WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ Институт физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина Российской академии наук

На правах рукописи

СОКОЛОВ ВАЛЕРИЙ СЕРГЕЕВИЧ

ЛОКАЛЬНОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ ЗАРЯДОВ В МЕМБРАНЕ ПРИ АДСОРБЦИИ И ИОННОМ ТРАНСПОРТЕ

Специальность 03.01.02 – Биофизика автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук Москва, 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физической химии и электрохимии им. А.Н.Фрумкина РАН

Официальные оппоненты:

Доктор физико-математических наук, профессор Антонов Валерий Федорович Доктор физико-математических наук, профессор Яковенко Леонид Владимирович Доктор химических наук Малев Валерий Вениаминович

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт биохимической физики им.

Н.М.Эмануэля РАН

Защита состоится 2012 года в на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д.501.001.96 Биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет, кафедра Биофизики, аудитория «Новая».

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова

Автореферат разослан « » _ _ 2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор Введение В настоящее время бурно развивается направление, которое называют молекулярной биологией клетки; ее важным разделом является биофизика мембран. Важность этого направления обусловлена тем, что мембранные структуры, широко представленные в клетке, выполняют множество функций: барьерную, информационную, обеспечивая генерацию и передачу нервного импульса, и энергетическую, осуществляя синтез АТФ.

Все эти функции реализуются в ходе пассивного и активного транспорта заряженных частиц через мембраны, за который ответственны белковые молекулярные машины.

Плазматическая мембрана, благодаря барьерным свойствам и транспортным белкам, поддерживает уникальный ионный состав клетки, отличающийся от состава внешней среды, что обеспечивает возможность жизни клетки в неравновесных условиях. Изучение мембранного транспорта дает ключ как к пониманию механизмов функционирования мембранных белков, так и к разработке препаратов и методов воздействия на мембранный транспорт, влияющих на функционирование отдельных клеток и организмов.

Несмотря на то, что механизм ионного транспорта изучается довольно давно, многие вопросы остаются открытыми. К ним в первую очередь относятся физические механизмы элементарных стадий переноса ионов в мембране. Мембранный транспорт включает в себя три основные стадии: диффузию в водном растворе, адсорбцию на границе раздела мембраны с водой и собственно перенос через мембрану. Предметом наших исследований является изучение двух последних стадий: адсорбция различных молекул на поверхности мембраны и собственно транспорт через липидный бислой, как пассивный, осуществляемый либо в результате прямого прохождения, либо с помощью ионофоров, так и активный, реализуемый Na,K,АТФ-азой. Скорость каждой из стадий определяется скачком электрического потенциала на соответствующем участке пути. Однако, детальное исследование влияния локальных электрических полей на отдельные стадии ионного транспорта не удавалось изучить из-за недостатка экспериментальных методов их регистрации. В настоящей работе были разработаны как новых экспериментальные методы измерения граничных и внутримембранных скачков потенциала, так и оригинальные подходы к изучению механизма ионного транспорта, в частности, регистрации токов смещения при функционировании Na,K,АТФ-азы.

На скорость отдельных стадий ионного транспорта могут влиять биологическиактивные соединения, молекулы которых встраиваются на границе мембраны и изменяют распределение электрического поля на границе мембраны с водой. Изучение взаимодействия таких соединений с липидной мембраной имеет как фундаментальное значение, поскольку они служат инструментом для изучения ионного транспорта, так и прикладное, поскольку многие из них из них являются лекарственными препаратами.

Эффективность действия этих соединений определяется не только способностью их связывания с мембраной, но и тем, на какой глубине в мембране это связывание происходит. В настоящей работе изучается связывание с липидной мембраной молекул различных соединений, обладающих заряженными группами. Глубина расположения заряженных групп в мембране определяется с помощью методов, позволяющих измерять скачки потенциала в плоскостях, расположенных на различном расстоянии от границы раздела мембраны с водой. На примере нескольких соединений, которые сами по себе представляют интерес, поскольку являются лекарственными препаратами, либо зондами, были установлены основные закономерности их адсорбции.

Актуальность Актуальность данного исследования определяется тем, что ионный транспорт необходим для поддержания жизнедеятельности клетки, и изучение функционирования молекулярных машин, осуществляющих этот транспорт, является одной из основных задач клеточной биологии. Установление молекулярного механизма ионного транспорта невозможно без знания окружения, в котором работают молекулярные устройства, осуществляющие ионный транспорт. Важным этапом в таком исследовании является установление детальной картины строения электрического поля в липидном бислое, в который встроены ионные переносчики. Решение этих задач потребовало создания нового направления, в котором исследуются локальные электрические поля в липидной мембране и способы их изменения. Это, в свою очередь, потребовало создания новых экспериментальных методов регистрации этих полей.

Научная новизна Большинство результатов было получено с помощью разработанных нами оригинальных методов. В первую очередь к ним относится метод компенсации внутримембранного электрического поля,, который позволил детально регистрировать и контролировать локальные электрические поля в мембране при адсорбции на ней различных соединений и при работе молекулярных машин, осуществляющих ионный транспорт. В результате исследований были открыты и изучены явления, которые ранее были недоступны для наблюдения: кинетика адсорбции заряженных и нейтральных молекул на границе БЛМ, электронейтральный транспорт органических ионов через мембрану, скачки потенциала, возникающие на границе мембраны при окислительных реакциях. Было показано, что, вопреки распространенной в литературе точке зрения, продукты цикла зрительного родопсина не разрушают мембраны как детергенты. Они обладают свойствами слабых фотосенсибилизаторов, но основную роль в гибели эпителиальных клеток играют продукты их автоокисления под действием освещения.

Изучение влияния граничных потенциалов на индуцированную проводимость позволило установить механизм электрогенного обменного транспорта, осуществляемого антибиотиками нигерициновой группы, что, в свою очередь, позволило объяснить необычные свойства трансмембранных потенциалов при градиентах участвующих в транспорте ионов. Разработанный в работе метод адмиттанса для исследования механизма переноса заряда в натриевом насосе позволил изучить те стадии переноса заряда при функционировании Na,K,ATP-азы, которые были недоступны для изучения с помощью традиционных электрофизиологических методов.

Практическая ценность Практическая значимость работы состоит в том, что она позволяет детально исследовать биологически активные соединения, механизм действия которых включает их связывание с мембраной. Особое значение имели исследования взаимодействия с липидной мембраной фотосенсибилизаторов, использующихся при лечении онкологических заболеваний. Изучены различные стадии действия фотосенсибилизаторов на мембрану: их связывание на поверхности, а также механизмы разрушения как самих мембран, так и встроенных в них молекул-мишеней активными формами кислорода, образующимися при освещении. Было также исследовано взаимодействие с мембраной продуктов цикла зрительного родопсина, накопление которых в клетках зрительного эпителия приводит к развитию возрастной дегенерации сетчатки глаза. Эти исследования могут иметь существенное значение для разработки эффективных средств лечения данных заболеваний.

Публикации По материалам диссертации опубликовано 53 статьи в ведущих международных и отечественных журналах, включенных в список ВАК. Biophysical Journal,. Biochimica et Biophysica Acta, European Biophysical Journal, Journal of Photochemistry and Photobiology, J.

Membrane Biol., Bioelectrochemistry, Доклады Академии Наук СССР, Биофизика, Биологические мембраны. Автор участвовал в публикации нескольких обзоров: в журнале Биологические мембраны (1999), а также в сборниках Planar Lipid Bilayers (BLMs) and their applications. editors H.T.Tien and A.Ottova-Leitmannova, Elsevier (2003); Ultrathin Electrochemical Chemo- and Biosensors: Technology and Performance. editor V.M.Mirsky.

Springer-Verlag, Heidelberg (2004).

Апробация Полученные нами результаты докладывались на авторитетных конференциях:

съездах Американского биофизического общества, (1996, Baltimore, 2001, New Orlean, 2007, Baltimore), Европейского биофизического общества (2007, London, UK; 2009, Genue, Italy) Съездах биофизиков России (Москва, 1982, Москва, 1999; Воронеж, 2004), Международных конференциях по Na,K,ATP-азе (1993, Toodmos, Germany, 1997, Argentine; 2003, Elsenor, Denmark; 2008, Aarhus, Denmark), Международных Фрумкинских симпозиумах.

Диссертация состоит из введения и 5 глав, в которых содержится литературный обзор, описание использованных в работе методов, а также результаты экспериментального исследования. В литературном обзоре представлены современные представления о строении электрического поля в мембране, способах измерения скачков потенциала на границе мембраны с раствором, влиянии различных соединений на ионный транспорт через мембрану посредством изменения этих скачков потенциала, а также о механизме активного транспорта, осуществляемого Na,K,ATP-азой. Результаты исследований содержатся в трех разделах, организованных в виде отдельных глав.

Первый раздел посвящен исследованию адсорбции заряженных и нейтральных дипольных молекул на поверхности БЛМ. Сначала с помощью различных экспериментальных методов и теоретических моделей изучены основные закономерности их адсорбции. Далее приводятся результаты, полученные при изучении взаимодействия с БЛМ важных для медицины соединений – продуктов цикла зрительного родопсина и фотосенсибилизаторов, используемых при лечении раковых заболеваний. Во втором разделе излагаются результаты исследования электрогенного обменного транспорта, осуществляемого антибиотиками нигерициновой группы, а также активного транспорта, осуществляемого Na,K,ATP-азой.

1. Адсорбция заряженных или дипольных молекул на БЛМ Исследование адсорбции различных соединений на БЛМ проводили с помощью трех методов, которые дополняют друг друга. Он позволили определить изменение потенциала в разных плоскостях по отношению к поверхности БЛМ. Эти методы включают в себя как оригинальный метод компенсации внутримембранного поля (КВП), так и широко известные, такие как измерение -потенциала по электрофоретической подвижности липосом, а также определение скачков потенциала в мембране на основании измерения кинетических параметров пассивного ионного транспорта. Как будет показано ниже, совокупность этих методов позволяет не только установить факт адсорбции молекул на БЛМ, но и их погружение внутрь липидного бислоя, либо проникновение сквозь бислой.

1.1. Измерение разности граничных потенциалов БЛМ методом компенсации внутримембранного поля по второй гармонике емкостного тока Для измерения разности граничных потенциалов асимметричных БЛМ нами был предложен метод компенсации внутримембранного поля (КВП), основанный на способности мембраны сжиматься в электрическом поле, уменьшая свою толщину и увеличивая электрическую емкость. (Alvares and Latorre, 1978). Принцип измерения можно иллюстрировать с помощью упрощенной модели, в которой мембрана представлена в виде трех последовательно соединенных конденсаторов (рис.1). Внешние конденсаторы C1 и C3 представляют полярные области мембраны, где возникают граничные потенциалы, внутренний конденсатор C2 - гидрофобную область мембраны, способную сжиматься в электрическом поле. Из-за того, что гидрофобная область мембраны имеет большую толщину и более низкую диэлектрическую проницаемость по сравнению с областями, где расположены головки фосфолипидов, емкость внутреннего конденсатора много меньше емкостей внешних конденсаторов. Поэтому именно на Cпадает основная часть приложенного внешней цепью напряжения, что позволяет полагать именно эту область мембраны ответственной за ее сжатие в электрическом поле.

in bI bII U = b U I II in b b С С С 1 Рис.1. Сверху - профиль распределения электрического потенциала на мембране в условиях короткозамкнутой цепи (сплошная линия) и компенсации внутримембранного поля (пунктир). Снизу – модель, представляющая гидрофобную область мембраны и ее полярные области в виде электрических конденсаторов.

Падение напряжения in на внутреннем конденсаторе (которое и определяет внутримембранное поле) равно сумме напряжения U, приложенного внешней цепью, и разности падений напряжений на внешних конденсаторах b=b’-b’’ (т.е., разности граничных потенциалов).

in =U -b (1) Если граничные потенциалы с двух сторон мембраны различны, в условиях короткозамкнутой цепи (т.е., при U=0) возникает внутримембранное поле (рис. 1, сплошная линия). Значение b измеряют как напряжение между растворами, которое компенсирует это внутримембранное поле, в результате чего достигается минимальное значение емкости мембраны. Мы предложили удобный способ измерения b, основанный на регистрации второй гармоники емкостного тока. Генерация высших гармоник происходит из-за того, что мембрана является нелинейным конденсатором, зависимость емкости которого от напряжения имеет минимум при U=b. Эту зависимость при малых изменениях емкости можно аппроксимировать первым членом разложения в степенной ряд вблизи точки минимума C = C0[1+ (U - b ) ], (2) где C0 – значение емкости в точке минимума, - коэффициент, характеризующий способность мембраны сжиматься в электрическом поле. Пусть U изменяется во времени по закону U = U0 +Vcos(t), (3) где U0 - постоянная составляющая напряжения, V - амплитуда и - круговая частота переменной составляющей напряжения. Тогда ток, регистрируемый во внешней цепи, содержит, помимо основной, вторую и третью гармоники.

V 2 (4) I = -VC01+ 3(U0 - b) + (t)- (Usin 3C0V - b)sin(2t)- C0V sin(3t) 2 Амплитуда второй гармоники пропорциональна U0-b - отклонению постоянной составляющей напряжения от точки минимума емкости (или постоянной составляющей внутримембранного поля).

I2 = 3C0V (U0 - b) (5) Таким образом, разность граничных потенциалов b можно определить как величину постоянной составляющей напряжения U0, обращающей этот сигнал в ноль.

Преимуществом данного метода является высокая точность измерения b благодаря использованию селективных усилителей, а также возможность автоматической компенсации второй гармоники с помощью обратной связи, что дает возможность регистрации кинетики изменения граничных потенциалов на БЛМ.

С помощью описанного выше метода КВП и других методов мы исследовали изменение граничного потенциала БЛМ при адсорбции на ней различных веществ.

Наиболее простыми из них были неорганические и органические ионы, а также электронейтральные молекулы, обладающие дипольным моментом. Многие из этих соединений представляют отдельный интерес, и сама возможность изучения их взаимодействия с мембраной, открывшаяся благодаря данной методике, служит иллюстрацией ее перспективности для клеточной биологии.

1.2..Неорганические ионы Неорганические ионы всегда присутствуют в среде, окружающей биологические мембраны, поэтому неудивительно, что исследование влияния этих ионов на свойства мембран, в частности, на электростатические потенциалы, представляет значительный интерес (см., например, обзоры (McLaughlin, 1977; Cevc, 1990; Tocanne, 1990). Было показано, что потенциалы на границе заряженной БЛМ с растворами неорганических ионов удовлетворительно описываются теорией Гуи-Чепмена, согласно которой для 1:электролита потенциал удовлетворяет простому уравнению zFs = sh 2RT 80RTc (6) В соответствии с этим уравнением, неорганические ионы влияют на поверхностный потенциал s либо за счет изменения поверхностного заряда мембраны вследствие адсорбции на БЛМ, либо за счет экранирования существующего заряда мембраны за счет изменения их концентрации c1 в растворе. Предсказываемое данной теорией изменение потенциала происходит снаружи мембраны, в диффузном слое раствора электролита. Для определения потенциала в этой области существует удобный метод, основанный на измерении электрофоретической подвижности липосом, и сопоставление этого метода и метода КВП позволило проверить способность последнего к измерению падения потенциала в диффузном слое. При этом следует отметить, что плоскость скольжения, где определяется -потенциал, измеряемый электрофоретическим методом, не совпадает с условной поверхностью мембраны, в которой определяется поверхностный потенциал s.

Ранее было показано, что значения -потенциала можно пересчитать, пользуясь теорией Гуи-Чепмена, в поверхностные потенциалы, предположив, что плоскость скольжения отстоит от поверхности мембраны на расстоянии около 2 А0, и тогда они согласуются с граничными потенциалами, измеренными по изменению проводимости в присутствие нонактина (McLaughlin, 1983). Мы показали, что аналогичная процедура позволяет получить совпадение поверхностных потенциалов, пересчитанных из -потенциалов, с потенциалами, измеренными методом КВП, в случае адсорбции на БЛМ из фосфатидилхолина двухвалентных ионов магния или бериллия (рис.2).

Следует отметить, что такое хорошее совпадение, свидетельствующее, что изменение потенциала происходит только в диффузном слое, не всегда имело место даже в случае неорганических ионов. Далее будет рассмотрен целый класс соединений, где потенциалы, измеренные данными методами, не совпадали, и это позволило сделать вывод о том, что плоскость, где расположены заряды адсорбированных соединений, погружена в мембрану.

-5 -4 -3 -2 -1 log(Me), M Рис.2. Зависимость изменения граничного потенциала бислойной липидной мембраны, сформированной из диолеилфосфатидилхолина, при адсорбции на ней двухвалентных ионов бериллия (кружки) и магния (треугольники) от концентрации этих ионов в растворе. Черными символами показаны потенциалы, измеренные на липосомах методом измерения электрофоретической подвижности, белые символы – потенциалы, измеренные на БЛМ методом КВП.

1.3. Амфифильные ионы Амфифильные ионы представляют собой органические молекулы, имеющие гидрофобные группы на одном конце и заряженные полярные группы – на другом. Мы изучили адсорбцию ряда амфифильных ионов на БЛМ с помощью трех методов: КВП, электрофоретической подвижности, и по изменению индуцированной проводимости.

Было показано, что адсорбция амфифильных ионов на мембране, в отличие от неорганических ионов, сопровождается погружением их заряженных групп в мембрану, а в ряде случаев - проникновением ионов через мембрану в электронейтральном виде по механизму, включающему в себя протонирование или депротонирование ионов на границах мембраны.

Зависимость потенциала от ионной силы. «Неэкранируемый скачок потенциала».

Нами было показано, что граничный потенциал, образующийся на БЛМ при адсорбции амфифильных ионов, зависит от ионной силы раствора значительно слабее, чем следует из теории Гуи-Чепмена. Для объяснения этого экспериментального факта было выдвинуто предположение, что заряженные группы амфифильных ионов s , мВ погружаются в мембрану. Аналогичное предположение высказывалось ранее в литературе при изучении гидрофобных ионов, которые, в отличие от амфифильных, свободно проникают через мембрану, увеличивая ее проводимость. Согласно простейшей модели (Andersen et al, 1978), граничный потенциал состоит из двух частей.

b = s + (7) Первое слагаемое - падение потенциала в диффузном слое, или поверхностный потенциал - экранируется электролитом в растворе (т. е. зависит от его концентрации в соответствии с теорией Гуи - Чепмена). Вторая часть - - возникает в примембранном слое между плоскостью адсорбции ионов и границей мембраны с водой, куда не могут свободно проникать ионы электролита из раствора. Этот потенциал не зависит от концентрации электролита, и поэтому, в соответствии с (Krasne et al, 1983), он был назван неэкранируемым скачком потенциала. Неэкранируемый потенциал пропорционален суммарному поверхностному заряду адсорбированных ионов .

= / с (8) где c - емкость поверхностного слоя мембраны, в котором происходит погружение ионов.

Величина связана с концентрацией ионов в растворе Ca распределением Больцмана zFb = zKCa exp(- ) RT, (9) где z – валентность ионов, K – константа связывания.

Зависимость граничного потенциала b от ионной силы тем слабее, чем больше вклад «неэкранируемого» скачка потенциала , т.е., чем глубже в мембране происходит адсорбция ионов. Слабая зависимость потенциала от ионной силы, свидетельствующая о возникновении неэкранируемого потенциала, наблюдалась нами для многих амфифильных ионов различной структуры. На рис.3 показаны измеренные методом КВП зависимости изменения граничного потенциала от концентрации в растворе амфифильных ионов 4 различных видов: анионов додецилсульфата натрия (SDS) и флуоресцентного красителя (ANS), а также катионов ремантадина (REM) и тетракаина при разных концентрациях KCl. Рассмотренная выше теория (сплошные кривые) позволила объяснить зависимость изменения граничного потенциала БЛМ от ионной силы раствора и концентрации адсорбируемых ионов в растворе. В некоторых случаях зависимость граничного потенциала от концентрации амфифильных ионов имела высокий наклон, который не мог быть описан рассмотренной выше теорией. Такой высокий наклон был объяснен нами с помощью более сложной теории, учитывающей дискретность распределения электрического поля адсорбированных ионов в мембране и их электрическое и неэлектрическое взаимодействия (Козлов и др., 1982).

Распределение электрического поля на границе мембраны с водой Неэкранируемый потенциал, образующийся между плоскостью адсорбции ионов и поверхностью мембраны, можно обнаружить, измеряя потенциалы в плоскостях, расположенных на разных расстояниях по отношению к ее границе. Наиболее информативным оказалось сопоставление результатов измерения -потенциала и граничного потенциала, измеренного методом КВП. Первый метод определяет потенциал в плоскости скольжения снаружи мембраны, второй – в плоскости, расположенной внутри мембраны вблизи ее гидрофобной области. Как можно видеть на рис. 3, граничный потенциал, измеренный методом КВП на плоских мембранах, значительно превышает потенциал, измеренный электрофоретическим методом на липосомах, причем различие потенциалов зависит от структуры амфифильных ионов, что влияет, очевидно, на глубину их погружения в мембрану.

100 150 0 -5 -4 -5 -4 -log (SDS-), M Log (ANS), M 1-5 -4 -3 -5 -4 -3 -log(REM), M log(Tetracain), M Рис.3. Зависимость изменения граничного потенциала при адсорбции на бислойной липидной мембране амфифильных ионов от их концентрации в растворе. Белыми символами показаны потенциалы, измеренные на липосомах методом измерения электрофоретической подвижности, черные символы – потенциалы, измеренные на БЛМ методом КВП. Треугольниками отмечены результаты измерений в растворе 0,01 М KCl, кружками – в 0,1 М KCl. Сплошными линиями изображены теоретические кривые, построенные по уравнениям (6-10).

b b , мВ , мВ b b , мВ , мВ Мы изучали также распределение потенциала внутри мембраны, сравнивая потенциалы, измеренные методом КВП, и методом, основанным на измерении кинетических параметров транспорта через БЛМ гидрофобных анионов. Влияние граничного потенциала на транспорт гидрофобных ионов легче всего проиллюстрировать при симметричном распределении потенциала в мембране и одинаковых составах растворов по обе стороны от нее (рис. 4). Гидрофобные ионы адсорбируются в некотором приповерхностном слое мембраны. Равновесная концентрация ионов в этом слое n связана с их концентрацией в растворе и разностью потенциалов между раствором и адсорбционным слоем n распределением Больцмана (в области низких концентраций, когда можно пренебречь их взаимодействием и насыщением мест связывания). При постоянной концентрации ионов в растворе изменение n приведет к изменению их равновесной концентрации в мембране согласно уравнению n zFn =exp(- ) n0 RT, (10) где n и n0 концентрации гидрофобных ионов в мембране до и после изменения граничного потенциала. Симметричное изменение граничных потенциалов с двух сторон мембраны вызывает изменение высоты потенциального барьера для ионов, причем на него влияет только та часть граничного потенциала, которая падает между плоскостью адсорбции гидрофобных ионов и плоскостью симметрии мембраны (рис. 4).

2I, нА 1 I q t, мс b 10 C C W W n n Рис.4. Слева - влияние симметричного изменения граничных потенциалов с двух сторон БЛМ на транспорт гидрофобных ионов. Сплошная линия на верхнем рисунке – первоначальный профиль потенциала в мембране, пунктирная – измененный профиль после адсорбции с двух сторон амфифильных ионов. На нижнем рисунке – разность этих профилей (в увеличенном масштабе). Справа – определение кинетических параметров транспорта гидрофобных ионов I0, и q методом релаксации тока. Подробности в тексте Изменение этой разности потенциалов приведет к изменению константы скорости перемещения ионов в мембране (если рассматривать это перемещение как прыжки через потенциальный барьер) согласно уравнению zF = exp(- ) RT (11) где 0 и - константы скорости перемещения ионов в мембране до и после изменения граничных потенциалов. Если проводимость мембраны пропорциональна произведению концентрации гидрофобных ионов в мембране n на константу скорости их перемещения , то, перемножив уравнения (13) и (14), можно получить простую формулу, описывающую изменение проводимости при изменении граничного потенциала.

g zFb = exp(- ) g0 RT (12) Эта формула, впервые полученная (Lesslauer et al, 1967), связывает изменение проводимости g с изменением граничного потенциала b между объемом раствора и плоскостью симметрии мембраны. Она широко использовалась для определения граничного потенциала на БЛМ с помощью измерения проводимости, индуцированной различными ионофорами (см., например, обзор McLaughlin, 1977). Если удается определить изменение не только суммарной проводимости g, но и параметров n и , то из уравнений (10) и (11) можно получить информацию о распределении граничного потенциала в мембране, разделив суммарный скачок b на 2 части. Одна из них, n падает между объемом раствора и плоскостью адсорбции гидрофобных анионов, другая, - между этой плоскостью и серединой БЛМ (рис.4).

В экспериментах мы использовали гидрофобные анионы тетрафенилбората (ТФБ) или дипикриламина (ДПА), механизм транспорта которых через мембрану хорошо изучен. Кинетические параметры транспорта определяли с помощью метода релаксации тока. В соответствии с (Andersen and Fuchs, 1975), значение константы скорости перемещения гидрофобных ионов через мембрану определяли как обратную постоянную времени экспоненциального спада тока , количество ионов в мембране полагали пропорциональным суммарному заряду q, перенесенному через мембрану, который определяли как интеграл аппроксимирующей ток экспоненты, а по амплитуде экспоненты I0 определяли начальную проводимость. С помощью данного метода была исследована адсорбция амфифильных анионов SDS. Полученные результаты показаны на рис. 5.

Видно, что величина b, измеренная методом КВП, близка к полученной из изменения начальной проводимости БЛМ (формула 12). Адсорбция SDS влияла на изменение суммарной проводимости в основном только за счет изменения коэффициента распределения гидрофобных ионов между мембраной и водой (n согласно формуле (10)), но практически не влияет на скорость транспорта этих ионов через мембрану (,, согласно формуле (11)). Полученные результаты показывают, что плоскость адсорбции ионов SDS расположена в мембране на меньшей глубине по сравнению с плоскостью адсорбции гидрофобных ионов, что неудивительно, если принять во внимание что глубина погружения плоскости адсорбции ионов в мембрану тем больше, чем большая степень их гидрофобности.

1-5,5 -5,0 -4,5 -4,log (SDS-), M Рис.5. Изменения n, (темные точки) и потенциалов в гидрофобной области мембраны (светлые точки), рассчитанные по данным измерения постоянной времени релаксации тока в зависимости от концентрации SDS в растворе. Для сравнения приведены значения n, измеренные методом КВП (крестики). БЛМ сформирована из L--фосфатидилхолина (50 мг/мл декана) в растворе 0,5 М КС1.

Кружками отмечены результаты измерения с ДПА, треугольниками - с ТФБ.

Электронейтральный транспорт амфифильных ионов через мембрану Метод КВП позволяет изучать адсорбцию на мембранах тех соединений, молекулы которых не могут проходить через БЛМ. Они адсорбируются и изменяют скачок потенциала на границе с одной стороны БЛМ, а граничный потенциал с противоположной стороны остается неизменным. Однако, имеется ряд соединений, молекулы которых способны проходить через БЛМ и изменять граничные потенциалы на обеих ее сторонах.

Мы показали, что амфифильные ионы могут проникать через мембрану по механизму электронейтрального транспорта. Этот транспорт связан с протонированием/депротонированием ионов на границе мембраны с водой, в результате чего ионы превращаются в электронейтральные молекулы, которые проходят через мембрану на противоположную границу, где опять превращаются в ионы. С помощью метода КВП нами был изучен механизм такого транспорта на примере лекарственного b , мВ препарата против гриппа ремантадина (REM), который является амфифильным катионом и слабым основанием. Механизм транспорта приведен на рис. 6, слева. Вследствие транспорта заряженные формы REM при его добавлении с одной стороны БЛМ появляются на обеих границах мембраны. Это доказывает эксперимент, согласно которому разность b, измеренная методом КВП при одностороннем введении REM, оказывается значительно меньше изменения потенциала на каждой из границ мембраны при симметричном добавлении REM в оба раствора, измеренного по изменению проводимости (рис.6, в центре). Нами было показано, что на соотношение поверхностных концентраций заряженных форм ремантадина RH+ на границах мембраны влияет разность рН между растворами.

b, мВ cis-раствор trans-раствор мембрана RHm+ RH+ RHm+ 1HS+ HS+ Rm Rm неперем неперем -3 -2 -1 1 2 pH слой слой --4 -3 -log[REM], M Рис.6. Слева – схема электронейтрального транспорта ремантадина через БЛМ. В центре – зависимость изменения граничного потенциала от концентрации REM в растворе с одной стороны БЛМ, измеренного методом КВП при рН 7.5 (кружки) и 5.0 (звезды), а также по изменению проводимости в присутствии пентахлорфенола (треугольники) или нонактина (перевернутые треугольники) при введении REM с обеих сторон БЛМ. Справа – зависимость b, измеренного методом КВП, от разности рН с двух сторон БЛМ.

Зависимость разности граничных потенциалов при введении REM в раствор с одной стороны БЛМ (которую будем называть цис-стороной) от pH, получаемой за счет изменения рН в противоположном растворе (с транс-стороны) представлена на рис. 6, справа. Видно, что b при увеличении pH растет, выходя на предельное значение при pH около 2. Как мы показали, в этих условиях вся заряженная форма REM расположена на границе мембраны с цис-стороны, в то время как ее концентрация с транс стороны оказывается ничтожно малой. Таким образом, предельное изменение потенциала, регистрируемое методом КВП при высоком pH, представляет собой изменение потенциала, вызванное адсорбцией REM только на цис - границе, когда его транспортом через мембрану можно пренебречь. Если рН в транс - отсеке изменять в другую сторону, b уменьшается до нуля, а при дальнейшем изменении рН даже изменяет знак. Это соответствует другому предельному случаю, когда из-за транспорта REM через мембрану концентрация заряженной формы с транс стороны БЛМ оказывается выше, чем с цис b , мВ стороны. Электронейтральный транспорт РЕМ через мембрану подавляется при низких значениях рН с двух сторон БЛМ, когда концентрация нейтральной формы REM в БЛМ становится пренебрежимо малой. В этих условиях скачок потенциала на одной границе БЛМ, измеренный методом КВП при одностороннем введении РЕМ, совпадает со скачками на обеих границах, измеренными по изменению проводимости БЛМ при симметричном введении РЕМ (рис.6, в центре).

Перенос ремантадина через мембрану по данному механизму приводит к выделению ионов водорода на границе с цис стороны и их поглощению – с транс стороны. Это приводит к образованию градиентов рН в неперемешиваемых слоях у поверхности мембраны. Их можно обнаружить, если ввести в мембрану протонофор, сделав ее селективной по протонам, и измерять мембранный потенциал (разность потенциалов между растворами в режиме разомкнутой цепи). Образование мембранного потенциала при электронейтральном транспорте слабых кислот или оснований через мембрану было обнаружено ранее (Антоненко, 1986). Аналогичные потенциалы, вызванные образованием градиентов рН в неперемешиваемых слоях, наблюдались нами и в случае с RЕМ.

Высказывалась гипотеза, что электронейтральный транспорт и связанные с ним изменения рН играют важную роль в антивирусном действии данного препарата, поскольку известно, что фактором, вызывающим активизацию вируса и слияние его оболочки с мембраной, является понижение рН внутри эндосомы, чему такие препараты как ремантадин препятствуют.

Рассмотренный выше механизм нашел отражение в разработанной нами теоретической модели (Портнов и др., 1986), что позволило количественно описать экспериментальные зависимости разности граничных потенциалов от концентрации ремантадина и значений рН в растворах по разные стороны от мембраны. Данный механизм справедлив не только для ремантадина, но и для многих других соединений.

Так, мы наблюдали аналогичные эффекты рН на разность граничных потенциалов при адсорбции ионов тетракаина (Черный и др., 1993) и фотосенсибилизатора гематопорфирина (Стожкова и др., 1995).

1.4. Нейтральные молекулы Нами была изучена методом КВП адсорбция на БЛМ нейтральных молекул, обладающих дипольным моментом. Благодаря ориентации таких молекул на границе мембраны, они создают скачок потенциала, который называют дипольным потенциалом.

Были исследованы как «классические», широко известные соединения - флоретин и флорицин, так и ранее не изученные – стириловые красители RH 421 и его аналоги.

Флоретин и флорицин Зависимости измеренных методом КВП стационарных значений b на БЛМ от концентрации флоретина и флорицина в растворе раствор с одной стороны от мембраны представлены на рис. 7. То, что эти потенциалы – дипольные, доказывали эксперименты, согласно которым значения b не зависели от ионной силы раствора и от собственного поверхностного заряда БЛМ. В образовании дипольного потенциала участвуют нейтральные формы флоретина и флорицина, адсорбированные на БЛМ, что подтверждала зависимость b от рН: повышение рН в области, соответствующей рК этих соединений, приводило к значительному уменьшению b.

-7 -6 -5 -Log C, M Рис.7. Изменения дипольного потенциала в зависимости от концентрации флоретина (кружки) или флорицина (треугольники) в растворе, измеренные методами КВП (черные символы или по изменений проводимости БЛМ в присутствии нонактина (белые симфолы).

Потенциалы, измеренные методом КВП, были сопоставлены с потенциалами, определенными методом проводимости в присутствии нонактина. Как можно видеть на рис.7, в случае флоретина метод КВП приводил к заниженным потенциалам. Последнее связано с переходом флоретина на другую границу мембраны, что приводит к изменению дипольного потенциала с противоположной стороны и уменьшению стационарного значения b, измеренного методом КВП, но не влияет на потенциал, измеренный методом проводимости, где флоретин присутствует на обеих границах мембраны симметрично. Способность флоретина проникать через мембрану была подтверждена с помощью независимых методов (Verkman,1985; Rokitskaya et al, 1997). В случае флорицина результаты, полученные двумя методами, совпали. Это свидетельствует, что проникновением флорицина через мембрану можно пренебречь. Различие проницаемостей БЛМ для флоретина и флорецина можно объяснить тем, что молекула последнего содержит гидрофильный глюкозидный остаток, затрудняющий проникновение этой молекулы через гидрофобную область мембраны.

, мВ Стириловые красители Стириловые красители принадлежат к классу быстрых зондов электрического поля, которые изменяют спектр флуоресценции при изменении мембранного потенциала за времена порядка миллисекунд. Молекула красителя электронейтральна и обладает значительным дипольным моментом (около 10 Д), который образуют делокализованный положительный заряд в пиридиновом комплексе и локализованный отрицательный заряд на сульфогруппе. Мы исследовали изменение граничного потенциала на БЛМ при адсорбции стириловых красителей RH421, RH437, RH160 и di-8-ANEPPS и показали, что эти красители способны вызывать на границе БЛМ появление дипольного потенциала значительной величины. Этот результат показывает, что данные красители не только являются флуоресцентными зондами - индикаторами электрического поля в мембране, но и сами могут существенно влиять на его величину.

Нами было показано, что при адсорбции RH-красителей на БЛМ значительно ускорялся транспорт гидрофобных анионов ДПА и ТФБ через мембрану (рис.8). При введении RH-421 в ячейку с двух сторон БЛМ происходило уменьшение характерного времени релаксации тока при скачкообразном изменении напряжения. При этом суммарное количество гидрофобных ионов в мембране n практически не изменялось. Для сравнения приведены результаты аналогичного эксперимента с флорицином, при адсорбции которого на БЛМ происходило заметное изменение обоих параметров.

RH-4-G n -флор n g -0 20 40 60 80 100 1-0 20 40 60 80 100 1t, мин t, мин Рис.8. Изменения b, и n, вычисленные по уравнениям (13) – (15) из измерений кинетики релаксации тока в присутствии ТРВ при добавлении RH 421 (слева) и флоретина (справа) с обеих сторон мембраны в момент времени, отмеченной стрелкой.

Влияние адсорбции красителей только на постоянную времени позволяет сделать вывод, что создаваемый ими скачок потенциала происходит не на поверхности мембраны, а значительно глубже плоскости адсорбции гидрофобных ионов (а также флоретина, где изменялись и , и n). Нами было показано, что -потенциал липосом при адсорбции красителей практически не меняется. Это позволило заключить, что красители , мВ , мВ адсорбируются в виде нейтральных молекул, образуя дипольный скачок потенциала на границе мембраны. Этот скачок потенциала имеет противоположный знак («плюс» в неполярной области мембраны) по сравнению с потенциалом, создаваемым флоретином.

Зависимость относительного изменения , пересчитанного по уравнению (11) в , от концентрации RH421 в растворе изображена на рис. 9. На этом же рисунке изображены значения b, полученные методом КВП при одностороннем введении RH421 в раствор.

Они оказались значительно меньше , полученных из экспериментов с гидрофобными ионами.

101[RH 421], мкМ Рис.9. Зависимость изменения граничного потенциала от концентрации RH421 в растворе.

Белые кружки – значения, вычисленные из изменения константы скорости релаксации тока в присутствии ТФБ-. Черные кружки – результаты измерений методом КВП.

Это различие потенциалов можно было бы объяснить проникновением молекул стириловых красителей на противоположную сторону мембраны. Однако, из литературных данных, основанных на измерениях флуоресценции, известно, что эти красители не проникают через БЛМ. Мы объяснили заниженное значение граничного потенциала, полученное методом КВП, тем, что дипольные молекулы стириловых красителей слишком глубоко погружаются в мембрану. Сформулированный выше принцип измерения разности граничных потенциалов методом КВП был основан на предположении, что разделение зарядов, благодаря которому образуется граничный скачок потенциала, происходит за пределами той области мембраны, которая сжимается в электрическом поле. В частности, в модели трех конденсаторов на рис. 1 предполагалось, что вызванное адсорбцией изменение потенциала происходит на обкладках конденсаторов, моделирующих границы мембраны, но не на центральном конденсаторе, моделирующем гидрофобную область мембраны, которая сжимается в электрическом поле. Однако, если на мембране адсорбируются длинные молекулы, такие как стириловые красители, изменение электрического поля может происходить в области углеводородных , мВ цепей фосфолипидов, т.е. в гидрофобной области мембраны. В этом случае метод КВП должен давать систематическую ошибку в измерении разности граничных потенциалов.

Используя модель неоднородной упругой мембраны, мы показали, что смещение потенциала минимума емкости, которое обычно трактуется в рамках метода КВП как изменение граничного потенциала, в случае глубокого погружения дипольных молекул в мембрану оказывается заметно меньше фактического изменения граничного потенциала (Пасечник и Соколов, 2003). Эта ошибка зависит от глубины погружения. Она незначительна, если диполи расположены в неоднородной области поверхностного слоя мембраны, но резко возрастает при их погружении в однородную гидрофобную область.

Из всех изученных нами соединений метод КВП давал ошибку только в случае стириловых красителей, которые, как показали исследования кинетики транспорта гидрофобных ионов, глубже всех погружаются в БЛМ. По-видимому, глубина погружения диполей стириловых красителей настолько велика, что они попадают в гидрофобную область БЛМ с однородным распределением диэлектрической проницаемости, которая ответственна за сжатие мембраны в электрическом поле.

2. Моделирование фотодинамических реакций на БЛМ Окисление жизненно важных молекул в мембране активными формами кислорода, образующимся при фотовозбуждении фотосенсибилизаторов (ФС), лежит в основе метода фотодинамической терапии раковых клеток. По схожему механизму происходит деградация мембранных структур зрительной системы продуктами, образованными в результате метаболизма зрительного родопсина. Наибольшее значение в этих процессах имеет синглетный кислород, первичной мишенью которого в клетках мембранные белки и липиды (Красновский, 1990). Бислойные липидные мембраны являются удобной моделью, позволяющей изучить механизм данных процессов. Мы исследовали адсорбцию на БЛМ фотосенсибилизаторов, использующихся при лечении раковых заболеваний, а также продуктов цикла зрительного родопсина, имеющих свойства слабых фотосенсилизаторов. Измерение граничного потенциала позволило также регистрировать реакции окисления молекул - мишеней синглетного кислорода, а также автоокисление фотосенсибилизаторов на поверхности БЛМ при освещении.

2.1.Исследование взаимодействия продуктов цикла зрительного родопсина с БЛМ.

Это исследование направлено на выяснение механизмов развития патологических изменений сетчатки глаза, к которым, прежде всего, относится возрастная макулярная дегенерация эпителиальных клеток. Ключевая роль в развитии возрастной дегенерации сетчатки принадлежит липофусциновым гранулам или “пигменту старости”, накапливающимся с возрастом в клетках ретинального пигментного эпителия.

Липофусцин - гетерогенный комплекс, состоящий из смеси белков, липидов и ряда флуорофоров, поглощающих свет в синей области спектра. Одними из основных флуорофоров являются бис-ретинилиден этаноламин (сокращенное название А2Е) и его окисленная форма (эпокси-А2Е) (рис.10), которые мы исследовали в нашей работе O O O O O OH OH N N O O O O A2E epoxy-A2E Рис.10. Структуры А2Е и эпокси-А2Е.

Встраивание А2Е в БЛМ регистрировалось по изменению граничного потенциала БЛМ методом КВП, либо по электрофоретической подвижности липосом. При введении А2Е в раствор происходил рост b, связанный с появлением положительного заряда на поверхности мембраны вследствие адсорбции на ней А2Е (рис.11).

Б 60 А свет свет свет 20 A2E свет A2E -50 0 50 100 150 200 20 100 200 3t, мин t, мин Рис.11 Кинетики изменения граничного потенциала при адсорбции А2Е и последующем включении света (А) и чередовании условий свет-темнота (Б). Водный раствор содержал 10 мМ KCl, 1 мМ HEPES, pH=7,0. (Б) - изменение потенциала на границе мембрана/раствор при адсорбции нативного А2Е (1), а также предварительно подверженного освещению в течение 1ч.30 мин.(2), и 2ч. 40 мин (3).

Разность граничных потенциалов b, измеренных на несимметричные мембранах, один из монослоев которых состоял из смеси липида (DPhPC) с А2Е, совпадала с поверхностным потенциалом s полученным из результатов измерения -потенциала.

Совпадение потенциалов означает, что плоскость расположения зарядов адсорбированных молекул А2Е расположена на поверхности мембраны вблизи границы раздела с водой.

b , мВ b , мВ Эксперименты на БЛМ не подтвердили высказанную ранее в литературе гипотезу, согласно которой гибель эпителиальных зрительных клеток вызвана нарушением стабильности мембран под действием А2Е. Как показали наши эксперименты, встраивание до 25 мольных процентов А2Е в мембраны из дифитаноилфосфатидилхолина не приводило к заметному уменьшению их стабильности. Слабое детергентное действие А2Е было обнаружено на бислоях, содержащих заряженные фосфолипиды фосфатидилсерин или кардиолипин.

При освещении БЛМ постоянным белым светом после завершения на ней адсорбции А2Е потенциал сначала возрастал, а затем уменьшался (рис. 11, А). Причины возрастания потенциала на начальных стадиях освещения не вполне ясны. Уменьшение потенциала под действием света можно объяснить образованием эпокси-А2Е, который, будучи менее липофильным, чем исходный А2Е, десорбируется с поверхности мембраны. Это подтверждают эксперименты, в которых исследовалась адсорбция эпокси-А2Е.

Образование эпоксидов происходило в результате предварительного освещения растворов А2Е видимым светом в присутствии кислорода. В зависимости от времени освещения были получены смеси с разным соотношением А2Е и его эпокси-форм, что регистрировалось по изменению их спектров поглощения. Адсорбция образцов, предварительно экспонированных светом (кривые 2 и 3 на рис.11Б), давала меньший адсорбционный потенциал, чем исходный препарат А2Е (кривая 1). Чем больше была длительность предварительного освещения, тем меньше было изменение граничного потенциала. Освещение БЛМ приводило к дальнейшему уменьшению граничного потенциала, которое, по-видимому, вызвано продолжением образования эпокси-форм А2Е в мембране и их десорбцией с поверхности мембраны. Эти эксперименты показали, что эпоксиды не способны встраиваться в мембрану, а значит, не могут влиять ни на ее стабильность, ни на функционирование мембранных белков. Поэтому мишенью эпоксидов в клетках являются не мембраны, а водорастворимые соединения, например, нуклеиновые кислоты (Sparrow, 2003).

2.2. Исследования адсорбции фотосенсибилизаторов и моделирование фотодинамических реакций на поверхности БЛМ Мы исследовали адсорбцию на БЛМ различных фотосенсибилизаторов:

гематопорфиринов и фталоцианинов и показали, что она подчиняется общим закономерностям, установленным ранее при изучении амфифильных ионов. В случае адсорбции гематопорфиринов было показано, что величина граничного потенциала, измеренного методом КВП на БЛМ, значительно превышала величину -потенциала на липосомах. Это свидетельствовало об образовании неэкранируемого скачка потенциала, связанного с погружением заряженных групп молекул гематопорфиринов в мембрану.

Величина погружения оказалась различной для трех аналогов гематопорфирина, различающихся степенью гидрофобности. Было также показано, что молекулы гематопорфирина могут проникать через БЛМ в электронейтральном виде по механизму, рассмотренному выше для ремантадина, из-за чего b зависит от разности рН по обе стороны мембраны.

0,1 мМ AlPcS0.01 M KCl PC 0.1 M KCl GMO 10 мМ NaF -1E-5 1E-0 20 40 AlPcS4, M t, мин Рис.12. Слева – кинетика изменения b при адсорбции тетрасульфированного алюмофталоцианина (AlPcS4) на БЛМ из дифитаноилхолина (PC) или глицерилмоноолеата (GMO). Справа – зависимость b от концентрации AlPcS4 в растворах с различной ионной силой: 100 мМ KCl, 10 мМ HEPES, pH 7.5 и 10 мМ KCl, мМ HEPES, pH 7.5.

При исследовании адсорбции фталоцианинов было показано, что эффективность их адсорбции зависит от вида атома металла в центре молекулы: добавление в раствор фталоцианина с атомом цинка приводило к значительно большему изменению b, чем для фталоцианина с атомом алюминия. Это объяснялось тем, что при адсорбции молекулы фталоцианина происходит образование координационной связи атома металла в центре молекулы с атомом фосфора молекулы фосфолипида. Добавление в раствор фторида, конкурирующего с фосфатом за образование связи с атомом алюминия, приводило к десорбции фталоцианина с БЛМ (рис.12, слева). Если БЛМ была сформирована из глицерилмоноолеата, молекулы которого не содержат фосфатных групп, адсорбции фталцианинов не происходило. Было также показано, что адсорбция тетрасульфированного алюмофталоцианина происходит на поверхности мембраны, поскольку измеренное методом КВП значение b совпадало с -потенциалом, измеренным по электрофоретической подвижности липосом, а зависимость потенциала от концентрации фталоцианина и от ионной силы раствора удовлетворяла уравнению ГуиЧепмена (рис.12, справа).

b b - , мВ , мВ С помощью метода КВП мы регистрировали реакции окисления молекул различных соединений на поверхности БЛМ синглетным кислородом, образующемся при освещении в присутствии фотосенсибилизатора. С этой целью использовались молекулы – мишени активных форм кислорода, способные адсорбироваться на БЛМ, создавая на границе мембраны дипольный скачок потенциала: флорицин, а также стириловые красители.

Данный подход позволяет также определить проницаемость БЛМ для синглетного кислорода, сравнивая скорости окисления этих молекул на противоположных границах мембраны: либо с той же стороны мембраны, что и молекулы фотосенсилизатора (которую будем обозначать cis), либо с противоположной (trans) стороны.

Пример кинетики изменения потенциала в этих экспериментах приведен на рис. 13.

Cis:

h AlPcSOphlorizin cis AlPcS4 cis O- + 0 100 200 3t, мин Trans:

h AlPcS4 cis AlPcS+ - OO-phlorizin trans -0 100 200 300 4t, мин Рис.13. Кинетики изменения b после добавления флорицина, четырежды сульфированного алюмофталоцианина и освещения мембраны в моменты, указанные стрелками. Флорицин добавляли либо с цис-стороны (А), либо с транс-стороны (Б). БЛМ сформирована из дифитаноилхолина, устойчивого к окислению.

Добавление флорицина и фталоцианина в ячейку с одной стороны от мембраны приводило к появлению разности граничных потенциалов вследствие их адсорбции на БЛМ. Освещение приводило к изменению потенциала, если в ячейке присутствовали одновременно и фталоцианин, и флоретин, но не влияло на потенциал в случае отсутствия одного из этих соединений. Верхний график на рис.13 соответствует случаю, когда флорицин и фталоцианин находятся в одном ("cis") отсеке и потенциалы, образующиеся их адсорбции на БЛМ, оказываются одного знака. Если флорицин находится в противоположном ("trans") по отношению к фталоцианину отсеке, то потенциал, b , мВ b , мВ образующийся при его адсорбции, оказывается противоположного знака (рис.13, снизу).

Знаки фотоэффектов в этих экспериментах оказались тоже противоположными и соответствовали уменьшению потенциала, образующегося при адсорбции флорицина.

Величина фотоиндуцированного изменения граничного потенциала была пропорциональна величине потенциала, образующегося при адсорбции флорицина.

Полученные результаты свидетельствуют, что освещение приводит к разрушению флорицина, адсорбированного на мембране. Выключение света приводило к восстановлению потенциала, что объяснялось адсорбцией на БЛМ свежих молекул флорицина из раствора.

Если молекулы фталоцианина и флорицина находятся на противоположных границах мембраны, они не могут непосредственно взаимодействовать друг с другом.

Поэтому транс-фотоэффект можно объяснить только предположив, что в реакции разрушения флорицина участвуют другие молекулы, образующиеся при освещении фталоцианина и способные проникать через мембрану. Ими являются молекулы синглетного кислорода, что подтвердилось последующими экспериментами с тушителями. Фотоэффект подавляется водорастворимым тушителем синглетного кислорода азидом натрия. Более сильным ингибитором оказался убихинон Q2. На БЛМ, сформированной из смеси фосфатидилхолина с убихиноном, фотоэффект в трансконфигурации ослаблялся. В цис-конфигурации, где синглетный кислород не должен проникать через мембрану, чтобы реагировать с флорицином, убихинон не ослаблял фотоэффект.

Сравнение скоростей окисления мишени в цис и транс конфигурациях может быть использовано для определения проницаемости PO БЛМ для синглетного кислорода.

Значение PO определяли как коэффициент пропорциональности потока O2 сквозь мембрану J и разностью концентраций синглетного кислорода [1O2]1 и [1O2]2 на границах с противоположных сторон мембраны:

1 J = PO([ O2] -[ O2] ), (13) 2 В эксперименте можно измерить отношение скоростей окисления флорицина с двух сторон БЛМ, которое равно отношению концентраций синглетного кислорода на границах:

[1O2 ]2 Rcis =. (14) [1O2 ]1 Rrans Для того, чтобы выразить проницаемость через полученное в эксперименте отношение Rcis/Rtrans, было рассмотрено уравнение диффузии и тушения синглетного кислорода в воде около БЛМ (Sokolov and Pohl, 2009), решение которого связывает поток O2 сквозь мембрану с его стационарной концентрацией на границе. В результате было получена простая формула для оценки проницаемость БЛМ для синглетного кислорода Dkq P1O =. (15) Rcis -Rtrans Измеренное в наших экспериментах значение Rcis/Rtrans составляло около 3. Для оценки были использованы известные значения константы скорости тушения синглетного кислорода в воде kq =3 x 105 с-1 (Rodgers and Snowden, 1982;Красновский, 1998) и коэффициента диффузии кислорода в воде D = 4.75 x 10-5 cм2 с-1 (Fischkoff and Vanderkooi, 1975a).

В результате было получено значение проницаемости мембраны для синглетного кислорода P1O 2 cм/с. Это значение значительно ниже проницаемости БЛМ для обычного кислорода, полученной методом ЭПР (согласно Subczynski et al., 1989 и Dzikovski et al., 2003, PO составляет около 200 см/с), но близко по порядку величины к проницаемости БЛМ для CO2, измеренной с помощью микроэлектродной техники.

3. Мембранный транспорт 3.1. Обменный транспорт (нигерицин) Антибиотики нигерицинового типа могут служить моделью обменного транспорта ионов в биологических мембранах. Эти антибиотики, являясь слабыми кислотами, способны образовывать комплексы с ионами металлов. Поэтому они переносят через мембрану сразу два типа ионов: калия и водорода, осуществляя их обменный транспорт.

Помимо обменного транспорта, антибиотики способны переносить через мембрану заряд, увеличивая таким образом ее проводимость. Механизм переноса заряда изучался нами на БЛМ. Наиболее интересные экспериментальные результаты были получены при измерении потенциалов, образующихся на БЛМ при градиенте концентрации ионов водорода или калия (рис. 14). При градиенте рН знак потенциала противоположен знаку равновесному потенциала мембраны, селективной по протонам, а при градиенте концентрации ионов калия потенциал превышает по величине равновесный потенциал мембраны, селективной по ионам калия. Эти необычные потенциалы объясняются переносом через БЛМ заряженных димеров нигерицина, благодаря чему обмен ионов калия на протоны оказывается неэквивалентным.

1 1 2 3 4 pH --0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,log(K1+/K2+) Рис.14. слева - зависимость разности потенциалов присутствии 5 М нигерицина от градиента рН. Исходное значение рН буферного раствора составляло 5,8. Значения концентрации КС1: 0,05 М (треугольники) и 0,5 М (кружки). Пунктирная прямая построена по уравнению Нернста для мембраны, селективной по протонам.

справа - зависимость разности потенциалов в присутствии 5 М нигерицина от градиента концентрации хлористого калия. Исходная концентрация КС1 в растворе составляла 0,05 М.

Значения рН буферного раствора: 7,3 (кружки); 6,0 (квадраты); 4,2 (треугольники).

Пунктирная прямая построена по уравнению Нернста для мембраны, селективной по ионам калия.

Образование потенциалов с необычными свойствами при неэквивалентном обмене ионов было нами проиллюстрировано с помощью термодинамического рассмотрения обменного транспорта. В случае, если один протон обменивается на два иона калия, в мембране наступает равновесие с образованием мембранного потенциала, зависящего от концентраций ионов в растворе в соответствии с простой формулой = 2K - H (16) где RT K'' RT H '' K = ln и H = ln - равновесные потенциалы для ионов калия и F K' F H ' водорода. Если концентрации ионов калия в растворах одинаковы, а значения рН различны, потенциал имеет противоположный знак по сравнению с равновесным потенциалом по протонам: = -H. Если значения рН растворов одинаковы, а концентрации ионов калия различны, потенциал, хотя и совпадает по знаку с равновесным калиевым потенциалом, вдвое превышает его по величине: = 2K. Такие свойства потенциала качественно согласуются с экспериментом. Количественное описание потенциалов было получено нами с помощью теоретической модели, где предполагалось, что ионы калия и водорода переносятся через мембраны как мономерами, так и димерами нигерицина. Если обозначить диссоциированную молекулу нигерицина T-, недиссоциированную – TH, а комплекс с ионом калия – TK, можно предположить несколько возможных заряженных димеров нигерицина, как отрицательно заряженных:

, мВ , мВ T2H- и T2K-, так и положительно заряженных: T2H2K+ и T2HK2+. В принципе, неэквивалентный обмен ионов калия на протоны и связанные с ним необычные мембранные потенциалы теоретически можно объяснить как с отрицательно заряженными димерами (Markin et al, 1975), так и с положительно заряженными (Маркин и др., 1984).

Окончательный выбор между этими моделями оказался возможен после того, как мы показали, что носители тока в мембране заряжены положительно.

Зависимость проводимости от поверхностного и диполъного потенциалов.

Исследование зависимости проводимости от граничного потенциала позволило определить знак заряда носителей тока в БЛМ. Предполагается, что зависимость относительного изменения проводимости g/g0 от изменения граничного потенциала должна описываться простой формулой (12), где знак коэффициента z определяется знаком заряда носителей тока в мембране и существенно влияет на зависимость g от b. При z<0 проводимость при увеличении граничного потенциала должна возрастать, а при z>0 - убывать.

В работе исследовалась зависимость изменения проводимости, индуцированной нигерицином или гризориксином, либо от изменения поверхностного потенциала, вызванного адсорбцией органического катиона цитилпиридиния бромистого, либо от изменения дипольного потенциала, вызванного адсорбцией флоретина. Изменение граничного потенциала при адсорбции флоретина или цитилпиридиния бромистого измерялось в отсутствие антибиотиков как разность граничного потенциала, возникшую после добавления этих веществ в раствор с одной стороны БЛМ. Изменение индуцированной проводимости БЛМ в присутствии антибиотиков измеряли при добавлении флоретина или бромистого цитилпиридиния с двух сторон БЛМ.

Зависимости граничного потенциала и проводимости БЛМ, индуцированной нигерицином, валиномицином или нонактином, от концентрации флоретина изображены на рис. 15, слева, а от концентрации цитилпиридиния бромистого - на рис. 15, справа. Для облегчения сопоставления изменений проводимости и граничного потенциала их зависимости от концентрации адсорбируемых веществ изображены на одних и тех же графиках. Масштаб и направления осей на обоих рисунках выбраны таким образом, чтобы эти зависимости могли совместиться в том случае, если выполняется формула (12) при z=+l. Валиномицин и нонактин, у которых носители тока известны (положительно заряженные комплексы с ионами калия) использовались в эксперименте для контроля.

b b 1 нонактин валиномицин 1 нигерицин гризориксин гризориксин 10 -6 -5 -4 -6,0 -5,5 -5,log(phlor), M log(ЦПБ), M Рис.15. слева - зависимость изменения граничного потенциала на БЛМ из ФЭА и ее проводимости, индуцированной присутствием в растворе 10-6 М нонактина, 510-6 M нигерицина или 510-6 М гризориксина от концентрации флоретина. Исходный раствор:

0,05 М КС1, 5 мМ буфер, рН 6,справа - зависимость изменения граничного потенциала на БЛМ из ДОЛ и ее проводимости, индуцированной присутствием в растворе 10-7 М валиномицина или 5 10-М гризориксина от концентрации цитилпиридиния бромистого. Помимо детергента и антибиотиков, раствор содержал 0,05 М КСУвеличение проводимости при уменьшении дипольного потенциала, вызванном адсорбцией флоретина, так же как уменьшение проводимости при увеличении поверхностного потенциала, вызванном адсорбцией бромистого цетилпиридиния, позволяют сделать вывод, что ток в БЛМ переносят положительно заряженные комплексы нигерицина или гризориксина. Разработанная нами модель ионного транспорта с положительно заряженными димерами удовлетворительно объяснила полученные в эксперименте зависимости проводимости и мембранного потенциала от концентрации ионов в растворах.

3.2.Активный транспорт ионов Na,K,ATP-азой Na,K,ATP-аза осуществляет активный транспорт ионов натрия из клетки и калия в клетку за счет энергии гидролиза одной молекулы ATP. Этот белок широко распространен в природе и играет важную роль в функционировании клетки. Механизм активного транспорта ионов Na,K,ATP-азой в общих чертах установлен: он осуществляется с помощью поочередного открытия каналов, соединяющих центры связывания ионов в белке с растворами либо с внутриклеточной, либо с внеклеточной стороны мембраны.

Невыясненными остаются некоторые вопросы, такие как структура каналов и кинетические характеристики процесса. Существенную информацию об этом может дать изучение электрических токов, связанных с функционированием Na,K,ATP-азы. В электрофизиологических исследованиях был обнаружен нестационарный электрический ток (ток смещения), связанный с перемещением ионов натрия в Na,K,ATP-азе в условиях b , mV, RT/F ln(G/G ), мВ b , mV, -RT/F ln(G/G ), мВ отсутствия ионов калия, когда этот ионный насос не может завершить полный ферментативный цикл. Подробное изучение этих токов позволило достаточно выяснить детальный механизм транспорта ионов натрия во внеклеточном канале Na,K,ATPазы.

Однако, специфика экспериментов на клетках не позволяла изучить этот транспорт во внутриклеточном канале. Мы смогли получить существенную информацию о внутриклеточном канале в экспериментах на модельной системе БЛМ с адсорбированными мембранными фрагментами (МФ), содержащими очищенную Na,K,ATPазу. Ток смещения в Na,K,ATPазе можно вызвать с помощью либо быстрого изменения концентрации одного из субстратов ферментативного цикла (в большинстве случаев - ATP), либо быстрого изменения потенциала. Мы объединили оба эти подхода, регистрируя малые изменения адмиттанса (комплексной проводимости) мембраны, вызванные быстрым фотоактивируемым освобождением ATP из Caged-ATP.

Теоретическая модель Для количественного исследования нестационарного транспорта в Na,K,ATP-азе была разработана теоретическая модель, основанная на цикле Алберса-Поста – последовательности состояний белка, описывающей его ферментативный цикл – перенос трех ионов натрия во внеклеточный раствор и двух ионов калия в обратном направлении за счет гидролиза молекулы ATP. Нестационарные токи наблюдались в отсутствие ионов калия, поэтому модель рассматривает только натриевую часть этого цикла. Кроме того, учитывался транспорт только одного из 3 ионов натрия, поскольку, как показано ранее (Holmgrem et al, 2000; Apell 2004), именно этот ион вносит основной вклад в электрический ток. Модель определяет приращение емкости и проводимости мембраны с Na,K,ATP-азой в ответ на быстрое освобождение АТФ, вызванное электрогенным транспортом ионов натрия, который формально представлен в виде последовательных переходов между пятью состояниями белка (рис.16). Транспорт в канале доступа с цитоплазматической стороны белка рассматривается как обратимый переход между первым состоянием с двумя связанными ионами натрия, E1(2Na) (которое в уравнениях будет обозначено “c0”) и вторым, где связаны три иона, E1(3Na) (обозначенным “c1”).

После гидролиза ATP цитоплазматический канал закрывается, и Na,K-ATP-аза необратимо переходит в состояние фосфорилирования, в котором ионы заперты (состояние окклюзии, обозначенное просто цифрой “1”). Это состояние нестабильно и релаксирует в другие состояния, показанные на рисунке последующими двумя переходами. Первый из них – переход в конформацию P-E2, в которой открывается внеклеточный канал доступа, но три Na+ иона остаются в центре связывания внутри белка, P-E2(3Na) (это состояние обозначено цифрой “2”). В дальнейшем первый Na+ ион освобождается в водную фазу, что формально представлено переходом белка в состояние P-E2(2Na) (обозначено цифрой “3”).

e c c e 2Na+-Ec10 k10 k3Na+-Ec(3Na+)E1-P 21 k21 kP-E2-3Na+ 32 k32 k3 P-E2-2Na+ Рис.16. Теоретическая модель нестационарного транспорта ионов натрия Na+,K+АТФазой. Слева – совокупность состояний Na+,K+-АТФазы, реализующихся в ходе гидролиза АТФ. c - цитоплазматическая сторона системы, e – внутриклеточная сторона.

Символами E1 и E2 обозначен белок в двух разных конформациях. Справа – динамические потенциальные барьеры, введенные в рассмотрение Лойгером (Lauger, 1991) и Апелем (Apell et al., 1987). Ион натрия, участвующий в транспорте, обозначен черным кружком (подробнее в тексте).

С физической точки зрения все состояния белка могут быть представлены как последовательная смена потенциальных барьеров для ионов натрия в мембране (рис.16, справа). В состоянии окклюзии ион находится в потенциальной яме между двумя высокими потенциальными барьерами. В остальных состояниях остается только по одному из этих высоких барьеров, закрывающих каналы либо с внеклеточной (в состояниях c0 и c1), либо с цитоплазматической стороны (в состояниях 2 и 3).

Электрогенными считаются только перемещения ионов натрия в цитоплазматическом и внеклеточном каналах доступа (переходы между состояниями c0 и c1, а также между состояниями 2 и 3). Эти переходы, представляющие собой диффузию или миграцию Na+ в каналах доступа Na,K,ATP-азы, приводят к появлению электрического тока во внешней цепи.

Кинетические уравнения, описывающие перемещение ионов Na+ с внутриклеточной стороны белка, могут быть записаны в следующем виде dnc= - k10nc1 + k01 Nac nc0, (17) [ ] dt где nc0 - поверхностная плотность «видимых» молекул Na,K,ATP-азы в состоянии c0, nc1 - в состоянии c1, [Nac] – концентрация ионов натрия в водном растворе с цитоплазматической стороны. k01 и k10 – константы скоростей прямого и обратного переходов между состояниями c0 и c1. В эксперименте измеряется изменение электрического тока, вызванное появлением ATP. Вклад в него вносят только те молекулы Na,K,ATP-азы в состоянии c0 и c1, транспорт в которых блокируется в результате гидролиза ATP и последующего фосфорилирования белка. Их суммарная плотность равна nc1 + nc0 = N. (18) Транспорт ионов Na+ с внеклеточной стороны белка состоит из 2 стадий: переходы между состояниями 1 и 2 и между состояниями 2 и 3. Он описывается двумя независимыми уравнениями:

dn= -k12n1 + k21n2 (19) dt dn= k12n1 -()[ ] k21 + k23 n2 + k32 Nae n3, (20) dt где n1, n2, и n3 – поверхностные плотности в состояниях 1, 2, и 3, соответственно, [Nae] – концентрация ионов натрия в водном растворе с внеклеточной стороны белка, k12 и k21 – константы скорости прямых и обратных переходов между состояниями 1 и 2, k23 и k32 – аналогичные константы переходов между состояниями 2 и 3. Суммарное количество молекул белка, участвующих в реакциях, равно числу молекул, фосфорилированных в результате гидролиза ATP, т.е., тому же самому числу «видимых в эксперименте» молекул Na,K,ATP-азы, которые рассматривались выше для внутриклеточной стороны мембраны, n1 + n2 + n3 = N (21) Приложение к мембране переменного напряжения приводит к перемещению ионов натрия либо в цитоплазматическом, либо во внеклеточном каналах доступа. В данной модели эти перемещения рассматриваются как прыжки через потенциальные барьеры, которые, в отличие от барьеров, запирающих каналы, имеют сравнительно малую высоту (рис. 16). Каналы доступа, согласно общепринятым представлениям, считаются узкими, и их можно рассматривать как среды с низкой диэлектрической проницаемостью (Lauger, 1991). В этом случае влияние электрического поля на константы скоростей соответствующих переходов между состояниями можно представить в виде простых поправочных коэффициентов (Lauger, 1979; Lauger, 1991; Маркин и Чизмаджев, 1974), которые в цитоплазматическом канале можно записать как k01 = k01 exp(c / 2) k10 = k10 exp(- c / 2) (22) и во внеклеточном канале как k23 = k23 exp(e / 2) (23) k32 = k32 exp(- e / 2), где = e/kT, k – постоянная Больцмана, T – абсолютная температура, e – элементарный заряд, c - падение потенциала в цитоплазматическом канале, e – падение потенциала во внеклеточном канале.

Перепады напряжения в цитоплазматическом и внеклеточном каналах, c и e, связаны с напряжением U, приложенным между водными растворами, следующим соотношением c = cU, e = eU, (24) где e и с - коэффициенты, определяющие, какая часть приложенного к мембране с Na,K,ATP-азой напряжения падает соответственно во внеклеточном и цитоплазматическом каналах доступа, CB = (25) CB + CF - коэффициент, определяющий, какая часть приложенного между растворами напряжения падает на мембранном фрагменте с Na,K,ATP-азой (согласно эквивалентной схеме на рис.17). Те же коэффициенты определяют связь перемещений ионов в каналах с током I, регистрируемым во внешней цепи:

dnc1 dnIc = ce, Ie = ee (26) dt dt Напряжение U, приложенное к мембране, изменяется во времени как U = V·cos(t) (27) Периодическое напряжение приводит к появлению переменного тока, который в первом приближении можно представить линейной комбинацией синуса и косинуса с частотой . Фосфорилирование белка в результате гидролиза ATP «выключает» транспорт с внутриклеточной стороны и «включает» - с внеклеточной стороны. Поэтому вызванное ATP приращение электрического тока представляет собой разность соответствующих токов. Это приращение пересчитывается в изменение емкости, Cp, и проводимости мембраны, Gp согласно формуле dU I = Ie - Ic = GpU + Cp. (28) ATP dt Написанные уравнения позволяют определить вызванные ATP изменения емкости и проводимости мембраны с Na,K,ATPазой и их зависимость от частоты переменного напряжения и концентрации ионов натрия. При решении этих уравнений использовалось приближение малых отклонений nc0, nc1, n1, n2 и n3 от соответствующих равновесных значений (Sokolov et al., 2008). Полученные изменения емкости и проводимости могут быть представлены в виде суммы простых функций, так называемых «функций Лоренца», 0 2 Cp = C0 + C1 - C2 (29) 2 2 2 + 0 2 + 1 2 + 2 2 Gp = C0 0 2 + C11 2 - C22 2 (30) 2 + 0 2 + 1 2 + Эти выражения показывают, что изменения емкости и проводимости мембраны связаны между собой и зависят от одних и тех же параметров: амплитуд C0, C1 и С2 и характерных частот 0, 1 и 2. Отрицательный член, пропорциональный C2, описывает вклад транспорта ионов в канале с внутриклеточной стороны. Положительные члены, пропорциональные C0 и C1, отражают вклад транспорта в канале с внеклеточной стороны.

Этих членов 2, поскольку транспорт состоит из двух стадий (конформационный переход и перенос ионов в канале), описываемых двумя независимыми уравнениями. Зависимость этих параметров от кинетических констант можно значительно упростить, если, в соответствии с (Holmgrem et al, 2000; Apell 2004), полагать, что скорость переноса иона натрия через внеклеточный канал значительно выше скорости конформационного перехода: k23 >> k12. В этом случае можно получить приближенные выражения Nae KeK[ ] C0 eN , (e ) 1+ Nae Ke 1+ Nae Ke K1 +[ ] [ ] ( ) ()() Nae Ke [ ] 0 k12 + k21, (31) 1+ Nae Ke [ ] () Nae Ke 2 [ ] C1 eN , (e ) 1+ Nae Ke 1+ Nae Ke K1 +[ ] [ ] ( ) ()() 1 k23 1+ Nae Ke.

[ ] () Nac Kc 2 [ ] C2 = eN , 2 = k10 1+ Nac Kc (c ) [ ] ) ( 1+ Nac Kc [ ] () Эти формулы показывают, как вызванные появлением АТФ приращения емкости и проводимости мембраны зависят от частоты переменного напряжения и концентрации ионов натрия в растворе. Зависимости C0, C1 и С2 от концентрации ионов натрия имеют колокообразный вид, достигая максимальных значений при концентрациях, соответствующих половинному заполнению мест связывания ионов в Na+,K+,ATP-азе.

Половинное заполнение происходит при концентрации, равной обратной константе равновесия связывания ионов. Согласно известным в литературе значениям этих констант, можно ожидать наибольший вклад в изменение адмиттанса от цитоплазматического канала при низкой концентрации ионов натрия (1-10 мМ), а от внеклеточного – при высокой (0,1-1 М). Таким образом, электрические сигналы от цитоплазматического и внеклеточного каналов можно различить как по знаку приращений емкости и проводимости, так и по влиянию на них концентрации ионов натрия.

Экспериментальная система Исследование электрогенного транспорта ионов Na+,K+-АТФазой выполнялись на модельной системе, состоящей из содержащих этот белок мембранных фрагментов (МФ), адсорбированных на БЛМ (рис. 17). Адсорбцию МФ на БЛМ контролировали по изменению емкости мембраны, а в ряде случаев – методом КВП. После введения суспензии МФ в один из отсеков ячейки потенциал, регистрируемый методом КВП, медленно рос во времени, достигая стационарного значения в течение 2 часов (рис.18а).

Знак изменения потенциала соответствовал появлению отрицательного поверхностного заряда с той стороны мембраны, куда была добавлена суспензия МФ. Одновременно происходило изменение емкости мембраны, которая сначала росла, а затем медленно уменьшалась (рис.18б). Уменьшение емкости говорит о том, что при адсорбции МФ на поверхности БЛМ происходит увеличение средней толщины мембраны. Потенциал, регистрируемый методом КВП при адсорбции МФ, может быть вызван электрическим полем, возникающим внутри БЛМ при сближении с ней отрицательно заряженного фрагмента на расстояние, сравнимое с толщиной диффузной обкладки двойного слоя (рис.18 в и г). Полученные в эксперименте результаты могут быть использованы для оценки величины электрического поля внутри мембран в области их контакта при условии, если известна степень покрытия поверхности БЛМ адсорбированными МФ. Взяв оценку степени покрытия около 30%, (Borlinghaus et al, 1987), можно получить электрический потенциал на МФ в зоне контакта около 60 мВ.

hv ADP Ip(t) Caged-ATP ATP ATP Rp + CF Na+ Cp U U I(t) Рис.17. - Схематическое изображение БЛМ с адсорбированным мембранным фрагментом, содержащими Na+,K+-АТФазу (слева) и их эквивалентная схема (справа).

Сплошной линией показан профиль электрического потенциала, возникающий в результате заряжения контактирующих мембран при переносе ионов Na+,K+-АТФазой в условиях коротко замкнутой цепи. Б – эквивалентная электрическая схема: Cp – суммарная емкость адсорбированных на БЛМ мембранных фрагментов, содержащих Na+,K+-АТФазу, CF – емкость области БЛМ, контактирующей с фрагментами, Ip(t) – ток, генерируемый всеми активными Na+,K+-АТФазами, I(t) – ток, регистрируемый в эксперименте.

а 0 50 100 1t, мин б 3,3,3,2,0 25 50 75 1t, мин Рис.18. Кинетика изменения потенциала, измеренного методом второй гармоники (а), и емкости (б) БЛМ после добавления суспензии мембранных фрагментов в момент, указанный стрелкой. Водный раствор содержит 150 мМ NaCl, 30 мМ Imidazole, 1 мМ EDTA, pH 6,5, концентрация фрагментов 0,05 мг белка на мл раствора после их добавления в ячейку. Справа - распределение потенциала в БЛМ и заряженном фрагменте мембраны в двух предельных случаях: когда эти мембраны расположены на большом расстоянии (в) и после их сближения до расстояния, намного меньшего дебаевской длины (г).

Электрогенный транспорт ионов натрия На рис. 19 изображены зависимости от времени тока короткого замыкания, его интеграла, а также изменения емкости и проводимости БЛМ с адсорбированными на ней фрагментами, содержащими Na,K,ATP-азу в ответ на освобождение ATP из Caged-ATP , мВ C, нФ при вспышке ультрафиолетового света. Записи иллюстрируют два эксперимента, различающиеся концентрацией ионов натрия: 150 мМ (слева) и 3 мМ (справа). Видно, что при высокой концентрации ионов натрия освобождение ATP вызывало увеличение емкости и проводимости мембраны, а при низкой концентрации емкость уменьшалась.

+ + 400 3 мМ Na 150 мМ Na 220 -2-20 1 2 3 4 0 1 2 3 4 7,5,2,0,0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 20 --0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 74352210 -10 1 2 3 4 0 1 2 3 4 t, сек t, сек h h Рис. 19. Сигналы, регистрируемые в эксперименте при двух концентрациях ионов натрия: 150 мМ (слева) и 3 мМ (справа). Сверху вниз показаны: регистрируемый в эксперименте ток, интеграл этого тока, изменения емкости и проводимости во времени, полученные в результате вычислений и используемые для определения изменений адмиттанса мембраны. Стрелками указаны моменты вспышки УФ – света.

В соответствии с рассмотренной выше моделью, отрицательные приращения емкости и проводимости при низкой концентрации ионов натрия вызваны их электрогенным перемещением в цитоплазматическом канале Na,K,ATP-азы, а положительные приращения при высокой концентрации этих ионов – их перемещением во внеклеточном канале Na,K,ATP-азы.

Зависимости приращений емкости проводимости мембраны от частоты переменного напряжения измерялись при разных концентрациях ионов натрия в диапазоне от 3 мМ до 1 М. Для того, чтобы можно было усреднять результаты измерений, полученные на разных мембранах с разной активностью Na,K,ATP-азы, приращения емкости и проводимости нормировали на величину заряда, перенесенного Na,K,ATP-азой через мембрану после вспышки света. Эта величина определялась по максимальному значению интеграла тока короткого замыкания. Типичные частотные зависимости, полученные таким образом при нескольких концентрациях ионов натрия, изображены на рис.20, слева.

Как показано в теоретической модели, частотная зависимость приращений емкости C и проводимости G описывается линейной комбинацией функций Лоренца с разными Ip, пА Ip, пА Q, пКл Q, пКл C, пФ C, пФ G,пСм G, пСм характерными частотами, причем амплитуды лоренцианов зависят от концентрации ионов натрия, принимая максимальные значения при концентрациях, близкой к обратной константе связывания в соответствующей стадии. При низких концентрациях ионов натрия (менее 10 мМ) частотные зависимости аппроксимировали суммой трех функций Лоренца, одна из которых имеет отрицательную амплитуду. При концентрации ионов натрия от 20 мМ до 1 М вклад отрицательного приращения емкости исчезал, и для аппроксимации частотных зависимостей было достаточно двух функций Лоренца (т.е., в этих условиях C2 = 0) и постоянной компоненты. Примеры аппроксимации частотных зависимостей показаны на рисунке в виде кривых. Аналогичным образом были проведены аппроксимации частотных зависимостей в широком диапазоне концентраций ионов натрия, в результате чего были получены зависимости от этой концентрации амплитуд C0, C1, C2 и характерных частот 0, 1, 2, трех Лоренцианов (рис.20, справа). Как можно видеть на рисунке, амплитуда «отрицательного» Лоренциана C2 убывает с ростом концентрации ионов натрия, и при концентрации выше 10 мМ практически равна нулю.

Его характерная частота 2 при этом растет. Что касается «положительных» Лоренцианов, то амплитуда «медленного» компонента C0 растет, а «быстрого» - уменьшается с концентрацией ионов натрия. Соответствующая медленному компоненту характерная частота 0 растет с концентрацией ионов натрия, а частота «быстрого» Лоренциана 1 во всем интервале концентраций остается практически постоянной.

Полученные в эксперименте зависимости амплитуд C0, C1, C2 и характерных частот 0, 1, 2, Лоренцианов от концентрации ионов натрия были аппроксимированы теоретическими кривыми, построенными по уравнениям (31). Это позволило определить ряд параметров транспорта ионов натрия в каналах доступа ионов Na,K,ATP-азы.

Теоретические кривые приведены на рисунке 20 в виде сплошных линий, а значения параметров приведены в подписи к рисунку.

Теоретические кривые удовлетворительно описывают большинство экспериментальных данных в широком диапазоне концентраций ионов натрия. Это означает, что рассмотренная теоретическая модель в принципе способна объяснить результаты электрических измерений. Особенно хорошее согласие с экспериментом получено в области высоких концентраций ионов натрия.

1 10 100 10Freq, Гц 8642-21 10 100 10Freq, Гц Рис.20. Слева - зависимость приращений емкости и проводимости от частоты прикладываемого к мембране переменного напряжения. Водный раствор содержал: 10 мМ MgCl2, 1 мМ EDTA, 30 мМ имидазола, pH 6.5; и NaCl в концентрации 150 мМ (1), 7 мМ (2) и 3 мМ (3). Каждая точка получена в результате усреднения не менее 3 измерений.

Сплошные линии построены по уравнениям (29-30) со следующими значениями параметров: C0= 1,2 V-1, C1= 0,48 V-1, C2=0, Clim= 0,17 V-1, 0= 58 s-1, 1= 2600 s,(сплошные линии); C0= 3,7 V-1, C1= 0, C2=-0,43 V-1, Clim= 0,06 V-1, 0= 17 s-1, 2= 380 s(пунктир); C0= 2,8 V-1, C1= 0,13 V-1, C2 =-0,25 V-1, Clim= -0,006 V-1, 0= 20 s-1, 1= 1200 s-2= 570 s-1 (точки);

Справа - зависимость амплитуд (вверху) и характерных частот (внизу) функций Лоренца, аппроксимирующих частотные зависимости изменений емкости и проводимости, вызванных скачкообразным освобождением АТФ при функционировании Na,K,ATP-азе от концентрации ионов натрия в растворе. Точки получены при усреднении результатов не менее 3 экспериментов. Сплошные линии – теоретические кривые, построенные по уравнениям (31) со следующими значениями параметров: A = 30 mM; e = 0,89; c = 0,21; = 0,06; K = 200; 1/Ke = 0,74 M; 1/Ki = 1.5 мM; k12 = 2,4 s-1; k23 = 1500 s-1; k= 160 s-1.

То, что характерная частота 0 определяется скоростью конформационного перехода Na,K,ATP-азы, было подтверждено нами при изучении эффектов высоких концентраций солей на кинетику функционирования белка. Известно, что солевой эффект приводит к замедлению конформационного перехода. В наших экспериментах солевой эффект приводил к значительному уменьшению характерной частоты 0 (Sokolov et al., 2001). Найденные нами значения 0 и 1 (последнее характеризует скорость «промежуточной стадии») оказались меньше по сравнению с аналогичными параметрами, полученными на клеточной системе (Holmgren et al, 2000). Полученное в измерениях на клетках значение скорости «медленной» стадии в разных работах составляло: 100 с-1 (Holmgren et al, 2000), 200 с-1 (Nakao and Gadsby, 1986; Rakowski, 1993;Holmgren et al, 1994) или 400 с-1 (Hilgemann, 1994), в то время - C/ Q, В - g/ Q, В как значение 0 в наших экспериментах изменялось от 20 до 100 с-1. Такое различие может быть связано различием условий проведения измерений. Как показали наши последние исследования, на величину характерной частоты 0 оказывает также существенное влияние рН раствора (Гришанин и др., 2010), который в наших экспериментах был ниже по сравнению с цитируемыми выше работами.

Константа диссоциации Na+ в активном центре с внеклеточной стороны, 1/Ke, оказалась около 0,74 M, а с внутриклеточной – 1,5 мМ. Эти значения близки к литературным, полученным с помощью флуоресцентных зондов, где они составляли, соответственно, 500 мМ и 1-5 мМ (в последнем случае значение зависело от концентрации ионов магния) (Schneeberger et al, 2000). Константа равновесия Kмежду двумя конформациями Na,K,ATP-азы в состояниях 1 (окклюзия Na+) и (деокклюзия Na+) оказалась равна 200, что тоже близко к литературным значениям (Wuddel and Apell, 1996). В работе впервые определены константы скорости обмена ионов натрия в цитоплазматическом канале: константа скорости освобождения ионов натрия (k10) составила около 160 s-1. Константа скорости k23 перехода между состояниями 2 and 3 (освобождение Na из внеклеточного канала доступа) - около 1500 s-1.

Диэлектрический коэффициент перемещения натрия (характеризующий относительную глубину канала, соединяющего раствор с центром связывания) с цитоплазматической стороны (0,2) оказался значительно меньше, чем с внеклеточной стороны (0.89). Таким образом, место связывания третьего иона натрия расположено в мембране асимметрично и находится ближе к цитоплазматической стороне мембраны. Несмотря на то, что сделанные оценки достаточно грубые, они хорошо согласуются с оценками диэлектрических коэффициентов, сделанными на основе измерений с электрохромными флуоресцентными красителями, где были получены значения диэлектрических коэффициентов 0.25 для цитоплазматического канала и 0.7 для внеклеточного (Apell, et al, 2001). Отметим, что оценки параметра, характеризующего скорость транспорта ионов натрия в цитоплазматическом канале, на основе прямых электрических измерений получены нами впервые.

Выводы 1. Разработана методика исследования связывания с липидной мембраной молекул биологически-активных соединений, обладающих заряженными группами или дипольным моментом. Она основана на оригинальном методе компенсации внутримембранного поля для измерения разности граничных потенциалов БЛМ по второй гармонике емкостного тока.

2. Сопоставление изменений компонентов граничного потенциала, измеренных методами КВП, проводимости и электрофоретической подвижности, при адсорбции этих соединений на границе мембраны с раствором позволило определить сравнительную глубину погружения их молекул в мембрану.

3. Показано, что погружение заряженной группы в мембрану органических ионов амфифильной структуры приводит к возникновению на границе мембраны скачка потенциала, не экранируемого электролитом.

4. Предложен способ изучения электронейтрального транспорта амфифильных ионов через мембрану, основанный на регистрации распределения заряженных форм этих ионов на границах мембраны. Показано, что это распределение регулируется разностью рН в растворах с двух сторон мембраны 5. Изучено взаимодействие продуктов цикла зрительного родопсина с БЛМ. Показано, они не способны дестабилизировать мембрану в темноте подобно детергентам. При освещении они обладают свойствами фотосенсибилизаторов, хотя и более слабо выраженными по сравнению с фотосенсибилизаторами, применяемыми против опухолевых клеток. Поэтому наибольшую роль в гибели зрительных клеток могут играть продукты их самоокисления при освещении, которые оказываются гидрофильными и десорбируются с поверхности мембраны.

6. Обнаружено изменение граничного потенциала при фотосенсибилизированном окислении молекул на поверхности мембраны синглетным кислородом, образующимся при освещении адсорбированного на мембране фотосенсибилизатора.

Синглетный кислород проникает через мембрану, вызывая окисление мишеней на обеих ее границах, и по сравнению скоростей окисления с двух сторон мембраны сделана оценка проницаемости мембраны для синглетного кислорода.

7. Показано, что обменный транспорт ионов калия и водорода, осуществляемый антибиотиками нигерициновой группы, является электрогенным из-за участия в нем положительно заряженных димеров. Этот транспорт приводит к появлению мембранных потенциалов с необычными свойствами: при градиенте рН знак потенциала противоположен знаку равновесного потенциала мембраны, селективной по протонам, а при градиенте концентрации ионов калия возникает потенциал, величина которого превышает равновесный потенциал мембраны, селективной по ионам калия.

8. Разработан оригинальный метод изучения электрогенного транспорта ионов в Na,K,ATP-азе, основанный на измерении малых приращений адмиттанса (емкости и проводимости) мембраны, связанном с локальным перемещением заряда внутри мембраны. С помощью этого метода определены кинетические характеристики перемещения ионов натрия в цитоплазматическом и внеклеточном каналах доступа ионов Na,K,ATP-азы: относительные глубины каналов, константы связывания ионов натрия в активных центрах с двух сторон белка, константы скорости связывания ионов и конформационного перехода. Параметры транспорта в канале с внеклеточной стороны Na,K,ATP-азы согласуются с литературными данными. Константы скоростей связывания и освобождения ионов натрия в цитоплазматическом канале доступа ионов определены впервые Список публикаций по теме диссертации 1. Markin V.S., V.S.Sokolov, L.I.Bogulavsky, LS.Jaguzhinsky. Nigericin-induced charge transfer across membranes. J.Membr.Biol. 25 (1-2):23-45, 1975.

2. Cherny,V.V., V.S.Sokolov, I.G.Abidor. 1980. Determination of surface charge of bilayer lipid membranes. Bioelectrochemistry and Bioenergetics 7:413-420.

3. Соколов,В.С. В.Г.Кузьмин. 1980. Измерение разности поверхностных потенциалов бислойных мембран по второй гармонике емкостного тока. Биофизика 25:170-172.

4. Соколов,В.С., В.В.Черный, И.Г.Абидор. 1980. Измерение поверхностного заряда бислойных липидных мембран. Доклады АН СССР 251:236-239.

5. Соколов,В.С., Т.Д.Чуракова, В.Г.Булгаков, В.Е.Каган, М.В.Биленко, Л.И.Богуславский. 1981. Исследование механизмов действия продуктов перекисного окисления липидов на проницаемость бислойных липидных мембран.

Биофизика 26:147-149.

6. Черный,В.В., М.М.Козлов, В.С.Соколов, Ю.А.Ермаков, В.С.Маркин. 1982.

Адсорбция 1-анилино-8-нафтален сульфоната на бислойных липидных мембранах.

Биофизика 27:812-817.

7. Ермаков,Ю.А., В.В.Черный, В.С.Соколов, С.А.Татулян. 1983. Граничные потенциалы на липидных мембранах в присутствии ионов 1-анилино-8-нафтален сульфоната. Биофизика 28:1010-1013.

8. Козлов,М.М., В.В.Черный, В.С.Соколов, Ю.А.Ермаков, В.С.Маркин. 1983. Теория адсорбции гидрофобных ионов в БЛМ с учетом их латерального взаимодействия и дискретности зарядов. Биофизика 28:61-66.

9. Соколов,В.С., В.С.Маркин. 1984. Электрогенный транспорт ионов калия и водорода через мембрану, осуществляемый артибиотиками нигерициноми и гризориксином. Биологические мембраны 1:1071-1086.

10. Соколов,В.С., В.В.Черный, В.С.Маркин. 1984. Измерение скачков потенциала при адсорбции флоретина и флорицина на поверхности липидных мембран методом компенсации внутримембранного поля. Биофизика 29:424-429.

11. Симонова,М.В., В.В.Черный, Е.Донат, В.С.Соколов, В.С.Маркин. 1986. Граничные потенциалы на бислойной мембране в присутствии ремантадина. Анализ трех методов измерения. Биологические мембраны 3:846-857.

12. Симонова,М.В., В.В.Черный, В.С.Соколов, В.С.Маркин. 1986. Транспорт нейтральной формы ремантадина через плоскую бислойную липидную мембрану.

Биологические мембраны 3:397-403.

13. Маркин В.С., В.И.Портнов, М.В.Симонова, В.С.Соколов, В.В.Черный. Теория переноса ремантадина и его аналогов через мембраны внутриклеточный сдвин рН неперемешиваемые слои и мембранные потенциалы. Биологические мембраны (5):502-523, 1987.

14. Маркин В.С., В.С.Соколов. 1988. Новая концепция мембранного равновесия и аномальные мембранные потенциалы при сопряженном транспорте ионов.

Электрохимия 24:781-787.

15. Черный,В.В., М.Пауличке, М.В.Симонова, Ю.А.Ермаков, Е.Хессель, В.С.Соколов, Д.Лерхе, В.С.Маркин. 1988. Изменение структуры биологических и модельных мембран при действии ремантадина. Биологические мембраны 5:648-657.

16. Markin V.S., V. S. Sokolov. A new concept of electrochemical membrane equilibrium.

Coupled transport and membrane potential. Bioelectrochemistry and Bioenergetics 23:116, 1990.

17. Mirsky,V.M., V.V.Cherny, V.S.Sokolov, V.S.Markin. 1990. Electrostatic assay of phospholipase A activity: an application of the second harmonic method of monitoring membrane boundary potentials. J. Biochem. Biophys. Methods 21:277-284.

18. Sokolov,V.S., V.V.Cherny, M.V.Simonova, V.S.Markin. 1990. Electrical potential distribution over the bilayer lipid membrane due to amphiphilic ions adsorption.

Bioelectrochemistry and Bioenergetics 23:27-44.

19. Cherny V.V., M. V. Simonova, V. S. Sokolov, and V. S. Markin. Transport of the neutral form of amphiphilic drugs through a planar bilayer lipid meembrane: the role of the pH gradient. Bioelectrochemistry and Bioenergetics 23 (1):17-26, 1990.

20. Cherny V.V., V. M. Mirsky, V. S. Sokolov, and V. S. Markin. BLM as enzyme sensitive electrode: determination of the phospholipase activity. Bioelectrochemistry and Bioenergetics 23:373-378, 1990.

21. Соколов,В.С., В.В.Черный, М.В.Симонова, В.С.Маркин. 1990. Распределение потенциала на границе мембрана/раствор при адсорбции амфифильных ионов.

Биологические мембраны 7:872-884.

22. Черный,В.В., В.М.Мирский, В.С.Соколов, В.С.Маркин. 1990. Электростатический метод определения активности фосфолипазы А. Биохимия 55:445-450.

23. Ермаков,Ю.А., В.В.Черный, В.С.Соколов. 1992. Адсорбция бериллия на нейтральных и заряженных липидных мембранах. Биологические мембраны 9:201213.

24. Черный,В.В., М.Г.Сихарулидзе, В.М.Мирский, В.С.Соколов. 1992. Распределение потенциалов на бислойной липидной мембране при функционировании фосфолипазы A2. Биологические мембраны 9:733-740.

25. Стожкова,И.Н., В.М.Мирский, В.С.Соколов. 1993. Стехиометрия фотохимической реакции, индуцирующей повреждение липидного бислоя в присутствии фотосенсибилизатора. Биологические мембраны 10:44-49.

26. Черный,А.В., В.С.Соколов, В.В.Черный. 1993. Распределение потенциала на границе мембрана/раствор при адсорбции тетракаина. Электрохимия 29:364-368.

27. Малков,Д.Ю. В.С.Соколов. 1995. Дипольный скачок потенциала на границе мембрана.раствор при адсорбции стириловых красителей RH-421, RH-237 и RH160. Биологические мембраны 12:658-669.

28. Один,А.П., В.А.Александрова, В.С.Соколов, Д.А.Топчиев. 1995.

Электростатическое взаимодействие катионных полиэлектролитов с клеточной мембраной в реализации антимутагенного эффекта. Биологические мембраны 12:185-190.

29. Стожкова,И.Н., В.В.Черный, В.С.Соколов. 1995. Транспорт диметилового эфира гематопорфирина через бислойную липидную мембрану. Биологические мембраны 12:200-207.

30. Malkov,D.Y. and V.S.Sokolov. 1996. Fluorescent styryl dyes of the RH series affect a potential drop on the membrane/solution boundary. Biochim. Biophys. Acta 1278:197204.

31. Malkov,D.Y., K.V.Pavlov, and V.S.Sokolov. 1997. Dipole potential drop due to RH-dye on the lipid bilayer and its influence on Na+/K+-ATPase activity. Ann. N. Y. Acad. Sci.

834:357-360.

32. Соколов,В.С., С.М.Стуколов, А.С.Дармостук, Х.-Ю.Апель. 1997. Изучение нестационарного электрогенного транспорта ионов натрия Na,K,ATP-азой методом измерения емкости. Биологические мембраны 14:529-548.

33. Стожкова,И.Н., В.В.Черный, В.С.Соколов, Ю.А.Ермаков. 1997. Адсорбция гематопорфиринов на плоской бислойной мембране. Биологические мембраны 14:310-323.

34. Apell,H.J., A.Schneeberger, and V.S.Sokolov. 1998. Partial reactions of the Na,KATPase: kinetic analysis and transport properties. Acta Physiol Scand. Suppl 643:235245.

35. Sokolov,V.S., H.-J.Apell, J.E.T.Corrie, D.R.Trentham. 1998. Fast Transient Currents in Na,K-ATPase Induced by ATP Concentration Jumps from the P3-[1-(3',5'Dimethoxyphenyl)-2-Phenyl-2-Oxo]ethyl Ester of ATP. Biophys. J. 74:2285-2298.

36. Sokolov,V.S., S.M.Stukolov, A.S.Darmostuk, and H.J.Apell. 1998. Influence of sodium concentration on changes of membrane capacitance associated with the electrogenic ion transport by the Na,K-ATPase. Eur. Biophys. J. 27:605-617.

37. Павлов,К.В., В.С.Соколов. 1999. Электрогенный транспорт ионов Na/K-ATPазой.

Биологические мембраны 16:604-638.

38. Sokolov,V.S., M.Block, I.N.Stozhkova, and P.Pohl. 2000. Membrane Photopotential Generation by Interfacial Differences in the Turnover of a Photodynamic Reaction.

Biophys. J. 79:2121-2131.

39. Sokolov,V.S., A.G.Ayuan, H.-J.Apell. 2001. Assignment of charge movements to electrogenic reaction steps of the Na,K-ATPase by analysis of salt effects on the kinetics of charge movements. European Biophysics Journal 30:515-527.

40. Passechnik,V.I., V.S.Sokolov. Estimation of electrochrome dyes position in the bilayer through the 2nd harmonic of capacitive current. Bioelectrochemistry 55 (1-2):47-51, 2002.

41. Ermakov,Yu.A., V.S.Sokolov. 2003. Boundary potentials of bilayer lipid membranes:

methods and interpretations. In Planar Lipid Bilayers (BLMs) and their applications.

H.T.Tien and A.Ottova-Leitmannova, editors. Elsevier, 109-141.

42. Пасечник,В.И., В.С.Соколов. 2003. Использование метода компенсации внутримембранного поля для оценки глубины погружения в мембрану электрохромных стириловых красителей. Биологические мембраны 20:433-442.

43. Sokolov,V.S., V.M.Mirsky. 2004. Electrostatic potentials of bilayer lipid membranes:

basic research and analytical applications. In Ultrathin Electrochemical Chemo- and Biosensors: Technology and Performance. V.M.Mirsky, editor. Springer-Verlag, Heidelberg. 255-291.

44. Соколов,В.С., Е.А.Соколенко, А.B.Соколов, О.А.Финогенова, А.Е.Донцов, М.А.Островский. 2005. Взаимодействие бис-ретинилиден этаноламина (А2Е) с бислойными липидными мембранами в темноте и при действии света.

Биологические мембраны 22:361-369.

45. Ayuyan A.G., V.S.Sokolov, A.A.Lenz, H.J.Apell. 2006. Effect of chaotropic anions on the sodium transport by the Na,K-ATPase. Eur.Biophys.J. 35 (3):247-254.

46. Pashkovskaya,A.A., E.A.Sokolenko, V.S.Sokolov, E.A.Kotova, Y.N.Antonenko. 2007.

Photodynamic activity and binding of sulfonated metallophthalocyanines to phospholipid membranes: Contribution of metal-phosphate coordination. Biochim. Biophys. Acta 1768:2459-2465.

47. Sokolov,V.S., E.A.Sokolenko, A.V.Sokolov, A.E.Dontsov, Y.A.Chizmadzhev, M.A.Ostrovsky. 2007. Interaction of pyridinium bis-retinoid (A2E) with bilayer lipid membranes. J. Photochem. Photobiol. 86:177-185.

48. Соколов,В.С., Е.А.Соколенко, Д.В.Филинский, Ю.А.Ермаков, О.Д.Лопина, Х.Ю.Апель. 2007. Электрические потенциалы, возникающие при адсорбции фрагментов мембран с Na,K,ATP-азой на липидных бислоях. Биологические мембраны 24:333-347.

49. Sokolov,V.S., A.A.Shcherbakov, A.A.Lenz, Yu.A.Chizmadzhev, H.-J.Apell. 2008.

Electrogenic transport of Na-ions in cytoplasmic and extracellular ion access channels of Na,K,ATP-ase probed by admittance measurement technique. Biochemistry (Moscow) Supplement Series A: Membrane and Cell Biology, 2 (2):161-180.

50. Соколов,А.B., В.С.Соколов, Т.Б.Фельдман, М.А.Островский. 2008. Взаимодействие полностью-транс-ретиналя с бислойными липидными мембранами. Биологические мембраны 25:501-508.

51. Князев,Д.Г., В.А.Радюхин, В.С.Соколов. 2008. Изучение межмолекулярных взаимодействий белков М1 вируса гриппа на поверхности модельной липидной мембраны методом компенсации внутримембранного поля. Биологические мембраны 25 (6):491-800.

52. Sokolov,V.S., P.Pohl. 2009. Membrane transport of singlet oxygen monitored by dipole potential measurements. Biophys. J. 96 (1):77-85.

53. Гришанин,К.О., В.Ю.Ташкин, А.А.Ленц, Х.-Ю.Апель, В.С.Соколов. 2010. О возможном участии протонов в функционировании Na+,K+,ATP-азы. Биологические мембраны 27 (6):512-518.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.