WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


на правах рукописи АНДРЕЕВА ИРИНА ГЕОРГИЕВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ ПУТЕЙ ТРАНСПОРТА И КАТАБОЛИЗМА ГЛЮКОЗЫ КЛЕТКАМИ PANTOEA ANANATIS

03.02.03 – Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2012

Работа выполнена в лаборатории №3 Закрытого Акционерного Общества «Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика»

Научный консультант:

кандидат биологических наук Каташкина Жанна Иосифовна.

Официальные оппоненты: Котова Ирина Борисовна кандидат биологических наук, доцент Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, Голденкова-Павлова Ирина Васильевна доктор биологических наук, доцент Института общей генетики имени Н.И. Вавилова РАН,

Ведущая организация:

Федеральное государственное учреждение науки Институт микробиологии имени С.Н. Виноградского РАН

Защита диссертации состоится 27 ноября 2012 г. в 15.30 на заседании диссертационного совета Д 501.001.21 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, д.1, стр. 12, биологический факультет МГУ, ауд. М-1.

Тел: 8 (495) 939-54-83, эл. почта: npiskunkova@rambler.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан __________2012 года.

Ученый секретарь диссертационного совета: к.б.н. Пискункова Нина Фёдоровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность проблемы Pantoea ananatis – один из представителей семейства энтеробактерий, различные штаммы которого известны как растительные патогены либо эпифиты. В последние десять лет данный вид привлекает к себе всё большее внимание исследователей поскольку, с одной стороны, он оказался распространённым и опасным патогеном растений, а с другой его природные штаммы способны продуцировать целый ряд полезных веществ (например, каротиноиды, 2,3-бутандиол и т.д.). Учитывая способность P. ananatis быстро расти на простых минимальных средах, содержащих глюкозу, сахарозу и другие углеводы и углеводороды (Moriya et al., 1999), данный вид можно рассматривать как перспективный объект биотехнологии.

На момент окончания экспериментов данной работы были секвенированы и аннотированы геномы только четырёх штаммов рода Pantoea, два из которых относятся к виду P. ananatis. При этом два генома (Pantoea sp. At-9b и P.

ananatis LMG20103) принадлежат патогенным штаммам и один геном принадлежит штамму Pantoea vagans C9-1, используемому в сельском хозяйстве в качестве биопротектора. За период подготовки работы к публикации геномы ещё двух штаммов P. ananatis были секвенированы и аннотированы.

Объект настоящего исследования - штамм P. ananatis AJ13355, относящийся к первому уровню биобезопасности (непатогенный штамм), на базе которого в настоящее время создаётся ряд штаммов-продуцентов, часть из которых уже находится на стадии промышленного внедрения. Составление подробной аннотации генома данного штамма и реконструкция его центрального метаболизма, несомненно, является актуальной и практически значимой задачей. С другой стороны, сравнение геномов P. ananatis AJ13355 и LMG20103 могло бы пролить свет на генетическую природу патогенности последнего штамма.

Современные методы секвенирования, доступные программные средства и обширные базы данных, содержащие последовательности ДНК и белков позволяют быстро определять полные нуклеотидные последовательности бактериальных геномов, составлять их аннотации и реконструировать метаболические пути.

Однако экспериментальная проверка предсказанных моделей зачастую не проводится или существенно задерживается, что определяется отсутствием эффективных генноинженерных методов для конкретного исследуемого организма. Поэтому экспериментальная проверка функционирования предсказанных метаболических путей, поиск новых ферментов, специфических для данного вида или рода, представляет большой научный и практический интерес.

Цели и задачи работы Диссертационная работа посвящена реконструкции путей транспорта и катаболизма D-глюкозы клетками Pantoea ananatis и экспериментальной проверке их функционирования.

В процессе работы решались следующие задачи:

• аннотация генома и теоретическая реконструкция путей транспорта и катаболизма D-глюкозы клетками P. ananatis;

• экспериментальное подтверждение функционирования и оценка относительного вклада и взаимозаменяемости предсказанных путей транспорта и катаболизма D-глюкозы клетками P. ananatis;

• изучение генов P. ananatis, нераспространённых среди Энтеробактерий.

Научная новизна и практическая значимость работы В диссертационной работе составлена подробная аннотация генома P.

ananatis AJ13355 и проведена теоретическая реконструкция центрального углеродного метаболизма для данной бактерии.

Ранее в нашей лаборатории были успешно адаптированы для использования в P. ananatis все наиболее эффективные методы прецизионной модификации хромосомы E. coli, основанные на использовании системы гомологичной рекомбинации фага и систем сайт-специфической рекомбинации. Это позволило нам в данной работе не только теоретически реконструировать центральный метаболизм углерода, но и, впервые для Pantoea, провести полную экспериментальную проверку построенной теоретической схемы. Было экспериментально подтверждено существование предсказанных путей транспорта и катаболизма глюкозы (фосфоенолпируватзависимой фосфотрансферазной системы (PTS), H+-симпортёров (GalP, XylE, FucP), глюкозодегидрогеназного пути, пути Эмбдена-Мейрхофа-Парнаса и пентозофосфатного пути) в клетках P. ananatis, показаны их одновременное функционирование и взаимная заменяемость, обнаружены интересные особенности регуляции.

В ходе работы были обнаружены специфические для Pantoea гены транспорта и катаболизма глюкозы (xylE, fucP, pqq, pzwf, pgnd) определяющие интересные особенности метаболизма. Использование найденных генов может быть полезным для повышения эффективности штаммов-продуцентов как на базе P. ananatis, так и на базе E.coli.

Публикации и апробация работы По теме диссертации опубликовано 4 печатных работы в журналах рекомендованных ВАК. Материалы диссертации докладывались на конкурсе работ сотрудников «АГРИ» (июнь 2009).

Диссертационная работы была апробирована на семинаре секции « Микробиология Ученого совета ЗАО АГРИ 2012 года.

Структура и объём работы Диссертация состоит из 6 разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждения», «Выводы» и «Список цитируемой литературы». Работа изложена на ____страницах, включая ______рисунков и_____таблиц. Список цитируемой литературы содержит _________источника, в том числе на русском языке.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1 Структура генома P. ananatis AJ133Объект исследования данной работы P. ananatis был обнаружен в середине 1990-ых в почве чайных плантаций Японии. Согласно стандартным микробиологическим тестам и секвенированию 16S рРНК (Kwon et al., 1997) штамм был идентифицирован как Pantoea ananatis (Takahashi et al., 2008).

Однако только в 2010-2011 годах силами нашей лаборатории геном P. ananatis был секвенирован и аннотирован. Основные результаты секвенирования и аннотации приведены в таблице 1.

В результате секвенирования было показано, что геном состоит из двух кольцевых молекул ДНК: 4555536-нк хромосомы [DDBJ: AP012032] и 321744нк плазмиды pEA320 [DDBJ:AP012033]. Ранее экспериментально было показано, что P. ananatis AJ13355 действительно содержит в геноме автономно реплицирующуюся плазмиду pEA320 (Hara et al., 2007). Как видно из таблицы 1 по G+C составу хромосома и плазмида P. ananatis AJ13355 похожи (53,8% и 53,4% соответственно), что позволяет предполагать либо недавнее выщепление плазмиды из генома либо её горизонтальный перенос от организма со схожим G + C составом.

С помощью GC-skew анализа, обычно используемого для идентификации лидирующей и отстающей цепей в репликации (Grigoriev, 1998), было установлено, что репликация хромосомы P. ananatis AJ13355 идёт в двух направлениях и начинается в районе oriC (3,803,243–3,803,475 нк), терминатор репликации определён приблизительно в районе 1,5 Mb.Для pEA320 точка начала репликации была предсказана в районе 107 kb, содержащем ген repA, кодирующий гомолог (64,7%) белка инициации репликации RepFIB, характерного для плазмид группы несовместимости FI. Также в «upstream» области repA гена был идентифицирован предположительный ген parAB, белковый продукт которого необходим для стабильного наследования плазмид (Velmurugan et al., 2003).

Таблица 1 - Основные параметры генома P. ananatis AJ13355.

Хромосома pEA3Размер 4555536 нк 321744нк G+C состав 53,76% 53,4% Кодирующие рамки (CDS) 3789 2CDS, кодирующие аннотированные белки 3753 2CDS, кодирующие гипотетические белки 523 1Плотность кодирования 84,60 84,Рибосомальные РНК 22 Транспортные РНК 78 В результате аннотации в хромосоме были идентифицированы 22 гена рРНК, сгруппированные в 7 оперонов, расположенные в противоположных репликативных половинах, так, что направление их транскрипции совпадал с направлением репликации, такое расположение ранее было показано для хромосом и других бактерий (Blattner et al., 1997; Kunst et al., 1997; Veith et al., 2004). В хромосоме были определены 3789 кодирующие рамки, из которых 3753 кодировали уже описанные белки, а 523 кодировали гипотетические белки. На плазмиде были идентифицированы 281 кодирующая рамка, 272 из которых кодировали уже описанные белки, а 110 кодировали гипотетические белки.

Исходя из анализа полученной аннотации была предложена возможная схема метаболизма D-глюкозы в клетках P. ananatis AJ13355 (см. Рис.1). При реконструкции были учтены известные схемы метаболизма для Escherichia coli и Кlebsiella pneumonia, как наиболее изученных на данный момент представителей семейство энтеробактерий.

Рис. 1 - Предполагаемая схема метаболизма D-глюкозы в клетках P. ananatis.

2 Экспериментальная проверка предположительной схемы транспорта и катаболизма глюкозы клетками P. ananatis 2.1 Основные пути поступления глюкозы в клетки P.ananatis В результате реконструкции центрального метаболизма в клетках P.ananatis. было предсказано наличие трёх независимых путей поступления Dглюкозы внутрь: 1) PTS-зависимый транспорт и фосфорилирование с образованием глюкозо-6-фосфата; 2) PQQ-mGDH-зависимое окисление в периплазме до 6-фосфоглюконата с его специфическим транспортом и последующим фосфорилированием глюконат киназой в цитоплазме; 3) транспорт D-глюкозы низко-аффинными H+-симпортёрами и её последующее фосфорилирование глюкокиназой.

Для проверки поставленной гипотезы были сконструированы штаммы с делециями (ptsHI-crr), gcd, glk. Первая делеция инактивировала гены, кодирующие белки HPr, EI и IIAGlc PTS, вторая – mGDH P. ananatis, glk – делеция гена глюкокиназы, предполагающая инактивацию всех путей вторичного транспорта D-глюкозы.

Как видно из таблицы 2 инактивация генов PTS (ptsHI-crr) в клетках P.ananatis не приводит к таким драматическим событиям как полное отсутствие роста. Штамм SC17(0)(ptsHI-crr) прекрасно растёт на минимальной среде с глюкозой, а замедление скорости роста составляет лишь 15%. Отсутствие остановки роста штамма SC17(0)(ptsHI-crr) было ожидаемо в связи с теоретическим предсказанием активной mGDH в клетках P. ananatis, однако даже совместная инактивация генов (ptsHI-crr) и gcd также не привела к полной остановке роста, хотя скорость роста полученного штамма упала на 60%.





Таблица 2 - Скорости роста различных штаммов P.ananаtis SC17(0) при росте на минимальной среде М9 с глюкозой (5г/л).

Среднее значение скорости роста Штамм Абсолютное, час-1 Относительное SC17(0) 0,97±0,02 1,SC17(0)(ptsHI-crr) 0,82±0,012 0,SC17(0)(ptsHI-crr)gcd 0,37±0,02 0,SC17(0)(ptsHI-crr)gcdglk 0,11±0,01 0,Поскольку даже тройной мутант с инактивированными PTS, mGDH и Glk сохраняет способность достаточно хорошо потреблять глюкозу, можно предполагать существование в P. ananatis дополнительных путей транспорта этого сахара.

2.2 Участие предполагаемых H+- симпортеров GalP, XylE и FucP в транспорте глюкозы в клетки P. ananatis Как было показано в предыдущей главе, клетки P. ananatis обладают разнообразным набором путей транспорта глюкозы. При этом весомый вклад вторичного транспорта в пути поступления глюкозы в клетки P. ananatis был подтверждён даже в условиях избыточной глюкозы.

В результате секвенирования, компьютерного анализа и аннотирования генома P. ananatis AJ13355 в геноме P. ananatis были идентифицированы открытые рамки считывания (ORFs), кодирующие белки, ортологичные белкам H+-симпортёров GalP и XylE и FucP E. coli MG1655. Для которых ранее была экспериментально показана возможность осуществления Н+-симпорта не только своих специфических субстратов D-галактозы, D-ксилозы и L-фукозы, соответственно, но и транспорта D-глюкозы при условии обеспечения конститутивной экспрессии соответствующих генов (Flores et al., 2005;

Сливинская и др., 2007).

Для оценки вклада каждого из симпортёров в транспорт D-глюкозы, были сконструированы штаммы SC17(0)(ptsHI-crr)gcdgalP и SC17(0)(ptsHIcrr)gcdxylE. Из таблицы 3 видно, что инактивация предполагаемого гена xylE в штамме SC17(0)(ptsHI-crr)gcd привела лишь к незначительному снижению скорости роста на глюкозе, в то время как инактивация galP в том же штамме уменьшила скорость роста в 3 раза (Таблица 3). Таким образом, GalP действительно вносит заметный вклад в транспорт глюкозы P. ananatis.

Таблица 3 - Скорости роста различных штаммов P.ananаtis SC17(0) при росте на минимальной среде М9 с глюкозой (5г/л).

Среднее значение скорости роста Штамм Абсолютное, час-1 Относительное SC17(0)(ptsHI-crr)gcd 0,37±0,02 0,SC17(0)(ptsH-crr)gcdgalP 0,132±0,021 0,SC17(0)(ptsH-crr)gcdхylE 0,37±0,013 0,Для прямой проверки способности предполагаемых низко-аффинных H+симпортёров GalP, XylE и FucP из P. ananatis транспортировать D-глюкозу, были сконструированы экспрессионные кассеты, несущие соответствующие гены под контролем конститутивного промотора. Далее полученные экспрессионные кассеты были интегрированы в хромосому PTS--штамма E.

coli, MG1655(ptsHI-crr), неспособного к росту на D-глюкозе (Simoni et al., 1976). Способность полученных штаммов – MG1655(ptsHI-crr)galP, MG1655(ptsHI-crr)xylE и MG1655(ptsHI-crr)fucP потреблять глюкозу проверялась измерением роста в жидкой среде, содержащей данный сахар в качестве единственного источника углерода.

Рис. 2 - Комплементация роста PTS- штамма E. coli MG1655(ptsHI-crr) (---) в результате конститутивной экспрессии генов galP(), xylE() и fucP() из P. ananatis при росте на минимальной среде М9 с глюкозой (5г/л). MG1655 ().

Из представленных на Рис. 2 кривых роста на глюкозе видно, что низкоаффинные H+-симпортёры GalP, XylE и FucP из P. ananatis действительно способны обеспечивать транспорт D-глюкозы в клетки кишечной палочки.

2.3 P. ananatis способна к внеклеточному окислению D-глюкозы до D-глюконовой кислоты При культивировании P. ananatis SC17(0) на минимальной среде с избыточным количеством D-глюкозы (от 5 г/л) в качестве единственного источника углерода происходит накопление глюконовой кислоты в культуральной жидкости (Таблица 4). Продукция глюконовой кислоты наблюдается и для многих других представителей рода Pantoea, и имеет экологические причины. Так, образование глюконовой кислоты клетками Pantoea agglomerans, связывают с необходимостью растворения минеральных фосфатов, необходимых для роста клетки (Sulbarn et al., 2009), а для клеток Pantoea citrea продукция глюконовой кислоты является необходимым этапом инфицирования плодов ананасов.(Cha et al., 1997; Pujol and Kado, 2000).

Многие микроорганизмы, включая ряд энтеробактерий, осуществляют окисление глюкозы с промежуточным образованием D-глюконо-1,5-лактона и его последующим превращением в глюконовую кислоту. Как правило, образование глюконовой кислоты происходит в периплазме и катализируется пирролохинолинхинон-зависимой мембранной глюкозодегидрогеназой (mGDH).

Хотя ортологи известных генов, кодирующих mGDH, присутствуют в большинстве энтеробактерий, только немногие из них способны также к эндогенному образованию PQQ (Liu et al., 1992; Pujol and Kado, 1999).

В геноме P. ananatis AJ13355 были обнаружены как близкий гомолог гена глюкозодегидрогеназы (gcd) из E. coli (идентичность кодируемых аминокислотных последовательностей 74%), так и pqqABCDEF оперон, гомологичный ранее описанному оперону биосинтеза PQQ из Klebsiella pneumonia. Кроме того, была найдена ORF, предположительно кодирующая глюконолактоназу (аннотирована как gnl). В данной главе описана детальная проверка функционирования данного пути утилизации глюкозы в P. ananatis.

2.3.1 Глюкозодегидрогеназная активность в мембранных фракциях P.ananatis Для экспериментального подтверждения функционирования реконструированного на основании аннотации генома P. ananatis PQQзависимого пути окисления глюкозы, с помощью адаптированного для P. ananatis метода Red-зависимой интеграции (Katashkina et al., 2009) были сконструированы делеции гена gcd и pqqABCDEF оперона.

Измерение глюкозодегидрогеназной активности в мембранной фракции клеток P. ananatis дикого типа подтвердило присутствие в клетках активного холофермента (Таблица 5). Инактивация гена gcd привела к отсутствию накопления глюконовой кислоты при росте на минимальной среде с Dглюкозой (5 г/л) в качестве единственного источника углерода (Таблица 4) и к падению глюкозодегидрогеназной активности до недетектируемого уровня (Таблица 5). Таким образом, было показано, что gcd действительно кодирует PQQ-зависимую мембраносвязанную глюкозодегидрогеназу GDH.

Таблица 4 - Накопление глюконовой кислоты в культуральной среде разных штаммов SC17(0), SC17(0)gcd, SC17(0)pqq.

Штамм SC17(0) SC17(0)gcd SC17(0)pqq Концентрация глюконовой 1,4 нд* нд кислоты, г/л нд – недетектируемый уровень (<0,06 г/л) Таблица 5 - Глюкозодегидрогеназная активность в мембранной фракции клеток штаммов SC17(0), SC17(0)gcd, SC17(0)pqq.

SC17(0)pqq PQQ SC17(0) SC17(0)gcd (1,88 ± 0.12)*110мкM (1,18 ± 0,04)*103 нд* GDH (1,6 ± 0.2)*1активность, 3мкM (1,2 ± 0,2)*103 нд нМ/(мин*мг) нд 0 (1,47 ± 0,01)*102 нд нд – недетектируемый уровень (<7 нМ/(мин*мг)).

Отсутствие глюкозодегидрогеназной активности в мембранной фракции штамма SC17(0)-pqq в случае, когда измерение проводилось без добавления PQQ, подтвердило участие генов pqq оперона в биосинтезе данного кофермента, необходимого для образования активного холофермента глюкозодегидрогеназы. К сожалению, химические реакции, приводящие к образованию PQQ, в настоящее время не известны. Поэтому нельзя было исключать участие каких-то дополнительных, не входящих в состав pqq оперона, генов в данном процессе. Для того, чтобы исключить участие в биосинтезе PQQ каких-либо специфических генов P. ananatis, не входящих в состав pqq оперона, решено было клонировать данный оперон и проверить способность клеток P. ananatis и E. coli синтезировать PQQ в условиях экспрессии клонированного оперона.

2.3.2 Клонирование pqq оперона и влияние его экспрессии на продукцию PQQ клетками P. ananatis и E. coli Для клонирования pqqABCDEF оперона из P. ananatis был выбран интегративный вектор pAH162-TcR на базе R6K репликона, содержащий в своём составе attP сайт фага 80, позволяющий осуществлять сайтспецифическую интеграцию данной плазмиды в attB сайт фага 80, расположенный в бактериальной хромосоме (Minaeva et al., 2008). В связи с тем, что клонируемый фрагмент имел достаточно большую длину (6,7 тпн), необходимо было избежать использования ПЦР и провести клонирование in vivo. Клонированный фрагмент содержал в своём составе нативную регуляторную область.

Для интеграции клонированного pqqABCDEF оперона в хромосому P.

ananatis был специально сконструирован реципиентный штамм SC17(0)80attB, в котором ген ampC был замещён сайтом attB фага 80. После проведения интеграции полученный штамм был излечен от векторной части интегративной плазмиды за счёт Int/Xis-зависимой рекомбинации (интегративный вектор pAH162-TcR содержит в своём составе attL и attR сайты фага , что позволяет легко удалять из хромосомы векторную часть интегративной плазмиды). Полученный в результате штамм был обозначен SC17(0)-80attB-pqq.

Проведеные измерения накопления PQQ в среде культивирования полученных штаммов SC17(0)pqq и SC17(0)-80attB-pqq показали, что накопление PQQ штаммом SC17(0)pqq не детектируется, а штамм SC17(0)80attB-pqq продуцирует в два раз больше PQQ, чем исходный штамм SC17(0) (Таблица 6). Таким образом, продукция PQQ клетками P. ananatis действительно определяется уровнем экспрессии pqqABCDEF оперона.

Таблица 6 - Накопление PQQ в культуральной среде разных штаммов P. ananatis.

Штамм SC17(0) SC17(0)-pqq SC17(0)-80attB-pqq PQQ концентрация, мкМ 28,2 ± 6 <3,02 54,4 ± Для проверки достаточности наличия pqqABCDEF оперона для обеспечения биосинтеза PQQ данный оперон был интегрирован в нативный сайт 80attB штамма E. coli MG1655(ptsHI-crr). Штамм MG1655(ptsHI-crr) неспособен к росту на минимальной среде с глюкозой в силу инактивировании в нём PTS. В E. coli mGDH существует только в апоформе, поскольку путь биосинтеза PQQ отсутствует, однако глюкозодегидрогеназная активность может быть восстановлена добавлением экзогенного PQQ. Мы надеялись добиться аналогичного эффекта благодаря экспрессии в клетках E. coli pqq oперона из P. ananatis.

Мы предположили, что экспрессия pqq oперона из P. ananatis обеспечит комплементацию (ptsHI-crr) мутации благодаря восстановлению активности глюкозодегидрогеназы и образованию дополнительного пути потребления глюкозы через её окисление до глюконовой кислоты. Полученные для штаммов MG1655(ptsHI-crr) и MG1655(ptsHI-crr)pqq кривые роста наглядно подтверждают наше предположение (Рис. 3). Тем не менее, нам не удалось детектировать продукцию PQQ клетками E. coli MG1655(ptsHI-crr)pqq.

Возможно, это объясняется худшей, по сравнению с P. ananatis, экспрессией оперона, расположенного под контролем природной регуляторной области.

Рис. 3 - Интеграция pqq oперона () восстанавливает рост штамма MG1655(ptsHIcrr)() на минимальной среде с глюкозой до уровня дикого типа MG1655().

2.4.1 Транспорт D-глюконовой кислоты в клетки P. ananatis В геноме P. ananatis с высокой степенью гомологии были идентифицированы все компоненты GntI системы E. coli (Таблица 7).

Таблица 7 - Сравнение аминокислотных последовательностей компонентов GntI систем в E.coli и P. ananatis.

E. coli ген Белок P.ananatis ген % Гомологии gntT Высоко-аффинная глюконат пермеаза PAJ_0432 gntR Репрессор генов gntT, gntK-gntU PAJ_2930 gntK Термостабильная глюконат киназа PAJ_2929 gntU Низко-аффинная глюконат пермеаза PAJ_2928 Известно, что GntI система – основная система транспорта и фосфорилирования глюконовой кислоты в E. coli (Tsunedomi et al., 2003). Эта система состоит из gntT гена, кодирующего высоко-аффинную глюконат пермеазу, и gntKU оперона, кодирующего глюконаткиназу GntK и низкоаффинную глюконат пермеазу GntU. Экспрессия этих генов, с одной стороны, регулируется репрессором GntR, действие которого снимается глюконовой кислотой, и, с другой стороны, активируется комплексом CRP-cAMP (Porco et al., 1997; Izu et al., 1997). Таким образом, GntI система работает, когда глюкоза отсутствует, а глюконовая кислота присутствует в достаточной концентрации в среде культивирования.

При культивировании штаммов-продуцентов на базе P. ananatis зачастую наблюдается накопление глюконовой кислоты в количествах токсичных для клеток. При этом инактивация глюкозодегидрогеназы с целью предотвращения накопления глюконовой кислоты в ряде случаев приводило к существенному замедлению роста культуры и соответствующему падению продуктивности.

Было решено исследовать регуляцию экспрессии gntKU оперона в P. ananatis с целью последующей оптимизации экспрессии этих генов для улучшения потребления глюконовой кислоты и снижения её накопления штаммамипродуцентами.

Сравнение регуляторных областей gntK генов E.coli и P. ananatis показало (Рис. 4), что в “upstream” области гена gntK P. ananatis можно выделить предполагаемые области «-10», «-35», единственный операторный участок для взаимодействия с репрессором GntR, расположенный также, как сайт GntR2 в E. coli и сайт связывания с комплексом CRP-сАМР, аналогичным образом расположенный, но ещё менее симметричный, чем сайт, ранее идентифицированный в промоторе gntKU оперона E.coli.

Рис. 4 - Сравнение регуляторных областей gntK генов E.coli и. P. ananatis Для исследования регуляции данного промотора был сконструирован штамм SC17(0)-PGZ, в котором промоторный участок gntKU оперона с помощью Red-зависимой рекомбинации был интегрирован перед lacZ геном в штамме SC17(0) lacZ T lacY так что в результате интеграции старт кодон lacZ thr гена был заменён на старт кодон gntK гена. Поскольку только правая половина обнаруженного в промоторной области gntKU оперона P. ananatis сайта связывания CRP имела гомологию с консенсусом, было решено проверить, влияет ли левая половина предполагаемого сайта на связывание CRP-cAMP.

Для этого были сконструированы аналогичные транскрипционные слияния lacZ с укороченными вариантами промотора, в первом из которых предполагаемый сайт связывания CRP был полностью удалён, а во втором содержал лишь правую половину (Рис. 4). Полученные штаммы были обозначены SC17(0)-PGZ-Short и SC17(0)-PGZ -1/2, соответственно.

Естественно было предположить, что P промотор должен gntKU индуцироваться глюконовой кислотой и репрессироваться в присутствии глюкозы в среде культивирования. Поскольку P. ananatis преобразует часть глюкозы в глюконовую кислоту, для дикого штамма невозможна ситуация роста на чистой глюкозе. Поэтому для точного определения коэффициента индукции был сконструирован штамм SC17(0)-PGZ-gcd, в котором образование глюконовой кислоты из глюкозы невозможно, а затем была получена его производная с инактивированным геном репрессора (штамм SC17(0)-PGZ-gcdgntR). Аналогично, для корректного определения уровня активации промотора комплексом CRP-cAMP были сконструированы штаммы SC17(0)-PGZcyaА и SC17(0)-PGZcrp, в которых были инактивированны предполагаемые гены аденилатциклазы и crp, соответственно.

Таблица 8 - Активность промотора Р.

gntKU Активность, ед.М D-глюкоза + Источник D-глюконовая D-глюкоза D-глюконовая углерода кислота кислота Штамм SC17(0)-PGZ 140±20 480±90 150±SC17(0)-PGZ-gcd 12±3 387±25 116±SC17(0)-PGZ-gcdgntR 150±1 378±30 нд SC17(0)-PGZ-cyaА 45±3 64±5 нд SC17(0)-PGZ-crp 48±3 68±7 нд SC17(0)-PGZ-Short 28±3 35±3 25±SC17(0)-PGZ-1/2 150±20 430±10 150±Измерение удельной активности -галактозидазы в полученных штаммах, выращенных на разных источниках углерода, показало (Таблица 8), что максимальная активность для каждого штамма наблюдалась при выращивании на среде, где единственным источником углерода служила глюконовая кислота.

Остаётся невыясненным, почему статистически значимое, хотя и незначительное, увеличение активности наблюдалось даже для штаммов SC17(0)-PGZ-cya, SC17(0)-PGZ-crp и SC17(0)-PGZ-Short. Как и ожидалось, различие в уровнях -галактозидазной активности при культивировании на глюкозе и смеси глюкозы с глюконовой кислотой наблюдалось только для штамма с инактивированным геном глюкозодегидрогеназы SC17(0)-PGZ-gcd.

Сравнение удельной активности -галактозидазы в штаммах SC17(0)PGZ-gcd и SC17(0)-PGZ-gcdgntR при культивировании на среде с глюкозой позволяет определить коэффициент репрессии в условиях отсутствия активации К =12. В то же время, при культивировании штамма SC17(0)-PGZр gcd на смеси глюкозы и глюконовой кислоты активность оказывается в 10 раз выше, чем при его культивировании на глюкозе. В литературе нет данных о том, что именно (глюконовая кислота или её фосфорилированная форма) является индуктором GntR. В любом случае, полученные данные говорят о том, что комплекс GntR с индуктором сохраняет частичную способность связываться с ДНК. Поэтому только делеция гена репрессора позволяет оценить истинную силу промотора в нерепрессированном состоянии.

Сравнение активности -галактозидазы в штамме SC17(0)-PGZ-gcd и его производных SC17(0)-PGZ-cyaА и SC17(0)-PGZ-crp позволяют определить коэффициент активации в условиях индукции К =6. В тоже время, а сравнение результатов измерения активности в штаммах SC17(0)-PGZ и SC17(0)-PGZ-gcd на смеси глюкоза+глюконовая кислота и только глюконовой кислоте свидетельствует лишь о троекратной активации промотора Р как gntKU для штамма дикого типа так и для штамма SC17(0)-PGZ-gcd в условиях присутствия глюконата в среде культивирования. Как и в предыдущем случае, наблюдаемое несовпадение уровней регуляции промотора измеренных при изменении среды культивирования и при полном удалении регуляторного белка может объясняться остаточной активностью регуляторного белка в непермиссивных условиях. В случае с CRP такое несовпадение может быть связано ещё и с тем, что при росте клеток в присутствии глюкозы концентрация cAMP снижается, но не становится нулевой. Для оценки уровня активации в неидуцированном состоянии проводилось измерение удельной активности галактозидазы штамма SC17(0)-PGZ-gcd, выращенного на лактозе в качестве единственного источника углерода (Таблица 9). В этом случае коэффициент активации составил К =80. Однако, по необъяснимым причинам на смеси а лактоза+D-глюконовая кислота, когда ожидается наблюдать и индукцию и активацию активность промотора Р оказалась в 8 раз ниже чем при gntKU условиях исключительно активации при росте на лактозе.

Таблица 9 - Активность промотора Р.

gntKU Штамм Источник углерода Активность, ед.М D-глюкоза 12±D-глюконовая кислота 387±SC17(0)-PGZ-gcd Лактоза 980±1D-глюкоза+D-глюконовая кислота 116±Лактоза+D-глюконовая кислота 120±Измерение активности промотора Р в штамме с полностью удалённым gntKU CRP-сайтом показало отсутствие активации (Таблица 10). В то время как штамм SC17(0)-PGZ-1/2, в котором была оставлена правая половина CRP-сайта демонстрировал активность промотора Р на уровне штамма дикого типа.

gntKU Таким образом, можно предполагать, что in vivo только правая половина CRPсайта действительно необходима для активации промотора комплексом CRPсАМР.

Таблица 10 - Активность промотора Р.

gntKU Активность, ед.М М9+D-глюконовая LB+D-глюконовая Среда LB кислота кислота Штамм SC17(0)-PGZ 90±10 480±90 105±SC17(0)-PGZ-Short 12,2±1,2 35±3 12,4±1, SC17(0)-PGZ-1/2 86±6 430±10 86±Полученные данные показывают, что в штамме дикого типа промотор gntKU оперона оказывается полностью индуцированным не только при росте на глюкозе и других сахарах, но даже при росте на глюконеогенных субстратах без экзогенного добавления глюконовой кислоты. Это говорит о том, что глюконеогенез в P. ananatis не только доходит до образования глюкозы, но ещё и завершается её конверсией в глюконовую кислоту. После истощения глюкозы в среде культивирования экспрессия gntKU оперона усиливается в три раза, что, по-видимому, и объясняет наблюдаемое обычно быстрое потребление глюконовой кислоты штаммами-продуцентами на заключительном этапе ферментации.

Чтобы улучшить потребление глюконовой кислоты в присутствии глюкозы в среде культивирования, мы попытались заменить природный промотор gntKU оперона сильным конститутивным промотором P. Для tac проверки эффективности такой замены был использован штамм SC17(0)zwfpgi, способный потреблять глюкозу только путем её окисления до глюконовой кислоты. Мы сравнили рост на глюкозе и глюконовой кислоте данного штамма и его производного, в котором Р был заменен на P.

gntKU tac Рис. 5 - Кинетические кривые роста на глюкозе штамма SC17(0)zwfpgi () и его производного, содержащего gntKU оперон под контролем промотора P () на минимальной tac среде М9 с глюкозой (А) или D-глюконовой кислотой (В) в качестве единственного источника углерода.

Из рисунка 5 видно, что такая замена промоторной области привела к заметному увеличению скорости роста штамма на глюкозе. Однако, в условиях полной индукции и активации при росте на глюконовой кислоте наблюдается противоположная ситуация: штамм с нативным промотором опережает в росте штамм с искусственной конструкцией.

Тем не менее, полученная конструкция P tac-gntKU, по-видимому, может быть использована для улучшения потребления глюконовой кислоты при росте на глюкозе штаммов на базе P. ananatis, особенно в случае её амплификации за счёт введения дополнительной копии.

2.5 Пути катаболизма глюкозо-6-фосфата и 6-фосфоглюконовой кислоты в клетках P.ananatis.2.5.1 Основная точка ветвления катаболизма D-глюкозы:

конструирование штаммов, несущих различные комбинации мутаций pgi, gcd, zwf и анализ их роста Как описано выше, согласно теоретической реконструкции центральной точкой ветвления катаболизма глюкозы в клетках P.ananatis является глюкозо6-фосфат, который может с помощью фермента фосфоглюкозоизомеразы быть преобразован во фруктозо-6-фосфат и далее пойти по пути Эмбдена-МейрхофаПарнаса или же с помощью глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы быть окисленным до 6-фосфоглюконолактона, тем самым включившись в пентозофосфатный путь (Рис. 1).

Для проверки функционирования и вклада каждого из перечисленных путей в катаболизм глюкозы были сконструированы штаммы несущие одиночные делеции pgi (фосфоглюкозоизомераза), zwf (глюкозо-6фосфатдегидрогеназы), получены различные комбинации этих мутаций и описанной выше делецией gcd (глюкозодегидрогеназа).

Анализ кривых роста полученных мутантов на минимальной среде с Dглюкозой в качестве единственного источника углерода показал (Таблица 11), что инактивация какого-либо из этих генов не приводит к существенным изменениям скорости роста (не более 25%). В главе 2.3 уже было показано, что в клетках P.ananatis при росте на среде с D-глюкозой глюкозодегидрогеназная реакция работает и данный путь функционирует. Однако, было важно показать взаимодействие и вклад каждого из трёх путей в катаболизм глюкозы. Так, выяснилось, что при инактивации гена gcd в клетках P.ananatis скорость роста на минимальной среде с D-глюкозой почти не меняется. Таким образом, можно предполагать, что оставшиеся два пути в данных экспериментальных условиях компенсируют отсутствие gcd. Стоит отметить, что условия эксперимента не в полной мере отражают реальность и вполне возможно, что в природе штамм SC17(0)gcd был бы вытеснен в конкурентной борьбе за ресурс. Интересно, что SC17(0)gcd достигает большей оптической плотности, чем родительский штамм SC17(0).

Инактивация pgi в клетках P.ananаtis приводила к замедлению скорости роста на 23%, а инактивация zwf только на 5%. Таким образом, можно заключить, что любые оставшиеся два пути в данных экспериментальных условиях с той или иной степенью успеха компенсируют отсутствие первого.

Из анализа роста двойных мутантов на минимальной среде с D-глюкозой (Рис. 3.12) ожидалось сделать вывод о работе каждого из путей в одиночку. В случае P. ananаtis все двойные мутанты были способны к росту на минимальной среде с глюкозой, т.е. каждый из путей способен обеспечить катаболизм D-глюкозы. Наибольшее падение скорости роста (50%) наблюдалось в штамме SC17(0)gcdzwf, у которого углеродный поток идёт предположительно только через путь Эмбдена-Мейрхофа-Парнаса, а вход в пентозофосфатный путь возможен только благодаря транскетолазной реакции.

Штамм SC17(0)zwfpgi, в котором предположительно работает только глюкозодегидрогеназный путь и SC17(0)gcdpgi, в котором работает только пентозофосфатный путь, характеризуются не столь сильным падением скорости роста около 30%. Однако, утверждать, о наименьшем вкладе пути Эмбдена-Мейрхофа-Парнаса в катаболизм глюкозы в клетках P.ananаtis неверно, поскольку большое значение для эффективной работы пути ЭмбденаМейрхофа-Парнаса имеет уровень аэрации.

Таблица 11 - Скорости роста различных штаммов P.ananаtis SC17(0) при росте на минимальной среде М9 с глюкозой (5г/л).

Среднее значение скорости Штамм Абсолютное, час-1 Относительное SC17(0) 0,79±0,02 SC17(0)zwf 0,74±0,02 0,SC17(0)pgi 0,6±0,013 0,SC17(0)gcd 0,82±0,02 1,SC17(0)zwfpgi 0,58±0,025 0,SC17(0)gcdpgi 0,53±0,012 0,SC17(0)gcdzwf 0,39±0,012 0,SC17(0)gcdzwfpgi 0,101±0,002 0,Тройной мутант, SC17(0)gcdzwfpgi значительно снижает скорость роста (в 10 раз), но продолжает расти на минимальной среде с глюкозой, что согласовывается с данными аннотации, предполагающими наличие дополнительного пути метаболизма глюкозы.

2.5.2 Проверка функциональной активности генов pzwf и pgnd.

В ходе компьютерного анализа на плазмиде P. ananatis был найден оперон гомологичный оперону из Mesorhizobium loti. Этот оперон содержит гены глюкоамилазы (cga), глюкозо-6-фостфатдегидрогеназы (zwf), 6фосфоглюконат дегидрогеназы (gnd), глюкокиназы (paj_0286) и предположительно обеспечивает утилизацию крахмала и гликогена. Для проверки функционирования дополнительных путей утилизации глюкозы на базе штамма SC17(0)pgigcd, в котором глюкоза метаболизируется через пентозофосфатный путь, были сконструированы штаммы несущие делеции pzwf и pgnd. Также оба гена были инактивированны в штамме SC17(0) gcd.

Из результатов измерения роста полученных мутантов видно (Таблица 12), на росте штамма SC17(0)gcd даже одновременная инактивация pzwf и pgnd не приводит к изменению скорости роста, это ожидаемо, поскольку в SC17(0)gcd работает и путь Эмбдена-Мейрхофа-Парнаса и пентозофосфатный путь. А в штамме SC17(0)gcdpgi инактивация pgnd приводит к ухудшению роста относительно исходного штамма на 10% (Таблица12), что указывает на функциональную активность гена pgnd. В то время как введение мутации pzwf на скорости роста этого штамма не сказывается. Однако, инактивация pzwf на фоне комбинации мутаций gcdpgipgnd приводит к замедлению роста ещё на 15%, что всё же подтверждает участие данного гена в метаболизме глюкозы.

Таблица 12 - Скорости роста различных штаммов P.ananаtis SC17(0) при росте на минимальной М9 с глюкозой (5г/л).

Среднее значение скорости Абсолютное, час-1 Относительное SC17(0) gcd 0,82±0,03 1,SC17(0) gcdpgi 0,35±0,01 0,SC17(0) gcd pzwf pgnd 0,78±0,022 SC17(0) gcd pgi pgnd 0,29±0,01 0,4SC17(0) gcdpgi pzwf 0,34±0,01 0,SC17(0) gcdpgi pzwf pgnd 0,23±0,01 0,Для подтверждения функциональной активности генов pzwf и pgnd, необходимо было измерить ферментативную активность соответствующих белковых продуктов. Однако, для этого следовало исключить вклад хромосомных zwf и gnd.

Taблица 13 - Aктивность глюкозо-6Р-дегидрогеназы в неочищенных экстрактах различных штаммов P. anantis.

Активность глюкозо-6Р-дегидрогеназы, нмоль/мин*мг Штамм NADP NAD SC17(0) 160 ± 8

Aктивность 6-фосфоглюконатдегидрогеназы была измерена для штаммов SC17(0), SC17(0)gnd и SC17(0)gndpgnd. Как видно из таблицы 14 NADPзависимая активность определялась только для штамма с интактными хромосомным zwf. NAD-зависимая активность в исходном штамме SC17(0) была в 8 раз ниже чем NADP-зависимая. После инактивации gnd активность 6фосфоглюконатдегидрогеназы уменьшилась в 2 раза, а штамме SC17(0)gndpgnd не детектировалась совсем. Таким образом, можно предполагать, что фермент pGnd активен и требует NAD в качестве кофактора, но в данных условиях активность эта низка. Для детального исследования активности pGnd было решено обеспечить конститутивную экспрессию гена pgnd.

Taблица 14 - Aктивность 6-фосфоглюконатдегидрогеназы в неочищенных экстрактах различных штаммов P. ananatis.

Специфическая активность глюконатдегидрогеназы, нмоль/мин*мг Штамм NADP NAD SC17(0) 98 ± 2 15 ± SC17(0)gnd 0 8 ± SC17(0)gndpgnd 0 2.5.2.1 Клонирование генов pzwf и pgnd.

Для дальнейшего исследования генов pzwf и pgnd было проведено их клонирование на низкокопийный вектор RSFP lac –lacI (Katashkina et al., 2007) под промотор P (Рис. 6).

lacUVРис. 6 - Конструирование плазмид RSFP lac-pzwf и RSFP lac-pgnd.

2.5.2.2 Измерение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в штамме SC17(0)zwf pzwf / RSFP lac-pzwf Для измерения активности плазмида RSFP lac-pzwf была введена в штамм SC17(0)zwfpzwf. Измерение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы было проведено в неочищенных экстрактах клеток, несущих плазмиду. Как видно из таблицы 15, плазмида RSFP lac-pzwf содержит копию плазмидного гена zwf, кодирующего глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу с двойной NAD+ / NADP+ кофакторной специфичностью. Кроме того, уровень NAD+ -зависимой активности в этих клонах был значительно выше, чем уровень NADР+ -зависимой активности.

Taблица 15 - Aктивность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в неочищенных экстрактах клеток штаммов SC17(0).

NADP-зависимая NAD-зависимая Штамм активность, нмоль/ активность, нмоль/ (мин*мг) (мин*мг) SC17(0)/ RSFP 57±5 lac –lacI SC17(0)zwfpzwf / RSFP 0 lac –lacI SC17(0)zwfpzwf / RSFP 3.9 ± 0.5 31 ± lac-pzwf 2.5.2.3 Измерение активности в штамме SC17(0)gndpgnd / RSFP lac –pgnd Для исследования активности 6-фосфоглюконат дегидрогеназы в составе RSFP –pgnd с помощью Red метода был сконструирован штамм lac SC17(0)gndpgnd, в который впоследствии была трансформирована плазмида RSFP lac–pgnd. Измерение активности 6-фосфоглюконатдегидрогеназы было проведено в неочищенных экстрактах клеток, несущих плазмиду. Как видно из таблицы 16, NAD-зависимая специфическая активность данного фермента приблизительно в 30 раз выше, чем NADР-зависимая активность.

Следовательно, как и ожидалось, клонированный ген кодирует NADзависимую 6-фосфоглюконатдегидрогеназу.

Taблица 16 - Aктивность 6-фосфоглюконат дегидрогеназы в неочищенных экстрактах штамма SC17(0)gndpgnd, содержащего RSFP lac-pgnd.

Штамм Специфическая активность 6фосфоглюконатдегидрогеназы, нмоль/мин*мг NADP NAD SC17(0) 98 ± 2 15 ± SC17(0)gnd 0 8 ± SC17(0)gnd pgnd 0 SC17(0)gndpgnd / RSFP 31 ± 4 1100 ± 2lac –pgnd 2.5.2.4 Физиологическая роль генов pzwf и pgnd Как уже было описано в обзоре литературы долгое время считалось, что реакции окислительной ветки пентозофосфатного пути являются исключительно NADP+ зависимыми. Но данное утверждение верно только для E.coli, у которой в ходе глюкозного катаболизма синтезируется недостаточное количество NADPH, вследствие чего кишечная палочка нуждается в образовании дополнительного количества NADPH с помощью энергозависимой трансгидрогеназы PntAB (Sauer et al., 2004.). Для большинства других бактерий скорость образования NADPH превосходит скорость его расходования в глюкозном метаболизме. Так, показано, что решающее значение для предотвращения избыточного синтеза NADPH играют ферменты окислительной ветви пентозофосфатного пути: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа и 6-фосфоглюконатдегидрогеназа (Fuhrer and Sauer, 2009), за счёт двойной специфичности и/или наличия NAD-зависимых изозимов.

Для объекта наших исследований P.ananatis в ходе предыдущих экспериментов было показано, что в штамме SC17(0)pgi gcd, в котором утилизация глюкозы возможна только через пентозофосфатный путь, делеция pzwf и pgnd приводит к снижению скорости роста. Таким образом, эти вторые гены активны и обеспечивают рост штамма SC17(0)pgi gcd в отличие от E.coli, для которой pgi существенно снижает скорость роста. Измерения активности ферментов pZwf и pGnd показали их предпочтительную NAD зависимость, что предполагает их участие в предотвращении избыточного образования NADPH в пентозофосфатном пути.

Выводы • Аннотирован и охарактеризован геном P. ananatis.

• Проведена теоретическая реконструкция путей транспорта и катаболизма Dглюкозы клетками P. ananatis.

• Показана и исследована работа предсказанных путей транспорта и катаболизма глюкозы: фосфоенолпируват-зависимой фосфотрансферазной системы, глюкозодегидрогеназного пути, транспорт глюкозы низкоаффинными H+-симпортёрами (GalP, XylE, FucP), пути ЭмбденаМейрхофа-Парнаса и пентозофосфатного пути в клетках P. ananatis.

Показаны их одновременное функционирование и взаимная заменяемость.

• Исследована регуляция gntKU оперона системы GntI периферического метаболизма глюконовой кислоты.

• Экспериментально подтверждены функции теоретически идентифицированных генов катаболизма D-глюкозы клетками P. ananatis:

gcd, pqq, zwf, pzwf, gnd и pgnd.

Основное содержание диссертации отражено в следующих печатных работах:

Hara, Y. The complete genome sequence of Pantoea ananatis AJ13355, an organism with great biotechnological potential./ Y. Hara, N. Kadotani, H. Izui, J.I.

Katashkina, T.M. Kuvaeva, I.G. Andreeva, L.I. Golubeva, D.B. Malko, V.J.

Makeev, S.V. Mashko, Y.I. Kozlov.// Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2011. – V.93.

– N.1. – P. 331–341.

1. Andreeva, I.G. Identification of Pantoea ananatis gene encoding membrane pyrroloquinoline quinone (PQQ) – dependent glucose dehydrogenase and pqqABCDEF operon essential for PQQ biosynthesis./ I.G. Andreeva, L.I.

Golubeva, J.I. Katashkina, T.M. Kuvaeva, S.V. Mashko. // FEMS Microbiol. Lett. – 2011. – V. 318. – P. 55–60.

2. Андреева И.Г./ Предполагаемые Н+-симпортёры GalP, XylE и FucP из Pantoea ananatis способны транспортировать глюкозу в клетки Escherichia coli../И.Г. Андреева, Л.И. Голубева, Ж.И. Каташкина. // Биотехнология – 2012. – 2 – с. 21–31.

3. Katashkina, J.I. Use of the Red – recombineering method for genetic engineering of Pantoea ananatis. / J.I. Katashkina, Y. Hara, L.I. Golubeva, I.G. Andreeva, T.M. Kuvaeva, S.V. Mashko. // BMC Molecular Biology. – 2009 – V. 10. – P. 34. doi: 10.1186/1471 – 2199 – 10 – (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2682490/)






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.