WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

ВОЛКОВА Валерия Владимировна

ИЗУЧЕНИЕ АЛЕЛЛОФОНДА ПОРОД Gallus Gallus С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МИКРОСАТЕЛЛИТОВ

03.02.07 Генетика

06.02.07 Разведение, селекция, генетика

сельскохозяйственных животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Дубровицы - 2012

Работа выполнена в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики животных Государственного научного учреждения Всероссийского научно-исследовательского института животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук.

Научные руководители:  доктор биологических наук, профессор

Кленовицкий Павел Михайлович

кандидат биологических наук

Гладырь Елена Александровна

Официальные оппоненты:  доктор биологических наук, профессор,

Букаров Нурмагомед Гаджикулиевич

ОАО «Московское» по племенной работе, начальник лаборатории иммуногенетической экспертизы

кандидат биологических наук,

Завада Александр Николаевич

ФГНУ ВНИИплем, заведующий лабораторией генетической экспертизы и мониторинга племенной продукции сельскохозяйственных животных

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К. И. Скрябина

Защита состоится «18»  декабря 2012 г. в  10-00 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 006.013.03 при Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук.

Адрес института: 142132, Московская область, Подольский район, п. Дубровицы, ГНУ ВИЖ, тел./факс (4967) 65-11-01. www.vij.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии.

Автореферат разослан «____»  ноября 2012 г.

Ученый секретарь Совета Д 006.013.03                                         И.В. Гусев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Важную роль в продовольственной безопасности страны играет птицеводство, обеспечивающее 40% животного белка в рационе россиян [Фисинин В.И., 2008].

По данным  ФАО [2010], от 70 до 90 % пород разных видов домашней птицы, внесенных во Всемирный перечень разнообразия домашних животных (WWL–DAD) близки к вымиранию или статус их неизвестен. Из 1273 пород кур лишь 321 находится вне состояния риска, 40 отнесены к исчезнувшим, судьба 493 не известна, остальные находятся на разных стадиях риска. Наиболее  интенсивно этот процесс идет в странах Европы и Северной Америки [Pym, 2011].

Местные породы кур, созданные народной селекцией, являются ценнейшими генетическими ресурсами [Сахацкий, и др.,1990; Эрнст, и др., 1992; Горбачева, 1993; Столповский и др., 1997, 2006]. Изучение местных пород, объективная оценка генофонда малочисленных пород  и замкнутых популяций кур, являющихся источником племенного материала российской перспективной селекции и резервом для создания новых форм и новых кроссов птицы, является  актуальной задачей для современной генетики и селекции [Моисеева и др., 1999, 2006]. При создании отечественных конкурентоспособных кроссов используются генофондные коллекции редких и исчезающих пород птицы, а также новый генетический материал ведущих фирм. В России собраны и сохраняются самые крупные мировые генофондные стада кур, насчитывающие 76 пород [Фисинин, 2010]. Всестороннее изучение генофонда пород кур, их генетической изменчивости и дифференциации необходимо для решения задач создания высокопродуктивной птицы.

В связи с этим, возникает необходимость в разработке и использовании для паспортизации животных и птицы высокопроизводительных систем ДНК анализа. В решении данной проблемы с высокой степенью надежности  могут быть использованы микросателлитные маркеры, позволяющие получать молекулярно-генетическую информацию для детальной характеристики видов и пород животных [Зиновьева и др., 2002, 2011, 2012; Букаров, 2010; Марзанов, и др., 2004, 2011], в том числе и птицы [Фисинин, и др., 2011, Новгородова и др., 2011, 2012] в рамках генетической паспортизации пород и линий кур.

Цель работы и задачи исследования. Целью работы явилось изучение аллелофонда пород кур с использованием разработанной универсальной системы анализа микросателлитов.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Дать характеристику системы сохранения и рационального использования пород кур генофондного стада;

2. Разработать мультиплексную тест-систему анализа восьми микросателлитов кур;

3. Оценить функциональные характеристики и потребительские свойства разработанной тест-системы;

4. Дать характеристику генетической структуры изучаемых пород кур по восьми микросателлитным локусам;

5.  Выполнить оценку генетической консолидированности и определить степень генетического сходства российских пород кур по микросателлитным локусам при создании паспортов кур 12-ти пород.

Научная новизна. Впервые в России разработана мультиплексная тест-система микросателлитного анализа.  С использованием созданной тест-системы определена степень генетической близости и дана характеристика аллелофонда 12 пород кур, в том числе 11 пород генофондного стада, в сравнении с породой леггорн.

Научная и практическая значимость. Предложена автоматическая система мультиплексного микросателлитного анализа кур для установления генетических различий между породами и кроссами кур. Дана характеристика аллелофонда 12 пород кур генофондного стада различного направления продуктивности.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены и обсуждены: на конференциях -  «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных: роль нанотехнологий в реализации приоритетных задач биотехнологии», БиоТехЖ-2008. - Дубровицы. 23-24 октября 2008; «Научные основы повышения продуктивности сельскохозяйственных животных», Краснодар. – 2009; на 8-й международной научной конференции «Современные достижения и проблемы генетики и биотехнологии сельскохозяйственных животных», Био-ТехЖ-2009. – Дубровицы. – 2009; «Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в АПК России», Сергиев Посад. 28-30 октября 2009; на международной научной молодежной конференции-школе «Биотехнологии в сельском хозяйстве: современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных, БиоТехЖ-2012» -Дубровицы - май, 2012; на научных конференциях Центра биотехнологии и молекулярной диагностики животных ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии в период с 2009-2012 гг.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработана тест-система анализа восьми микросателлитов Gallus Gallus, которая характеризуется высокой производительностью (8 аллелей на локус), информативностью (не менее 4 аллелей в локусе), точностью подтверждения происхождения по обоим родителям (P1X) - 99,60%, точность подтверждения происхождения по одному родителю (P2X) – 96,08%, вероятность исключения родителей (Р3Х) – 99,99%.

2. Созданы ДНК- паспорта 12 пород кур, в т.ч. 11 пород кур генофондного стада по восьми микросателлитным локусам.

3. Подтверждена гипотеза о наличии породоспецифических аллелей, свойственных замкнутым популяциям кур.

4. Установлены филогенетические связи между изучаемыми породами  кур, обусловленные  общностью их исторического происхождения.

Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 6 статей, из них 2 в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ («Проблемы биологии продуктивных животных»,2011, №1; «Достижения науки и техники АПК», 2011, № 10).

Структура и объем работы. Диссертация написана на 118 страницах, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы. Диссертационная работа содержит 25 таблиц и 23 рисунка. Список литературы включает 153 источников, в том числе 114 источника на иностранном языке.

2. материалы и Методы исследований

Исследования проводили в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики животных ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии в соответствии с планами научно-исследовательских работ Центра биотехнологии и молекулярной диагностики животных в  период 2007-2012 гг. на 11 породах генофондного стада ГНУ ВНИТИП и белом леггорне ФГУП ППЗ «Птичное».

Схема исследований представлена на рисунке 1.

В молекулярно-генетических исследованиях были использованы образцы ДНК 350 кур 12 пород, в т.ч. 330 голов 11 пород кур генофондного стада ГНУ ВНИТИП Россельхозакадемии - Австралорп черно-пестрый (АВС_ЧП, n=30), Адлерская серебристая (АДЛ_С, n=30), Загорская лососевая (ЗАГ_Л, n=30), Голошейная (ГЛШ, n=30), Котляревская (КОТЛ, n=30), Кучинская юбилейная (КУЧ_Ю, n=30), Ленинградская белая (ЛЕН_Б, n=30), Московская белая (МОС_Б, n=30), Первомайская (ПЕР, n=30), Русская белая (РУС_Б, n=30), Юрловская голосистая (ЮРЛ_Г, n=30) и Леггорн белый* (ЛЕГ_Б, n=20)  ФГУП ППЗ «Птичное».

Материалом для выделения ДНК служили пробы крови, ткани (гребешков) и пульпы пера кур. Выделение ДНК проводили с помощью колонок фирмы Nexttec (Германия) и с использованием набора реагентов для выделения ДНК DIAtomTM DNA Prep100. Анализ ДНК и постановку ПЦР проводили согласно «Методическим рекомендациям по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве» [Зиновьева  и др., 1998].

Мультиплексный анализ 8 локусов: MCW0111, MCW0067, LEI0094, MCW0123, MCW0081, MCW0069, MCW0104 и MCW0183 и электрофоретическое разделение фрагментов ДНК методом капиллярного электрофореза проводили на приборе ABI 3130xl. Обработку данных капиллярного электрофореза проводили посредством перевода длин детектируемых фрагментов в числовые выражения на основании сравнения их подвижности со стандартом ДНК. Данные об аллелях каждого животного суммировали в электронной таблице Microsoft Excel. Полученная матрица генотипов служила основой для статистической обработки результатов.

Рис. 1. Схема исследований

Оценку функциональных характеристик тест-системы выполняли по пяти показателям: универсальность, воспроизводимость, информативность, доля внутри- и межпопуляционной изменчивости; мультиплексность. Оценку потребительских свойств определяли по следующим критериям  возможности: использования различного исходного материала для исследований (кожа, кровь, пульпа пера); применения для генетической паспортизации кур; определения происхождения (родителей) и/ или исключение  родителей (точность подтверждения происхождения по обоим родителям,  точность исключения родителей).

При проведении сравнительных популяционно-генетических исследований по характеристике аллелофонда изучаемых пород кур для создания ДНК паспортов рассчитывали следующие показатели: минимальное, максимальное и среднее число аллелей (Na), частоты встречаемости аллелей, число информативных аллелей (Ne), число эффективных аллелей, число и частоты встречаемости приватных аллелей; анализ распределения популяций по Paetkau D. с соавт. [2004]; наблюдаемую (Ho) и ожидаемую (He) степени гетерозиготности; индексы фиксации Fis, Fit, Fst; индекс фиксации Fst (AMOVA), генетические дистанции (Nei) [1983]. Статистическую обработку данных проводили по стандартным методикам Меркурьева Е.К, [1983], Вейр Б., [1995] с использованием программного обеспечения GenAlEx (ver. 6.4.1), MSA_WIN 4.05 и PAST.

3. Результаты исследований

3.1. Характеристика системы сохранения и рационального использования пород кур генофондного стада

В ГНУ ВНИТИП разработан комплекс методов сохранения пород кур в малочисленных группах. Генофондное стадо в ЭПХ ВНИТИП сегодня насчитывает 76 пород кур. Для сохранения и воспроизводства малочисленных пород сельскохозяйственной птицы придерживаются следующих требований: поголовье кур должно быть не менее 100 голов, петухов – 25 голов на породу.

Табл. 1. Характеристика направления продуктивности и численности исследованных генофондных пород кур

№ п/п

Порода

Тип

продуктивности

породы

Численность родительского стада России*, гол.

Предполагаемое использование

банк

ДНК, гол.

создание ДНК–паспортов

1

АВС_ЧП

Мясо–яичная

до 400

30

+

2

АДЛ_С

Мясо–яичная

до 50 000

30

+

3

ЗАГ_Л

Мясо–яичная

до 400

30

+

4

ГЛШ

Мясо–яичная

до 400

30

+

5

КОТЛ

Мясо–яичная

до 400

30

+

6

КУЧ_Ю

Мясо–яичная

до 70 000

30

+

7

ЛЕН_Б

Мясо–яичная

до 400

30

+

8

МОС_Б

Мясо–яичная

до 400

30

+

9

ПЕР

Мясо–яичная

до 400

30

+

10

РУС_Б

Яичная

до 400

30

+

11

ЮРЛ_Г

Мясо–яичная

до 400

30

+

12

ЛЕГ_Б**

Яичная

более 200000

20

+

*- данные за 2011 г., ГНУ ВНИТИП Россельхозакадемии

** - промышленная порода

Это позволяет  удерживать уровень инбридинга в пределах 1,0 % на поколение и вести в сохраняемой популяции отбор по количественным признакам. Анализ приведенных в табл.1 данных показывает, что все исследованные нами генофондные породы кур соответствуют данному требованию. Отбор и комплектование стада сохраняемой популяции проводят в период наивысшей яйценоскости путем случайной выборки из числа типичных представителей породы. Решение этой задачи может быть достигнуто как на основе существующих стандартов пород, так и с использованием данных по их молекулярно-генетической паспортизации. Использование этих приемов в значительной мере облегчает организацию селекционно-племенной работы по сохранению и воспроизводству имеющегося поголовья с целью консервации генетического статуса стада и избежание появления особей, отличающихся от типичных представителей породы. При этом продуктивность кур коллекционных пород может быть  на 20% ниже, чем у промышленных форм того же  направления продуктивности.

При наличии специфических генов, характерных для отдельной породы, уровень продуктивности не учитывается. Из одиннадцати исследованных  пород  этому условию соответствуют пять. Три из них: АДЛ_С,ЗАГ_Л и КУЧ_Ю несут мутации генов окраса,  позволяющие осуществлять раннее определение пола у цыплят.  АВС_ЧП несет  рецессивный аллель гена st, осветляющий окрас покровов и улучшающий товарный вид тушек птицы. ГЛШ порода несет доминантную мутацию гена BMP12, способствующую обеспечению нормальной терморегуляции у птицы при более высокой температуре окружающей среды.

Птица в генофондных хозяйствах воспроизводится только методом чистопородного разведения, различные варианты скрещивания не допускается. Отбор и размножение типичных особей коллекционной породы надежный и доступный метод сохранения генетических ресурсов, что важно для сохранения селекционируемых в течение долгого времени пород с их интегрированной совокупностью аллелей. Для объективной характеристики генофонда 11 пород кур был отобран генетический материал и создан Банк ДНК 23% особей от всего поголовья птицы родительского стада ГНУ ВНИТИП каждой породы.

3.2. Разработка мультиплексной тест-системы анализа восьми микросателлитов кур

Исходя из рекомендаций FAO/ISAG [2004], локализации микросателлитных маркеров на различных хромосомах, образующихся длин амплификационных фрагментов микросателлитных локусов, теоретически общей температуры амплификации, а так же принимая во внимание возможность использования двух (FAM и R6G) флуоресцентных красителей были выбраны 8 локусов: MCW0111, MCW0067, LEI0094, MCW0123, MCW0081, MCW0069, MCW0104 и MCW0183 (рис. 2) сформированные в одну мультиплексную панель.

Примечание: длины амплифицируемых фрагментов указаны в парах оснований (п.о.); фрагменты, меченные FAM показаны надосью Х, R6G – под осью Х. Минимальная и максимальная длина аллелей показана в парах оснований (п.о.) внизу соответствующих прямоугольников

Рис. 2. Схема локусов микросателлитов тест-системы Gallus Gallus на основе мультиплексного анализа 8-и МС

Результативность мультиплексной ПЦР предварительно оценивалась методом гель-электрофореза в 3% агарозном геле (рис.3).

Примечание: Дорожки 1,10 - MCW0123; 2, 11 - MCW0111; 3, 12 - MCW0081; 4, 13 - MCW0069; 5, 14 - MCW0067; 6, 15 - MCW0104; 7, 16 - LEI0094; 8, 17 - MCW0183. Дорожки 9,18 первого ряда – смесь 8-ми микросателлитных маркеров. Второй ряд, дорожка 18 – отрицательный контроль (реакционная смесь без добавления ДНК)

Рис. 3. Результаты анализа продуктов мультиплексной ПЦР восьми локусов МС Gallus Gallus в 3% агарозном геле

Окончательную оценку оптимального состава реакционной смеси и температурно-временного режима ПЦР осуществляли на основании результатов анализа продуктов амплификации методом капиллярного электрофореза с использованием генетического анализатора ABI 3130xl Genetic Analyzer (рис.4).

Примечание: названия микросателлитных локусов предствалены над фореграммами. Длины образующихся фрагментов представлены под осью Х

Рис. 4. Фореграмма анализа микросателлитов кур с использованием разработанной тест-системы

3.3. Оценка функциональных характеристик и потребительских свойств разработанной тест-системы

Генотипирование ДНК 3-х пород кур по 30 гол. в каждой: ЗАГ_Л, РУС_Б, ЮРЛ_Г, представляющих два направления продуктивности позволило суммарно исследовать 720 (100,0%) локусов микросателлитов. Точность идентификации кур (PI)  с использованием тест-системы из 8 МС составила 6,62 * 10-8 , точность подтверждения происхождения по обоим родителям (P1X) - 99,60%, точность подтверждения происхождения по одному родителю (P2X) – 96,08%, вероятность исключения родителей (Р3Х) – 99,99%.  Результаты оценки информативности разработанной тест-системы показали следующее: среднее число аллелей на локус (Na) составило 6,50±1,10, среднее число информативных аллелей на локус (Na>5%) составило 4,88±0,67, среднее число эффективных аллелей на локус (Ne) составило 3,97±0,75 аллеля на локус, соответственно. Результативность мультиплексности разработанной тест-системы для ДНК-экспертизы кур показана по возможности амплификации в одной реакции в среднем 8 локусов.

При оценке потребительских свойств созданной тест-системы показана 100% результативность амплификации ДНК, выделенной из разного биологического материала птицы вида Gallus Gallus: крови, ткани гребешка и пульпы пера.  Оценка потенциала разработанной тест-системы в проведении генетической экспертизы племенной птицы показала, что вероятность совпадения генотипов составляет от 5,0*10-7 в МОС_Б до 9,7*10-8 в КОТЛ породах и в среднем по породам КОТЛ, КУЧ_Ю, ЛЕН_Б, МОС_Б и ПЕР находится на уровне 4,9*10-7. При сопоставлении параметров информативности по показателям частот встречаемости аллелей Na, Na с частотой 5%,  Ne  получены следующие значения: 6,50±1,06; 4,20±0,53 и 3,37±0,65, соответственно, согласующиеся с данными, детектированными на меньшем поголовье птиц трех пород, полученными при тестировании функциональных характеристик тест-системы.

Оценка функциональных и потребительских свойств разработанной тест-системы показала ее 100% универсальность при проведении исследование генотипа вне зависимости от породы кур, пола и направления продуктивности, 100% совпадение результатов микросателлитного анализа в серии из 3-х повторов, информативность со средним числом выявленных в популяции аллелей от четырех и выше, мультиплексность при одновременном 100% результативном анализе 8-ми МС.

3.4. Характеристика генетической структуры изучаемых пород кур по восьми микросателлитным локусам

Анализ микросателлитных профилей изучаемых пород кур черно проводили между собой.

Совокупное число микросателлитных аллелей, выявленное в 12 исследованных породах кур, равнялось 110 (табл. 2), при этом минимальным аллельным разнообразием характеризовалась птица  породы ГЛШ, максимальным КУЧ_Ю, 36 и 63 аллеля, соответственно.

Табл. 2. Характеристика пород по 8 микросателлитным локусам

Порода

Локусы тест-системы

Число аллелей в породе, n

Полиморфных локусов,

MCW0111

MCW0067

LEI0094

MCW0123

MCW0081

MCW0069

MCW0104

MCW0183

АВС_ЧП

5***

4***

5

13**

4

6***

10

4***

51

100,00

АДЛ_С

4

3

5***

8

3

4

6

6***

39

100,00

ЗАГ_Л

5**

8**

3

14

7***

6

7

11***

61

100,00

ГЛШ

4

3

6***

10*

3**

4***

1

5

36

87,50

КОТЛ

3

5

9*

13

4***

4

9***

6***

53

100,00

КУЧ_Ю

6

6**

10

13

5

7**

9***

7

63

100,00

ЛЕН_Б

3

3

10***

9

4

5

10**

7

51

100,00

МОС_Б

3

4

6

8

7

4

8***

8***

48

100,00

ПЕР

4

5

4

15

4

4

8

7

51

100,00

РУС_Б

4***

7***

7

9***

5***

3

7***

7

49

100,00

ЮРЛ_Г

4

3

9

15*

4*

7**

9

7

58

100,00

ЛЕГ_Б

4

7

9

11*

9

7*

9

5***

61

100,00

Итого аллелей в локусе

9

10

19

16

12

9

21

14

110

В среднем по породам:

98,96±1,04

* P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001

Как следует из данных таблицы 2 число выявленных аллелей в локусе находилось в диапазоне от 9 в локусах MCW0111и MCW0069 до 21 в локусе MCW0104 и в среднем составило 13,75 аллеля на локус или 51,75 на породу. В среднем по 12 породам процент полиморфных локусов составил 98,96±1,04%, с диапазоном от 87,50% в ГЛШ до 100% во всех остальных 11 породах. Число выявленных аллелей в зависимости от породы варьировало от 1 (MCW0104, ГЛШ) до 15 (MCW0123, ПЕР и ЮРЛ_Г).

Установлено достоверное отклонение от генетического равновесия в 11 из 12 пород кур, за исключением ПЕР, что указывает на инбридированность популяций, обусловленную, по всей видимости, использованием ограниченного числа птиц родительского стада и технологией разведения замкнутых популяций птицы.

Анализ аллельных профилей кур в породном аспекте показал (рис.5), что среднее число аллелей на локус по всем породам составило 6,47±1,01 и изменялось в диапазоне от 4,50±0,95 у кур ГЛШ породы до 7,88±0,93 у кур породы КУЧ_Ю. Следует отметить относительно низкое генетическое разнообразие породы АДЛ_С - в среднем 4,88±0,61 аллеля на локус МС. Среднее число аллелей на локус колебалось от 4,08 в локусе MCW0111 до 11,50 в локусе MCW0123. В 11 из 12 пород число информативных аллелей было более 3,50 на МС, что говорит об информативности созданной панели.

Примечание: Ось Х – исследуемые породы кур (расшифровка аббревиатур приведена в разделе «Материалы и методы»); ось Y – число аллелей, Na – среднее число аллелей, Na5% – число информативных аллелей с частотой встречаемости 5%,  Ne –  число эффективных аллелей

Рис. 5. Аллельное разнообразие 12 пород кур, оцененное по 8 микросателлитным локусам

Анализ данных представленных на рисунке 6 показал, что в десяти породах кур было выявлено 14 приватных аллелей, принадлежащих 6 МС с частотой встречаемости от 1,70%, определенной в 8-ми  породах ЮРЛ_Г (аллель 290 локуса LEI0094),  РУС_Б (аллель 197 локуса MCW0104), ПЕР

.

Примечание: ось Х – частоты встречаемости аллелей, ось Y – популяции кур (расшифровка аббревиатур популяций приведена в разделе «Материалы и методы»), локус и аллель МС.

Рис. 6. Приватные аллели, выявленные в исследованных породах кур

(аллель 237 локуса MCW0104), ЛЕН_Б (аллель 272 локуса LEI0094), КУЧ_Ю (аллель 197 локуса MCW0104), ГЛШ (аллель 319 локуса MCW0183), ЗАГ_Л (аллель 289 локуса MCW0183) и (аллель 126 локуса MCW0081) и АВС_ЧП (аллель 112 локуса MCW0111)  до 25,00% в породе РУС_Б (аллель 108 локуса MCW0111). Показано, что в трех  породах кур выявлено три аллеля с частотой 5% - ЛЕН_Б аллель 274 локуса LEI0094, ЗАГ_Л аллель 187 локуса MCW0067 и РУС_Б аллель 195 локуса MCW0104. Полученные результаты подтверждают гипотезу о наличии породоспецифических аллелей, свойственных замкнутым популяциям.

3.5. Оценка генетической консолидированности и определение степени генетического сходства российских пород кур по микросателлитным локусам при создании паспортов кур 12-ти пород

Фактическая степень гетерозиготности (табл. 3) варьировала от 42,5% у ГЛШ породы кур до 75,4% у кур породы ЮРЛ_Г и в среднем составила 62,1%. В шести из 12 исследованных пород выявлен дефицит гетерозигот, при этом наибольшее значение показателя отмечено в породе ЛЕГ_Б  – 11,4%. Выявленный дефицит гетерозигот указывает на возможное использование в селекции пород умеренного инбридинга.

Расчет значений Rst (AMOVA) показал, что доля межпопуляционной изменчивости в общей изменчивости по МС составляет 19,46%, в то время как на изменчивость внутри индивидуумов приходится 80,54%. Таким образом, возможно, именно замкнутость разведения кур в малочисленных стадах и является ведущим фактором в формировании генетического разнообразия птицы генофондного стада ГНУ ВНИТИП.

Табл. 3. Фактическая и ожидаемая степени гетерозиготности

Породы

Ho

He

Ho-He

UHe

Fis

АВС_ЧП

0,533±0,062

0,595±0,074

-0,062

0,605±0,075

0,098±0,048

АДЛ_С

0,671±0,026

0,659±0,022

0,012

0,670±0,022

-0,021±0,037

ЗАГ_Л

0,633±0,053

0,690±0,038

-0,057

0,702±0,039

0,083±0,060

ГЛШ

0,425±0,102

0,453±0,101

-0,028

0,460±0,103

0,085±0,070

КОТЛ

0,588±0,058

0,659±0,059

-0,072

0,670±0,060

0,094±0,069

КУЧ_Ю

0,642±0,047

0,668±0,039

-0,026

0,679±0,040

0,033±0,061

ЛЕН_Б

0,638±0,031

0,624±0,044

0,013

0,635±0,045

-0,039±0,046

МОС_Б

0,688±0,043

0,637±0,049

0,050

0,648±0,049

-0,090±0,028

ПЕР

0,617±0,085

0,578±0,076

0,039

0,588±0,077

-0,053±0,044

РУС_Б

0,675±0,061

0,669±0,051

0,006

0,681±0,051

-0,023±0,073

ЮРЛ_Г

0,754±0,070

0,728±0,041

0,027

0,740±0,041

-0,023±0,065

ЛЕГ_Б

0,606±0,052

0,720±0,044

-0,114

0,738±0,045

0,149±0,067

В среднем

0,622±0,018

0,640±0,017

-0,018

0,651±0,017

0,024±0,017

Примечание: Не – ожидаемая степень гетерозиготности, Ho – фактическая степень гетерозиготности, F - Разница Ho-He. «+/-» - избыток  /  дефицит гетерозигот, Fis – индекс фиксации.

Как представлено в таблице 4 среднее значение Fst по 8-и локусам для всех пород составило 0,1583. Это свидетельствует о том, что 84,17% всей изменчивости обусловлено внутрипородным разнообразием и только 15,83% приходится на межпородное разнообразие.

Табл. 4. Показатели F-статистики и коэффициент миграции, оцененные по 8-ми микросателлитам

Локус

Fis

Fit

Fst

Nm

MCW0111

-0,0271

0,1461

0,1686

1,2326

MCW0067

-0,0425

0,1430

0,1779

1,1554

LEI0094

-0,0014

0,1275

0,1287

1,6930

MCW0123

0,0329

0,0947

0,0640

3,6583

MCW0081

0,0528

0,2263

0,1832

1,1147

MCW0069

0,0119

0,1965

0,1869

1,0880

MCW0104

0,0874

0,2417

0,1691

1,2285

MCW0183

0,0895

0,2611

0,1884

1,0767

В среднем

0,0254

0,1796

0,1583

1,5309

Значение данного показателя было ниже по сравнению с исследованными ранее породами крупного рогатого скота (Fst=0,114), свиней (Fst=0,152) и коз (Fst=0,143), где внутрипородное разнообразие было соответственно 88,6, 84,8 и 85,7%. Это указывает на меньшую генетическую изолированность пород кур друг от друга по сравнению с породами крупного рогатого скота, свиней и коз.

В результате проведенных исследований установлена высокая генетическая консолидированность изучаемых пород кур (рис.7).

А

Б

Примечание: ось Х – измерение 1, ось Y – измерение 2; расшифровка аббревиатур приведена в разделе «Материалы и методы»; А - Двухмерное распределение в группах кур 12 пород; Б - Дендрограмма филогенетического родства двенадцати пород кур, построенная на основании значений генетических дистанций по Nei M. (1983) методом UMPGA

Рис. 7. Анализ генетической консолидированности изучаемых пород кур

Анализ пространственного распределения  (рис. 7А) изучаемых пород кур  показал, что они в большинстве своем представляют собой хорошо консолидированные частично перекрывающиеся массивы, что указывает на различия в ДНК-профилях, и с другой стороны, - на возможную общность происхождения. Вероятность идентификации породной принадлежности особи (рис.7А) на основании анализа 8 МС в зависимости от породы варьировала от 93,33 до 100% и в среднем составила 97,71%, в то время как у крупного рогатого скота породная принадлежность на основании анализа по МС (13 локусов) может быть определена в 65,5% случаев, у свиней (12 локусов) – в 90,2% случаев [Зиновьева и др., 2010]. Анализ пространственного распределения изучаемых пород кур генофондного стада показал, что они представляют собой хорошо консолидированные во многом перекрывающиеся массивы, что указывает на некоторые различия в ДНК-профилях, с другой стороны, - на общность происхождения.

Анализ структуры филогенетического дерева (рис.7Б) показывает, что формирование кластеров и ветвей носило ярко выраженный породный характер. Единый центральный кластер формируют породы, созданные на основе породы ЛЕГ_Б и производных от него пород: ЛЕН_Б, РУС_Б, АДЛ_С, МОС_Б.  КУЧ_Ю через АВС_ЧП, при выведении которого была использована производная от ЛЕГ_Б порода, примыкает к центральному кластеру.  ЗАГ_Л объединяет центральный кластер пород на основе ЛЕГ_Б с ЮРЛ_Г, КОТЛ, ПЕР и АСТ_ЧП. Дальше всех отстоит ГЛШ, образующая единственную ветвь и объединяющая все другие изучаемые породы кур.

Полученные данные вошли в состав ДНК паспортов 12 пород кур.

ВЫВОДЫ

1. Дана характеристика системы сохранения и рационального использования пород кур генофондного стада с учетом генетических особенностей и направления продуктивности пород.        

2.  Разработана универсальная тест-система генетического анализа пород кур включающая 8 микросателлитных маркеров. Среднее число аллелей на локус составило 6,47 и  колебалось от 4,08 в локусе MCW0111 до 11,50 в локусе MCW0123. В 11 из 12 пород число информативных аллелей было выше 3,50 на МС, что говорит об информативности созданной панели.

3.        Оценены функциональные характеристики и потребительские свойства разработанной тест-системы. Точность идентификации пород кур (PI)  с использованием тест-системы из 8 микросателлитов составила 5,01 * 10-7, точность подтверждения происхождения по обоим родителям (P1X)  - 99,60%, точность подтверждения происхождения по одному родителю (P2X) – 96,08%, вероятность исключения родителей (Р3Х) – 99,99%.  Вероятность совпадения генотипа не  превышает 1 случая на 20000 особей.

4.        По 12 породам процент полиморфных локусов в среднем составил 98,96±1,04%, с диапазоном от 87,50% в голошейной до 100% во всех остальных 11 породах. В шести из 12 исследованных пород выявлен дефицит гетерозигот, при этом наибольшее значение показателя отмечено в породе белый леггорн – 11,4%.  Установлено достоверное отклонение от генетического равновесия в 11 из 12 пород кур, за исключением первомайской, что указывает на инбридированность популяций кур генофондного стада.

5.        Выявлено 14 приватных аллелей, принадлежащих 6 микросателлитам с частотой встречаемости от 1,70% до 25,00%. В трех  породах кур выявлено три аллеля с частотой более 5% - ленинградская белая аллель 274 локуса LEI0094, загорская лососевая аллель 187 локуса MCW0067 и русская белая аллель 195 локуса MCW0104. Подтверждена гипотеза о наличии породоспецифических аллелей, свойственных замкнутым популяциям кур.

6.         Установлены филогенетические связи между изучаемыми породами  кур, обусловленные  общностью их исторического происхождения. Единый центральный кластер формируют породы, созданные на основе породы белый леггорн и его производных. Дальше всех отстоит голошейная, образующая самостоятельную ветвь.

7.        Показана  высокая генетическая консолидированность изучаемых пород кур. Вероятность идентификации породной принадлежности особи на основании анализа 8 микросателлитов  в зависимости от породы варьировала от 88,89 до 100% и в среднем составила 97,08%.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

  1. Лабораториям молекулярно-генетической экспертизы для контроля состояния генофонда кур, оценки генетического разнообразия и породной принадлежности птиц, разводимых в замкнутых популяциях, рекомендуем использовать разработанную тест-систему анализа 8 микросателлитов: MCW0111, MCW0067, LEI0094, MCW0123, MCW0081, MCW0069, MCW0104 и MCW0183.

2.        Отбор и комплектование генофондных стад рекомендуем проводить с учетом данных по молекулярно-генетической паспортизации пород кур.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

Статьи в журналах, рекомендованных ВАК Российской Федерации.

  1. Новгородова, И.П. Изучение информативности микросателлитов кур G. Gallus для характеристики аллелофонда индеек M. Gallopavo / И.П. Новгородова, В.В. Волкова, Е.И. Гладырь, М.И. Селионова, Е.И. Растоваров, В.И. Фисинин, Н.А. Зиновьева // Достижения науки и техники АПК. – 2011. – № 10. – С. 66-67.
  2. Фисинин, В.И. Анализ генетической структуры пород домашних кур с использованием микросателлитных маркеров / В.И. Фисинин, Е.А. Гладырь, В.В. Волкова, А.А. Севастьянова, Н.А. Зиновьева // Проблемы биологии продуктивных животных. – 2011. – № 1. – С. 68-72.

Статьи в других изданиях.

  1. Волкова, В.В. Разработка системы молекулярно-генетической идентификации Gallus Gallus / В.В. Волкова, Е.А. Гладырь, Н.А. Зиновьева, В.И. Фисинин, А.А. Севастьянова // Сборник материалов конференции: «Научные основы повышения продуктивности сельскохозяйственных животных». – 2009. – Краснодар. – С. 16-18.
  2. Фисинин, В.И. Разработка системы молекулярно-генетического анализа Gallus Gallus с целью оценки состояния и динамики изменения отечественного генофонда кур / В.И. Фисинин, Е.А. Гладырь, Н.А. Зиновьева, А.А. Севастьянова, В.В. Волкова // Сборник трудов научной конференции: «Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в АПК России». – 2009. – изд. ВНИТИП: 110-115.
  3. Фисинин, В.И. Создание универсальной молекулярно-генетической тест-системы изучения и контроля состояния генофонда кур (Gallus gallus) / В.И. Фисинин, Л.К. Эрнст, Е.А. Гладырь, Н.А. Зиновьева, А.А. Севастьянова, В.В. Волкова // Сборник трудов 8-й международной научной конференции-школы: «Современные достижения и проблемы генетики и биотехнологии сельскохозйственных животных» / БиоТехЖ. – 2009. – Дубровицы. – С. 27-37.
  4. Эпова, Л.А. Разработка системы генетической контроля происхождения пород кур с использованием микросателлитных маркеров / Л.А. Эпова, В.В. Волкова // Сборник материалов конференции: «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных: роль нанотехнологий в реализации приоритетных задач биотехнологии» (23-24 октября 2008) / БиоТехЖ. – 2008. – С. 285-288.





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.