевым красным (100 мкМ, 1 ч) сохраняло способность митохондрий активно накапливать Р1при последующем действии Glu, т.е. препятствовало падению , значения m которого были сравнимы с его значениями в митохондриях контрольных (не подвергнутых действию Glu) культур.

После кратковременной токсической обработки Glu происходили не только функциональные (падение ), но и значительные ультраструктурные m нарушения митохондрий КЗН (рис. 5). В таких нейронах наблюдались митохондрии как с конденсированным матриксом, так и набухшие, со сниженной электронной плотностью, в которых большая часть крист была разрушена. Подобное набухание митохондрий, при котором сохраняется часть крист и мембран, или интенсивное набухание, заканчивающееся превращением органелл в вакуоли с электронно-прозрачным матриксом, отмечалась Боголеповым (1979) при исследовании гипоксических повреждений ткани мозга. Возможно, вначале происходит конденсация митохондрий, а затем наступает стадия их набухания и разрушения крист. Подобная динамика наблюдается при воздействии ингибиторов дыхательной цепи митохондрий (Полякова, 1991). Однако, возможно, что наличие в клетках конденсированных и набухших митохондрий может указывать на гетерогенность повреждения их популяции.

Таким образом, используя модель эксайтотоксического повреждения КЗН, мы показали, что при перегрузке цитоплазмы нейронов ионами кальция, вызванной гиперактивацией Glu рецепторов, избыток [Ca2+] i электрогенно транспортируется в митохондрии, вызывая снижение , m которое сопровождается повреждением их ультраструктуры. Токсическое действие глутамата на КЗН, развивающиеся в культуре 3-4 суток, гораздо менее выражено, чем на нейроны, развивающиеся в культуре более 7 суток.

Механизмы повреждения Рис. 6. Динамика изменения [Ca2+] i нейронов при глюкозной (флуоресценция Fluo-3, А) и , m депривации (флуоресценция ТМРЭ, Б) в КЗН (7 DIV) при ГД. Изменения флуоресценции Fluo-3 и ТМРЭ были вычислены как: (F-F )/F x100%, где F o o o- Глюкозная депривация (1 ч) в флуоресценция красителя в культурах клеток, присутствии блокаторов ионотропных инкубированных в растворе с глюкозой, а F – в отсутствие глюкозы. * р<0,01. По оси абсцисс глутаматных рецепторов (MK-801, – продолжительность ГД.

мкМ и NBQX, 10 мкМ), добавленных для исключения возможного действия эндогенного Glu, вызывала постепенное повышение в нейронах [Ca2+]i (рис. 6), регистрируемое с помощью флуоресцентного зонда Fluo-3. В то же время было обнаружено снижение после такой ГД (рис. 6). Кроме того, ГД вызывала m усиление флуоресценции гидроэтидина в КЗН, что свидетельствовало об интенсивной продукции АФК. Блокада ионотропных Glu рецепторов их антагонистами (MK-801 и NBQX) не препятствовала возрастанию продукции АФК, которое, следовательно, не опосредуется активацией этих рецепторов.

Известно, что митохондрии, как основные органеллы, генерирующие АФК и депонирующие ионы Са2+, транспортируемые в них за счет энергии , играют m важную роль в развитии окислительного стресса. В наших экспериментах ингибиторы комплексов дыхательной цепи I, III и IV (ротенон, антимицин A и азид натрия, соответственно), а также ингибитор ATP-синтазы олигомицин и разобщитель окислительного фосфорилирования CCCP (carbonyl cyanide chlorophenylhydrazone), добавленные в раствор, лишенный глюкозы и содержащий MK-801 и NBQX, повышали [Ca2+] и снижали продукцию АФК, i что свидетельствует об участии митохондрий в регуляции этих показателей при ГД (табл. 1). Это может быть связано с прекращением электрогенного транспорта Ca2+ в митохондрии и с выходом накопленного Ca2+ из их матрикса, а также c более быстрым снижением уровня ATP.

Добавление при ГД в солевой раствор, содержащий MK-801 и NBQX, хелатора внутриклеточного кальция BAPTA или ингибирование транспорта Ca2+ в митохондрии рутениевым красным препятствовало индуцированным ГД повышению [Ca2+] и усилению продукции АФК, что указывает на прямую i зависимость гиперпродукции АФК от перегрузки КЗН ионами Са2+.

Аналогичный эффект оказывал субстрат аэробной продукции ATP пируват (табл. 2). Пируват и рутениевый красный, добавленные в начале ГД в инкубационный раствор, содержащий MK-801 и NBQX, в значительной степени предотвращали снижение и, таким образом, препятствовали деэнергизации m митохондрий нейронов, вызываемой ГД (рис. 7).

Приведенные выше результаты свидетельствуют о том, что 1 ч ГД вызывает значительное повышение [Ca2+] при одновременном снижении . Однако i m даже через 24 часа после часовой ГД существенной гибели нейронов не происходит. Это может быть обусловлено обратимостью указанных выше изменений [Ca2+] и .

i m Рис. 7. Изменение флуоресценции ТМРЭ (m, верхняя панель) и соответствующие поля зрения в фазовом контрасте (нижняя панель) после 1 ч инкубации культур в растворе с глюкозой и без нее (ГД) в присутствии рутениевого красного (100 мкМ) и пирувата (10 мМ). Живые культуры, 7 DIV. Масштаб 20 мкм.

Таблица 1. Влияние митохондриальных ингибиторов на [Ca2+] и продукцию АФК в КЗН i при глюкозной депривации (ГД) Обработка Флуоресценция Флуоресценция продукта Fluo-3, % окисления гидроэтидина, % ГД 100+1* 100+5* Контроль (с глюкозой) 42+1 32+ГД+ротенон 2 мкМ 328+34** 54+4** ГД+антимицин А 0,054 мкг/мл 324+32** 39+3** ГД+азид натрия 5 мМ 117+4** 52+4** ГД + CCCP 10 мкМ 347+29** 51+3** ГД+ олигомицин 4 мкг/мл 155+9** 39+3** * p<0,001, по сравнению с контролем, ** p<0,001 по сравнению с ГД, n=12.

Таблица 2. Влияние BAPTA, рутениевого красного и пирувата на [Ca2+] и АФК при ГД i Обработка Флуоресценция Флуоресценция продукта Fluo-3, % окисления гидроэтидина, % Контроль 43±1 29±ГД 100±1* 100±1* ГД + BAPTA 0,05 мМ 69±2** 36±3** ГД+рутениевый красный 0,1 мМ 58±2** 34±7** ГД + пируват 10 мМ 44±3** 25±2** *p<0,001 по сравнению с контролем, ** p<0,001 по сравнению с ГД, n=12.

Повышение [Ca2+] при ГД (1 ч) в нейронах 3-4-суточных культур было i менее выраженным по сравнению с нейронами в 7-8-суточных культурах и составляло, соответственно, 151±5 и 191±5% от исходного уровня. Вызванная ГД кальциевая перегрузка как в зрелых, так и в незрелых культурах была обратимой: восстановление нормального содержания глюкозы в среде инкубации полностью возвращало [Ca2+] к исходному уровню.

i В нейронах незрелых культур после ГД (1 ч) снижался до 65±2%, а m зрелых – до 18±2% от исходного уровня. При восстановлении нормального содержания глюкозы незрелых КЗН полностью восстанавливался, тогда m как в зрелых даже после 1 ч инкубации в растворе с восстановленной нормальной концентрацией глюкозы этот показатель был на 10±2% ниже исходного уровня. Поскольку изменения и [Ca2+] были наиболее выражены m i у зрелых нейронов, для исследования ультраструктуры нейронов при ГД мы использовали 7-8-суточные культуры.

В нейронах контрольных культур, инкубированных с глюкозой в течение 2х часов, при ультраструктурном исследовании выявлялись некрупные, округлые или немного вытянутые митохондрии, содержащие митохондриальный матрикс большей, по сравнению с окружающей цитоплазмой, электронной плотности (рис. 8). Популяция митохондрий как в контроле, так и при ГД, а также в период восстановления доступа глюкозы к клеткам содержит как нормальные митохондрии, так и митохондрии с электронноплотным матриксом (рис. 8, 9). Наиболее выраженным проявлением действия ГД являлось увеличение количества митохондрий с локальным Рис. 8. Ультраструктура митохондрий культивированных зернистых нейронов после 2х часовой инкубации в сбалансированном солевом растворе, содержащем глюкозу. Клетки содержат как нормальные митохондрии (треугольник), так и митохондрии со слабо различимыми кристами (стрелка). Масштаб 0,2 мкм.

набуханием и разрушением крист. Так, нейроны контрольных культур содержали менее 5% митохондрий с локальными набуханиями, тогда как при ГД их количество увеличивалось до 12%. В остальных митохондриях после ГД кристы были видны менее отчетливо, чем в контроле. Этот период ГД соответствовал снижению и повышению [Ca2+]. В период восстановления m i доступа глюкозы к нейронам некоторые митохондрии в них оставались набухшими с локальной потерей крист, их число составляло в среднем 14% от всех исследованных митохондрий. Видимо, именно митохондрии с набуханиями и потерей крист не способны к восстановлению нормальной ультраструктуры, а снижение , вызванное ГД, в значительной мере m обратимо и не приводит к значительным ультраструктурным изменениям. Эти данные коррелируют с выживаемостью нейронов через 24 ч после часовой ГД (86% от контроля).

Таким образом, впервые было показано, что несмотря на выраженную кальциевую перегрузку нейронов и снижение при 1 ч ГД большая часть m нейронов сохраняет жизнеспособность, а ультраструктура изменяется незначительно, несколько увеличивается лишь процент митохондрий с локальным набуханием и потерей крист. Это подтверждают полученные ранее данные о том, что высокий уровень [Ca2+], возникающий непосредственно после i патологического воздействия, не обязательно является признаком последующей клеточной гибели (Dubinsky and Rothman, 1991). Возможно, что на первых этапах ГД снижение выполняет защитную функцию, предотвращая критическую m аккумуляцию Ca2+ в митохондриях, превышение которой приводит к их набуханию и деструкции, а в дальнейшем и к гибели нейронов.

Рис. 9. Ультраструктура митохондрий зернистых нейронов при ГД (1 ч, А, Б), и инкубированных 1 ч без глюкозы, а затем –1 час в таком же растворе, но с глюкозой (В, Г). Клетки содержит как неизмененные морфологически (А, В) митохондрии, так и измененные (Б, Г), с локальными набуханиями (треугольники) и конденсированную (стрелка). Масштаб 0,2 мкМ.

Окислительный стресс Цитотоксическое действие параквата на нейрохимически зрелые и незрелые культивированные зернистые нейроны и значение глутамина для развития цитотоксичности Окислительный стресс инициировали паракватом, токсичность которого при попадании в нейрон опосредована интенсивной продукцией АФК (Gonzalez-Polo et al., 2004; Miranda-Contreras et al., 2005). Добавление в среду культивирования параквата (0,2 мМ) вызывало интенсивную гибель нейронов, при этом в течение 24х часов в зрелых и незрелых культурах выживало примерно одинаковое количество клеток (33±3% и 38±3%, соответственно).

Присутствие в среде блокаторов ионотропных Glu рецепторов (МК-801 10 мкМ и CNQX 10 мкМ) почти полностью защищало КЗН от токсического действия параквата. В зрелых культурах выживало 82±3% клеток (с блокаторами без параквата – 85±2%), в незрелых – 88±2% (с блокаторами без параквата – 95±2%). Гибель клеток, индуцированная паракватом, происходила лишь тогда, когда среда инкубации содержала глутамин, из которого может синтезироваться Glu. Деструкции нейронов, индуцированной паракватом, в зрелых культурах препятствовал менадион (витамин К3).

Таким образом, мы впервые показали, что нейродеструктивный эффект параквата опосредуется цитотоксическим действием глутамата, выброс которого из клеток стимулируется окислительным стрессом, но, возможно, АФК стимулируют и синтез Glu из глутамина митохондриальной глутаминазой.

Для оценки антиоксидантного статуса КЗН окислительный стресс индуцировали добавлением в инкубационную среду перекиси водорода (Н О ) в 2 концентрации 25-250 мкМ в присутствии MK-801 и CNQX. В этих экспериментах нейрохимически незрелые КЗН при концентрациях Н О 50 и 2 100 мкМ оказались более чувствительными к окислительному стрессу, чем клетки, достигшие нейрохимической зрелости.

Известно, что в период развития ЦНС происходят пластические перестройки, которые характеризуются как дифференцировкой вновь образованных нейронов, так и их апоптотической гибелью. Индукция апоптоза неспецифическим блокатором протеинкиназ стауроспорином в концентрации от 5 до 1000 нМ в течение 24 часов в 3-4-суточных культурах вызывает дозозависимую гибель КЗН. Однако в 7-8-суточных культурах низкие концентрации стауроспорина (100-330 нМ) оказались более токсичными, чем высокая (1000 нМ). Так, при концентрации стауроспорина 330 нМ выживало на 65,7% меньше КЗН, чем при 1000 нМ, что может быть связано с участием в развитии апоптоза зрелых нейронов протеинкиназ, имеющих низкое сродство к стауроспорину, действие которых (в развитии апоптоза) и блокируется стауроспорином в высокой концентрации. Кроме того, незрелые культуры оказались более устойчивы к апоптотическому сигналу стауроспорина, по сравнению со зрелыми, в которых при действии 330 нМ стауроспорина выживало на 36% меньше КЗН.

Влияние закисления среды на жизнеспособность нейронов Для понижения внеклеточного рН среду культивирования заменяли бессывороточной средой с кислым (6,5 и 6,0) или нормальным (7,2-7,3) рН на ч, что индуцировало гибель зернистых нейронов как в молодых, так и в зрелых культурах, которая была прямо пропорциональна интенсивности внеклеточного ацидоза: в зрелых культурах при рН 6,5 выживало 78,0±3,6% КЗН, а при рН 6,- 67,0±3,9%, тогда как в молодых – 57,5±4,5% и 34,0±4,6%, соответственно.

Закисление среды культивирования в течение 3-4 ч вызывало снижение [Ca2+] как в зрелых, так и незрелых КЗН, которое в последних было прямо i пропорционально интенсивности наружного ацидоза, достигая при рН 6,43±1,1% относительно базального уровня (рН 7,3). В зрелых КЗН рН 6,вызывал в отдельных экспериментах более сильное снижение [Ca2+], чем рН 6,0, i при котором [Ca2+] уменьшалась лишь на 18,0±1,5%. В культурах клеток i гиппокампа гибели нейронов от ацидоза предшествовало не снижение, а достоверное повышение [Ca2+]. Кроме того, 3-часовой внеклеточный ацидоз при i рН 6,5 и 6,0 снижал в молодых КЗН на 13,0±1,8% и 27,0±1,8%, а в зрелых – m на 7,0±1,5% и 12,0±1,4%, соответственно, что коррелировало с изменениями [Ca2+]. В то же время показано, что в культивированных нейронах коры i внеклеточный ацидоз вызывает повышение уровня [Ca2+] за счет входа Ca2+ в i нейрон через чувствительный к H+ ионный канал типа 1а (ASIC1а) (Xiong et al., 2006). Блокада нами кислоточувствительных каналов ASIC1a в незрелых КЗН с помощью специфического блокатора амилорида (30 мкМ, 24 ч) не предотвращала вызываемое ацидозом снижение выживаемости КЗН. Экспрессия мРНК к ASIC1a в незрелых КЗН составила 11,6% от значений в первичных культурах коры, взятых в качестве положительного контроля и принятых за 100%. Следовательно, вклад ASIC1a в регуляцию внутриклеточного Ca2+ при ацидозе КЗН должен быть незначительным, а одной из причин повреждения КЗН является обнаруженное нами снижение [Ca2+], поскольку такое уменьшение i концентрации кальция в цитоплазме, вызванное редукцией уровня внеклеточного калия, является сигналом развития апоптоза (Galli et al., 1995).

Более короткое (30 мин) закисление также приводило к редукции уровня [Ca2+] в незрелых КЗН до 89±4% и 70±3% при pH 6,5 и 6,0, соответственно, но и i к возрастанию концентрации свободного внутриклеточного цинка ([Zn2+] ), i определяемому с помощью специфического флуоресцентного зонда FluoZin-AM, до 115±5% при pH 6,5 и 146±9% при pH 6,0 (рис. 10). Во многих работах обсуждается роль цинка как фактора, индуцирующего апоптоз (Jiang et al., 2001;

Рис. 10. Хелатор ионов цинка TPEN (5 мкМ, 30 мин) предотвращает возрастание флуоресценции FluoZin-3 (верхний ряд) при ацидозе. Нижний ряд - фазовый контраст соответствующего поля зрения. Живые незрелые КЗН. Масштаб 10 мкм.

Bossy-Wetzel et al., 2004; Malaiyandi et al., 2005; Gazaryan et al., 2007).

Специфический внутриклеточный хелатор ионов цинка TPEN (5 мкМ, 30 мин) предотвращал возрастание [Zn2+] в КЗН (рис. 10). Добавление в среду i культивирования хелатора Zn2+ TPEN (5 мкМ, 24 ч), или антиоксидата тролокса (100 мкМ, 24 ч), повышало выживаемость КЗН при pH 6,0 (24 ч). Менадион (витамин К3, 3 мкМ, 24 ч), который в низких концентрациях шунтирует перенос электронов с NADH на Q-цикл, минуя комплекс I (Dedukhova et al., 1986;

Wijburg et al., 1990), значительно увеличивает выживаемость КЗН при кислых значениях pH (с 30±3 и 61±5 до 69±7 и 91±6 % при рН 6,0 и 6,5, е е соответственно). Подобный эффект менадион оказывает и на токсическое действие экзогенного цинка (ZnCl, 0,04, 0,05, 0,06 мM), препятствуя гибели КЗН. Выживаемость при этом повышалась с 55±6 до 95±8; с 24±4 до 75±10; и с 9±2 до 56±13 %, соответственно.

Добавленный за 30 мин до воздействия менадион (3 мкM) достоверно повышал выживаемость КЗН при химической гипоксии, индуцированной ингибитором комплекса I цепи транспорта электронов митохондрий ротеноном (5 мкМ, 1 ч) с 58±2% до 83±3%. Однако при блокаде других комплексов дыхательной цепи, 2го – 3-нитропропионовой кислотой (3-НПА, 1 мM 20 ч), 3го – антимицином A (0,1 мкM 1,5 ч), и 4го – азидом натрия (1 мМ 9 ч), менадион не защищал КЗН от гибели.

Таким образом, мы впервые показали, что менадион селективно проявляет защитное действие только в случае, если химическая гипоксия вызвана блокадой комплекса 1 дыхательной цепи митохондрий, и может служить маркером повреждений, связанных с блокадой этого комплекса. Следовательно, нейродеструктивное действие ацидоза на КЗН связано с индуцируемым Zn2+ снижением активности комплекса I дыхательной цепи митохондрий и избыточной продукцией АФК этим комплексом.

Особенности действия глутамина на зернистые нейроны После 3 ч инкубации в содержащем глюкозу растворе митохондрии КЗН активно накапливали ТМРЭ. В сестринских культурах при ГД свечение ТМРЭ в митохондриях было в 2 раза слабее. Добавление глутамина или пирувата (2 мM) в безглюкозный раствор предотвращало снижение . Следует отметить, что m защита пируватом митохондрий КЗН от деэнергизации в условиях ГД была более эффективна, чем глутамином. В присутствии глюкозы инкубация культур в растворе в течение 24 ч не вызывала заметной гибели нейронов, тогда как без глюкозы (ГД) за то же время погибали почти все нейроны. Блокада ионотропных Glu рецепторов MK-801 (10 мкм) и NBQX (10 мкм) не устраняла нейродеструктивный эффект ГД. Пируват в концентрации 2-5 мМ эффективно препятствовал нейрональной гибели при ГД (24 ч) (табл. 3). Присутствие глутамина в концентрации 2 мМ также полностью предотвращало гибель КЗН при ГД (табл. 4). Добавление глутамина в раствор, содержащий глюкозу, не влияло на жизнеспособность нейронов. В условиях ГД глутамин в концентрации 5 мM оказывал менее выраженный защитный эффект, который полностью отсутствовал при концентрации глутамина 10 мМ. В то же время, блокаторы ионотропных Glu рецепторов MK-801 и NBQX препятствовали негативным эффектам повышенных концентраций глутамина. Следовательно, о снижение эффективности защиты КЗН при повышении концентрации глутамина связано с эксайтотоксичностью глутамата. Повышение концентрации внеклеточного Glu в нервной ткани при ишемии может быть опосредовано усилением его высвобождения из аксонных терминалей и активацией синтеза из глутамина с участием митохондриальной глутаминазы, а при гипоксии/ишемии активность глутаминазы может значительно возрастать (Newcomb et al., 1997, 1998), что и показывают наши эксперименты.

При химической гипоксии, инициированной ингибитором комплекса дыхательной цепи митохондрий ротеноном (1 мкМ, 2 ч), выживаемость КЗН 7-DIV снижалась лишь до 89±3,7%, а 3-4 DIV - до 41±4,8%, однако при добавлении глутамина (2 мМ) этот показатель уменьшался до 31±6% и 10,0±1,3%, соответственно. Конкурентный антагонист ионотропных глутаматных рецепторов APV (0,2 мМ) полностью предотвращал гибель КЗН, Табл. 3. Влияние пирувата и блокаторов ионотропных глутаматных рецепторов MK-801+NBQX на выживаемость КЗН в норме и при ГД (24 ч) Добавки инкубационного раствора Выживаемость нейронов в % Без блокаторов +MK-801+NBQX Контроль 100±2 111±ГД 12±2 21±4* ГД+ пируват 2 мМ 83±6** 85±7** ГД+ пируват 5 мМ 94±6** 93±6** *p<0,01 по сравнению с контролем, **p<0,01 по сравнению с ГД, n=45, где n - количество полей зрения.

Табл. 4. Влияние глутамина и блокаторов ионотропных глутаматных рецепторов MK-801+NBQX на выживаемость КЗН в норме и при ГД (24 ч) Добавки инкубационного раствора Выживаемость нейронов в % С глюкозой ГД Нет добавок (контроль) 100±3 10±2* MK-801+NBQX (10 мкМ) 106±4 15±4* Глутамина (2 мМ) 89±4 97±6** Глутамин (2 мМ)+MK-801+NBQX 96±5 114±5** Глутамин (5 мМ) 82±4 47±4*, **, $ Глутамин (5 мМ)+MK-801+NBQX 94±4 117±6**, + Глутамин (10 мМ) 54±5* 2±0,3*, $ Глутамин (10 мМ) +MK-801+NBQX 78±3# 113±6**, ++ *р<0,01 по сравнению с контролем с глюкозой, **р<0,01 по сравнению с ГД, +p<0,01 по сравнению с 5 мМ глутамина при ГД, ++p<0,01 по сравнению с 10 мМ глутамина при ГД, $ p<0,01 по сравнению с 2 мM глутамина при ГД, #p<0,01 по сравнению с 10 мМ глутамина с глюкозой. n=45, где n - количество полей зрения на точку.

вызванную совместным действием ротенона и глутамина. Удаление глюкозы потенцировало действие ротенона на незрелые КЗН: выживаемость уменьшалась до 11,0±0,8%. ГД значительно снижала защитное действие блокатора ионотропных Glu рецепторов от клеточной гибели, индуцированной ротеноном. ГД за 2 ч нейроны не повреждала. Кроме того обнаружено повышение [Ca2+] в КЗН при действии ротенона (1 мкМ, 20 мин). Глутамин не i влиял на индуцированный ротеноном подъем [Ca2+], тогда как блокаторы Glu i рецепторов полностью его предотвращали. Удаление глюкозы потенцировало вызванное ротеноном повышение [Ca2+] и снижало эффективность защитного i действия блокаторов, тогда как ГД за 20 мин [Ca2+] не изменяла.

i В присутствии глюкозы блокирование Na+/K+-ATPазы уабаином (Уа 1 мМ, 3 ч) вызывало незначительную гибель незрелых КЗН как в отсутствие, так и в присутствии 2 мМ глутамина (85±4% и 89±4% выживших КЗН, соответственно). При действии Уа на фоне ГД выживаемость КЗН снижалась до 34±3%, однако глутамин повышал ее до 81±3%. Конкурентный блокатор NMDA-подтипа Glu рецепторов (APV, 0,25 мМ) защищал нейроны от токсического эффекта Уа при ГД. 30-минутная экспозиция с Уа вызывала возрастание [Ca2+] в КЗН. Глутамин не снижал индуцированный Уа подъем i [Ca2+] при нормальном содержании глюкозы, а ГД его потенцировала. В i условиях ГД глутамин снижал, а блокаторы ионотропных Glu рецепторов (МК-801 и NBQX, 01 мкМ) предотвращали кальциевую перегрузку КЗН, индуцированную Уа.

В растворе с глюкозой активация NMDA-подтипа Glu рецепторов (NMDA 50 мкМ, 2 ч) вызывала незначительную гибель нейронов: выживало 78±3%, в присутствии глутамина (2 мМ) - 73±4%. ГД потенцировала действие NMDA, снижая выживаемость КЗН до 40±2%, которая в присутствии глутамина повышалась до 79±5%. NMDA (50 мкМ, 20 мин) вызывал возрастание [Ca2+] и i снижение , которые потенцировались ГД. Глутамин в условиях ГД m препятствовал изменениям [Ca2+] и , индуцированным NMDA.

i m Ишемическое воздействие (кислородно-глюкозная депривация, КГД, 3 ч, глюкозная депривация (ГД, 6 ч), нормобарическая гипоксия (кислородная депривация, 6 ч), химическая гипоксия (ротенон 0,15-1,5 мкМ, 1 ч) с последующей инкубацией в условиях нормоксии в среде (24 ч) вызывали интенсивную гибель культивируемых нейронов коры головного мозга эмбрионов крыс (10 DIV), степень которой определяли по содержанию лактатдегидрогеназы в питательной среде. Под воздействием глутамина (0,мМ) выживаемость нейронов после нормобарической гипоксии и КГД не изменялась, однако при химической гипоксии достоверно снижалась.

Отсутствие глюкозы потенцировало действие химической гипоксии, но и в этом случае прослеживалось негативное влияние глутамина на выживаемость нейронов коры. Однако при действии только ГД глутамин достоверно снижал на 30% клеточную гибель, а в присутствии блокаторов ионотропных Glu рецепторов (MK-801 и CNQX) полностью защищал культивированные нейроны коры от ГД. Сами блокаторы в отсутствие глутамина не защищали нейроны и не предупреждали вызванное ГД повышение [Ca2+].

i Следовательно, влияние глутамина на выживаемость нейронов зависит от функциональной активности митохондрий. Так, при ГД он способен поддерживать , синтез ATP, нормальный уровень [Са2+] и, в конечном итоге, m i выживание нейронов (рис. 11 — левая часть). Вероятно, это связано с тем, что митохондрии нейронов для поддержания окислительного фосфорилирования при ГД используют глутамат, образующийся из глутамина при участии глутаминазы (Shtherland et al., 2008). Однако при блокаде функций митохондрий, например, при аноксии, ишемии, химической гипоксии, индуцированной ротеноном, присутствие глутамина в среде культивирования усиливает гибель нейронов даже при наличии глюкозы. При этих воздействиях и, как мы показали, видимо, при окислительном стрессе глутаминаза может интенсивно производить глутамат из глутамина (Goldberg et al., 1988; Newcomb et al., 1997, 1998). При этом цикл трикарбоновых кислот (Кребса) не способен активно метаболизировать глутамат, что ведет к его накоплению и вызывает гибель нейронов (рис. 11, правая часть). В других случаях, когда гибель нейронов не связана с Glu токсичностью, глутамин, как мы показали, например, на модели повреждения нейронов ацидозом, не оказывает на нее заметного влияния.

Результаты наших экспериментов показали, что при блокаде Рис. 11. Схема работы митохондрий при гипогликемии и ишемии. При гипогликемии (левая часть схемы) митохондрия интактна, глутаминаза, локализованная на внешней стороне внутренней мембраны, преобразует глутамин (Gln) в аммоний (NH4) и глутамат (Glu), который может утилизироваться в цикле трикарбоновых кислот (Кребса) с образованием аспартата (Asp), что дает возможность поддерживать и m синтезировать ATP. При ишемии, аноксии, химической гипоксии (правая часть схемы), из-за отсутствия кислорода или вследствие химической блокады белковых комплексов, перенос электронов по дыхательной цепи прекращается, поэтому синтеза ATP не происходит, падает, работа цикла трикарбоновых кислот нарушается, однако m глутаминаза продолжает функционировать, дезаминируя глутамин до глутамата и вызывая накопление последнего.

митохондриальных функций, в условиях полного выключения митохондрий из процесса генерации АТР, глутамин стимулирует процессы развития повреждения нейронов. Однако, если митохондрии функционально активны, то глутамин в условиях дефицита глюкозы может использоваться митохондриями КЗН как субстрат для поддержания клеточной энергетики, и способствовать выживанию нейронов.

Совместное действие повреждающих факторов ишемии При совместном действии в течение 24 ч нетоксических концентраций Glu (0,1 мМ) и индуктора окислительного стресса параквата (0,075 мМ) на незрелые КЗН 3-4 DIV выживало только 56±3% нейронов. В зрелых культурах (7-9 DIV) такого потенцирующего эффекта параквата на токсичность Glu (0,025-0,1 мМ) не обнаружено. В такой концентрации паракват за 60 мин не изменял ни базальный уровень, ни вызванное Glu возрастание [Ca2+].

i В зрелых культурах уменьшение рН в течение 24 ч с контрольного е значения (7,2) до 6,5 и 6,0 снижало выживаемость нейронов на 12±3% и 18±3%, соответственно, но повышало ее при токсическом действии 150 мкМ параквата на 50±3% и 53±2%, соответственно. В незрелых культурах лишь умеренный ацидоз (рН 6,5) вызывал небольшое повышение выживаемости нейронов при действии параквата, по сравнению с его действием при рН 7,2. Следует напомнить, что ацидоз сам по себе вызывал интенсивную гибель нейронов в незрелых культурах.

При индукции апоптоза стауроспорином (100 нМ, 24 ч) в среде с нормальным (7,3) и сниженным (6,5) рН выживаемость зрелых КЗН е составляла, соответственно, 70±2 и 67±2%, тогда как незрелых – лишь 18±2 и 10±1%. Следовательно, защитный эффект ацидоза при индукции апоптоза стауроспорином не проявляется.

Рассмотренные выше патологические процессы, вовлеченные в развитие ишемии головного мозга, практически все связаны с изменениями уровня внутриклеточного кальция и митохондриями. Как было показано нами, снижение функциональной активности митохондрий происходит и при Glu токсичности, и при ацидозе, и при ГД. Вероятно, эти нарушения имеют место и при окислительном стрессе, так как митохондрии являются не только основными продуцентами свободных радикалов, но и мишенями для повреждающего действия АФК (Chen et al., 2011). Изменение [Са2+] является i результатом взаимодействия транспортных систем, многие из которых энергозависимы, поэтому на их работу влияет состояние энергетики клетки, в первую очередь продукция ATP митохондриями. К тому же митохондрии являются одной из важнейших систем, депонирующих кальций. При ГД, Glu токсичности, так же, как и при ишемии происходит нарушение кальциевого гомеостаза вследствие перегрузки цитоплазмы нейронов ионами Са2+.

Внеклеточный ацидоз может приводить как к снижению, так и к повышению [Са2+], что, по-видимому, зависит от наличия ASIC1a каналов у нейрона.

i Следует отметить, что даже при однонаправленности этого процесса механизмы повышения [Са2+] при действии различных повреждающих факторов также i различаются. Если при ишемии и Glu токсичности повышение [Са2+] и гибель i нейронов опосредуются Glu рецепторами, то при ГД и ацидозе эта зависимость менее выражена, а в клеточных культурах может вовсе не прослеживаться.

Глутамин по-разному влияет на выживаемость нейронов при моделировании ишемии и ГД. Если в первом случае он выступает как фактор, потенцирующий нейрональную гибель, то во втором может ее предотвращать.

Все рассматриваемые процессы находятся в жесткой взаимосвязи. Так, если Glu может участвовать в развитии окислительного стресса и инициировать ацидоз цитоплазмы нейронов, то ацидоз, в свою очередь, может влиять на активность Glu рецепторов и каскад Glu токсичности, а также инициировать окислительный стресс. ГД может усиливать токсическое действие Glu и продукцию АФК в нейронах. Поэтому данные, полученные при моделировании отдельных звеньев ишемического нейродеструктивного процесса, таких как ГД, ацидоз, глутаматная токсичность, окислительный стресс, нельзя упрощенно суммировать и их следует экстраполировать на ишемию с большой осторожностью.

Защита нейронов от ишемии Индукция нейропротекции транзиторным снижением активности Na+/K+-ATPазы В качестве защитного воздействия при окислительном стрессе была использована предобработка культур блокатором Na+/K+-ATPазы уабаином. Уа (100 мкМ) в контрольных культурах за 24 ч не влиял на жизнеспособность КЗН (табл. 5), но достоверно повышал количество живых нейронов при последующей индукции окислительного стресса, как паракватом, так и Н О.

2 При этом выживаемость в зрелых культурах была значительно выше, чем в Таблица 5. Влияние уабаина (Уа) на жизнеспособность КЗН в зрелых и незрелых культурах при окислительном стрессе, индуцированном паракватом.

Воздействие 7-8 DIV 3-4 DIV Контроль 100,0±2,5 100,0±2,Уа 0,1 мМ 104,0±2,6 98,0±2,Паракват 0,15 мМ 61,0±5,4 44,0±2,Уа+паракват 0,15 мМ 96,0±3,9** 65,0±3** Паракват 0,2 мМ 33,0±3,5 38,0±2,Уа + паракват 0,2 мМ 78,0±3,1** 55,0±2,6** Н О 0,05 мМ 49,0±6,8 49,0±2,2 Уа+Н О 0,05 мМ 82,0±5,9** 70,0±3** 2 Н О 0,075 мМ 7,9±1,1 32,0±1,2 Уа+Н О 0,075 мМ 52,0±5,3** 59,0±2,7** 2 ** р<0,001 по сравнению с действием соответствующего индуктора окислительного стресса, n=45, где n - количество полей зрения на точку.

незрелых.

Полученные данные позволяют заключить, что предобработка Уа является гораздо более эффективной защитой от окислительного стресса для зрелых нейронов, чем для незрелых. Добавление Уа (0,1 мМ) защищало КЗН 7-8 DIV от апоптоза, индуцированного через 24 ч стауроспорином, однако не оказывало защитного эффекта на КЗН 3-4 DIV, что может быть связано с разной степенью активности Na+/K+-ATPазы в зрелых и незрелых КЗН (Inoue et al., 1988). Мы предполагаем, что защитное действие Уа опосредуется ингибированием высокоаффинной изоформы Na+/K+-ATPазы, так как активность именно этой изоформы повышается на поздних стадиях развития нейронов. Зрелые и незрелые нейроны различаются по активности Na+/K+-ATPазы и экспрессируют разные изоформы этого транспортера. У нейрональных предшественников и незрелых нейронов экспрессирована в основном изоформа Na+/K+-ATPазы, слабо чувствительная к Уа, тогда как общая активность этой транспортной системы и активность высокочувствительной к Уа изоформы возрастают по мере развития нейронов (Inoue et al., 1988; Corthsy-Theulaz et al., 1990; Habiba et al., 2000). Показано, что Уа активирует Akt-киназу (Zhou et al., 2001), идентифицированную как ключевой фермент, опосредующий антиапоптотический эффект многих ростовых факторов (Burgess et al., 1999).

Мы установили, что NMDA-подтип Glu рецепторов не вовлечен в защитное действие Уа при апоптозе КЗН, вызванном понижением концентрации калия, поскольку нейропротекция проявляется даже на фоне его блокады (Isaev et al., 2000).

Ишемическую толерантность можно индуцировать, имитируя отдельные звенья развития ишемического каскада субтоксическими воздействиями, а именно: сублетальными концентрациями Glu или NMDA, высокой концентрацией К+ (Grabb and Choi, 1999; Schurr et al., 2001; van Rensburg et al., 2009), умеренным окислительным стрессом (Ohtsuki et al., 1992), транзиторной деполяризацией (Taga et al., 1997). Высвобождение и накопление Glu в нервной ткани при окислительном стрессе авторы многих работ связывает с нарушением его обратного захвата, обусловленным негативным воздействием АФК и арахидоновой кислоты на работу Na+/K+-ATPазы (Chan et al., 1983; Volterra et al., 1994). Одним из признаков повреждения нейронов при гипоксии и Glu токсичности является снижение активности Na+/K+-ATPазы (Pylova et al., 1989;

Jamme et al., 1999), поэтому индуцировать эндогенные защитные антиишемические механизмы можно также ингибированием этой транспортной системы (Bruer et al., 1997).

Защитное действие препаратов семейства SkQ in vitro и in vivo Как указывалось нами выше, окислительный стресс, индуцируемый усилением продукции АФК, рассматривается как критический фактор ишемического повреждения нейронов, при котором митохондрии являются не только одними из главных генераторов АФК, но и сами повреждаются ими.

Поэтому эти органеллы должны быть одной из основных мишеней фармакологической нейропротекторной терапии.

В связи с этим были проведены исследования in vivo и in vitro нового класса веществ, синтезированных в НИИ физико-химической биологии им. А.Н.

Белозерского под руководством акад. В.П.

Рис. 12. Накопление SkQR1 и митотрекера зеленого в Скулачева и являющихся митохондриях культивированных зернистых митохондриальнонейронов. Живая культура. Масштаб 10 мкм.

адресованными антиоксидантами семейства SkQ (Skulachev, 2007). Эти молекулы состоят из восстановителя — пластохинона, соединенного углеводородной цепочкой с катионом (трифенилфосфонием в SkQ1 или родамином в SkQR1), проникающим через митохондриальную мембрану в отрицательно заряженный матрикс функционально активных митохондрий. Локализация SkQR1 в митохондриях КЗН, выявленных с помощью потенциалнезависимого красителя митотрекера зеленого показана на рис. 12.

Вещества семейства SkQ не оказывали влияния на жизнеспособность КЗН в концентрациях ниже 100 нМ. При индукции окислительного стресса (Н О 2 100 мкМ, 20 мин) защитный эффекта SkQR1, SkQ1 и SkQRB не превышал 20% (р<0,05, n=45). Однако если для SkQ1 и SkQRB достоверное защитное действие наблюдалось в интервале концентраций 12-50 нМ, то для SkQR1 этот интервал был шире (12-100 нМ). Следует отметить, что в данной модельной системе С12R19, лишенный антиоксиданта аналог SkQ, защитных свойств не проявлял.

Для in vivo исследований на модели компрессионной ишемии был выбран SkQR1, проявляющий защитный эффект в широком диапазоне концентраций.

Объем очага ишемического повреждения теменной области коры на 7й день после операции составлял от 0,5 до 27,7 мм3 (среднее значение – 11±2 мм3), а у получавших внутрибрюшинно за сутки до ишемии SkQR1 (1 мкмоль/кг веса) – до 12,0 мм3 (среднее значение – 3,7±0,9 мм3, p<0,005, n=15). Таким образом, препарат значительно снижал все три параметра: минимальное, максимальное и среднее значение объема ишемического очага. КЭЗ был 67%. Защитный эффект SkQR1 был хорошо выражен независимо от локализации ишемического очага.

Так, размер и протяженность зоны повреждения заметно снижались при его инициации не только в теменной, но и в лобной области головного мозга, где защитный эффект составлял 56%.

При других патологических состояниях, связанных с действием окислительного стресса in vivo, также показана высокая эффективность применения препаратов этого класса (Antonenko et al., 2008). Эти проникающие катионы можно также использовать как средства терапии для лечения целого ряда возрастных заболеваний, которые опосредованы АФК, таких как сердечная аритмия, инфаркт миокарда и почки, а так же болезнь Альцгеймера (Skulachev et al., 2009, Skulachev et al., 2011). Следует подчеркнуть, что защитные свойства могут быть связаны не только с антиоксидантной активностью исследуемых веществ. Мы не исключаем возможность нейропротекторного действия SkQRпутем индукции ишемической толерантности. Эффекты ишемической толерантности могут опосредоваться рядом каскадных реакций, участниками которых, в частности, является эритропоэитин (Prass et al., 2003), обладающий мощным нейропротекторным эффектом (Grasso et al., 2007; McPherson and Juul, 2008), а также белок GSK-3b (Dirnagl and Meisel, 2008; Juhaszova et al., 2009).

Основным местом синтеза эритропоэитина во взрослом организме является почка (Tan et al., 1991), хотя его заметная продукция происходит и в головном мозге (Noguchi et al., 2007). Плотников с соавторами показали увеличение содержания эритропоэитина в почке и фосфорилированной формы GSK-3b в мозге и почке при введении животным SkQR1 (Plotnikov et al., 2011). Поэтому можно предположить, что нейропротекторный эффект SkQR1 при его введении за 1 сутки до ишемии опосредован способностью этого препарата усиливать продукцию эритропоэитина и фосфорилирование GSK-3b, индуцируя тем самым ишемическую толерантность.

Соединения класса SkQ, особенно SkQR1, могут быть использованы для защиты нервной ткани во время плановых операций на мозге, при которых он подвержен значительной травматизации (Jadhav et al., 2007; Jadhav and Zhang, 2008).

Фармакологическая коррекция ишемических повреждений помощью препарата Целлекс В качестве нового нейропротекторного препарата был использован разработанный в ЗАО «Фарм-Синтез» целлекс, представляющий собой комплекс органоспецифических сигнальных слабокислых белков массой от до 140 кДа. Защитный эффект целлекса при введении после токсического воздействия Glu (25 мкМ) на КЗН (7 DIV) носил стабильный и дозозависимый характер, увеличивая выживаемость с 59+4% до 69+4, 79+5 и 78+4 % при 0,01, 0,05 и 0,11 мг/мл целлекса, соответственно (в двух последних р<0,05, n=45).

Сам препарат в таких концентрациях не оказывал токсического влияния на культуры нейронов. При окислительном стрессе, индуцированном перекисью водорода, защитного действия целлекса выявлено не было.

Хроническое и даже одноразовое (через 1 час после операции) внутрибрюшинное введение препарата (0,4, 3 мг/кг) значительно уменьшало объем очага ишемического повреждения коры головного мозга крыс при фотоиндуцированном тромбозе (рис. 13). КЭЗ(0,4 мг/кг)=29%; КЭЗ(3,мг/кг)=52%. В то же время, предварительное введение целлекса в течение 4х суток до фототромбоза было менее эффективным.

Рис. 13. Средние значения В основе обнаруженных эффектов этого нового объема очага ишемического белково-пептидного комплекса может лежать его повреждения в зависимости от концентрации целлекса.

способность оказывать прямое нейрорепаративное действие, снижать активацию провоспалительных реакций, стимулировать синтез нейротрофинов и предотвращать гибель нейронов после ишемии, а также уменьшать степень эксайтотоксического повреждения, поскольку в наших экспериментах in vitro целлекс эффективно препятствовал нейротоксическому действию Glu.

Защитное действие препарата ГК-2 при моделировании ишемии Низкомолекулярный аналог фактора роста нервов, синтезированный в ФГБУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН (Середенин С.Б., Гудашева Т.А.// Заявка на изобретение рег. № 2009105176, приоритет от 16.02.2009.) - пептид ГК-2 (гексаметилендиамид бис-N-моносукцинил-аспарагинил-лизин), способный проникать через гематоэнцефалический барьер (Гудашева, 2011), препятствовал повреждению КЗН, подвергнутых окислительному стрессу, индуцированному перекисью водорода. Выживаемость КЗН повышалась с 34,1±3,6% без коррекции до 44,1±3,7, 48,2±4,6 и 52,9±4,2 при добавлении 0,5, и 1,5 мг/л ГК-2, соответственно (р<0,001, n=45). Сам ГК-2 в указанных концентрациях не влиял на выживаемость КЗН.

Выраженные нейропротекторные и антиамнестические свойства препарата были продемонстрированы и в экспериментах на животных. Внутрибрюшинное введение ГК-2 после двустороннего фокального фотоиндуцированного тромбоза (ишемии) префронтальной коры головного мозга крыс приводило к уменьшению объема ишемического очага на 7е сутки после операции с 14,0±6,мм3, до 5,5±1,0 мм3 (р<0,05, n=9), КЭЗ 62% (рис. 14) и сохранению условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ). Это хорошо согласуются с данными о роли фактора роста нервов в нейропластичности и репарации мозга (Varon and Conner, 1994; Hefti, 1994; Frade and Barde, 1998; Lessmann, 1998; Spedding and Gressens, 2008; Alleva and Francia, 2009). В последствии наши данные были подтверждены и на других моделях фокальной ишемии головного мозга (Середенин с соавт., 2011), были обнаружены антипаркинсонные свойства ГК-2 (Гудашева с соавт., 2010, Поварнина с соавт., 2011), способность увеличивать синтез белков теплового шока (Антипова, 2010).

В таблицах 6 и 7 приведены значения средних размеров очагов ишемического повреждения коры головного мозга и выживаемости КЗН при использовании новых нейропротекторов in vivo и in vitro. Все представленные вещества оказывали выраженный защитный эффект с Рис. 14. Объемная реконструкция очага коэффициентом защиты выше ишемического повреждения при двустороннем %, действуя на разные звенья фотоиндуцированном тромбозе без коррекции и с коррекцией препаратом ГК-2 (1 мг/кг).

ишемического процесса.

Окраска метиленовым синим. Масштаб 0,6 см Таблица 6. Действие ГК-2, целлекса и SKQR1 на объем очага ишемического повреждения ГК-2, Целлекс, SKQR1, 1 мг/кг в/б при 3 мг/кг в/б при 1 мкмоль/кг в/б при Объем очага ишемического фототромбозе, фототромбозе, компрессионной повреждения m=4 m=4 ишемии, m=Без коррекции, V мм3 14,0 8,3 11,o С коррекцией, V мм3 5,5* 4,0 3,7* Е Эффективность защиты, E (%) 60,7 51,9 67,Примечания. в/б – внутрибрюшинно, m- число дней введения препарата. Эффективность лечения рассчитывалась по формуле E(%)= 100*(V ) /V. *p<0,05 по сравнению с Е-V о о ишемией без коррекции, n=9-15.

Таблица 7. Нейропротекторное действие ГК-2, целлекса и SKQR1 на КЗН при глутаматной токсичности и окислительном стрессе ГК-2, Целлекс, SKQR1, 1,5 мг/мл после 0,7 мг/мл после 50 нМ перед окислительного глутаматного окислительным Выживаемость КЗН стресса воздействия стрессом Без коррекции, В (%) 34,1 58,5 31,о С коррекцией, В (%) 52,9* 78,8 53,1* к Эффективность защиты, Е (%) 18,8 20,3 21,Эффективность лечения рассчитывалась по формуле (%) Е= В. p<0,05 по сравнению к-В о, с повреждающим воздействием без коррекции, n=45.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ В настоящей работе, при моделировании in vitro патогенетических факторов ишемии (цитотоксичности глутамата, глюкозной депривации, окислительного стресса, ацидоза), было обнаружено, что эксайтотоксическое повышение внутриклеточной концентрации ионов кальция в нейронах приводит к электрогенному транспорту избытка Ca2+ в митохондрии и снижению мембранного потенциала митохондрий, которое сопровождается повреждением их ультраструктуры. При этом нейротоксическое действие глутамата в незрелых культурах (3-4 суток in vitro), по сравнению со зрелыми, 7-8-суточными культурами, выражено гораздо слабее. Однако эта толерантность к глутамату резко снижается, если его воздействие сочетается с глюкозной депривацией или окислительным стрессом.

При кратковременной глюкозной депривации большая часть нейронов, несмотря на выраженную кальциевую перегрузку и снижение , сохраняет m жизнеспособность. Это свидетельствует о том, что повышение [Ca2+] i непосредственно после повреждающего воздействия не является обязательным признаком последующей клеточной гибели. Вероятно, первоначальное снижение выполняет защитную функцию, предотвращая аккумуляцию Ca2+ m в митохондриях до критического уровня, превышение которого приводит к набуханию и деструкции митохондрий, а в дальнейшем и к гибели нейронов.

Показано, что нейрохимически зрелые нейроны сильнее, чем незрелые, подвержены деструктивному действию глюкозной депривации.

При глюкозной депривации, не нарушающей функциональную активность дыхательная цепи митохондрий, глутамин может использоваться в качестве энергетического субстрата, восстанавливая синтез АТР, что способствует выживанию нейронов. Однако при цитотоксическом воздействии, приводящем к блокаде дыхательной цепи митохондрий, добавление глутамина активирует синтез глутамата глутаминазой, что способствует повреждению нейронов.

Нейродеструктивный эффект параквата опосредуется цитотоксическим действием эндогенного глутамата. Окислительный стресс стимулирует высвобождение последнего из нейронов. Кроме того, при окислительном стрессе, возможно, стимулируется синтез глутамата из глутамина митохондриальной глутаминазой. На фоне блокады глутаматных рецепторов окислительным стрессом повреждаются прежде всего незрелые нейроны.

Обнаруженное нами нейропротекторное действие менадиона проявляется только в случае, если химическая гипоксия вызвана блокадой комплекса I дыхательной цепи митохондрий, и может служить маркером повреждений, связанных с нарушением его функционирования. Следовательно, вышеописанное нейродеструктивное действие параквата, уменьшаемое менадионом, повреждает этот комплекс. Поскольку защитный эффект менадиона наблюдается и при внеклеточном ацидозе, то повреждение культивированных зернистых нейронов под влиянием ацидоза связано с вызываемым Zn2+ ингибированием комплекса I, который при этом усиленно продуцирует активные формы кислорода. Однако не стоит забывать, что одной из причин повреждения этого типа нейронов может являться обнаруженное нами снижение [Ca2+], поскольку это может служить сигналом развития i каскада, индуцирующего апоптоз. Незрелые зернистые нейроны сильнее повреждаются ацидозом, чем достигшие нейрохимической зрелости.

Исходя из вышесказанного, можно заключить, что если токсичность повреждающих факторов ишемии связана с гиперактивацией глутаматных рецепторов или же с глюкозной депривацией, то сильнее повреждаются зрелые нейроны, а если с окислительным стрессом или ацидозом — то незрелые.

Подверженность нейрохимически незрелых культивированных зернистых нейронов глутаматной токсичности резко возрастает, если она сопряжена с другими повреждающими факторами, глюкозной депривацией или окислительным стрессом.

Действие всех повреждающих факторов ишемии сопряжено с нарушением ионного баланса и повреждением митохондрий. Снижение функциональной активности митохондрий происходит при глутаматном воздействии, ацидозе, глюкозной депривации и, вероятно, при окислительном стрессе. Митохондрии являются не только основными источниками АТР клеток, но и продуцентами свободных радикалов, а также важнейшей системой депонирования кальция, перегрузка которым может вызвать дисфункцию и деструкцию этих органелл. В то же время транспортные системы поддержания ионного баланса в основном энергозависимы и, следовательно, также напрямую связаны с функционированием митохондрий.

Анализ полученных нами данных указывает на неоднозначность и многоплановость ишемических патобиохимических реакций. Поэтому получение универсального нейропротекторного средства, направленного на коррекцию ишемических повреждений головного мозга, маловероятно.

Наиболее перспективной представляется разработка принципиально новых подходов к поиску препаратов, направленных на стимуляцию эндогенных нейропротекторных и репаративных процессов (Суслина и Пирадов, 2008).

В основу таких разработок может быть положено использование существующих эндогенных нейропротекторов, их синтетических аналогов с заданными свойствами или получение препаратов, стимулирующих эндогенную продукцию нейропротекторов. К таким веществам, несомненно, относятся соединения, использованные в нашей работе. Так, показана возможность индукции ишемической толерантности путем снижения активности Na+/K+ATPазы уабаином, предобработка которым является эффективной защитой зрелых нейронов in vitro от окислительного стресса и апоптоза, опосредуемой, вероятно, ингибированием высокоаффинной формы Na+/K+-ATPазы, активацией Akt-киназ и усилением антиоксидантной защиты. Кроме того, ярко выраженным нейропротекторным действием in vivo и in vitro обладают исследованные нами белковый комплекс целлекс, дипептид ГК-2 и митохондриально-адресованный антиоксидант SkQR1, что указывает на перспективность их использования в дальнейших предклинических и клинических испытаниях при ишемических формах церебральной патологии.

Таким образом, полученные результаты, с одной стороны, раскрывают новые механизмы ишемических нейродеструктивных процессов и свидетельствуют об их тесной взаимосвязи с дисфункцией митохондрий и нарушением ионного баланса нейронов, а с другой служат экспериментальным обоснованием возможности практического применения исследованных нейропротекторов в неврологической клинике.

ВЫВОДЫ 1. Степень повреждения культур зернистых нейронов мозжечка под влиянием повреждающих факторов ишемии зависит от сроков культивирования:

деструкция зрелых нейронов (7-8 дней in vitro) наиболее выражена при глюкозной депривации и гиперактивации глутаматных рецепторов, тогда как незрелых (3-4 дня in vitro) – при окислительном стрессе и ацидозе.

2. Кратковременная (в течение часа) глюкозная депривация, приводящая к снижению мембранного потенциала митохондрий, указывающему на их дисфункцию, сопровождается гетерогенным изменением ультраструктуры митохондрий, популяция которых содержит как интактные, так и конденсированные органеллы, а также митохондрии с локальными набуханиями и разрушением крист.

3. Повышение внутриклеточной концентрации ионов кальция после кратковременной (1 ч) глюкозной депривации в зрелых нейронах обратимо при восстановлении нормального уровня глюкозы в инкубационной среде, но восстановление мембранного потенциала митохондрий происходит не полностью (90%), чему соответствует число митохондрий, содержащих локальные набухания, и гибель 14% нейронов через 24 ч после часовой глюкозной депривации.

4. Вызываемое глюкозной депривацией снижение митохондриального мембранного потенциала предотвращается ингибированием транспорта Ca2+ в митохондрии или добавлением пирувата, а кальциевая перегрузка цитоплазмы нейронов усиливается ингибиторами дыхательной цепи, что указывает на вовлечение митохондрий в каскад внутриклеточных нейродеструктивных процессов вследствие снижения мембранного потенциала митохондрий и синтеза АТР, нарушения аккумуляции кальция и усиления продукции активных форм кислорода этими органеллами.

5. Снижение мембранного потенциала митохондрий и гибель нейронов при глюкозной депривации предотвращаются глутамином, который в отсутствие глюкозы может служить энергетическим субстратом окислительного фосфорилирования. В то же время, при дисфункции митохондрий, вызванной цитотоксическим воздействием, глутамин снижает выживаемость нейронов в результате гиперактивации глутаматных рецепторов синтезируемым из него глутаматом.

6. Гибель культивированных зернистых нейронов при окислительном стрессе, индуцированном паракватом, происходит вследствие блокады комплекса I дыхательной цепи митохондрий, поскольку его шунтирование менадионом, минуя комплекс I дыхательной цепи митохондрий, повышает выживаемость культур. Кроме того, в каскаде нейродеструктивного действия параквата принимает участие эндогенный глутамат, поскольку блокада ионотропных глутаматных рецепторов или удаление глутамина из инкубационной среды защищает нейроны.

7. Гибель культивированных зернистых нейронов мозжечка от умеренного внеклеточного ацидоза опосредована снижением внутриклеточной концентрации Ca2+, возрастанием внутриклеточной концентрации Zn2+, снижением мембранного потенциала митохондрий и усилением продукции свободных радикалов, о чем свидетельствует защитное действие хелатора цинка TPEN, менадиона, шунтирующего I комплекс дыхательной цепи, и антиоксиданта тролокса.

8. Предобработка уабаином является эффективной защитой зернистых нейронов мозжечка зрелых культур от окислительного стресса и апоптоза, что указывает на возможность индукции ишемической толерантности путем умеренной транзиторной блокады Na+/K+-ATPазы.

9. Новые фармакологические препараты повышают выживаемость нейронов в культурах, подвергнутых действию повреждающих факторов ишемии:

белковый комплекс целлекс - при токсическом действии глутамата, пептид ГК-2 и митохондриально-адресованные антиоксиданты семейства SkQ - при окислительном стрессе. Указанные препараты препятствуют увеличению объема ишемического очага и функциональным нарушениям при моделировании фокальной ишемии коры головного мозга in vivo.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ 1. Стельмашук Е.В., Исаев Н.К., Зоров Д.Б., Викторов И.В. Кальций вызывает снижение мембранного потенциала митохондрий клеток зерен мозжечка крыс при токсическом воздействии глутамата. //Бюлл. эксперим. биол. мед.

1997. т. 123. № 4. с. 378-380.

2. Захарова И.О., Стельмашук Е.В., Викторов И.В., Тюрин В.А., Аврова Н.Ф.

Защитный и модуляторный эффект различных концентраций ганглиозидов в клетках-зернах мозжечка и в синаптосомах мозга крыс. //Нейрохимия.

1998. т. 15. вып. 2. с. 117-125.

3. Avrova N.F., Victorov I.V., Tyurin V.A., Zakharova I.O., Sokolova T.V., Andreeva N.A., Stelmaschuk E.V., Tyurina Y.Y., Gonchar V.S. Inhibition of glutamateinduced intensification of free radical reactions by gangliosides: possible role in their protective effect in rat cerebellar granule cells and brain synaptosomes. //Neurochemical Research. 1998. v. 23. № 7. p. 945-952.

4. Isaev N.K., Stelmashook E.V., Alexandrova O.P., Andreeva N.A., Polyakova I.A., Victorov I.V., Zorov D.B. The lack of extracellular Na+ exacerbates Ca2+dependent damage of cultured cerebellar granule cells. //FEBS Letters. 1998. v.

434. p. 188-192.

5. Stelmashook E.V., Weih M., Zorov D., Victorov I., Dirnagl U., Isaev N. Short-term block of Na+/K+-ATPase in neuro-glial cell cultures of cerebellum induces glutamate dependent damage of granule cells. //FEBS letters. 1999. v. 456. p.

41-44.

6. Стельмашук Е.В., Исаев Н.К., Александрова О.П., Андреева Н.А., Зоров Д.Б, Викторов И.В. Влияние изоосмотического раствора с пониженным содержанием натрия на состояние митохондрий культивированных клетокзерен мозжечка. //Бюлл. эксперим. биол. мед. 2000. т. 129. № 1. с. 41-44.

7. Isaev N.K., Stelmashook E.V., Halle A., Harms C., Lautenschlager M., Weih M., Dirnagl U., Victorov I.V., Zorov D.B. Inhibition of Na+,K+-ATPase activity in cultured rats cerebellar granule cells prevents the onset apoptosis induced by low potassium. //Neuroscience Letters. 2000. v. 283. № 1. p. 41-44.

8. Андреева Н.А., Стельмашук Е.В., Исаев Н.К., Островская Р.У., Гудашева Т.А., Викторов И.В. Нейропротекторные эффекты ноотропного дипептида ГВС-111 при кислородно-глюкозной депривации, глутаматной токсичности и оксидатовном стрессе in vitro. //Бюлл. эксперим. биол. мед. 2000. т. 130.

№ 10. с. 418-421.

9. Стельмашук Е.В., Андреева Н.А, Манухова Л.А., Зоров Д.Б., Исаев Н.К.

Бифоназол модулирует гибель культивированных клеток-зерен мозжечка крыс, индуцированную глутаматом и кислородно-глюкозной депривацией. // Бюлл. эксперим. биол. мед.,2001. т. 132. № 11. с. 542-544.

10. Isaev N.K, Stelmashook E.V., Dirnagl U., Andreeva N.A., Manuhova L., Vorobjev V.S., Sharonova I.N., Skrebitsky V.G., Victorov I.V., Katchanov J., Weih M., Zorov D.B. Neuroprotective effects of the antifungal drug clortimazole.

//Neurosci. 2002. v. 113. № 1. p. 47-53.

11. Стельмашук Е.В., Андреева Н.А, Исаев Н.К. Различие действия стауроспорина на зрелые и незрелые культуры клеток-зерен мозжечка крыс. //Нейрохимия. 2004. т. 21. № 1. с. 68-71.

12. Isaev N.K., Stelmashook E.V., Ruscher K., Andreeva N.A., Zorov D.B.

Menadione reduces rotenone-induced cell death in cerebellar granule neurons. // Neuroreport. - 2004. - v. 15(14).- P. 2227-2231.

13. Стельмашук Е.В., Беляева Е.А., Исаев Н.К. Влияние ацидоза, окислительного стресса и глутаматной токсичкости на жизнеспособность клеток-зерен в зрелых и незрелых клеточных культурах. //Нейрохимия. - 2006. - т. 23. - № 2. - с. 131-135.

14. Исаев Н.К., Стельмашук Е.В., Дирнагл У., Плотников Е.Ю., Кувшинова Е.А., Зоров Д.Б. Глюкозная депривация стимулирует продукцию свободных радикалов в митохондриях культивированных зернистых нейронов мозжечка. //Биохимия. - 2008. - т. 73. - в. 2. - С. 185-195.

15. Stelmashook E.V., Isaev N.K., Zorov D.B. Paraquat potentiates glutamate toxicity in immature cultures of cerebellar granule neurons. //Toxicology Letters. - 2007. - v. 174. - № 1-3. - p. 82-88.

16. Бакеева Л.Е., Барсков И.В., Егоров М.В., Исаев Н.К., Капелько В.И., Казаченко А.В., Кирпатовский В.И., Козловский С.В., Лакомкин В.Л., Левина С.В., Писаренко О.И., Плотников Е.Ю., Сапрунова В.Б., Серебрякова Л.И., Скулачев М.В., Стельмашук Е.В., Студнева И.М., Цкитишвили О.В., Васильева А.К., Викторов И.В., Зоров Д.Б., Скулачев В.П. Производное пластохинона, адресованное в митохондрии, как средство, прерывающее программу старения. 2. Терапия некоторых старческих патологий, опосредованных АФК (сердечной аритмии, инфарктов сердца и почки и инсульта головного мозга). //Биохимия. - 2008.

- т. 73. - в. 12. - С. 1607-1621.

17. Лозиер Е.Р., Джанибекова А.И., Стельмашук Е.В., Граф А.В., Зоров Д.Б., Соколова Н.А., Исаев Н.К. Глюкозная депривация потенцирует токсичность уабаина и глутамата в кортикальных нейронах различных сроков культивирования. //Нейрохимия. - 2009. т. 26. № 3. с. 1-5.

18. Stelmashook E.V., Isaev N.K., Plotnikov E.Y., Uzbekov R.E., Alieva I.B., Arbeille B., Zorov D.B. Effect of transitory glucose deprivation on mitochondrial structure and functions in cultured cerebellar granule neurons. //Neurosci Lett.

2009. v. 461. p. 140-144.

19. Плотников Е.Ю., Силачев Д.Н., Чупыркина А.А., Даньшина М.И., Янкаускас С.С., Моросанова М.А., Стельмашук Е.В., Васильева А.К., Горячева Е.С., Пирогов Ю.А., Исаев Н.К., Зоров Д.Б. Новое поколение скулачевионов, обладающих выраженным нефро и нейропротекторным действием. //Биохимия. - 2010. - т. 75. - в. 2. - С. 177 – 184.

20. Isaev N.K., Stelmashook E.V., Lukin S.V., Freyer D., Mergenthaler Ph., Zorov D.B. Acidosis-Induced Zinc-dependent death of cultured cerebellar granule neurons. //Cellular and Molecular Neurobiology. 2010. v. 30. № 6. 877-883.

21. Стельмашук Е.В., Новикова С.В., Исаев Н.К. Влияние глутамина на гибель культивированных зернистых нейронов, индуцированную глюкозной депривацией и химической гипоксией. //Биохимия. - 2010. - т. 75. в. 8. с.

1150-1156.

22. Stelmashook E.V., Lozier E.R., Goryacheva E.S., Mergenthaler P., Novikova S.V., Zorov D.B., Isaev N.K. Glutamine-mediated protection from neuronal cell death depends on mitochondrial activity. //Neurosci. Lett. 2010. v. 482. p. 151–155.

23. Середенин С.Б., Романова Г.А., Гудашева Т.А., Шакова Ф.М., Барсков И.В., Стельмашук Е.В., Антипова Т.А.. Нейропротективное и антиамнестическое действие дипептидного миметика фактора роста нервов ГК-2 при экспериментальном ишемичесом инфаркте коры головного мозга. //Бюлл.

эксперим. биол. мед. 2010. т. 150. № 10. с. 406-410.

24. Романова Г.А., Шакова Ф.М., Барсков И.В., Стельмашук Е.В., Петров Т.В., Соколов М.А. Функциональные и морфологические повреждения при фокальной ишемии префронтальной коры головного мозга крыс; коррекция с помощью нового оригинального препарата Целлекс. //Журнал неврологии и психиатрии им. Корсакова. 2010. № 9(2). с. 52-56.

25. Капай Н.А., Исаев Н.К., Стельмашук Е.В., Попова О.В., Зоров Д.Б., Скребицкий В.Г., Скулачев В.П. Митохондриальноµадресованное производное пластохинона, антиоксидант SkQR1, введенный in vivo, предотвращает нарушение длительной потенциации, вызванное амилоидом в срезах гиппокампа. //Биохимия. 2011. т. 76. № 12. с. 1695 – 1699.

26. Lozier E.R., Stelmashook E.V., Uzbekov R.E., Novikova S.V., Zorov S.D., Alieva I.B., Arbeille B, Zorov DB, Isaev NK. Stimulation of kainate toxicity by zinc in cultured cerebellar granule neurons and the role of mitochondria in this process. // Toxicol. Lett. 2012. v. 208. p. 36-40.

27. Isaev N.K., Lozier E.R., Novikova S.V., Silachev D.N., Zorov S.D., Stelmashook E.V. Glucose starvation stimulates Zn2+ toxicity in cultures of cerebellar granule neurons. //Brain Research Bulletin. 2012. v. 87. p.80-84.

Статьи в других изданиях 28. Стельмашук Е.В., Андреева Н.А., Манухова Л.А., Зоров Д.Б., Исаев Н.К. Антигрибковые препараты клотримазол и бифоназол предотвращают гибель культивированных клетокзерен мозжечка крыс при глутаматной токсичности и кислородно-глюкозной депривации. //Сборник статей «Функциональная нейроморфология. Фундаментальные и прикладные исследования.» /Науч. Ред. В.Н. Гурин, В.В. Солтанов. – Мн.: Бизнесофсет.

2001. c. 173-175.

29. Андреева Н.А., Стельмашук Е.В., Исаев Н.К., Ходоров Б.И. Влияние блокады ATPзависимого транспорта Са2+ и Na+ на глутаматную токсичность в культурах клеток-зерен мозжечка крысы. //Сборник статей Всероссийской научной конференции с международным участием «Структурно-функциональные и нейрохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга» ГУ НИИ мозга РАМН. - М., 2005. - с. 21-24.

30. Стельмашук Е.В., Андреева Н.А., Белоусов В.В., Исаев Н.К. Уабаин уменьшает повреждающее действие окислительного стресса in vitro. //Всероссийская научная конференция с международным участием «Структурно-функциональные и нейрохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга». ГУ НИИ мозга РАМН. - М., 2005. - с. 267-270.

31. Исаев Н.К., Стельмашук Е.В., Беляева Е., Зоров Д.Б. Глюкозная депривация стимулирует продукцию активных форм кислорода в культивированных нейронах мозжечка.

//Сборник статей Международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация". Московская область г. Пущино Институт биофизики клетки РАН. 2005 - с. 130-132.

32. Стельмашук Е.В., Исаев Н.К. Влияние предобработки уабаином на жизнеспособность клеток-зерен в зрелых и незрелых клеточных культурах при окислительном стрессе.

//Сборник статей Всероссийской научной конференции с международным участием. ГУ НИИ мозга РАМН. «Структурно-функциональные и нейрохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга – 2006». - М., 2006. - с. 310-313.

33. Стельмашук Е.В., Андреева Н.А., Манухова Л.А., Захарова Е.И., Белоусов В., Зоров Д.Б., Викторов И.В., Исаев Н.К. Формирование ишемической толерантности в культурах клеток-зерен можзечка с помощью гипероксигенации. //Сборник статей Всероссийской научной конференции с международным участием ГУ НИИ мозга РАМН «Структурнофункциональные и нейрохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга – 2006». - М., 2006. - с. 313-317.

34. Исаев Н.К., Стельмашук Е.В., Манухова Л.А., Зоров Д.Б. Клотримазол снижает активность комплекса I дыхательной цепи митохондрий в культивированных астроцитах.

//Сборник статей Всероссийской научной конференции с международным участием. ГУ НИИ мозга РАМН «Структурно-функциональные и нейрохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга – 2006» - М., 2006. - с. 123-126.

35. Левина С.В., Стельмашук Е.В., Барсков И.В., Исаев Н.К., Зоров Д.Б., Викторов И.В.

Исследование влияния односторонней ретракционной ишемии головного мозга на горизонтальную активность крыс. //Сборник статей конференции ГУ НЦ неврологии РАМН "Структурно-функциональные, нейрохимические и иммунохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга". - М., 2007. с. 340-344.

36. Стельмашук Е.В., Исаев Н.К. Влияние параквата и рН среды на выживаемость зернистых нейронов мозжечка различных сроков культивирования. Материалы Всероссийской научной конференции с международным участием "Актуальные вопросы функциональной межполушарной асимметрии и нейропластичности", - М., 2008. - с.

647-651.

37. Лукин С.В., Джанибекова Н.А., Лозиер Е.Р., Стельмашук Е.В., Трофимова Л.К., Граф А.В., Зоров Д.Б., Соколова Н.А., Исаев Н.К. Влияние ацидоза и амилорида на жизнеспособность нейронов коры головного мозга различных сроков культивирования. //Сборник статей Всероссийской научной конференции с международным участием "Актуальные вопросы функциональной межполушарной асимметрии и нейропластичности". - М., - 2008, с. 591-595.

38. Стельмашук Е.В., Новикова С.В., Исаев Н.К. Глутамин защищает зернистые нейроны мозжечка при глюкозной депривации и токсическом действии NMDA in vitro. //Сборник статей Всероссийской конференции с международным участием «Современные направления исследований функциональной межполушарной асимметрии и пластичности мозга. Экспериментальные и теоретические аспекты нейропластичности».

- М., 2010. - с. 498-501.

Тезисы докладов 39. Зоров Д.Б., Высоких М.Ю., Зорова Л.Д., Исаев Н.К., Красников Б.Ф., Кузьминова А.Е., Мешков К.И., Самсонов А.К., Стельмашук Е.В. Структура и функция митохондриальной поры. //2й съезд биохимического общества РАН. - Пущино, -1997. - С. 378-379.

40. Викторов И.В., Андреева Н.А., Дупин А.М., Исаев Н.К., Лыжин А.А., Стельмашук Е.В., Хаспеков Л.Г. Исследование механизмов гипоксических/ишемических повреждений нейронов в культуре клеток головного мозга. //Материалы 3й международной конференции «Колосовские чтения 97». - С-Пб. - 1997. - С. 23.

41. Стельмашук Е.В., Исаев Н.К., Узбеков Р.Э., Полякова И.А., Викторов И.В., Зоров Д.Б.

Ультраструктурные изменения митохондрий культивированных клеток-зерен мозжечка после воздействия токсических доз глутамата. //Всероссийская конференция «Гипоксия:

механизмы, адаптация, коррекция» М., -1997. - С. 116-117.

42. Zakharova I.O., Victorov I.V., Tyurin V.A., Stelmaschuk E.V., Sokolova T.V., Tyurina Yu.Yu., Avrova N.F. Inhibition of glutamate-induced enhancement of free radical reactions by gangliosides: possible role in their protective effect in rat cerebellar granule cells and brain synaptosomes. //33 International congressof phisiological sciences. - St. Peterburg, - 1997. - P093.34.

43. Александрова О.П., Стельмашук Е.В., Исаев Н.К., Викторов И.В. Исследование морфологических изменений культивированных клеток-зерен мозжечка при действии глутамата. //Hypoxia Med. J., - 1998. - V. 6. - № 2. - P. 26.

44. Avrova N.F., Victorov I.V., Tyurina Y.Y.,Sokolova T.V., Shestak K.I., Zakharova I.O., Andreeva N.A., Stelmaschuk E.V. Tyurin V.A., Protective effect of gangliosides in hypoxic dysfunction of th the nerve cells. //J. of Neurochemistry. "12 Meeting of the European Society for Neuroscience",- 1998. - 71 Suppl: S 32.

45. Андреева Н.А., Стельмашук Е.В., Исаев Н.К., Островская Р.У., Гудашева Т.А., Викторов И.В. Исследование защитного действия пептида ГВС-111 при моделировании гипоксии in vitro. //Материалы 2-й Всероссийской конференции «Гипоксия механизмы, адаптация, коррекция». - М., - 1999. - С. 5-6.

46. Исаев Н.К., Стельмашук Е.В., Викторов И.В. Влияние снижения активности Na+/ K+АТФазы на жизнеспособность клеток-зерен в диссоциированных нейроглиальных культурах мозжечка крыс. //Материалы конференции «Механизмы структурной, функциональной и нейрохимической пластичности мозга». - М., - 1999. - С. 41.

47. Isaev N.K., Stelmashook E.V., Krasnikov B.F., Viktorov I.V., Zorov D.B. Short-term block of Na+/K+ ATPase induces glutamate-dependent damage of cultured cerebellar granule cells. //Biophysical Journal. - 1999. - v. 76. - № 2. - Part 2. A378.

48. Стельмашук Е.В., Андреева Н.А., Исаев Н.К., Викторов И.В. Ходоров Б.И. Влияние блокады Са2+ насосов плазматической мембраны и эндоплазматического ретикулума на нейротоксичность глутамата в культуре клеток-зерен мозжечка крысы. //11 Российский конгресс по патофизиологии. - 2000. - С. 179.

49. Маркова Е.Г., Исаев Н.К., Стельмашук Е.В. Избирательное влияние фактора роста нервов на дифференцировку дендритов различных морфологических типов холинергических нейронов септума мозга крысы при культивировании. // Конференция "Новое в изучении пластичности мозга".- М., - 2000. - С. 56.

50. Стельмашук Е.В., Андреева Н.А., Манухова Л.А., Захарова Е.И., Белоусов В.В., Зоров Д.Б., Викторов И.В., Исаев Н.К. Повышение устойчивости к гипоксии клеток-зерен мозжечка с помощью кислорода. //Материалы 3 Всероссийской конференции: «Гипоксия:

механизмы, адаптация коррекция». - М. - 2002. - С. 117.

51. Стельмашук Е.В., Андреева Н.А., Белоусов В.В., Исаев Н.К. Фармакологическое прекондиционирование уабаином при моделировании гипоксии in vitro. //Материалы Всероссийской конференции: «Гипоксия: механизмы, адаптация коррекция». - М. - 2002.

- С. 116.

52. Стельмашук Е.В., Андреева Н.А., Исаев Н.К. Влияние снижения активности Na+/K+АТФазы на индуцированный стауроспорином апоптоз культивированных клеток-зерен. // Материалы конференции «Пластичность и структурно-функциональная взаимосвязь коры и подкорковых образований мозга». - М. - 2003. - С. 86.

53. Стельмашук Е.В., Беляева Е.А., Андреева Н.А., Исаев Н.К. Влияние стауроспорина и снижения внеклеточного рН на жизнеспособность клеток-зерен мозжечка в зрелых и незрелых клеточных культурах. //Материалы конференции по проблеме «Механизмы синаптической передачи». - М. - 2004. - С. 90.

54. Манухова Л.А, Стельмашук Е.В., Зоров Д.Б., Исаев Н.К. Исследование влияния токсического действия клотримазола на культивированные клетки мозжечка крыс.

//Материалы конференции по проблеме «Механизмы синаптической передачи». - М. - 2004. - с. 55.

55. Исаев Н.К., Стельмашук Е.В., Андреева Н.А., Беляева К.А., Зоров Д.Б. Защитное действие витамина К3 при химической гипоксии культивированных клеток-зерен мозжечка крыс. //3 Российском конгрессе по патофизиологии с международным участием. - М. - 2004. - C. 214.

56. Беляева Е.А., Стельмашук Е.В., Зоров Д.Б., Исаев Н.К. Сурамин и базиленовый синий снижают продукцию свободных радикалов, индуцированную глюкозной депривацией в клетках-зернах мозжечка. //4 Всероссийская конференция с международным участием «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция». - 2005. - С. 13.

57. Стельмашук Е.В., Беляева Е.А., Андреева Н.А., Исаев Н.К. Снижение жизнеспособности культивированных клеток-зерен мозжечка при ацидозе. //V Международная конференция по функциональной нейроморфологии «Колосовские чтения — 2006». - С.Пб. - Морфология. - 2006. - т. 129. - № 2. - С. 91.

58. Стельмашук Е.В., Исаев Н.К. Совместное влияние окислительного стресса и ацидоза на жизнеспособность гранулярных нейронов мозжечка в зрелых и незрелых клеточных культурах. //Тезисы докладов ХХ съезда физиологического общества им. И.П. Павлова. - М. -2007. - С. 432.

59. Исаев Н.К., Стельмашук Е.В. Окислительный стресс усиливает токсичность глутамата в незрелых культурах зернистых нейронов мозжечка. Тезисы докладов ХХ съезда физиологического общества им. И.П. Павлова. - М. - 2007. - С. 42.

60. Стельмашук Е.В., Исаев Н.К. Ацидоз вызывает снижение уровня цитоплазматического кальция и мембранного потенциала митохондрий в культивированных клетках-зернах мозжечка. //Неврологический вестник. - 2007. - 39, в. 1 (приложение к журналу) Материалы научного конгресса «Бехтерев – основоположник нейронаук: творческое наследие, история и современность». - с. 239.

61. Исаев Н.К., Стельмашук Е.В. Исследование изменений кальциевого баланса и энергетического состояния митохондрий в незрелых клетках-зернах мозжечка при глюкозной депривации. //Неврологический вестник. - 2007. - т. 39, в. 1 (приложение к журналу) Материалы научного конгресса «Бехтерев – основоположник нейронаук:

творческое наследие, история и современность». - С. 131.

62. Исаев Н.К., Стельмашук Е.В. Форсколин защищает незрелые культивированные зернистые нейроны мозжечка от гибели, индуцированной ацидозом. //Тезисы докладов конференции с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга». - С-Пб. -2008. - С. 61.

63. Стельмашук Е.В., Исаев Н.К. Исследование влияния глутамина на жизнеспособность незрелых культивированных зернистых нейронов мозжечка при химической гипоксии.

//Тезисы докладов конференции с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга». - 2008. - СПб. - С. 136.

64. Лозиер Е.Р., Джанибекова Н.А, Стельмашук Е.В., Исаев Н.К. Глюкозная депривация потенцирует токсическое воздействие уабаина и глутамата на культивированные нейроны различных сроков культивирования. //Тезисы докладов конференции с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга». - Спб. - 2008. - с 81.

65. Романова Г.А., Шакова Ф.М., Барсков И.В., Стельмашук Е.В., Назаренко М.Е., Соколов М.А. Ишемические очаговые повреждения коры; коррекция когнитивных расстройств и объема повреждения целлексом". //Патогенез. 3. 2008. с. 84 (Тезисы докладов 5ой конференции "Гиппоксия: механизмы, адаптация,коррекция". - М. - 2008.) 66. Плотников Е.Ю.,. Бакеева Л.Е, Барсков И.В., Егоров М.В., Исаев Н.К., Капелько В.И., Казаченко А.В., Кирпатовский В.И., Козловский С.В., Лакомкин В.Л., Левина С.В., Писаренко О.И., Сапрунова В.Б., Серебрякова Л.И., Силачев Д.Н., Скулачев М.В., Стельмашук Е.В., Студнева И.М., Цкитишвили О.В., Васильева А.К.,. Викторов И.В, Зоров Д.Б., Скулачев В.П. Производное пластохинона, адресованное в митохондрии, как средство, прерывающее программу старения. Терапия некоторых старческих патологий, опосредованных АФК (сердечной аритмии, инфарктов сердца и почки и инсульта головного мозга). //Второй Международный форум по нанотехнологиям (научнотехнической секции «Нанотехнологии в медицине: иммунологичекие препараты и адресная доставка лекарств») Тезисы докладов. - М. - 2009. Сайт тезисов:

http://rusnanotech09.rusnanoforum.ru/Post.aspx/Show/23687.

67. Исаев Н.К., Мергентхалер Ф., Фраер Д., Стельмашук Е.В., Маизел А. Роль глутамина в нейрональной гибели, индуцированной ишемией, гипогликемией и гипоксией. //Шестой Международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии». - Судак. - 2010. Труды /под ред. Лосевой Е.В. Логиновой Н.А.

Синельниковой В.В. М.: МАКС Пресс. 2010. - С. 143-144.

68. Горячева Е.С., Лозиер Е.Р., Исаев Н.К., Стельмашук Е.В. Глутамин модулирует токсическое воздействие ротенона, уабаина и NMDA на незрелые культивированные зернистые нейроны мозжечка. //ХХI Съезд Физиологического общества им. И.П.Павлова.

Тезисы докладов. – М. – Калуга: Типография ООО "БЭСТ-принт". 2010. - С. 156-157.

69. Стельмашук Е.В., Новикова С.В., Алиева И.Б., Узбеков Р.Э., Исаев Н.К. Морфофункциональное состояние культивированных зернистых нейронов мозжечка крыс при глюкозной депривации и влияние глутамина на их жизнеспособность. //Материалы докладов X конгресса международной ассоциации морфологов. Ярославль, 29-сентября 2010 г. Морфология — 2010. - т. 137. - №4. - C. 86.

70. Zorov D.B., Isaev N.K., Plotnikov E.Y., Silachev D.N., Chupyrkina A.A., Pevzner I.B., Khryapenkova T.G., Jankauskas S.S., Morosanova M.A., Danshina M.I., Goryacheva E.S., Lozier E.R., Stelmashook E.V. Effects of SkQs on oxidative stress-mediated injuries of kidney and brain. //International Workshop "From Homo sapiens to Homo sapiens liberatus”. - М.- 2010. - р. 8-9.

71. Стельмашук Е.В., Новикова, Исаев Н.К. Роль Zn2+ и Са2+ в гибели нейронов, индуцированной ацидозом. Нейронаука для медицины и психологии: 7-й Международный междисциплинарный конгресс. Судак, Крым, Украина, 3-13 июня 20г.: Труды /под ред. Лосевой Е.В. Логиновой Н.А. - М.: МАКС Пресс. - 2010. - С. 404.

72. Силачев Д.Н., Исаев Н.К., Стельмашук Е.В., Барсков И.В., Новикова С.В., Певзнер И.Б., Плотников Е.Ю., Зорова Л.Д., гуляев М.В., Пирогов Ю.А., Горячева Е.С., Лоизер Е.Р., Скулачев В.П., Зоров Д.Б. Новое поколение митохондриальнонаправленных антиоксидантов обладает нейропротекторным действием. //Материалы Седьмой национальной научно-практической конференци с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека». - Смоленск.- 2011. - С. 260-262.

73. Лозиер Е.Р., Исаев Н.К., Узбеков Р.Э., Алиева И.Б., Новикова С.В. Стельмашук Е.В. Цинк потенцирует токсическое действие каината на культивированные зернистые нейроны мозжечка. //Тезисы докладов 6й Российской конференции с международным участием "Гиппоксия: механизмы, адаптация,коррекция", Москва 11-13 октября 2011 г. Патогенез. - 2011. - т. 9. - № 3. - С. 43.

Жирным шрифтом выделены журналы, рекомендованные ВАК РФ.

Обзорные статьи Исаев Н.К., Андреева Н.А., Стельмашук Е.В., Зоров Д.Б. Роль митохондрий в механизмах токсического действия глутамата. //Биохимия. - 2005. - т. 70. в. 6. с.

741-750.

Исаев Н.К., Стельмашук Е.В., Зоров Д.Б. Клеточные механизмы гипогликемии. //Биохимия. - 2007. - т. 72. - в. 5. - С. 586-595.

Зоров Д.Б., Исаев Н.К., Плотников Е.Ю., Зорова Л.Д., Стельмашук Е.В., Васильева А.К., Архангельская А.А., Хряпенкова Т.Г. Митохондрия как многоликий Янус. //Биохимия. - 2007. - т. 72. - в. 10. - С. 1371-1384.

Исаев Н.К., Стельмашук Е.В., Плотников Е.Ю., Хряпенкова Т.Г., Лозиер Е.Р., Долудин Ю.В., Силачев Д.Н., Зоров Д.Б. Роль ацидоза, NMDA-подтипа глутаматных рецепторов и кислоточувствительных каналов (ASIC1a) в развитии нейрональной гибели при ишемии. //Биохимия. 2008. т. 73. в. 11. с. 1461-1466.

Stelmashook E.V., Isaev N.K., Lozier E.R., Goryacheva E.S., Khaspekov L.G. Role of glutamine in neuronal survival and death during brain ischemia and hypoglycemia.

//Int. J. Neurosci. 2011. v. 121 N 8. p. 415-422.

Список сокращений.

АФК – активные формы кислорода ГД - глюкозная депривация КЗН - культивированные зернистые нейроны MK-801 - (+)-5-метил-10,11-дигидро-5Н-дибензо(a,d)цикло-гептен-5,10-имин малеат Р123 - родамин 1ТМРЭ – этиловый эфир тетраэтилродамина Уа - уабаин ATP - аденозин три фосфат BAPTA - 1,2-бис(o-аминофенокси)етан-N,N,N',N'-тетрауксусная кислота [Ca2+], [Ca2+] - внеклеточная и внутриклеточная концентрация Са2+, соответственно e i CCCP - карбонил-1-цианид-3-хлорофенил гидрозон DIV - сутки in vitro EIPA - 5-(N-этил-N-изопропил)амилорид Glu - глутамат NMDA - N-метил-D-аспартат рН рН - внеклеточный, внутриклеточный рН (отрицательный десятичный логарифм е, i концентрации ионов Н+), соответственно SkQR1 - 10-(6-пластохинонил) додецилродамина TPEN - тетракис-(2-пиридилметил)этилендиамин - митохондриальный мембранный потенциал m






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.