WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

МАШКОВ ОЛЕГ ИГОРЕВИЧ


Клонирование гена эндонуклеазы I бактериофага Т7

и создание штаммов-суперпродуцентов

03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Уфа 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук (ИБГ УНЦ РАН)

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор

Чемерис Алексей Викторович

Официальные оппоненты: Вахитова Юлия Венеровна

Зимин Андрей Антонович

Доктор биологических наук

Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН

Заведующая лабораторией

Кандидат биологических наук

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов Пущинского научного центра РАН,

старший научный сотрудник

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита диссертации состоится «___» ____________ 2012 г.  в «____» часов

на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 002.133.01

при ИБГ УНЦ РАН по адресу: Уфа, пр. Октября, 71

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского научного центра РАН (Уфа, пр. Октября, 71),

e-mail: molgen@anrb.ru

Автореферат разослан «____» ______________ 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета                                 Бикбулатова С.М.

Общая характеристика работы

Актуальность работы. Рекомбинационный процесс является основой непостоянства генома, это источник новых комбинаций существующих единиц наследственности [Holliday, 1964, 1974]. Четырёх-нитевой перекрест или так называемая структура Холлидея образуется в результате взаимодействия двух молекул ДНК в том месте, где их последовательности отличаются высокой степенью подобия. Точка перекреста (обмена нитями между двумя молекулами) способна самопроизвольно мигрировать в пределах участка высокой гомологии между молекулами [Hsieh, Panyutin, 1995]. Однако, миграция точки перекреста на протяжённом участке невозможна без соответствующего ферментативного аппарата. В силу спиральной формы молекул, при продвижении в любую сторону точки перекреста, неизбежно будут возникать отрицательные или положительные сверхвитки на обеих взаимодействующих сторонах. Данное обстоятельство накладывает существенные ограничения как на скорость миграции перекреста, так и на конечное расстояние, которое способен пройти этот комплекс. В разрешении возникающей ситуации принимают участие перекрест-расщепляющие ферменты (junction resolving enzymes) или резолвазы [Lilley, White, 2001]. Протяжённость участка, на котором взаимодействующие молекулы способны произвести обмен цепями, зависит от ориентации относительно перекреста точки разрешения.

       Способность резолваз различать спаренные и неспаренные основания в молекулах ДНК находит применение для обнаружения однонуклеотидного полиморфизма, составляющего значительную долю вариабельности человеческих геномов [Lishanski, 2000; Lishanski et al., 2000; Yang et al., 2003; Pule et al., 2008]. Причем, несмотря на то, что методов выявления однонуклетидных замен предложено довольно много, ряд из них характеризуются невысокой специфичностью, тогда как считается, что разрешение образующихся четырех-нитевых структур Холлидея крайне чувствительно к спариванию / неспариванию азотистых оснований. Одним из таких важных ферментов является эндонуклеаза бактериофага Т7, производимая единственной фирмой New Englands Biolabs, Inc. (США) и характеризующаяся высокой стоимостью. В этой связи представляет интерес клонирование гена данной эндонуклеазы, создание на его основе штамма-суперпродуцента, обеспечивающего наработку функционально активного белка.

Цель работы создание бактериального (Escherichia coli) штамма-суперпродуцента эндонуклеазы I бактериофага Т7 и использование рекомбинантного фермента для разрешения структур типа Холлидея и изучения однонуклеотидных замен.

Для выполнения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

  1. Амплификация, клонирование и секвенирование гена бактериофага Т7, кодирующего эндонуклеазу I.
  2. Создание генно-инженерных конструкций на основе экспрессирующих векторных молекул, несущих ген t7e1 в различных штаммах Е.coli.
  3. Получение штаммов-продуцентов эндонуклеазы Т7Е1 на основе культуры клеток E.coli.
  4. Создание штамма-суперпродуцента эндонуклеазы Т7Е1 на основе вектора pET22-bT7.
  5. Оптимизация условий очистки целевого белкового продукта.
  6. Оценка специфической ферментативной активности очищенного белкового экстракта, включая разрешение структур типа Холлидея и детекцию однонуклеотидных замен по конечной точке и в режиме реального времени.

Научная новизна. Показано, что рекомбинантная Т7Е1 эндонуклеаза способна разрешать четырех-нитевые перекресты или структуры Холлидея, а также различать спаренные и неспаренные азотистые основания, в том числе, в режиме реального времени, что позволяет рекомендовать данный фермент для выявления однонуклеотидного полиморфизма ДНК человека.

Научно-практическая значимость работы. Создан штамм-суперпродуцент фермента Т7E1, находящего новое применение в анализе полиморфизма ДНК. Оптимизация отдельных стадий технологии получения и очистки рекомбинантной Т7 эндонуклеазы I из штаммов E.coli обеспечивает наработку функционально активного фермента в количестве до 50 мг/л жидкой культуры.

Конкурсная поддержка работы. Данная работа проводилась в рамках государственного контракта № 02.740.11.0290 по ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на школе-семинаре молодых ученых УНЦ РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика – наука XXI века» (Уфа, 2007), на IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009), на II школе-конференции молодых учёных «ЭкоБиотех-2011» (Уфа, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, входящих в Перечень ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 105 страницах, содержит 28 рисунков и 4 таблицы. Состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 155 работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Объектом исследования в данной работе служил ген эндонуклеазы I бактериофага Т7 (t7e1), а также синтетическая ДНК и ДНК человека.

В экспериментах использовали рекомбинантные плазмидные вектора pKRXT7-E1, рЕТ-3аТ7, рЕТ-22bT7, pQE-30T7, PinPointXA-2T7, несущие ген t7e1. В качестве штаммов-продуцентов целевого белка для различных векторных систем использовали соответствующие бактериальные культуры: для фагмидного вектора pKRX использовался бактериальный штамм E.coli XL1-Blue; для рекомбинантных экспрессирующих векторов на основе серии рЕТ штамм E.coli BL21(DE3)pLysS; для работы с рекомбинантным вектором на основе pQE-30 штамм E.coli BL21(DE3); для рекомбинантного вектора на основе PinPoint – штамм E.coli JM109.

Методы исследования

Выделение высокомолекулярной ДНК проводили фенольно-детергентным методом [Graham, 1978]. Выделение плазмидной ДНК проводили методом мягкого лизиса [Clewell, Helinski, 1969]. Специфическая амплификация целевой нуклеотидной последовательности осуществлялась по стандартной методике ПЦР, с некоторыми модификациями температурно-временного режима, либо с использованием различных технологий «горячего старта», в том числе с использованием HS Taq ДНК-полимеразы и наноразмерных коллоидных частиц золота. Определение нуклеотидных последовательностей клонированных фрагментов ДНК проводили на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 310 фирмы «Applied Biosystems» (США), используя наборы для секвенирования «Big Dye Terminator v.3.1». Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей выполнялся с помощью пакета компьютерных программ «Lasergene» фирмы «DNASTAR, Inc.» (США). Выделение белкового продукта осуществляли либо разрушением бактериальной клеточной стенки и нуклеиновых кислот последовательным добавлением лизоцима и ДНКазы, либо непродолжительным воздействием на клеточную массу ультразвука при помощи ультразвукового дезинтегратора УЗДН-2Т (СССР). Белковый экстракт анализировался в 15% полиакриламидном геле, содержащем SDS [Sambrook et al., 1989]. Аффинную хроматографию клеточного лизата проводили как с растворимой, так и с нерастворимой в воде фракциями. Целевой белковый продукт выделяли с помощью элюирующего буферного раствора, содержащего высокую концентрацию имидазола. Количественную оценку выхода белкового продукта в полученных фракциях осуществляли с помощью детекции спектра поглощения OD254 на высокоэффективном жидкостном хроматографе BioLogic Duo Flow фирмы «BioRad» (США). При визуальном контроле наличия целевого продукта в исследуемых фракциях проводили сравнительный SDS-ПААГ-электрофорез в денатурирующих условиях. По итогам анализа спектра поглощения OD254 и SDS-ПААГ-электрофореза отбирали фракции с наибольшим количеством целевого продукта. Отобранные фракции проверяли на присутствие специфической ферментативной активности с использованием в качестве субстрата четырёхнитевого ДНК-перекреста. Наличие эндонуклеазной активности по конечной точке определяли при сравнительном ПААГ-электрофорезе в денатурирующих условиях. Разрешение структур типа Холлидея при анализе однонуклеотидного полиморфизма ДНК проводили в изотермических условиях в ДНК-термоциклере с оптическим модулем модели iQ5 фирмы Bio-Rad Laboratories (США) в реальном времени путем регистрации FRET-эффекта с использованием в качестве донора флуоресценции красителя FAM и в качестве акцептора - флуорохрома ROX на предложенной ранее платформе «УФА» [Чемерис и др., 2005].

Результаты и обсуждение

Получение экспрессирующих рекомбинантных векторных молекул

В качестве стартового материала использовали тотальную геномную ДНК, выделенную из исходной культуры бактериофага Т7. Для получения полноразмерной последовательности гена t7e1 были подобраны праймеры, отжигающиеся по краям данного гена. Для удобства клонирования экстра-последовательность праймеров несла сайт узнавания для рестриктазы BamHI. Для специфичной амплификации целевого продукта использовали различные способы проведения ПЦР-амплификации: понижение температуры отжига праймеров, изменение рабочей концентрации праймеров, изменение концентрации ионов Mg2+ в буферном растворе ПЦР, применение «горячего старта». Применение методики «горячего старта» объяснялось наличием у прямого и обратного праймеров участков взаимной гомологии, что было вызвано особенностями нуклеотидных последовательностей концов гена t7eI. Для исключения образования праймерных димеров в ходе ПЦР использовали различные подходы в виде простого предварительного нагрева реакционной смеси и добавления Taq ДНК полимеразы, использования специфически связанной с моноклональными антителами ДНК-полимеразы HS Taq ДНК-полимеразы, а также применения наноразмерных (диаметром около 13 нм) частиц коллоидного золота, по-видимому, также при низкой температуре связывающегося с серосодержащими аминокислотами Taq полимеразы и исключающей последнюю из реакции. Дополнительным важным моментом использования частиц коллоидного золота служит ускоренная теплопередача внутри самой реакционной смеси. При использовании технологии такого отложенного старта удалось наработать целевую последовательность без появления в реакционной смеси неспецифических продуктов амплификации.

Клонирование гена Т7 эндонуклеазы I в плазмидную

векторную конструкцию pKRX

В результате высокоспецифичной амплификации геномной ДНК бактериофага Т7 был получен фрагмент, размер которого совпал с ожидаемым и составил 474 п.н. При помощи рестриктазно-лигазного метода клонирования с использованием вектора pKRX был получен ряд рекомбинантных плазмид, содержащих ген эндонуклеазы I бактериофага Т7. Векторные молекулы со вставкой t7e1 проверяли на сохранение рамки считывания целевого фрагмента, а также на наличие и правильное расположение других структурных и регуляторных элементов.

Для наработки достаточного количества рекомбинантной ДНК, несущей ген t7e1 in vivo использовали векторную молекулу pKRXT7-E1, которой был трансформирован штамм E.coli XL1-Blue (рис. 1).

Рис. 1. Схема расположения основных регуляторных и структурных элементов рекомбинантной векторной молекулы pKRXT7-E1.

T7 promoter – промотор Т7-РНК-полимеразы; MCS – сайт множественного клонирования (Multiple Cloning Site), полилинкерная последовательность с сайтами узнавания ферментов рестрикции; ATG-codon – инициирующий кодон; t7e1 – ген эндонуклеазы I бактериофага Т7, амплифицированный с праймерами T7-E2-U и T7-E1-L; lac promoter – промотор лактозного оперона; lacZ ген -галактозидазы E.coli.

После выделения и очистки плазмидная ДНК pKRXT7-E1 была амплифицирована с праймерами к гену t7e1: Т7Е1-U и Т7Е1-L (рис. 2а). Далее был проведён рестрикционный анализ продукта ПЦР, полученного при амплификации плазмидной ДНК клонов pKRX, содержащих вставку, с праймерами T7E1-U и T7E1-L (рис. 2б). Рестрикционый анализ показал наличие фрагментов, соответствующих по размеру ожидаемым. Следовательно, в вектор pKRX был встроен ген эндонуклеазы I бактериофага Т7, который впоследствии был специфически амплифицирован и расщеплён соответствующими рестриктазами.

а) б)

Рис. 2. Электрофоретический анализ рекомбинантной вставки, амплифицированной с праймерами к гену t7e1.

а) продукты ПЦР ДНК клонов со вставкой гена t7e1 в векторе pKRX.

1 – маркер (pBluscript II SK:HpaII); 29 – продукты ПЦР ДНК клонов, полученных после трансформации.

б) рестрикционный анализ фрагмента плазмиды pKRXT7-E1, гомологичного гену t7e1. 1 – маркер (pBluscript II SK:HpaII); 2 – амплифицированный фрагмент плазмиды pKRXT7-E1 с праймерами к гену t7e1; 3 – результат рестрикции амплификата Csp6I; 4 – результат рестрикции амплификата HaeIII.

Клонирование гена эндонуклеазы I бактериофага Т7

в экспрессирующую векторную молекулу рЕТ-3а

Идентифицированный при помощи рестрикционного анализа и специфической амплификации плазмидной ДНК ген t7e1 был переклонирован в экспрессирующий вектор pET-3a по сайту рестрикции BamHI. В результате был получен клон pET-3аТ7. При амплификации плазмидной ДНК данного клона с праймерами к гену t7e1 нарабатывался ПЦР-продукт ожидаемого размера (470 п.н.). При рестрикции BamHI плазмиды pET-3aT7 также было показано наличие соответствующего фрагмента (рис. 3а). Направление вставки гена t7e1 в экспрессирующем векторе рЕТ-3а определяли при помощи амплификации с использованием Т7-праймера и праймерами к гену t7e1. С целью подтверждения полученных сведений в ПЦР использовали также другие наборы праймеров (рис. 3б). Полученные результаты в виде наработки ПЦР-продуктов в ожидаемых вариантах (рис. 3в) подтвердили правильность генно-инженерной конструкции.

Рис. 3. Электрофоретический анализ штамма рЕТ-3аТ7.

а) плазмидный профиль рЕТ-3аТ7. 1 – маркер (pBluscript II SK:HpaII); 2 – плазмида рЕТ-3а; 3 – плазмида рЕТ-3аТ7; 4 – плазмида рЕТ-3аТ7:BamHI.

б) схема расположения внутренних и внешних праймеров при определении направления вставки гена t7e1. Серым цветом показаны внутренние праймеры к гену t7e1 (T7F1 и T7R1), чёрным – внешние (T7E1-U и T7E1-L).

в) проверка ориентации вставки гена t7e1 в конструкции рЕТ-3аТ7.

1 – маркер (pBluscript II SK:HpaII); 27 продукты ПЦР: 2 – рЕТ-3аТ7 с праймерами Т7 и T7E1-L; 3 – рЕТ-3аТ7 с праймерами Т7 и T7E1-U; 4 – рЕТ-3аТ7 с праймерами Т7 и T7F1; 5 – рЕТ-3аТ7 с праймерами Т7 и T7R1; 6 – рЕТ-3аТ7 с праймерами Т7R1 и T7F1; 7 – рЕТ-3аТ7 с праймерами Т7E1-U и T7E1-L.

Окончательная проверка нуклеотидной последовательности и ориентации вставки осуществлялась с помощью автоматического секвенирования.

Клонированная последовательность гена t7eI содержит собственный ATG-кодон, что способствовало эффективной экспрессии эндонуклеазы I в клетках E.coli. Помимо Т7-промотора векторная молекула рЕТ-3а содержит RBS (ribosome binding site) – сайт связывания рибосом (рис. 4).

Рис. 4. Схема расположения основных регуляторных и структурных элементов экспрессии в генно-инженерной конструкции, несущей вставку гена t7e1, составленная на основе данных автоматического секвенирования векторной молекулы pET-3аT7. T7 promoter – промотор Т7-РНК-полимеразы; T7 transcription start – точка начала транскрипции для Т7-РНК-полимеразы; RBS – сайт связывания рибосом; ATG-codon – инициирующий кодон; T7-Tag coding sequence – последовательность, кодирующая иммунно-аффинную пептидную метку из первых 11-ти аминокислот основного продукта 10-го гена бактериофага Т7; t7e1 – ген эндонуклеазы I бактериофага Т7, амплифицированный с праймерами T7-E2-U и T7-E1-L; T7 terminator – терминатор транскрипции Т7-РНК-полимеразы.

Секвенирование также показало, что при рестрикции рЕТ-3а рестриктазой BamHI и последующего лигирования с геном t7e1, рамка считывания была восстановлена. Таким образом, сделан вывод, что конструкция рЕТ-3аТ7 способна к экспрессии фермента эндонуклеазы I бактериофага Т7.

Клонирование гена эндонуклеазы I бактериофага Т7 в экспрессирующие векторные молекулы pQE-30 и PinPointXA-2

Помимо вышеуказанного вектора pET-3a для создания экспрессирующей конструкции, содержащей ген эндонуклеазы I бактериофага Т7, были использованы векторные молекулы рЕТ-15, pET-22, рЕТ-26, pET-44, pQE-30, PinPointXA-2. Наиболее удачными (с точки зрения сохранения направления рамки считывания, наличия полной последовательности гена t7e1 при условии отсутствия мутаций, изменяющих аминокислотную последовательность) оказались лишь некоторые клоны. Среди них можно выделить pET-22bT7(cl7), pQE-30T7(cl22) и PinPointXA-2T7(cl14).

В случае pQE-30T7(cl22) и PinPointXA-2T7(cl14) применялся рестриктазно-лигазный метод направленного клонирования с использованием двух эндонуклеаз рестрикции BamHI и HindIII (для клонирования в вектор pQE-30) или NdeI (для клонирования в вектор PinPointXA-2). Для этого при амплификации гена t7e1 использовали праймеры T7E2-U и T7-HindIII-R или T7-NdeI. Каждый из праймеров в своей экстра-последовательности содержит сайт рестрикции. Для T7E2-U таковым является сайт рестрикции BamHI, для T7-HindIII-R – сайт рестрикции HindIII, а для T7-NdeI – сайт рестрикции NdeI. После обработки векторной молекулы и амплифицированного гена t7e1 соответствующими рестриктазами образуются фрагменты с идентичными комплементарными липкими концами. В случае смешения в растворе гена t7e1 и плазмидной ДНК происходит реассоциация гидролизованных одинаковыми рестриктазами фрагментов разных молекул нуклеиновых кислот.

Анализ с помощью секвенирования вставки гена t7e1 и прилегающих районов в рекомбинантных конструкциях pQE-30T7(cl22) и PinPointXA-2T7(cl14) показал полное сохранение всех структурных и регуляторных элементов экспрессии целевого белка (рис. 5).

Однако дальнейшее практическое использование pQE-30T7(cl22) и PinPointXA-2T7(cl14) показало крайне слабую наработку целевого белка и даже отсутствие таковой в бактериальной культуре. Изменение условий культивирования, индукции, выделения или анализа клеточного лизата не принесло положительных результатов при детекции какого-либо полипептида на специфическом субстрате (табл. 1).

Рис. 5. Схемы расположения основных регуляторных и структурных элементов экспрессии в генно-инженерной конструкции, несущей вставку гена t7e1, составленные на основе данных автоматического секвенирования векторных молекул pQE-30T7(cl22) и PinPointXA-2T7(cl14) соответственно. T5 transcription start – точка начала транскрипции для Т5-РНК-полимеразы; biotin purification tag-coding region – последовательность, кодирующая аффинную пептидную биотиновую метку; Factor Xa Protease recognition site последовательность, кодирующая сайт узнавания для фактора Ха-протеазы; ATG-codon – инициирующий кодон; MCS – сайт множественного клонирования; t7e1 – ген эндонуклеазы I бактериофага Т7, амплифицированный с праймерами T7-E2-U и T7-HindIII-R (в случае pQE-30Т7) или T7-NdeI (в случае PinPointXa-2Т7); 6xHis-tag – последовательность, кодирующая аффинную пептидную метку из шести гистидинов.

Поскольку при анализе белкового продукта индуцированных бактериальных культур, содержащих конструкции pET-3aT7, pQE-30T7(cl22) и PinPointXA-2T7(cl14), не обнаружено полипептидной цепи с молекулярной массой и ферментативной активностью соответствующей Т7Е1, было осуществлено клонирование целевого фрагмента в вектор рЕТ-22.

Таблица 1

Параметры выделения целевого белка из экспрессирующих векторных молекул pQE-30T7(cl22) и PinPointXA-2T7(cl14)

Стадия

Изменяемые параметры

Культивирование до индукции

температурный режим: от 20 до 37°С;

OD600 перед индукцией от 0,3 до 0,8.

Индукция бактериальной культуры

конечная концентрация IPTG в бактериальной культуре:

от 0,05 до 0,3 мМ;

время наращивания индуцированной культуры:

от 2 до 6 часов;

температурный режим культивирования: от 20 до 37°С.

Выделение белкового продукта

УЗ-дезинтегрирование клеточной культуры.

либо

выделение белкового продукта последовательным воздействием лизоцимом и ДНКазой.

Анализ клеточного лизата

Сравнительный анализ результатов электрофоретического разделения полипептидов, выделенных из подвергшихся индукции и контрольных культур.

либо

аффинная хроматография клеточного лизата индуцированной культуры и последующий электрофоретический анализ.

Клонирование гена эндонуклеазы I бактериофага Т7

в экспрессирующую векторную молекулу рЕТ-22

Рекомбинантная векторная молекула рЕТ-22bТ7(cl7) создана с использованием аналогичных процедур молекулярного клонирования, применяемых в случае образования рЕТ-3аТ7 (клонирование и последующее лигирование по уникальному сайту рестрикции BamHI). Анализ с помощью секвенирования последовательности вставки гена t7e1 и прилегающих районов pET-22bT7(cl7) не выявил критических изменений, способных влиять на экспрессию целевого белка – рамка считывания сохранена, инициирующий и терминирующий кодоны на соответствующих местах, в плазмиде не утрачены сайты транскрипции и трансляции (рис. 6).

Рис. 6. Схема расположения основных регуляторных и структурных элементов экспрессии генно-инженерной конструкции, несущей вставку гена t7e1, составленная на основе данных автоматического секвенирования векторной молекулы pET-22bT7(cl7). T7 promoter – промотор Т7-РНК-полимеразы; T7 transcription start – точка начала транскрипции для Т7-РНК-полимеразы; Lac-operator – оператор лактозного оперона; RBS – сайт связывания рибосом; ATG-codon – инициирующий кодон; Multiple Cloning Site – сайт множественного клонирования; t7e1 – ген эндонуклеазы I бактериофага Т7, амплифицированный с праймерами T7-E2-U и T7-E1-L; His-tag – последовательность, кодирующая аффинную пептидную метку из шести гистидинов; T7 terminator – терминатор транскрипции Т7-РНК-полимеразы.

Экспрессия и очистка рекомбинантного белка Т7Е1,

клонированного в векторную молекулу pET-22bT7(cl7)

Экспрессия рекомбинантной векторной молекулы рЕТ-22bT7(cl7)

Бактериальный штамм E.coli BL21(DE3)pLysS был трансформирован вектором рЕТ-22bT7(cl7). Данный штамм позволяет осуществлять строгий контроль экспрессии белков, находящихся под контролем Т7-РНК-полимеразного промотора, благодаря наличию pLys-плазмиды, которая кодирует Т7-лизоцим естественный ингибитор Т7-РНК-полимеразы. При экспрессии целевого белка лизоцим не влияет на рост клеточной культуры. В целях недопущения так называемого «подтекания» промотора (явления, при котором возможна незначительная экспрессия гена, находящегося под контролем промотора, без добавления индуктора) наращивание бактериальной культуры перед индукцией (а также контрольного образца без индукции) проводили на питательной среде, содержащей 2%-ю химически чистую глюкозу (репрессор промотора Т7-РНК-полимеразы). После УЗ-дезинтегрирования проводили сравнительный SDS-PAAG-электрофорез индуцированных и контрольных образцов (рис. 7). В отличие от рекомбинантных молекул рЕТ-3аТ7, pQE-30T7(cl22) и PinPointXA-2T7(cl14), в образцах рЕТ-22bT7(cl7), подвергавшихся индукции, уверенно обнаруживался дополнительный полипептидный продукт.

Рис. 7. Электрофореграмма клеточного лизата штамма рЕТ-22bT7(cl7).

М – белковый маркер (kDa). 1 – без IPTG; супернатант. 2 – без IPTG; осадок, разведённый в 0.5 М мочевине. 3 – без IPTG; осадок, разведённый в 1 М мочевине. 4 – без IPTG; осадок, разведённый в 2 M мочевине. 5 – 0.5 мМ IPTG; супернатант. 6 – 0.5 мМ IPTG; осадок, разведённый в 0.5 M мочевине. 7 – 0.5 мМ IPTG; осадок, разведённый в 1 M мочевине. 8 – 0.5 мМ IPTG; осадок, разведённый в 2 M мочевине.

Примечание: овалом выделена область с дополнительным полипептидным продуктом.

Необходимо учитывать, что после вставки в векторную молекулу рЕТ-22b гена t7e1 экспрессируемый участок включает не только последовательность самого гена, но и отрезок между полилинкерной последовательностью и инициирующим кодоном с одной стороны и полилинкером и Т7-терминатором с другой (рис. 6). При этом расчётная молекулярная масса целевого полипептида увеличивается с 17,2 до 25,3 кДа. Электрофоретическое разделение клеточного лизата штамма рЕТ-22bT7(cl7) служит подтверждением данного факта (рис. 7).

На основании представленных данных сделано заключение, что при выбранных условиях культивирования и выделения белкового экстракта в штамме рЕТ-22bT7(cl7) происходит наработка рекомбинантного белка Т7Е1.

Аффинная хроматография клеточного лизата индуцированной культуры, содержащей рекомбинантную молекулу рЕТ-22bT7(cl7)

Для специфичной очистки рекомбинантного белка Т7Е1, была проведена аффинная хроматография с помощью Ni2+-NTA-субстрата. В случае экспрессии рекомбинантного гена t7e1 на С-конце полипептидной цепи имеется аффинная метка – полигистидиновый домен, состоящий из шести последовательно расположенных остатков гистидина. Анализ выхода белкового продукта осуществлялся на высокоэффективном жидкостном хроматографе модели BioLogic Duo Flow фирмы «BioRad» (США). Так, нами был зафиксирован выход основной белковой массы (рис. 8.1б) при добавлении в отмывочный буфер небольшого количества имидазола (конечная концентрация в растворе – 20 мМ – рис. 8.1а). Однако, при увеличении концентрации элюирующего агента до 200 мМ (рис. 8.2а) наблюдался выход дополнительной белковой фракции (рис. 8.2б). Это можно объяснить наличием в клеточном лизате рекомбинантного белка Т7Е1 с присоединённой к его N-концу полигистидиновой аффинной меткой, с помощью которой фермент и удерживался на Ni2+-NTA-субстрате.

Рис. 8. Хроматограмма выхода очищенного клеточного лизата штамма рЕТ-22bT7(cl7). 1а – повышение концентрации имидазола до 20 мМ в отмывочном буфере. 1б – начало выхода основной части белкового продукта штамма рЕТ-22bT7(cl7). 2а – повышение концентрации имидазола до 200 мМ в отмывочном буфере. 2б – начало выхода белкового продукта, связавшегося с Ni2+-NTA-субстратом.

Фракции, в которых детектировался максимальный выход полипептида с аффинной меткой, подвергали диализу в течение 2 часов при 4°С против градиента 20 мМ Tris-HCl, 200 мМ NaCl, 1 мМ дитиотрейтола, 0.1 мМ EDTA, 50% глицерина, 0.15% Triton X-100 (pH 7.5 при 25 °C). Данный этап необходим для сохранения ферментативной активности рекомбинантного белка. После этого для анализа чистоты белкового продукта проводили денатурирующий электрофорез в 15% SDS-полиакриламидном геле (рис. 9).

Рис. 9. Электрофореграмма результатов аффинной хроматографии на Ni2+-NTA-субстрате клеточного лизата штамма рЕТ-22bT7(cl7). М белковый маркер (kDa). «-» Без IPTG, супернант. I 0.5 мМ IPGT, супернатант. 1 6 последовательные фракции, полученные при проведении аффинной хроматографии на Ni2+-NTA-субстрате клеточного лизата рЕТ-22bT7(cl7).

По результатам электрофоретического разделения и последующего окрашивания белкового препарата проводили относительную оценку количества очищенного полипептидного продукта с помощью программы TotalLab 2.01. Разработанная схема выделения и очистки рекомбинантного белка позволяет нарабатывать его в количестве до 50 мг/л жидкой культуры E.coli.

С теми фракциями, где по итогам электрофоретического анализа обнаруживалась наибольшая концентрация одиночного продукта массой 25 кДа (на рис. 9 это четвёртая фракция), осуществляли эксперимент на наличие специфической ферментативной активности, характерной для Т7Е1.

Исследование ферментативной активности очищенного рекомбинантного белкового продукта Т7Е1

Белковый продукт Т7Е1 обладает специфической ферментативной активностью, которая выражается в расщеплении четырёх-нитевых перекрестов. Для проверки наличия ферментативной активности, характерной для Т7Е1, была создана олигонуклеотидная структура, моделирующая четырёх-нитевой перекрест. В её состав входят четыре одноцепочечных олигонуклеотида. Каждый из них частично комплементарен двум другим (рис. 10). В итоге, при отжиге в одной пробирке эквимолярных количеств всех олигонуклеотидов образуется ДНК-перекрест, являющийся природным субстратом для Т7Е1.

Рис. 10. Схема ДНК-перекреста и его разрешение Т7 эндонуклеазой I.

b-цепь, длиною 54 нуклеотида, с 1-го по 40-й комплементарна х-цепи, с 41-го по 54-й – h-цепи; h-цепь, длиною 28 нуклеотидов, с 1-го по 14-й комплементарна b-цепи, с 15-го по 28-й – r-цепи; r-цепь, длиною 54 нуклеотида, с 1-го по 14-й комплементарна h-цепи, с 15-го по 54-й – х-цепи; х-цепь, длиною 80 нуклеотидов, с 1-го по 40-й комплементарна r-цепи, с 41-го по 80-й – b-цепи.

Полученный ДНК-перекрест в эквимолярном количестве отбирали для анализа ферментативной активности выделенных фракций или коммерчески доступного фермента Т7Е1 (New England Biolabs, США). Далее проводили инкубирование растворов в течение двух часов при 37°С. По результатам электрофоретического разделения продуктов ферментативной реакции можно заключить, что при добавлении элюирующего буферного раствора с высоким содержанием имидазола удавалось добиться единовременного выхода белковой фракции, обладающей специфической ферментативной активностью Т7Е1 (рис. 11).

Рис. 11. Электрофоретическое разделение в денатурирующих условиях (7 М мочевина) результатов ферментативной активности Т7Е1 и полученных фракций клеточного лизата штамма рЕТ-22bT7(cl7) после очистки на Ni2+-NTA-субстрате. 1 – ДНК-перекрест без обработки ферментативным препаратом. 2 – ДНК-перекрест после обработки коммерческим ферментом Т7Е1 (New England Biolabs, США). 3-6 – ДНК-перекрест после обработки полипептидным продуктом 4-7 фракций, соответственно, полученными при хроматографии на Ni2+-NTA-субстрате.

Из рис. 11 видно, что электрофореграмма ДНК-перекреста при денатурирующих условиях не имеет одной выраженной полосы. Вместо этого образец разделяется на три отличающихся по массе фрагмента. Подобное распределение объясняется тем, что два олигонуклеотида из четырёх (b- и r-цепь) имеют одинаковую длину – 54 нуклеотида. Однако, после обработки коммерческим ферментом Т7 эндонуклеазой I характер распределения конформомеров ДНК-перекреста изменяется. Появляются дополнительные фрагменты, обусловленные расщеплением в точке разветвления двух из четырёх нитей ДНК-перекреста. По литературным данным известно, что эндонуклеаза I способна разрезать четырёх-нитевую ДНК двумя способами. Однако в любом случае разрешение структуры Холлидея происходит при одновременном введении одноцепочечных разрывов фосфодиэфирных связей с противоположных 5’-концов цепей ДНК, относительно центра перекреста. Как показано на рисунке 10, Т7 эндонуклеаза I способна разрезать нити ДНК либо со стороны b- и r-цепей, либо со стороны х- и h-цепей. Поскольку в электрофоретической дорожке, соответствующей коммерческому ферменту Т7Е1 (рис. 11, дорожка 2), происходит разделение ДНК-перекреста на фрагменты 54, 40 и 14 нуклеотидов, можно с уверенностью сказать, что в данном случае преобладает разрешение структуры Холлидея со стороны h- и х-цепей. Аналогичная картина наблюдается для ДНК-перекреста, обработанного ферментативным препаратом из четвёртой фракции клеточного лизата. При этом, данная фракция соответствует повышению концентрации имидазола в элюирующем буфере с 20 мМ до 200 мМ. Последующие пятая и шестая фракции (на рис. 11 дорожки 4 и 5, соответственно), собранные при 200 мМ концентрации имидазола, таковой ферментативной активности не проявляют. Из чего можно заключить, что в них не содержится достаточного количества рекомбинантного белкового продукта. Последняя дорожка электрофореграммы соответствует этапу промывки колонки деионизированной водой. В ней, принимая во внимание наличие нерасщеплённого ДНК-перекреста, также не содержится активной формы Т7 эндонуклеазы I.

       В качестве одного из методов выявления однонуклеотидных замен служит ферментативное расщепление гетеродуплексов в местах неспаривания нуклеотидов или мисматчей, образующихся в результате отжига цепей ДНК, одна из которых несет мутацию.

Рис. 12. Кривые флуоресценции олигонуклеотидных структур с полным (1) и неполным (2) спариванием, обрабатываемых рекомбинантной эндонуклеазой Т7Е1.

       На рис. 12 можно видеть изменения регистрируемых в режиме реального времени в ДНК-термоциклере с оптическим модулем в условиях изотермической реакции уровней флуоресценции для разрешаемой с помощью рекомбинантной эндонуклеазы T7EI структур Холлидея с полным (1) и неполным (2) спариванием соответственно. Резкое падение под действием Т7Е1 эндонуклеазы уровня флуоресценции (переноса резонансной энергии флуоресценции) соответствует прохождению цепей места неспаривания и отдалением красителя-акцептора от красителя-донора.

ВЫВОДЫ

  1. Амплифицирован, клонирован и секвенирован ген бактериофага Т7, кодирующий эндонуклеазу I.
  2. Проведенное сравнение различных созданных генно-инженерных конструкций, оптимизированных для экспрессии в различных штаммах E.coli, позволило установить, что в отношении уровня экспрессии и эффективности очистки оптимальна конструкция, находящаяся под контролем промотора и терминатора РНК полимеразы Т7 и содержащая на N-конце рекомбинантного гена t7e1 полигистидиновый домен в штамме E.coli, несущем дополнительную pLys-плазмиду, кодирующую Т7-лизоцим, являющийся естественным ингибитором Т7-РНК-полимеразы, для исключения «подтекания» промотора.
  3. Создан штамм-суперпродуцент E.coli BL21(DE3)pLysE / pET-22bT7(cl7) для наработки эндонуклеазы I бактериофага Т7, в котором целевой фермент экспрессируется в составе слитного белка, содержащего на N-конце домен из шести последовательно расположенных остатков гистидина.
  4. Разработан метод очистки, позволяющий получить до 50 мг фермента Т7 эндонуклеазы I из 1 литра культуры клеток E.coli BL21(DE3)pLysE / pET-22bT7(cl7).
  5. Показано, что синтезированный белковый препарат Т7Е1 обладает ферментативной эндонуклеазной активностью по отношению к олигомерным ДНК-перекрестам и способен в виде неспаренных участков выявлять однонуклеотидные замены.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Машков О.И., Чубукова О.В. Клонирование и экспрессия гена эндонуклеазы I бактериофага Т7 // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2011. Т. 13, № 5(3). С. 259262.
  2. Бикбулатова С.М., Чемерис Д.А., Никоноров Ю.М., Машков О.И., Гарафутдинов Р.Р., Чемерис А.В., Вахитов В.А. Способы детекции результатов полимеразной цепной реакции в режиме реального времени // Вестник Башкирского университета. 2012. Т. 17, № 1. С. 5967.
  3. Чемерис Д.А., Магданов Э.Г., Машков О.И., Гарафутдинов Р.Р., Чемерис А.В. ПЦР с отложенным (горячим или задержанным) стартом // Биомика. 2011. Т. 2, №1. С. 18.
  4. Машков О.И. Структура Холлидея и перекрест-расщепляющие ферменты как основные агенты гомологичной генетической рекомбинации // Биомика. 2011. Т. 2, № 1. С. 923.
  5. Машков О.И., Чубукова О.В. Детекция de novo однонуклеотидного полиморфизма ДНК с помощью изменённой эндонуклеазы I бактериофага Т7 // Материалы Школы-семинара молодых ученых УНЦ РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика – наука XXI века». Уфа. 2007. С. 9395.
  6. Машков О.И., Чубукова О.В. Высокочувствительная детекция однонуклеотидных замен при помощи изменённой эндонуклеазы I бактериофага Т7 // Материалы IV российского симпозиума «Белки и пептиды». Казань. 2009. С. 305.
  7. Машков О.И., Узянбаева А.Х., Гарафутдинов Р.Р., Сахабутдинова А.Р., Чемерис А.В. Особенности протекания ПЦР в присутствии наночастиц золота // Материалы II-ой Всероссийской школы-конференции молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика – наука XXI века». Уфа. Биомика. 2011. Т.1, № 2. С. 7778.
 





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.