WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

                                На правах рукописи

Лаптева  Юлия  Сергеевна

Клонирование и экспрессия генов литических

эндопептидаз L1 и L5 Lysobacter sp. XL1

03.01.03 – Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва - 2012

Работа выполнена в лаборатории молекулярной микробиологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино

Научный руководитель:

кандидат биологических наук,                        Грановский Игорь Эдуардович

ФГБУН ИБФМ РАН

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук,                Кошелева Ирина Адольфовна

ФГБУН ИБФМ РАН

кандидат химических наук,                        Залунин Игорь Арсеньевич

ФГУП «ГосНИИгенетика»

Ведущая организация:                Федеральное государственное бюджетное

                                               учреждение науки Институт теоретической

                                               и экспериментальной биофизики РАН

Защита диссертации состоится « » декабря 2012 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д.217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, Москва, 1-ый Дорожный пр., д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИгенетика»

Автореферат разослан « »  ноября 2012 г

Ученый секретарь диссертационного совета,                        

Кандидат химических наук, доцент                                        Т.Л. Воюшина        

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Литические ферменты представляют собой чрезвычайно разнообразную группу белков, которые осуществляют гидролиз различных структурных компонентов клеточных стенок микроорганизмов, что приводит к их лизису. Бактериолитические ферменты разрушают пептидогликан, главный структурный компонент бактериальной клеточной стенки. В зависимости от того, какой участок пептидогликана они гидролизуют, бактериолитические ферменты разделяются на четыре группы. Глюкозаминидазы и мурамидазы расщепляют различные участки глюкановых цепей пептидогликана, амидазы гидролизуют амидную связь между мурамовой кислотой и пептидной субъединицей, и пептидазы (эндопептидазы) расщепляют пептидные связи в пептидных субъединицах или межпептидных мостиках.

Все живущие в настоящее время организмы – от высших животных и человека до бактерий и вирусов – способны синтезировать бактериолитические ферменты. Лизоцимы слизистых оболочек животных обеспечивают им защиту от проникновения патогенных микроорганизмов. Секретируемые в окружающую среду бактериолитические ферменты микроорганизмов обеспечивают их питанием, источниками энергией, строительным материалом за счет других организмов и собственных отмерших клеток. Бактериолитические ферменты выполняют также регуляторные функции: участвуют в сложных процессах развития микробных клеток и вирусов, в частности, в спорообразовании и фаговой инфекции, соответственно.

Бактериолитические ферменты используются для проведения экспериментов в молекулярной и клеточной биологии: при изучении строения и функционирования бактериальных клеточных стенок, в реакциях протеолиза для изучения структуры белков. Препараты на основе бактериолитических ферментов применяются для борьбы с антибиотико-устойчивыми патогенными микроорганизмами: ахромопептидаза из Achromobacter lyticus, лизостафин из Staphylococcus simulans, лизобакт, ларипронт и яичный лизоцим.

Бактерии рода Lysobacter представляют интерес для прикладной и фундаментальной науки и интенсивно изучаются уже с 1970-х гг, поскольку синтезируют различные литические ферменты. Антимикробный препарат лизоамидаза, получаемый на основе культуральной жидкости Lysobacter sp. XL1, активен против бактерий родов Staphylococcus, Bacillus, Streptococcus, Corynebacterium, Streptomyces и др., дрожжей, например, родов Saccharomyces и Candida. Показано, что антимикробное действие препарата обеспечивают пять бактериолитических ферментов и дрожжелитическая металлопротеаза. Бактериолитические ферменты лизоамидазы представлены тремя эндопептидазами L1, L4 и L5, а также N-ацетилмурамоил-L-аланин амидазой L2 и мурамидазой L3. В настоящее время все они выделены из культуральной жидкости Lysobacter sp. XL1 и в различной степени охарактеризованы.

По данным ингибиторного анализа эндопептидазы L1, L4 и L5 отнесены к семейству сериновых протеаз. По отношению к бактериальным пептидогликанам эндопептидаза L1 (~22 кДа) проявляет амидазную и эндопептидазную активности (гидролизует амидную связь между мурамовой кислотой и аланином, пептидные связи между диаминопимелиновой кислотой и аланином, а также между глицинами межпептидного мостика). Наиболее выражена у L1 именно эндопептидазная активность.

Эндопептидаза L5 (~26 кДа) содержится в культуральной среде в существенно меньших количествах, чем L1, и ее ферментативные свойства мало изучены. В отличие от L1, эндопептидаза L5 обладает только эндопептидазной активностью.

Эндопептидазы L1 и L5 являются термостабильными ферментами с оптимумом реакции 70 и 80 С, соответственно. Они проявляют различный спектр антимикробной активности. Так, например, клетки Bacillus subtilis и Micrococcus luteus разрушают оба фермента. В тоже время, только эндопептидаза L1 способна разрушать живые клетки Staphylococcus aureus и Bacillus subtilis, а эндопептидаза L5, в отличие от L1, способна разрушать живые клетки Kocuria rosea, Corynebacterium flavum, Alcaligenes faecalis.

К началу данной работы информация о структуре генов литических ферментов Lysobacter sp. XL1 отсутствовала. Поэтому, актуальным для дальнейших научных исследований и прикладных разработок являлось их идентификация и характеристика.

Цель исследования. Цель данной работы заключалась в клонировании и определении нуклеотидной последовательности генов бактериолитических эндопептидаз L1 и L5 Lysobacter sp.XL1 и создании штаммов-продуцентов этих ферментов на основе бактерий рода Pseudomonas.

Задачи исследования:

  1. Клонировать гены бактериолитических эндопептидаз L1 и L5 Lysobacter sp.XL1 и определить их нуклеотидную последовательность;
  2. Проанализировать экспрессию генов эндопептидаз L1 и L5 на уровне транскрипции в Lysobacter sp. XL1;
  3. Сконструировать систему экспрессии генов эндопептидаз L1 и L5 Lysobacter sp. XL1 в бактериях рода Pseudomonas и проанализировать её эффективность.

Научная новизна работы. В данной работе определена нуклеотидная последовательность фрагмента хромосомы ДНК Lysobacter sp. XL1 размером 9017 п.н., в котором локализованы гены эндопептидаз L1 и L5 (alpA и alpB, соответственно).

На основании анализа выведенных аминокислотных последовательностей определены структурные особенности эндопептидаз L1 и L5. В частности показано, что они синтезируются в виде препробелков: на N-конце расположен сигнальный пептид, за ним следует про-часть и затем зрелый фермент. Установлено, что эндопептидазы L1 и L5 являются близкими по размеру гомологичными белками, последовательности их препробелков идентичны на 62%. По результатам проведенного филогенетического анализа эндопептидазы L1 и L5 были отнесены к подсемейству S1Е семейства S1 клана PA сериновых пептидаз.

В данной работе впервые проведен анализ экспрессии генов эндопептидаз L1 и L5. Установлено, что данные гены транскрибируются индивидуально, каждый с собственного промотора, а транскрипты обнаруживаются на поздней экспоненциальной стадии роста. Определены размеры 5- нетранслируемых областей мРНК alpA и alpB. На основании анализа нуклеотидной последовательности предсказаны промоторные области генов alpA и alpB, а также наличие Rho-независимых терминаторов транскрипции.

Впервые сконструирована система экспрессии секретируемых бактериолитических эндопептидаз на основе P. fluorescens. Полученные рекомбинантные штаммы-продуценты эффективно секретируют активные эндопептидазы L1 и L5 в культуральную жидкость.

Научно-практическое значение работы. Полученные в данной работе результаты имеют как фундаментальное, так и прикладное значение. Рекомбинантные эндопептидазы могут быть использованы в молекулярной и клеточной биологии для разрушения клеток различных микроорганизмов и определения структурных компонентов их клеточных стенок. Кроме этого, в медицине и фармакологии эндопептидазы, как по отдельности, так и в комбинации друг с другом, или другими литическими ферментами, могут быть использованы для создания антимикробных препаратов.

Результаты данного исследования открывают возможности дальнейшего изучения механизмов регуляции экспрессии генов бактериолитических эндопептидаз Lysobacter sp. XL1.

Сконструированная на основе бактерий рода Pseudomonas система экспрессии может быть использована для наработки в псевдомонадах рекомбинантных белков, продукция которых в других продуцентах затруднена вследствие их токсичности, нерастворимости и низкого уровня экспрессии.

Апробация диссертации. Материалы диссертации были представлены на конференции «Фундаментальные науки – медицине» (Москва, декабрь 2005), на 10-, 11- и 12-ой Пущинской конференции молодых ученых (Пущино, 2006, 2007, 2008), на международной конференции «Molecular Genetics of Bacteria and Phages Meeting» (Madison, 2007), на IV-м Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, июнь 2009), на международном конгрессе и выставке по биотехнологии и биоэнергетике «ЕвразияБио-2010», на Всероссийский симпозиуме с международным участием «Биологически активные вещества микроорганизмов: прошлое, настоящее, будущее» (Москва, 2011).

Диссертационная работа была апробирована на совместном семинаре лабораторий молекулярной микробиологии, биологии плазмид и биохимии клеточной поверхности микроорганизмов ФГБУН Института биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г.К. Скрябина РАН и на заседании секции «Молекулярная биология» Ученого совета ФГУП «ГосНИИгенетика».

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе две статьи и два патента.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы, приложение и список цитируемой литературы. Работа изложена на ____ страницах машинописного текста и содержит ___ рисунков и ___ таблиц. Список цитируемой литературы содержит ____ источников, в том числе ___ на русском языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Поиск и определение нуклеотидной последовательности генов эндопептидаз L1 и L5.

Для идентификации фрагмента генома Lysobacter sp. XL1, кодирующего гена эндопептидазы L1, были использованы данные о нуклеотидной последовательности участка гена эндопептидазы L1 Lysobacter sp. XL1 размером 426 п.н. (Золова О.Э., личное сообщение). Данный фрагмент нарабатывали при помощи ПЦР и использовали в качестве зонда для идентификации рестрикционных фрагментов геномной ДНК, содержащих ген эндопептидазы L1 методом ДНК-ДНК гибридизации (Рис. 1).

Рисунок 1. Гибридизация по Саузерну рестрикционных фрагментов геномной ДНК Lysobacter species XL1 с ДНК-зондом к последовательности гена, кодирующего зрелую часть эндопептидазы L1. Цифрами отмечены эндонуклеазы рестрикции EcoRI (1), HindIII (2), XbaI (3), XhoI (4), BamHI (5), SalI (6). Справа указаны размеры фрагментов в тыс. пар нуклеотидов.

По результатам гибридизации были отобраны EcoRI и SalI-фрагменты геномной ДНК Lysobacter sp. XL1. Для их наработки был применен подход инвертированной ПЦР и была установлена их нуклеотидная последовательность. Компьютерный анализ контига позволил идентифицировать две протяженные ОРС размером 1197 и 1200 п.н., обозначенные нами как alpA и alpB, соответственно (Рис. 2). ОРС alpA кодирует литическую эндопептидазу L1, а продукт ОРС alpB проявляет высокую степень гомологии с AlpA (см. ниже). Анализ показал, что предполагаемый белок AlpB содержит аминокислотную последовательность, соответствующую экспериментально установленной последовательности N-концевого пептида зрелой части фермента L5 Lysobacter sp. XL1 (UniProtKB acc.# P85158). Поскольку ОРС эндопептидаз L1 и L5 расположены рядом, было сделано предположение, что в геноме Lysobacter sp. XL1 гены литических ферментов формируют единый кластер. Поэтому, были определены последовательности участков генома, фланкирующих ОРС alpA и alpB. Для этого была получена мини-библиотека геномной ДНК Lysobacter sp. XL1, при помощи гибридизации отобраны клоны, содержащие интересующие участки генома, и определена их нуклеотидная последовательность. В результате был составлен контиг размером 9017 п.н. в котором на расстоянии 2,4 т.п.н. выше alpA и 3,6 т.п.н. ниже alpB генов других литических ферментов обнаружено не было (Рис. 2, GenBank acc.# GU188567). На правом фланге секвенированного фрагмента была идентифицирована ОРС, обозначенная orfA, имеющая противоположную ориентацию по отношению к alpA и alpB. Анализ базы данных Pfam (http://pfam.sanger.ac.uk, Finn et al., 2010) показал, что белок OrfA длиной 600 а.о. предположительно относится к семейству ABC-транспортеров и содержит характерные для этих белков TMD (от англ., transmembrane domain, pf00664) и ABC (от англ., ATP binding cassette, pf00005) домены.

Рисунок 2. Структура кластера генов alpA, alpB и orfA Lysobacter sp. XL1 (№ GU188567, GenBank). Серыми стрелками отмечено расположение и направление ОРС. Р1 и Р2 - промоторы генов alpA и alpB, соответственно. Над картой указано положение сайтов эндонуклеаз рестрикции.

AlpA и AlpB являются секретируемыми литическими протеазами.

Поскольку секретируемые протеазы микроорганизмов синтезируются, как правило, в виде неактивных предшественников (препроферментов), был проведен анализ аминокислотных последовательностей белков AlpA и AlpB с целью идентификации участков сигнальных пептидов, границ про-частей и зрелых ферментов. С использованием он-лайн сервиса SignalP 4.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) был проведен поиск сигнальных пептидов. Согласно предсказанию, положение сайтов процессинга с вероятностью 1,000 находится между 33 и 34 а.о. для AlpA и между 28 и 29 а.о. для AlpB. Границы и длину про-частей и зрелых ферментов рассчитывали на основании экспериментально установленных N-концевых пептидов зрелых ферментов L1 и L5. На основании анализа установлено, что сайт процессинга пробелка находится между 199 и 200 а.о. для AlpA, и 194 и 195 а.о. для AlpB. Суммируя данные анализа аминокислотных последовательностей можно заключить, что эндопептидазы AlpA и AlpB имеют традиционную для секретируемых протеаз микроорганизмов и синтезируются в виде препробелков, созревание которых происходит в процессе секреции (Рис. 4).

С целью установления родства белков AlpA и AlpB был проведен поиск гомологичных белковых последовательностей в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) с помощью программы BLAST.

Аминокислотные последовательности, соответствующие зрелым частям белков, выравнивали между собой с помощью программы CLUSTAL Х. Построение дерева производили с помощью пакета программ TREECON с использованием метода «объединения соседних пар» (neighbor-joining).

Статистическая достоверность ветвления оценивалась с помощью бутстреп-анализа 1000 альтернативных деревьев, используя соответствующую функцию программы TREECON. Эволюционное расстояние выражено как число замен на 100 аминокислот.

Рисунок 3. Дендрограмма родства сериновых протеаз, построенная на основе сравнительного анализа аминокислотных последовательностей зрелых ферментов. На рисунке указаны номера последовательностей в базе данных UniProt. Представлены ферменты из следующих организмов: P00778 - Lysobacter enzymogenes, D2K8B3 и D2K8B4 - Lysobacter sp. XL1, P52320 и Q07006 - Streptomyces griseus, Q03424 и P41140 - Streptomyces fradiae, Q05308 - Rarobacter faecitabidus, P0C1U8 и Q9FD08 - Staphylococcus aureus, P15636 - Achromobacter lyticus, Q9HWK6 - Pseudomonas aeruginosa PAO1, Q8VSL2 - Shigella flexneri, CAA00270 (номер последовательности в базе данных GenBank) - Neisseria gonorrhoea, Q9EZE7 - Escherichia coli, P00784 - Carica papaya. В качестве корневого вида выбран папаин. В правой части рисунка указаны кланы (PA и CA) и семейства (S1Е, S1B, S1D, S6 и С1А) протеаз в соответствии с базой данных пептидаз MEROPS (Rawlings et al., 2010, http://merops.sanger.ac.uk/).

Филогенетический анализ последовательностей зрелых ферментов AlpA и AlpB показал их родство с белками клана PA, класса S сериновых пептидаз, семейства S1, подсемейства S1E, типовым ферментом которого является химотрипсин А (Рис.3).

Наибольшую гомологию последовательности AlpA и AlpB проявляют с -литической протеазой (-ЛП) L. enzymogenes: предшественник этого фермента идентичен на 78% и 58% с предшественниками AlpA и AlpB, соответственно.

На основании выравнивания последовательностей белков -ЛП, AlpA и AlpB (Рис. 4) было выявлено наличие у последних каталитической триады His (H235 для AlpA, H234 для AlpB), Asp (D262 для AlpA, D261 для AlpB), Ser (S343 для AlpA и AlpB), порядок расположения аминокислотных остатков в которой характерен для сериновых протеаз клана PA. Окружение остатка серина активного центра (-Asp-Ser-Gly-Gly-) характерно для всего семейства химотрипсина класса сериновых протеаз. Что позволяет отнести белки AlpA и AlpB, как и -литическую протеазу L. enzymogenes, к этому семейству.

Рисунок 4. Выравнивание аминокислотных последовательностей эндопептидаз AlpA и AlpB Lysobacter. sp. XL1 и -литической протеазы L. enzymogenes. Крупными стрелками отмечены участки сигнального пептида, про-областии и зрелого фермента. Рамками выделены аминокислотные остатки каталитической триады His-Asp-Ser. Маленькими стрелками указаны остатки метионинов субстрат-связывающего кармана. Горизонтальной линией отмечены остатка поверхностной петли.

Хорошо изученная -ЛП L. enzymogenes специфична к пептидным субстратам с небольшими гидрофобными боковыми цепями перед расщепляемой связью. Ключевыми аминокислотными остатками, определяющими субстратную специфичность -ЛП, являются Met в положениях 343 и 363, которые выстилают полость субстрат-связывающего кармана, а также большинство остатков поверхностной петли, примыкающей к карману – это а.о. в положениях с Asn367 по Ser385 (Рис.4). Замена этих остатков на Ala и некоторые другие аминокислотные остатки значительно расширяла ее субстратную специфичность и приводила к тому, что -ЛП расщепляла пептиды с большими гидрофобными боковыми цепями пред расщепляемой связью: Met, Phe, Leu, Val, Tyr и Trp. Субстратная специфичность L1 и L5 практически не изучена. Из результатов выравнивания аминокислотных последовательностей этих ферментов и -ЛП видно, что аминокислотные остатки в последовательности AlpA и -ЛП в этих положениях идентичны, тогда как у AlpB значительно различаются. У AlpB Met в положениях 343 и 363 замещены Thr, а также имеются замены в 11-ти из 19-ти положений последовательности поверхностной петли. Ряд аминокислотных остатков в этой области у AlpB соответствует аминокислотным остаткам у исследованных мутантных форм -ЛП. На основании этого мы предполагаем, что фермент AlpB будет более активен на пептидных субстратах, содержащих остатки с большими гидрофобными боковыми цепями перед расщепляемой связью. Очевидно, что субстратная специфичность AlpA и -ЛП сходная, тогда как у AlpB значительно отличается. Различный спектр антимикробной активности AlpA и AlpB свидетельствует в пользу этого предположения.

Гены alpA и alpB кодируют функционально активные бактериолитические ферменты.

Для проверки того, что идентифицированные гены alpA и alpB кодируют функционально активные бактериолитические ферменты, они были индивидуально клонированы в плазмидном векторе pET-29a под контролем промотора T7lac и экспрессированы в E. coli. Клетки E.coli BL21(DE3) трансформировали соответствующими плазмидами и выращивали в присутствии индуктора (ИПТГ) на агаризованной среде, содержащей разрушенные клетки золотистого стафилококка (S. aureus 209-P). О наличии литической активности судили по появлению зон лизиса вокруг растущих колоний. Как видно из результатов анализа (Рис. 5) литическая активность наблюдалась только вокруг колоний клеток E. coli, экспрессирующих гены alpA и alpB, в то время как у контрольных клеток, трансформированных вектором pET-29a, она отсутствовала. Стоит отметить, что продукты генов alpA и alpB оказались токсичными для клеток E. coli. Это проявлялось в существенном замедлении скорости их роста на минимальной среде Дэвиса в присутствии индуктора. Очевидно, что пептидогликан бактерии S. aureus 209-P чувствителен к действию эндопептидаз AlpA и AlpB.

На основании проведенного анализа можно сделать вывод о том, что гены alpA и alpB действительно кодируют секретируемые бактериолитические эндопептидазы L1 и L5 Lysobacter sp. XL1.

ОРС alpA и alpB транскрибируются с собственных промоторов.

Рисунок 5. Экспрессия генов литических эндопептидаз AlpA и AlpB Lysobacter sp. XL1 в E. coli. Представлен тест на наличие бактериолитической активности по отношению к клеточным стенкам S. aureus. Клетки E. coli BL21(DE3) (3), трансформированные плазмидами с геном alpA (1, 2) или alpB (4-6), выращивали на агаризованной среде, содержащей клеточные стенки Staphylococcus aureus 209-P. Лизис клеточных стенок S. aureus проявляется в виде зон просветления вокруг колоний.

Lysobacter sp. XL1 продуцирует в культуральную жидкость в ~ 10-20 раз больше эндопептидазы AlpA, чем AlpB. Для того чтобы объяснить различие в уровне продукции этих эндопептидаз, был проведен анализ сигналов трансляции и транскрипции для этих ОРС.

При анализе нуклеотидных последовательностей выше ОРС alpA и alpB было установлено, что на расстоянии 8 н.о. для alpA и 7 н.о. для alpB перед инициирующим ATG-кодоном находится последовательность Шайна – Дальгарно. Для обеих ОРС она представляет собой полипуриновую последовательность AGGAG, которая комплементарна 3-концевой области последовательности генов 16S рРНК различных видов Lysobacter, представленных в базе данных GenBank (Рис. 6A). Наличие на каноническом расстоянии от инициирующего кодона последовательности Шайна-Дальгарно, а также отсутствие в этой области структур типа «стебель – петля» (данные не приведены) не позволяет предположить существенную разницу в эффективности инициации трансляции мРНК alpA и alpB.

Был проведен анализ нуклеотидных последовательностей, расположенных за стоп-кодоном ОРС alpА и alpB, который позволил идентифицировать потенциальные терминаторы транскрипции (Рис. 6Б).

Так, на расстоянии 26 н.о. от стоп-кодона ОРС alpА располагается 29-членная палиндромная последовательность, способная образовывать богатую парами G/C структуру типа «шпильки» из 12 п.н. (75%) и 5 неспаренными основаниями на вершине. Столь высокое содержание G/C пар обычно характерно для Rho-независимых терминаторов транскрипции. На расстоянии 27 н.о. от стоп-кодона ОРС alpB также находится 24-членная палиндромная последовательность, формирующая структуру типа «стебель-петля» из 20 спаренных (80% G/C) и 4 неспаренных оснований. Непосредственно за шпилькой следует олиго(U)-участок.

А

Б

Рисунок 6. Анализ трансляционных и транскрипционных сигналов для alpA (1) и alpB (2) Lysobacter sp XL1. А. Приведены фрагменты последовательностей 5-нетранслируемых областей мРНК генов alpA (2391 – 2407 н.о.) и alpB (4190 – 4205 н.о.), а также 3-концевого участка 16S рРНК Lysobacter sp. Shinshu-th3 (1530 – 1543 н.о., GenBank № AB121774). Предполагаемый сайт связывания с рибосомой в мРНК alpA и alpB выделен жирным шрифтом и подчеркнут. Инициаторный кодон выделен жирным шрифтом, курсивом и подчеркнут. Б. Приведены фрагменты последовательностей 3-нетранслируемых областей мРНК генов alpA (3628 – 3656 н.о.) и alpB (5430 – 5453 н.о.), способные формировать структуры типа «стебель - петля». Анализ последовательностей проводили при помощи программы UNAFold (http://mfold.rna.albany.edu/). Справа указана свободная энергия шпильки в ккал/моль. Положения сайтов связывания рибосом и структур типа «стебель - петля» приведены в соответствии с последовательностью № GU188567 (GenBank).

Наличие потенциальных терминаторов транскрипции, а также удаленность ОРС alpА и alpB друг от друга на 602 н.о. позволяют предположить, что каждый из генов имеет собственный промотор. Для проверки этого предположения была проведена гибридизация по Нозерну тотальной РНК Lysobacter sp. XL1 c ДНК-зондами, специфичными к ОРС alpА или alpB (Рис. 7). Как видно из результатов гибридизации, в клетках Lysobacter sp. XL1 обнаруживаются транскрипты размером около 1,5 т.н.о., содержащие ОРС alpA или alpB. Транскриптов большего размера, которые бы могли потенциально содержать обе ОРС, обнаружено не было. Вследствие чего можно сделать вывод, что мРНК alpA или alpB являются моноцистронными, гены alpA или alpB не организованны в оперон, а транскрибируются каждый с собственного промотора.

Кроме того, мРНК alpА обнаруживается в середине экспоненциальной фазы роста и ее уровень значительно увеличивается к концу экспоненциальной - началу стационарной фазы роста. При этом, количество мРНК alpB существенно ниже (примерно на порядок), чем alpА, и транскрипт детектируется лишь в конце экспоненциальной фазы роста. Вероятно, ген alpA находится под контролем более сильного промотора, чем alpB.

Рисунок 7. Анализ экспрессии генов alpA и alpB на уровне транскрипции. Тотальную РНК клеток Lysobacter sp. XL1, находящихся в середине (1) или конце логарифмической (2) фазы роста, гибридизовали с 32P-меченным ДНК-зондом к гену alpA или alpB.

С целью предсказания промоторов мы определили стартовую точку транкрипции для генов alpA и alpB. С использованием метода 5'-RACE (от англ. Rapid Amplification of cDNA Ends) были определены 5'-концы мРНК alpA и alpB. Результаты анализа и секвенирования клонов кДНК представлены в таблице 1). Для 8 из 11 клонов в случае alpA и 7 из 9 клонов alpB положение стартовых точек транскрипции совпадало. 3 клона кДНК alpA и 2 клона кДНК alpB соответствовали более короткому 5-UTR. Предположительно, это могло быть обусловлено преждевременной терминацией синтеза кДНК, или частичной деградацией мРНК с 5'-конца. Таким образом, как следует из представленных данных, длина 5'-нетранслируемой области мРНК alpA составляет 134 н.о., а мРНК alpB имеет длину 140 н.о. Для обеих мРНК 5'-концевым нуклеотидным остатком является G.

Таблица 1. Данные по определению стартовых точек транскрипции для генов alpA и alpB Lysobacter sp. XL1 методом 5-RACE.

ген

положение стартовой точки

транскрипции по № GU188567

длина 5-UTR (н.о.)

количество клонов

alpA

2271

134

8

2275

130

1

2276

129

1

2287

118

1

alpB

4063

140

7

4092

111

1

4111

92

1

Транскрипция у бактерий рода Lysobacter практически не исследовалась, и данные по консервативным элементам промоторов этих бактерий, а также о структуре РНК-полимеразы отсутствуют. На каноническом расстоянии – 35 и – 10 от стартовой точки транскрипции генов alpA и alpB мы идентифицировали предполагаемые промоторы и сравнили их соответствующими консенсусами для 70-промотора E. coli (рис. 8). В случае alpA обнаружено совпадение 3 из 6 н.о. с консенсусом E. coli в области – 35 и 2 – в области – 10. В случае alpB в области – 35 5 из 6 н.о. соответствуют консенсусу E. coli, в области – 10 так же совпадают только 2 н.о.

Рисунок 8. Анализ областей 35 и 10 генов alpA и alpB в сравнении с соответствующими консенсусами для 70-промотора E. сoli. Области консенсусов выделены жирным шрифтом и подчёркнуты. Стартовая точка транскрипции (+1) выделена жирным шрифтом. Звездочками отмечены совпадающие нуклеотидные остатки.

Результаты анализа, тем не менее, не позволяют делать выводы о силе промоторов этих генов. Несмотря на эволюционную консервативность 70, очевидно, что последовательности промоторов бактерий рода Lysobacter в областях -35 и -10 могут существенно отличаться от консенсусов 70-промотора E. coli. В частности, для Xanthomonas campestris, которая, как и Lysobacter sp. XL1, относится к семейству Xanthomonadaceae, анализ частоты встречаемости потенциально сильных промоторов генов, проведённый на основе 70-консенсусов E. coli, показал, что такие промоторы в геноме практически отсутствуют. Кроме того, активность промоторов генов alpA и alpB может регулироваться транскрипционными факторами, либо зависеть от альтернативных -факторов. В пользу этого свидетельствует существенное увеличение количества мРНК alpA и alpB в клетках на поздней экспоненциальной стадии роста. Вовлечение транскрипционных факторов в регуляцию экспрессии литических ферментов было показано для Lysobacter enzymogenes штамма C3. В этом штамме продукция литических ферментов регулируется продуктом гена clp, принадлежащего к CRP-семейству глобальных регуляторов.

Таким образом, различие в уровне продукции белков L1 и L5 Lysobacter sp. XL1 обусловлено различным содержанием в клетках мРНК генов alpA и alpB. Последнее может быть вызвано, как различной силой промоторов генов alpA и alpB, либо альтернативной регуляцией любого из них, либо различной стабильностью их мРНК.

Локализация генов эндопептидаз AlpA и AlpB Lysobacter sp. XL1.

Для штамма Lysobacter sp. XL1 была отмечена нестабильность в продукции ряда литических ферментов, в частности эндопептидаз L1 и L5. При условии локализации генов данных ферментов на плазмиде, феномен можно было бы объяснить утратой частью клеток популяции плазмидной ДНК. Был проведен анализ штамма Lysobacter sp. XL1 на наличие в нем плазмид с использованием электрофореза в пульсирующих полях, а также выделением плазмидной ДНК методом щелочного лизиса. В результате анализа было показано отсутствие в клетках Lysobacter sp. XL1 плазмид. На основании этого можно сделать вывод о том, что гены alpA и alpB имеют хромосомную локализацию.

Продукция рекомбинантных эндопептидаз AlpA и AlpB в клетках бактерий рода Pseudomonas. Продукция эндопептидаз L1 и L5 природным штаммом Lysobacter sp. XL1 невысока (около 0,5-1,0 и 0,05 мг/л культуральной жидкости, соответственно), а очистка белков затруднена в следствие того, что они обладают близкими физико-химическими свойствами. В связи с этим, актуальным является использование гетерологичных систем экспрессии для продукции данных ферментов. Ранее нами была проведена работа по созданию штаммов-продуцентов бактериолитических эндопептидаз AlpA и AlpB на основе E.coli (неопубликованные данные). Для этого был протестирован целый ряд штаммов E. coli, систем и условий экспрессии. Тем не менее, добиться удовлетворительного выхода ферментов, секретируемых из клетки естественным путем, нам не удалось. Культивирование в условиях экспрессии сопровождалось лизисом клеток-продуцентов и освобождением ферментов в культуральную среду. По-видимому, причиной этого являлось накопление активных ферментов AlpA и AlpB в периплазматическом пространстве клеток, что приводило к деградации пептидогликана. Перечисленное выше делает невозможным использование E. coli для наработки препаративных количеств рекомбинантных белков AlpA и AlpB. Поэтому на следующем этапе работы была поставлена задача поиска альтернативного продуцента бактериолитических эндопептидаз AlpA и AlpB.

В качестве альтернативного продуцента литических ферментов Lysobacter были выбраны бактерии рода Pseudomonas. Оба этих рода достаточно близки. Кроме того, из литературы известно, что бактерии рода Pseudomonas, так же как и Lysobacter, секретируют в окружающую среду широкий спектр белков, в том числе и протеаз, в частности эластазу, которая синтезируется в виде препрофермента. Кроме того, в последнее время псевдомонады успешно используются в качестве альтернативы E. coli для наработки рекомбинантных белков. Поэтому следующий этап работы заключался в разработке системы экспрессии генов эндопептидаз AlpA и AlpB Lysobacter sp. XL1 на основе бактерий рода Pseudomonas.

Конструирование системы экспрессии генов alpA и alpB на основе бактерий рода Pseudomonas. В данной работе в качестве потенциальных штаммов-продуцентов литических эндопептидаз AlpA и AlpB первоначально рассматривались 8 различных штаммов псевдомонад: 7 штаммов P. fluorescens - M4-80, 2-7q, Pf-5, Q2-87, Q8r1-q6, 38a, 2-79, и 1 штамм P. putida KT2440. Данные бактерии были проверены на соответствие ряду требований, существенных для использования их в качестве продуцентов. В первую очередь будущий продуцент не должен обладать собственной бактериолитической активностью, так как секреция им во внеклеточную среду собственных литических ферментов усложняет анализ экспрессии исследуемых рекомбинантных белков и затрудняет их выделение. Поэтому все штаммы были проанализированы на наличие эндогенной бактериолитической активности.

Для этого их выращивали на индикаторной агаризованной среде CY, содержащей разрушенные клетки золотистого стафилококка (S. aureus). В качестве положительного контроля использовали штаммы Lysobacter sp. XL1 и XL2. О наличии литической активности судили по появлению зон лизиса вокруг растущих бактерий (Рис. 9).

Тест на индикаторной среде не выявил эндогенной бактериолитической активности ни у одного из исследуемых штаммов псевдомонад. При этом хорошо проявлялась бактериолитическая активность у контрольных штаммов Lysobacter sp. XL1 и XL2.

Рисунок 9. Анализ эндогенной бактериолитической активности у штаммов псевдомонад. Представлен тест на наличие литической активности по отношению к клеточным стенкам S. aureus для штаммов P. fluorescens M4-80 (Ps1), 2-7q (Ps2), Pf-5 (Ps3), Q2-87 (Ps4), Q8r196 (Ps5), 38a (Ps6), 2-79 (Ps7), P. putida KT2440 (Ps8), а также Lysobacter sp. XL1 (XLI) и XL2 (XLII).

Поскольку конструирование системы экспрессии требует проведения генно-инженерных манипуляций с использованием плазмидных векторов, был проведен анализ устойчивости всех штаммов псевдомонад к интересующим нас антибиотикам (Таблица 2). По совокупности вышеописанных свойств в качестве потенциальных штаммов-продуцентов были выбраны штаммы P. fluorescens М4-80 и Q2-87.

Таблица 2. Анализ устойчивости штаммов Pseudomonas к антибиотикам.

Штамм/ антибиотик

Рифампицин

100 мкг/мл

Тетрациклин

мкг/мл

Ампициллин

1000 мкг/мл

Канамицин

мкг/мл

1

P. fluorescens M4-80

+

-

(10)

+

-

(50)

2

P. fluorescens 2-7q

+

-

(10)

+

-

(150)

3

P. fluorescens Pf-5

+

-

(75)

+

-

(50)

4

P. fluorescens Q2-87

+

-

(10)

+

-

(50)

5

P. fluorescens Q8r1-96

+

-

(10)

+

-

(50)

6

P. fluorescens 38a

+

+

(100)

+

-

(50)

7

P. fluorescens 2-79

+

-

(50)

+

-

(150)

8

P. putida KT2440

+

-

(50)

+

+

(150)

“+” и “-“ – устойчивость или чувствительность к антибиотику, соответственно.

В скобках указана пороговая концентрация антибиотика.

Далее, для решения поставленной задачи мы решили сконструировать систему экспрессии в псевдомонадах на основе «промотор/РНК-полимераза фага Т7». Конструирование проводили при помощи полученных в ходе выполнения данной работы плазмид (Рис. 10). Принцип данной системы экспрессии близок к аналогичной системе экспрессии, разработанной для E. coli, с некоторыми различиями (Рис.11).

А

Б

Рисунок 10. Карты плазмид, использованных для конструирования системы экспрессии в псевдомонадах. А – плазмида для интеграции в хромосому псевдомонад генов alpA (или alpB) и lacI, Б - плазмида с геном РНК-полимеразы фага Т7.

А именно, гены alpA или alpB, находящиеся под контролем гибридного промотора Т7lac, а также ген репроссора lacI, в составе плазмидного вектора интегрировали в бактериальную хромосому при помощи системы сайт-специфической рекомбинации псевдомонадного фага ϕCTX (Рис.10, А). Затем векторную последовательность удаляли из хромосомы при помощи дрожжевой FLP-рекомбиназы по FRT1 и FRT2 сайтам. Ген РНК-полимеразы фага Т7 был клонирован в составе челночного вектора под контроль lac-промотора. В результате была получена плазмида pUT7-pol (Рис. 10, Б), несущая ген устойчивости к тетрациклину и способная реплицироваться в клетках E. сoli и Pseudomonas.

Рисунок 11. Схема экспрессии генов аlpA и alpB

в псевдомонадах.

Использование репрессора LacI делает систему индуцибельной и позволяет запускать синтез AlpA и AlpB опосредованно, после индукции lac-промотора при помощи индуктора ИПТГ и накопления в клетках РНК-полимеразы фага Т7 (Рис. 11).

Таким образом, были получены рекомбинантные штаммы P. fluorescens M4-80/А, M480/В, Q2-87/А и Q2-87/В, несущие в хромосоме ген эндопептидазы AlpA или AlpB, соответственно.

Для проверки бактериолитической активности полученных рекомбинантных штаммов Р. fluorescens их трансформировали плазмидой pUT7-pol и выращивали в присутствии индуктора на агаризованной среде CY, содержащей разрушенные клетки S. aureus 209-P. О наличии бактериолитической активности судили по появлению зон лизиса вокруг растущих колоний псевдомонад. Как видно из результатов анализа (рис. 12) Литическая активность наблюдалась только вокруг колоний клеток псевдомонад экспрессирующих гены alpA и alpB, в то время как в контрольных клетках (штаммы P. fluorescens M4-80 и Q2-87, трансформированные плазмидой pUT7-pol) она отсутствовала.

Рисунок 12. Экспрессия генов литических эндопептидаз AlpA и AlpB Lysobacter sp. XL1 в штаммах P. fluorescens. Представлен тест на наличие бактериолитической активности при росте на агаризованной среде CY, содержащей клеточные стенки S. aureus, в присутствии ИПТГ. Клетки Q2-87 и M4-80 -контроль; Q2-87/А или В и M4-80/А или В – содержащие, соответственно, гены alpA или alpB.

Экспрессия генов alpA и alpB при выращивании рекомбинантных штаммов на жидких средах. Для природного штамма Lysobacter sp. XL1 была установлена зависимость продукции литических ферментов от состава среды. Для проверки зависимости экспрессии генов alpA и alpB от состава среды культивирования рекомбинантные штаммы Р. fluorescens выращивали в колбах на средах с различным содержанием дрожжевого экстракта, пептона, триптона и минеральных солей:

1 – 0,3% триптон, 0,1% дрожжевой экстракт, 0,1% CaCl2, рН 7,4;

2 – 0,5% дрожжевой экстракт, 1% NaCl, рН 7,4;

3 – 0,2% пептон, 0,2% дрожжевой экстракт, 0,5% глюкозу,

  0,42% Na2HPO412H2O, 0,1% KH2PO4, 0,06% KCl, 0,5% MgSO47 H2O,

  0,01% FeSO47 H2O, pH 7,2;

4 – LB: 1% триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 0,5% NaCl, рН 7,2;

Штаммы Р. fluorescens M4-80/A и M4-80/B плохо росли на жидких средах, возможно ввиду токсичности продуктов генов alpA и alpB, или нестабильности плазмид в этих клетках. Поэтому для дальнейшей работы были использованы штаммы Р. fluorescens Q2-87/A и Q2-87/B (таблицы 3 и 4).

Таблица 3. Рост и бактериолитическая активность штамма Р. fluorescens Q2-87/A.

Среда

Оптическая плотность, А540

Литическая активность, ЛЕ/мл

24 часа

48 часов

24 часа

48 часов

1

1,9

1,4

2,4

10,9

2

2,4

0,8

10,0

26,1

3

4,4

4,2

12,0

35,0

4

3,4

2,5

25,2

46,4

Таблица 4. Рост и бактериолитическая активность штамма Р. fluorescens Q2-87/B.

Среда

Оптическая плотность, А540

Литическая активность, ЛЕ/мл

24 часа

48 часов

24 часа

48 часов

1

2,1

1,1

28,8

37,2

2

1,6

0,5

39,6

22,8

3

2,9

3,0

15,0

26,8

4

3,9

3,1

23,8

30,8

Представлены данные через 24 и 48 часов индукции.

Измерение бактериолитической активности в культуральной жидкости проводили турбидиметрическим методом на основании уменьшения оптической плотности суспензии автоклавированных клеток S. aureus при добавлении соответствующего препарата. За 1 единицу активности принимали количество фермента, которое приводило к уменьшению оптической плотности суспензии клеток S. aureus на 0,01 за 1 минуту.

Из результатов анализа следует, что рекомбинантные штаммы Р. fluorescens Q2-87/A и Q2-87/B на всех средах продуцируют активные бактериолитические ферменты, что выявляется по наличию бактериолитической активности в культуральной жидкости, которая детектируется уже к 24 часам индукции и достигает максимума к 48 часам индукции. Дальнейшее увеличение времени индукции не приводило к увеличению активности. Максимальная литическая активность для AlpA наблюдалась при экспрессии на средах 3 и 4, а для AlpВ – на средах 1 и 4.

Поскольку AlpA и AlpB являются секретируемыми белками, то для анализа процесса созревания и секреции ферментов было исследовано наличие в культуральной жидкости и клетках зрелых пептидаз и их предшественников при помощью иммуноблоттинга с поликлональными антителами к пробелкам AlpA и AlpB. Как видно из рисунка 13, в культуральной жидкости рекомбинантных штаммов Р. fluorescens Q2-87/A и Q2-87/B содержатся зрелые белки AlpA и AlpB, соответственно.

Рисунок 13. Секреции эндопептидаз AlpA и AlpB клетками Р. fluorescens Q2-87 в культуральную жидкость в зависимости от состава среды.  Иммуноблоттинг белков культуральной жидкости рекомбинантных штаммов

Р. fluorescens Q2-87/A и Q2-87/B, выращенных на разных средах.

При этом, предшественники AlpA и AlpB в культуральной жидкости не обнаруживаются, а в клетках Р. fluorescens Q2-87/A и Q2-87/B не было детектировано ни зрелых белков, ни их предшественников (данные не приведены). Содержание ферментов в культуральной жидкости коррелирует с уровнем литической активности (см. таблицы 3 и 4). Количество зрелого AlpA увеличивается к 48 часам индукции при росте на всех средах. Увеличение количества зрелого AlpB в культуральной жидкости наблюдалось при росте на средах 1, 3 и 4. Тогда как на среде 2 к этому времени было выявлено некоторое снижение количества AlpB.

Экспрессия генов alpA и alpB при выращивании на некоторых средах сопровождалась лизисом клеток, что проявлялось в уменьшении оптической плотности культур. Наибольший лизис клеток наблюдался при росте на среде 2. При выращивании на среде 3 лизиса клеток в условиях индукции не происходило. Таким образом, оптимальной для продукции бактериолитических эндопептидаз является среда 3, которая, в частности, применяется для выращивания природного штамма Lysobacter sp. XL1 при получении лизоамидазы.

Уровень продукции эндопептидазы AlpA рекомбинантным штаммом сопоставим с природным продуцентом – выход ферментов с одного литра культуральной жидкости составляет примерно 1 мг. В то время как эффективность продукции эндопептидазы AlpB в 50 раз выше по сравнению с природным штаммом и составляет 2-3 мг с литра культуральной жидкости. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что в полученных рекомбинантных штаммах Р. fluorescens происходит эффективная продукция, правильное сворачивание, созревание и секреция рекомбинантных литических эндопептидаз AlpA и AlpВ Lysobacter sp. XL1.

ВЫВОДЫ

  1. Определена нуклеотидная последовательность хромосомного фрагмента генома Lysobacter sp. XL1 размером 9017 п.н., содержащего гены alpA и alpB литических эндопептидаз L1 и L5 соответственно.
  1. Эндопептидазы L1 и L5 являются близкими по размеру гомологичными белками, имеющими сходную структурную организацию. На основании результатов филогенетического анализа эндопептидазы L1 и L5 отнесены к клану PA, семейству S1 класса сериновых пептидаз и подсемейству S1Е – химотрипсина.
  1. На основании сравнительного анализа аминокислотных последовательностей предсказано, что эндопептидазы AlpA и AlpB имеют различную субстратную специфичность. AlpA гидролизует пептидные связи после аминокислотных остатков с короткими, а AlpB - с длинными гидрофобными боковыми цепями.
  1. Показано, что мРНК генов alpA и alpB являются моноцистронными и обнаруживаются на поздней экспоненциальной стадии роста. Более высокое содержание мРНК alpA по сравнению с alpB коррелирует с более высоким содержанием эндопептидазы L1 в культуральной жидкости Lysobacter sp. XL1.
  1. Сконструирована система экспрессии эндопептидаз L1 и L5 на основе бактерий рода Pseudomonas. Рекомбинантные штаммы-продуценты эффективно секретируют активные зрелые эндопептидазы AlpA и AlpB в культуральную жидкость.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Лаптева Ю.С., Золова О.Э., Соколов А.С., Степная О.А., Грановский И.Э. Штаммы Lysobacter sp. XL1 и XL2 не содержат плазмид. Учен. зап. Казан. ун- та. Сер. Естеств. науки. – 2011. – Т. 53, кн. 2. – С. 63-72.
  2. Yu. S. Lapteva, O.E. Zolova, M.G. Shlyapnikov, I.M. Tsfasman, T. A. Muranova O.A. Stepnaya, I. S. Kulaev,  I.E. Granovsky. Cloning and expression analysis of genes of lytic endopeptidases L1 and L5 from Lysobacter sp. XL1. Appl. Environ. Microbiol. Oct. 2012., vol. 78., Nо. 19., р. 7082-7089.
  3. Грановский И. Э., Калинин А. Е., Лаптева Ю. С., Латыпов О. Р., Васильева Н. В., Цфасман И. М., Степная О. А., Кулаев И. С., Муранова Т. А., Красовская Л.А. Литическая протеаза AlpA бактерии Lysobacter sp. XL1, фрагмент ДНК, кодирующий литическую протеазу AlpA бактерии Lysobacter sp. XL1, и способ получения литической протеазы AlpA бактерии Lysobacter sp. XL1. Патент 2407782 Российская Федерация. № 2009105828/10, заявл. 20.02.2009, опубл. 27.12.2010, Бюл. № 36. – 16 с.
  4. Грановский И. Э., Калинин А. Е., Лаптева Ю. С., Латыпов О. Р., Васильева Н. В., Цфасман И. М., Степная О. А., Кулаев И. С., Муранова Т. А., Красовская Л.А. Литическая протеаза AlpB бактерии Lysobacter sp. XL1, фрагмент ДНК, кодирующий литическую протеазу AlpB бактерии Lysobacter sp. XL1, и способ получения литической протеазы AlpB бактерии Lysobacter sp. XL1. Патент 2408725 Российская Федерация. № 2009105830/10, заявл. 20.02.2009, опубл. 10.01.2011, Бюл. № 1. – 15 с.
  5. Кулаев И.С., Лаптева Ю.С., Калинин А.Е., Хохлова О.В., Шляпников М.Г., Цфасман И.М., Степная О.А., Грановский И.Э. Антимикробный препарат лизоамидаза: клонирование и экспрессия в E.coli генов бактериолитических эндопептидаз Л1 (alpA) и Л5 (alpB). Материалы конференции «Фундаментальные науки – медицине». Москва, 14-16 декабря, 2005, С. 171-172.
  6. Лаптева Ю.С., Калинин А.Е., Хохлова О.В., Цфасман И.М., Степная О.А., Шляпников М.Г., Грановский И.Э. Литические эндопептидазы Л1 и Л5 Lysobacter sp. XL1: обнаружение генов и экспрессия в E.coli. Материалы 10-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология – наука 21 века», Пущино,17-21 апреля, 2006, IX.68, С. 380.
  7. Julia Lapteva, Andrey Kalinin, Olga Khokhlova, Irina Tsfasman, Olga Stepnaya, Igor Granovskiy. Cloning and Expression of Bacteriolytic Endopeptidase Genes from Lysobacter sp. XL1. The 2007 “Molecular Genetics of Bacteria and Phages Meeting”. University of Wisconsin-Madison, Madison, Wisconsin, 7 –12 August, 2007, P. 194.
  8. Лаптева Ю.С., Грановский И.Э. Литические эндопептидазы Л1 и Л5 Lysobacter sp. XL1: молекулярный анализ генов и сравнительная характеристика ферментов. Материалы 11-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология – наука 21 века», Пущино, 29 октября - 2 ноября, 2007, С. 96.
  9. Лаптева Ю.С., Анисимова Е.В. Экспрессия генов литических эндопептидаз Л1 и Л5 Lysobacter sp. XL1 в бактериях рода Pseudomonas. Материалы 11-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология – наука 21 века», Пущино, 29 октября - 2 ноября, 2007, С. 208.
  10. Лаптева Ю.С., Михайлова И.М., Красовская Л.А., Цфасман И.М., Степная О.А, Грановский И.Э. Создание гетерологичной системы экспрессии генов бактериолитических эндопептидаз Л1 и Л5 Lysobacter species XL1 на основе бактерий рода Pseudomonas. Материалы 12-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология – наука 21 века», Пущино, 10 -14 ноября, 2008, С. 212.
  11. Лаптева Ю.С., Михайлова И.М., Красовская Л.А., Цфасман И.М., Степная О.А, Грановский И.Э. Создание гетерологичной системы экспрессии генов бактериолитических эндопептидаз Л1 и Л5 Lysobacter species XL1 на основе бактерий рода Pseudomonas. Материалы IV Российского симпозиума «Белки и пептиды», Казань, 23-27 июня, 2009, С. 374.
  12. Кулаев И.С., Степная О.А., Цфасман И.М., Красовская Л.А., Васильева Н.В., Грановский И.Э., Латыпов О.Р., Лаптева Ю.С., Шишкова Н.А., Маринин Л.И. Получение рекомбинантных литических эндопептидаз антимикробного препарата лизоамидаза и проверка их лечебной эффективности на моделях сибиреязвенной инфекции. Материалы 2-го Международного Конгресса-Партнеринга и Выставки по биотехнологии и биоэнергетике «ЕвразияБио-2010», Москва, 13-15 апреля, 2010, С. 115.
  13. Красовская Л.А., Васильева Н.В., Лаптева Ю.С., Грановский И.Э., Руденко Н.В., Цфасман И.М., Степная О.А., Кулаев И.С. Получение рекомбинантных литических эндопептидаз AlpA и AlpB Lysobacter sp. XL1 в гетерологичной системе Pseudomonas. Материалы всероссийского симпозиума с международным участием «Биологически активные вещества микроорганизмов: прошлое, настоящее, будущее», Москва, 2011, Сборник тезисов, с.70.





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.