WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

На правах рукописи

Пылаев Тимофей Евгеньевич

ИССЛЕДОВАНИЕ КОМПЛЕКСОВ ДНК-ЗОЛОТЫЕ НАНОЧАСТИЦЫ МЕТОДАМИ СПЕКТРОСКОПИИ ПОГЛОЩЕНИЯ И ДИНАМИЧЕСКОГО РАССЕЯНИЯ СВЕТА

Специальность 03.01.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Воронеж – 2012

Работа выполнена в лаборатории нанобиотехнологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук» (ИБФРМ РАН)

Научный консультант: доктор физико-математических наук, профессор Хлебцов Николай Григорьевич

Официальные оппоненты: Наквасина Марина Александровна доктор биологических наук, доцент, Воронежский государственный университет, профессор кафедры биофизики и биотехнологии Потапенко Александр Яковлевич доктор биологических наук, профессор, Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова, заведующий кафедрой медицинской и биологической физики педиатрического факультета

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московский государственный университет имени М.В.

Ломоносова

Защита состоится «11» мая 2012 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 212.038.03 при Воронежском государственном университете по адресу:

394006, г. Воронеж, Университетская пл., д. 1.

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Минобрнауки Российской Федерации и на сайте Воронежского государственного университета www.vsu.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке Воронежского государственного университета.

Автореферат разослан « » апреля 2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета Грабович М.Ю.

доктор биологических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы Комплексы ДНК с золотыми наночастицами (ЗНЧ) получают химической конъюгацией через тиольные производные или физической адсорбцией. Такие комплексы нашли применение как средство внутриклеточной доставки генетических векторов и зондов, для усовершенствования технологии ПЦР-анализа, для развития методов генной диагностики (обнаружения ДНК-мишеней) на уровне продуктов ПЦР-анализа, в биосенсорике с использованием аптамеров и флуоресцентных меток, а также в исследовании трехмерных кристаллических структур на основе блоков ЗНЧ-ДНК (Mirkin et al., 1996). Применение золотых наночастиц в биомедицинских приложениях обусловлено их уникальными химическими и физическими свойствами. В водных растворах цитрат-стабилизированные частицы коллоидного золота (КЗ) имеют отрицательный поверхностный заряд, что способствует физической адсорбции макромолекул за счет электростатических взаимодействий. Максимум поглощения на длине волны плазмонного резонанса около 520 нм определяет ярко-красный цвет золей КЗ. Длины волн максимумов поглощения и рассеяния индивидуальных частиц можно настраивать за счет изменения размера, формы и структуры частиц.

Образование комплексов ДНК-ЗНЧ часто сопровождается агрегацией частиц, что приводит к изменениям цвета раствора и значительным изменениям в спектрах экстинкции и рассеяния за счет оптического взаимодействия частиц в кластерах. Эти изменения могут быть зафиксированы визуально или методами спектроскопии (колориметрии). Фактически, эта простая физическая картина лежит в основе всех вариантов колориметрического метода изучения комплексов ЗНЧ-ДНК. Наряду с колориметрией, образование агрегатов ЗНЧ можно исследовать методом динамического рассеяния света (ДРС), основанного на измерении флуктуаций рассеянного света, обусловленных броуновским движением рассеивателей.

Большинство работ по использованию комплексов ЗНЧ-ДНК в биомедицинских исследованиях носят фундаментальный характер, и лишь немногие нашли применение в лабораторной или клинической практике. В литературе описаны следующие варианты колориметрического детектирования ДНК: использование частиц КЗ, функционализованных через тиольные производные одноцепочечных ДНК (оцДНК) (Mirkin et al., 1996, Sato et al., 2005, Baptista et al., 2006), и использование немодифицированных ЗНЧ (Li, Rothberg, 2004, Xia et al., 2010, He et al., 2008).

Использование функционализации ЗНЧ посредством тиольных производных оцДНК было предложено в работе (Mirkin et al., 1996) и реализовано в виде трехмерных самособирающихся ЗНЧ для чувствительной детекции ДНК-мишеней. Дальнейшее развитие этого подхода проходило с использованием систем с конъюгатами частиц КЗ одного типа, функционализованных через тиольные производные на 3' или 5' концах зондовых оцДНК в работах (Sato et al., 2005, Baptista et al., 2006, Song et al., 2010).

Использование немодифицированных частиц КЗ основано на исследовании авторов работы (Li, Rothberg, 2004), показавших, что при высокой ионной силе, оцДНК защищает немодифицированные частицы КЗ от агрегации в отличие от двухцепочечной ДНК (дцДНК). Совсем недавно, авторы работы (Xia et al., 2010) описали новый вариант этой стратегии, с использованием оцДНК зонда, немодифицированных частиц КЗ и положительно заряженного полиэлектролита для детектирования молекул ДНК, белков, низкомолекулярных веществ и неорганических ионов.

В описанных выше методах детекции ДНК-мишеней использовались цитратстабилизированные отрицательно заряженные частицы КЗ. В работе (He et al., 2008) описана новая версия использования немодифицированных частиц путем применения положительно заряженных золотых наностержней (ЗНС). Специфичность реакции подтверждалась отсутствием спектральных изменений при добавлении некомплементарных ДНК и зависимостью степени агрегации от точечных мутаций.

Согласно литературным данным, имеется большой разброс в оценках предела обнаружения ДНК от 0.1 нМ до 0.1 пМ.

Наряду с изменениями цвета (спектров поглощения и рассеяния света), агрегация ЗНЧ может быть зарегистрирована по изменению интенсивности свечения флуоресцентных меток, связанных с ДНК-зондом или находящихся в растворе (Zhang et al., 2011).

Хотя опубликованные работы показали определенные преимущества подхода с использованием немодифицированных ЗНЧ, несколько важных вопросов оставались нерешенными до начала исследований, описанных в данной работе. В частности, не было исследовано влияние формы наностержней на результаты колориметрии, и не был дан ответ на естественный вопрос: нельзя ли заменить положительно заряженные стержни более простыми (по синтезу) положительно заряженными сферическими золотыми наночастицами? Подобные частицы можно получить, например, из обычных цитратных частиц КЗ функционализацией молекулами цетилтриметиламмония бромида (ЦТАБ).

Таким образом, к моменту начала исследований, описанных в данной диссертации, имелся ряд нерешенных вопросов, связанных с проблемой использования ЗНЧ для детектирования молекул нуклеиновых кислот без модификации поверхности наночастиц и в минимальный промежуток времени. Этим определяется актуальность и научная значимость темы диссертации. Круг решаемых в данной работе задач включает разработку генодиагностических систем, основанных на изменении оптических свойств водных дисперсий комплексов ДНК-ЗНЧ, индуцированных реакцией гибридизации.

Исходя из вышесказанного, целью диссертационной работы было исследование взаимодействия ДНК с золотыми наночастицами в растворах методами спектроскопии и динамического рассеяния света на примере модельных систем олигонуклеотидов и положительно заряженных наночастиц коллоидного золота и золотых наностержней.

Для достижения поставленной цели в работе решались следующие задачи исследования:

• исследовать влияние размера, формы и поверхностного заряда золотых наночастиц на воспроизводимость колориметрического теста;

• разработать метод детектирования олигонуклеотидов с использованием комплексов положительно заряженных золотых наночастиц и ДНК, а также методов спектроскопии поглощения и динамического рассеяния света;

• получить калибровочные кривые для определения олигонуклеотидов методами спектроскопии поглощения и динамического рассеяния света и оценить возможность детектирования точечных мутаций методом динамического рассеяния света;

• определить значения «золотых чисел» для препаратов РНК, выделенных из зрелых зерен ячменя, и оценить их корреляцию с морозостойкостью сортов;

• сравнить чувствительность флуоресцентного метода определения ДНК-мишеней с колориметрическим тестом. Выяснить механизмы изменения интенсивности флуоресценции в системах ДНК+ЗНЧ+флуоресцентная метка.

Научная новизна полученных результатов заключается в следующем:

• впервые показано, что морфология золотых наностержней является критическим фактором для колориметрической детекции ДНК и что агрегация наностержней сопровождается изменениями спектров рассеяния, не описанными в литературе;

• разработан новый метод детектирования олигонуклеотидов, защищенный патентом РФ, основанный на использовании положительно заряженных ЦТАБ-покрытых наночастиц золота;

• показано, что концентрационные пределы детектирования ДНК с использованием спектроскопии поглощения и динамического рассеяния света составляют 100 и 10 пМ, соответственно.

Научно-практическая значимость работы определяется тем, что в ней получены новые экспериментальные данные о свойствах комплексов ДНК+ЗНЧ, которые могут быть использованы для разработки простых диагностических тест-систем колориметрического типа, в том числе и для анализа ПЦР-продуктов. Полученные в работе наностержни улучшенной сигарообразной формы используются в ИБФРМ РАН, Саратовском государственном университете им. Н.Г. Чернышевского, Институте проблем лазерных и информационных технологий РАН, Отделении перспективных лазерных технологий (ИПЛИТ РАН, г. Троицк). Получен патент РФ на способ колориметрического детектирования олигонуклеотидов с использованием катионных золотых наносфер.

Достоверность научных результатов подтверждается воспроизводимостью экспериментальных данных и их соответствием теоретическим расчетам, а также качественным и количественным согласием с результатами независимых исследований других авторов.

На защиту выносятся следующие основные положения и результаты:

• в отличие от золотых наностержней с морфологией «dog-bone», наностержни улучшенной сигарообразной формы имеют низкую коллоидную стабильность в гибридизационных условиях и не пригодны для реализации колориметрического метода детектирования ДНК;

• функционализованные молекулами ЦТАБ положительно заряженные наночастицы золота с диаметрами 15-25 нм показывают лучшую воспроизводимость колориметрического и ДРС тестов определения ДНК-мишеней по сравнению с золотыми наностержнями. Функционализация полиэтиленимином и полидиаллилдиметиламмоний хлоридом не дает положительных результатов;

• метод динамического рассеяния имеет большую чувствительность в определении ДНКмишеней по сравнению со спектроскопией поглощения. Соответствующие минимальные концентрационные пределы детектирования равны 10 пМ и 100 пМ при объеме пробы порядка 100 мкл. ДРС-тест с положительно заряженными частицами золота позволяет дифференцировать наличие одно- и трехбуквенных несоответствий в исследованных модельных молекулах ДНК-мишеней;

• тушение флуоресценции при ДНК-инициированной агрегации наночастиц золота обусловлено действием двух факторов: собственно тушением молекул флуорофора на частицах золота и эффектом внутреннего фильтра.

Личный вклад диссертанта и результаты, полученные совместно с другими исследователями:

Экспериментальные результаты получены лично автором в сотрудничестве с д.б.н.

В.А. Богатыревым, д.б.н. Л.А. Дыкманом, д.ф.-м.н. Б.Н. Хлебцовым, д.б.н. В.К.

Плотниковым, к.ф.-м.н. В.А. Ханадеевым. Общее планирование экспериментов, их обсуждение и подготовка результатов к публикации проводились совместно с д.ф.-м.н., проф. Н.Г. Хлебцовым и д.б.н. В.А. Богатыревым. На защиту вынесены только те положения и результаты, в получении которых роль автора была определяющей.

Работа выполнена в лаборатории нанобиотехнологии ИБФРМ РАН по планам НИР в рамках бюджетной темы: «Нанобиотехнология частиц с настраиваемым плазмонным резонансом: синтез, функционализация, оптические свойства, применения в биологии и медицине», № гос. регистрации 01200904392 (рук. д.ф.-м.н. профессор Хлебцов Н.Г.).

Государственные контракты и гранты: данная работа была частично поддержана грантами РФФИ (07-04-00301а, 07-04-00302а, 08-02-0399а, 09-02-00496а, 11-02-00128а);

программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине»; Правительства Российской Федерации для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих ученых в российских образовательных учреждениях высшего профессионального образования (научн. рук.

член.-корр. РАН Никитов С.А., научн. рук. направления от ИБФРМ РАН д.ф.-м.н.

профессор Хлебцов Н.Г.); госконтрактом № 02.513.11.3043 в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы», контрактом № 24.439.11.0/ИБФРМ в рамках ФЦП «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2013 гг.)» (рук. д.б.н. Дыкман Л.А.).

Апробация результатов:

Основные результаты диссертации представлялись автором на следующих научных конференциях:

• Saratov Fall Meeting – International School for Young Scientists and Students on Optics, Laser Physics & Biophysics, Saratov (Саратов, 2007-2011 два устных доклада и один стендовый доклад).

• Отчетная конференция по итогам завершенных тем НИР ИБФРМ РАН. (Саратов, 12-мая 2009, устный доклад).

• Всероссийская молодежная выставка-конкурс прикладных исследований, изобретений и инноваций. (Саратов, 27-28 октября 2009, стендовый доклад).

• 2-ой Международный форум по нанотехнологиям, (Москва, 6-8 окт. 2009, стендовый доклад).

• Всероссийский Форум «Селигер 2010» (Тверская область, 10-19 июля 2010, инновационный проект).

• V Всероссийская конференция молодых ученых “Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой” (Саратов, 28 сент. – 1 окт. 2010, устный доклад).

• Конкурс молодежных инновационных проектов на получение национальной премии в области инноваций – Зворыкинская премия (Саратов, 13 окт. 2010, устный доклад).

• Открытый урок по нанотехнологиям в биологии в Гимназии №87 (Саратов, 10 дек. 2010, устный доклад).

• Workshop of Local Cluster Saratov (Рабочее совещание в рамках Европейского проекта Photonics4Life FP-7, Саратов, 11 марта 2011, стендовый доклад).

• Семинар с представлением устного доклада Bio-Medical Micro/Nano Fluidic Device Lab (Gwangju Institute of Science and Technology, Gwangju, Republic of Korea, 22 ноября 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 работ, в том числе три статьи в рецензируемых журналах и патент РФ.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, основной части, содержащей 4 главы, заключения и списка использованных литературных источников (129 наименований). Работа изложена на 121 странице, иллюстрирована 33 рисунками и включает 5 таблиц.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во Введении обоснована актуальность темы работы и её научно-практическое значение, представлены объекты и методы исследования.

В Главе 1 приведен аналитический обзор литературы по теме диссертации.

Рассмотрены основные способы детектирования молекул нуклеиновых кислот с использованием комплексов плазмонно-резонансных наночастиц с молекулами ДНК.

Обсуждаются основные принципы построения диагностических тест-систем на основе агрегационных свойств золотых наночастиц, исследуемых с помощью спектроскопии экстинкции, рассеяния, метода ДРС, а также флуоресцентного анализа. Подробно рассмотрены варианты колориметрического детектирования олигонуклеотидов с использованием частиц КЗ и ЗНС.

Сведения об использованных материалах и методах изложены в Главе 2. В ней перечислены реактивы, оборудование, буферные растворы; а также модели олигонуклеотидов, использованных в работе.

Модель 1: 21-мерная оцДНК, гомологичная участку генома вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1, U5 длинный терминальный повтор LTR) (Литех, Россия).

Зондовая молекула:

5'-ATGTGGAAAATCTCTAGCAGT-3' (P1);

Молекулы-мишени:

5'-ACTGCTAGAGATTTTCCACAT-3' (комплементарная мишень, кДНК, T1);

5'-ACTGCTAGATATTTTCCACAT-3' (однобуквенное несоответствие кДНК, М11);

5'-ACTTCTAGATATTTTTCACAT-3' (трехбуквенное несоответствие кДНК, М13);

В качестве некомплементарной ДНК была взята последовательность зондовой молекулы (P1).

Модель 2: 23-мерная оцДНК генов защитного белка и защитного прекурсора антигена (pagA) Bacillus anthracis (Синтол, Россия).

Зондовая молекула:

5'-TCCTGCAGATACACTCCCACCAA-3' (P2);

Молекулы-мишени:

5'-TTGGTGGGAGTGTATCTGCAGGA-3' (комплементарная мишень T2);

5'-TTGGTTGGAGTGTATCTGCAGGA-3' (однобуквенное несоответствие кДНК, М21);

5'-TTGGTTGGAGTTTATCTGCATGA-3' (трехбуквенное несоответствие кДНК, М23);

В качестве некомплементарной ДНК была взята последовательность зондовой молекулы (P2).

В заключительной части главы 2 приведены методики получения коллоидных растворов отрицательно и положительно заряженных частиц КЗ и ЗНС. Описаны отдельные этапы оптимизации колориметрического теста с положительно заряженными частицами КЗ и ЗНС.

В Главе 3 дана сравнительная оценка использованию комплексов немодифицированных положительно заряженных частиц КЗ и ЗНС с олигонуклеотидами для колориметрического детектирования ДНК-мишеней (колориметрического теста).

3.1. Колориметрический тест с золотыми наностержнями 3.1.1. Синтез и характеристика золотых наностержней улучшенной сигарообразной формы Известные методы синтеза ЗНС включают две стадии: синтез золотых наночастиц размером 2-4 нм (зародышей) и последующее восстановление HAuCl4 аскорбиновой кислотой в присутствии зародышей, ЦТАБ и следовых количеств ионов серебра. При этом одностадийное добавление восстановителя не позволяет контролировать процесс вторичного роста и обычно приводит к формированию наностержней с заметной полидисперсностью по длине и толщине. Кроме того, одностадийное добавление восстановителя часто приводит к росту частиц нецилиндрической формы, называемых в литературе «dog-bone». Подобные частицы были использованы в пионерской работе (He et al., 2008) для колориметрического детектирования комплементарных мишеней оцДНК и детектирования молекул-мишеней, содержащих однобуквенные и трехбуквенные несоответствия. При экспериментальном воспроизведении метода (He et al., 2008), мы столкнулись с плохой воспроизводимостью результатов, поэтому мы решили использовать новый вариант синтеза наностержней, впервые описанный в работе (Ratto et al., 2010). На рис. 1 приведена общая схема синтеза наностержней и пример трансмиссионного электронно-микроскопического (ТЭМ) изображения ЗНС улучшенной формы, а также ТЭМ изображение частиц, получаемых при одностадийном добавлении восстановителя. Таким образом, дробное добавление восстановителя позволило получить частицы, отличающиеся высокой степенью мономорфности и монодисперсности по размерам. Однако неожиданным результатом дальнейших исследований оказалось то, что данные частицы показали довольно низкую коллоидную стабильность в реальных условиях гибридизационного буфера (см. ниже). Поэтому параллельно с синтезом и исследованием ДНК колориметрии с такими частицами, мы провели исследования с частицами типа «dog-bone» с различными осевыми отношениями.

Рис. 1. (а) Схема синтеза наностержней методом двухстадийного добавления восстановителя. 1 – ростовой раствор, 2 – первичное восстановление аскорбиновой кислотой, 3 – добавление зародышевого раствора, 4 – рост наностержней в течение 24 ч, 5 – дробное добавление восстановителя, 6 – однократное добавление восстановителя, 7 и 8 – готовые препараты ЗНС. (б) Пример ТЭМ изображения ЗНС улучшенной формы. (в) ЗНС с морфологией типа «dog-bone». Стрелками показаны отклонения от модели цилиндров с полусферическими концами.

Основными методами характеристики ЗНЧ являются электронная микроскопия и спектры поглощения, имеющие четкий резонанс на длине волны, зависящей от осевого отношения частиц. При этом для цилиндрических частиц с округленными концами обычно экспериментальные спектры согласуются с расчетными. Однако для частиц с морфологией «dog-bone» измеренные спектры (рис. 2) плохо согласуются с теоретическими расчетами, в которых используется модель сигар.

Рис. 2. Измеренный спектр частиц ЗНС-730 (точки) в сравнении с расчетными спектрами для модели сигар (1) и модели, предложенной в [3] (2). Справа показано распределение частиц по длинам и толщинам, полученное на основе обработки ТЭМ изображений 650 частиц. Этот ансамбль включает, в основном, ЗНС (показаны на вставке вверху) и побочные частицы (на вставке внизу). Теоретический расчет был выполнен в [3] с учетом всех частиц ансамбля и с усреднением по их ориентациям.

Для моделирования спектров таких частиц сложной формы, в лаборатории нанобиотехнологии ИБФРМ РАН был разработан эффективный метод, который описан и экспериментально проверен в работе [3]. В табл. 1 приведены геометрические параметры синтезированных нами трех образцов, а на рис. 2 точками показано распределение длин и средних толщин в ансамбле из 650 наностержней ЗНС-730 вместе с побочными частицами, не имеющими формы стержней. Как видно из рис. 2, расчеты для модели цилиндрических сигарообразных частиц не согласуются с измерениями реальных частиц сложной формы, а предложенная новая модель [3] хорошо описывает данные эксперимента. Аналогичные результаты были получены для всех трех образцов ЗНС [3].

Таблица 1. Геометрические параметры образцов ЗНС и побочных частиц (ПЧ).

Длина Диаметр Длина ПЧ, Диаметр ПЧ, Числовая доля ЗНС, Образец стержня, стержня, (нм) (нм) (%) (нм) (нм) ЗНС-730 60.2±7.8 25.1±2.0 40.0±8.5 35.7±8.5 ЗНС-830 43.2±8.2 10.6±2.2 24.0±8.4 21.4±7.6 ЗНС-970 60.8±8.6 11.0±1.2 24.0±3.9 20.0±3.97 3.1.2. Оптимизация колориметрического теста с наностержнями Для оптимизации колориметрического теста с наностержнями, было исследовано влияние формы частиц, их коллоидной стабильности в гибридизационном буфере, концентрации ЦТАБ, концентрации NaCl в гибридизационном буфере и концентрации зондовых молекул.

На верхней панели рис. 3a показаны ТЭМ изображения гантелеобразных наностержней ЗНС-750, состоящих на 89% по числу частиц из стержней со средней длиной Lav = 42 ± нм и средним диаметром dav =12.3 ±1.5 нм. На ТЭМ изображениях также показаны побочные частицы других форм (около 11%) со средними большими и малыми осями в и 30 нм, соответственно. На нижней панели показаны ТЭМ изображения частиц ЗНС-7 с морфологией «dog-bone», состоящие из стержней (85%) со средней длиной Lav = 60 ± нм и средним диаметром dav = 25 ± 2 нм. Статистический анализ ТЭМ изображений сигарообразных частиц ЗНС-690 (рис. 3б), дал только 5% побочных частиц и 95% ЗНС со средней длиной Lav = 70 ± 4 нм и средним диаметром dav = 30 ± 2 нм.

Продольные плазмонные резонансы экстинкции (рис. 3в,г) локализованы около 690 и 740 нм для образцов ЗНС-690 и ЗНС-740, соответственно. По сравнению со спектром экстинкции образца ЗНС-690, спектр образца ЗНС-740 значительно уширяется из-за полидисперсности размера и формы частиц. Следует отметить, что результаты колориметрических измерений для образцов ЗНС-740 и ЗНС-750 были достаточно похожи; поэтому мы приводим далее данные для образца ЗНС-740.

Чтобы обеспечить подходящие условия для гибридизации ДНК, выполнимость колориметрического теста должна быть проверена сравнением спектров экстинкции или рассеяния ЗНС до и после добавления комплементарных мишеней (кДНК) в присутствие 170 мМ NaCl (Ma et al., 2010). Поэтому, сначала была проверена коллоидная стабильность ЗНС в растворах NaCl с концентрациями от 0.1 M до 1 M (рис. 3в,г) при постоянной концентрации ЦТАБ. В работе (Ma et al., 2010) указано, что электростатическое взаимодействие между положительно заряженной свободной мицеллой ЦТАБ в растворе и Рис. 3. ТЭМ изображения отрицательно заряженной ДНК-мишенью должно гантелеобразных ЗНС-750 (а, сверху), быть исключено для успешного стержней с морфологией «dog-bone» колориметрического детектирования ЗНС-740 (а, снизу) и сигарообразных комплементарной ДНК-мишени ЦТАБ-покрытыми стержней ЗНС-690 (б). На панелях (в) и частицами. В связи с этим, необходимо было (г) показаны соответствующие спектры экстинкции частиц ЗНС-740 и ЗНС- провести предварительные эксперименты по 690, измеренные при различных определению оптимальной концентрации ЦТАБ. В концентрациях NaCl (от 0 до 1 M).

результате была найдена оптимальная концентрация ЦТАБ равная 1 мМ, что согласуется с данными (Ma et al., 2010). Другим важным условием выполнимости колориметрического теста является минимальная концентрация зондовой оцДНК, используемой для обнаружения кДНК-мишени в области предела детекции. На основе специально проведенных экспериментов, для детекции гибридизации была выбрана концентрация зондовой оцДНК 15 нМ, которая близка к концентрациям, используемым в работах (He et al., 2008, Ma et al., 2010).

Хотя образец ЗНС-690 состоял, в основном, из идеальных сигарообразных частиц с минимальным количеством побочных частиц, была обнаружена достаточно неожиданная низкая коллоидная стабильность и типичное для агрегации поведение даже при концентрации NaCl ниже 0.1 M (рис. 3г). Напротив, раствор наностержней ЗНС-740 с морфологией «dog-bone» показал отличную стабильность при высокой 1 M концентрации NaCl (рис. 3в). Такое различие между указанными образцами несколько неожиданно, так как осевые отношения наностержней ЗНС-690 и ЗНС-740 очень близки (2.33 и 2.4, соответственно). По-видимому, осевое отношение не является определяющим фактором в данном случае. Точный механизм, отвечающий за такую низкую коллоидную стабильность образца ЗНС-690, неизвестен. В работе [3] было высказано предположение, что механизм снижения стабильности может быть связан с морфологией частиц и слабым расклинивающим давлением в случае агрегации стержней бок о бок. Другой причиной может быть различная структура бислоя ЦТАБ для сигарообразных стержней и частиц с морфологией «dog-bone». С практической точки зрения, этот экспериментальный результат фактически исключает применение ЗНС-690 для колориметрической детекции кДНК-мишени. Поэтому, только частицы ЗНС-740 тестировали в качестве платформы для колориметрической детекции ДНК.

3.1.3. Результаты колориметрического теста с ЗНС На рис. 4a показана фотография пробирки с раствором наностержней ЗНС-740 в смеси гибридизационного буфера (вода + Tris-HCl + NaCl) и зондовой оцДНК P1 (HIV-1 LTR U5) (1), пробирки с почти бесцветным раствором после добавления комплементарной кДНК (2) и раствором с некомплементарной ДНК (3), который имеет тот же цвет, что и первый образец.

Сильное изменение цвета раствора после добавления кДНК-мишени связано с агрегацией частиц (рис. 4б), которая может быть зарегистрирована измерением спектров экстинкции (рис. 4в), спектров дифференциального рассеяния света (рис. 5а) и по данным динамического рассеяния света (рис. 6). После добавления кДНК-мишени к смеси ЗНС и зондовой оцДНК, продольный плазмонный пик уменьшается в амплитуде, уширяется и слегка сдвигается в красную область. С другой стороны, пик экстинкции на 530 нм показывает незначительные изменения кроме слабого возрастания величины максимума для кривой, соответствующей 5-нМ кДНК-мишени. Отметим, что полученные нами спектры экстинкции похожи на спектры, рассмотренные в работе (He et al., 2008) (уширение и сдвиг в красную область главного пика экстинкции) и слегка отличаются от спектральных изменений, описанных в работе (He et al., 2008) (уширение и синий сдвиг главного пика экстинкции). Однако все эти наблюдения могут быть объяснены агрегацией частиц с возможной преобладающей бок о бок кластеризацией ЗНС, наличие которой подтверждается ТЭМ изображениями (рис.

4б). Отметим, что спектр экстинкции Рис. 4. (а) Фотографии смеси ЗНС-740 в смеси ЗНС в буферном растворе не гибридизационном буфере с зондовой оцДНК Pизменяется после добавления раствора (1), после добавления комплементарной (2, T1) и зондовой оцДНК, хотя распределение некомплементарной (3, T2 ) ДНК-мишеней. (б) частиц по размерам, измеренное ДРС, ТЭМ изображения агрегатов ЗНС в обнаруживает слабую агрегацию (рис. 6).

гибридизационном буфере после добавления 1 нМ Это может быть объяснено различными кДНК-мишени. (в) Спектры экстинкции ЗНС-7чувствительностями поглощения и после добавления зондовой оцДНК P1 (1), и рассеяния света на агрегацию частиц (He et кДНК-мишени T1 с концентрациями 0.1, 1, 10 пМ, al., 2008). Точный механизм агрегации 0.1, 0.5, 1, 5 нМ (кривые 2-8, соответственно). На ЗНС, вызванной гибридизацией ДНКвставке показан увеличенный фрагмент спектра мишени и зонда, до сих пор неизвестен.

экстинкции в области максимума. (г): Изменение максимума экстинкции A = (Aprobe - Atarget ) / Atarget Имеются, по крайней мере, два предположения (He et al., 2008).

как функция концентрации кДНК.

Согласно первому, зондовая оцДНК и кДНКмишени адсорбированы на разных ЗНС. Таким образом, гибридизация ДНК между соответствующими частицами может быть движущей силой для агрегации ЗНС – механизм, похожий на агрегацию по типу перекрестных сшивок конъюгатов ЗНЧ с тиолмодифицированными олигонуклеотидами (Mirkin et al., 1996). Однако маловероятно, что такой механизм имеет место в нашем случае агрегации ЗНС, так как она не термообратима и её скорость возрастает с возрастанием температуры. Другой возможный механизм основан на том, что электростатическая адсорбция отрицательно заряженных фосфатных остовов зондовых оцДНК на положительно заряженных ЗНС сначала Рис. 5. (а): Спектр дифференциального рассеяния света ЗНС-750 в завершается формированием комплексов оцДНКгибридизационном буфере ЦТАБ-ЗНС (He et al., 2008). Так как плотность (пунктирная кривая), после добавления заряда дуплексов дцДНК намного больше, чем у зондовой оцДНК HIV-1 (1) и кДНКоцДНК (He et al., 2008), гибридизация ДНК мишени с концентрациями 7.5 и 15 нМ приводит к формированию дцДНК, которая (кривые 2 и 3, соответственно); (б) действует как «клей» на соседние частицы ЗНС и спектр рассеяния света, полученный на однолучевом спектрофлуориметре, вызывает их агрегацию.

раствора ЗНС в гибридизационном Кроме спектров экстинкции, были измерены буфере + зондовая оцДНК HIV-1 (16.также спектры дифференциального рассеяния для нМ, кривая 1) и после добавления системы, показанной на рис. 4. Агрегация ЗНС кДНК-мишени T1 с концентрациями после добавления кДНК-мишени вызывает 6.67 (2) и 11.67 нМ (3). Адаптировано уменьшение главного резонанса рассеяния, красный из работы (He et al., 2008).

сдвиг и уширение (рис. 5а, кривые 2 и 3). Кроме того, появляется дополнительный спектральный пик около 550 нм, ранее зарегистрированный в работе (He et al., 2008). Интересно сравнить относительные изменения в значениях пика рассеяния на 550 нм, нормированного на концентрацию кДНК-мишени (нМ) I = (Itarget - I ) /(Itarget [cDNA]). Для скорректированного нами probe спектра (рис. 5а) и [кДНК]=7.5 нМ, мы получили I = 0.09, в хорошем согласии с аналогичным значением I = 0.088, найденным из нескорректированного спектра рис. 5б при [кДНК]=6.7 нМ. Как показано на рис. 5а, агрегация ЗНС может быть также охарактеризована по измерениям в красной области, например на длине волны 850 нм, где параметр чувствительности I = 0.082 близок к параметру при 550 нм. В принципе, метод ДРС также применим для чувствительного детектирования агрегации наночастиц, возникающей при гибридизации зондов и мишеней (рис. 6). Например, по данным колориметрии и ДРС добавление 15 нМ кДНК приводит к значительным изменениям в цвете суспензии и сильной агрегации сразу после добавления кДНК-мишени. Однако, для несферических наночастиц, таких как ЗНС, вращательная диффузия отдельных частиц может влиять на результаты измерений ДРС. Это связано с тем, что модель, лежащая в основе обработки данных ДРС, применима только для разбавленной суспензии невзаимодействующих сфер.

Хотя эксперименты подтвердили применимость колориметрической детекции ДНК с использованием немодифицированных золотых наностержней (He et al., 2008), мы встретились с трудностями в практической реализации.

Например, колориметрический тест не работал не только с идеальными сигарообразными ЗНС, но и с ЗНС, полученных путем метода быстрого доращивания (Ratto et al., 2010) (с ЦТАБ Рис. 6. Функции распределения по производителей Fluka и Sigma). Более того, хотя размерам наностержней ЗНС-750 в смеси с гибридизационным буфером (1) и колориметрический тест срабатывал с ЗНС, зондовой оцДНК P1 (2), и после синтезированными по зародышевому методу с ЦТАБ от Fluka, тот же тест мог не работать с добавления раствора кДНК-мишени T1 с ЦТАБ от Sigma. Поэтому нами, был разработан концентрацией 15 нМ (3). ДРС новый подход, основанный на положительно измерения проведены на приборе PhotoCor FC-2 при угле рассеяния 90o.

заряженных коллоидных золотых наносферах.

3.2. Колориметрический тест с положительно заряженными частицами КЗ В патенте [4] мы предложили новую версию метода (He et al., 2008), применяя ЦТАБпокрытые положительно заряженные частицы КЗ для детектирования ДНК-мишеней методами спектроскопии поглощения и ДРС. Положительно заряженные 16-, 25-, и 30-нм частицы КЗ (КЗ-16, КЗ-25, КЗ-30) были получены функционализацией синтезированных отрицательно заряженных частиц (цитратное восстановление HAuCl4) молекулами ЦТАБ.

После функционализации молекулами ЦТАБ, значение и знак дзета-потенциала ( ) изменились от -(30-40) мВ до +(25-45) мВ. Добавление гибридизационного буфера и зондовой оцДНК снизило до +(8-17) мВ. Средний диаметр частиц КЗ-16 и относительная ширина на половине максимума по ТЭМ изображениям, составили 15.8 ±1.4 нм и 14%, соответственно. Аналогичным образом были охарактеризованы образцы КЗ-25 и КЗ-30 по ТЭМ, ДРС и калибровке спектроскопии поглощения.

Перед изучением ДНК-содержащих растворов частиц КЗ, были проведены тесты по оптимизации, аналогичные таковым для ЗНС. В частности, мы обнаружили, что те же самые финальные концентрации NaCl (170 мМ), ЦТАБ (1 мМ) и зондовой оцДНК (15 нМ) были почти оптимальными для детекции кДНК. Наряду с ЦТАБ, мы также проверили полиэтиленимин (ПЭИ) и полидиаллилдиметиламмоний хлорид (ПДДА) в качестве возможных модифицирующих агентов, придающих частицам положительный заряд.

Однако частицы КЗ-ПЭИ были нестабильны в солевых гибридизационных условиях, в то время как частицы КЗ-ПДДА показали высокую коллоидную стабильность одновременно в растворах зондовой оцДНК и кДНК-мишени. Поэтому оба этих модификатора оказались непригодны, и далее мы будем рассматривать только ЦТАБ-покрытые частицы КЗ.

Следующим параметром оптимизации является размер частиц КЗ. С общей точки зрения, удельная поверхность и коллоидная стабильность ЗНЧ уменьшается с увеличением их размера. Следовательно, мы можем ожидать увеличение чувствительности детекции для более крупных частиц. Однако эксперименты показали, что верхний предел размера частиц, пригодных для колориметрического или ДРС детектирования, равен примерно 30 нм. В данной работе мы использовали препараты частиц КЗ-16, КЗ-25 и КЗ-30.

На рис. 7a показаны изменения цвета коллоида ЦТАБ-покрытых частиц КЗ-16 до (1) и после (2) добавления кДНК-мишени T1, а также негативный контроль с некомплементарной ДНК T2 (3). Подобно случаю с ЗНС, изменение цвета раствора и агрегация могут быть количественно охарактеризованы по спектру экстинкции (рис. 7б) и ДРС (рис. 8). Имея в виду сравнимую чувствительность методов поглощения и статического рассеяния света (рис. 4 и 5) и слабую интенсивность рассеяния частиц КЗ-16, мы не измеряли спектры статического рассеяния света для Рис. 7. (а) Фотография пробирки с раствором препаратов частиц КЗ.

ЦТАБ-покрытых частиц КЗ-16 в смеси Спектры экстинкции (рис. 7) вместе с гибридизационного буфера и зондовой оцДНК данными ДРС (рис. 8) ясно указывают на P1 (1), после добавления кДНК-мишени T1 (2).

агрегацию частиц КЗ после добавления Пробирка 3 показывает негативный контроль с кДНК к растворам, содержащим ЦТАБT2 (3). (б) Спектры экстинкции ЦТАБпокрытые частицы КЗ и зондовую оцДНК.

покрытых частиц КЗ-16 в смеси с Механизм может быть сходным с таковым гибридизационным буфером и зондовой для ЗНС (рис. 8). Фосфатные группы оцДНК P1 после добавления кДНК-мишени цвиттерионных молекул оцДНК могут (T1 ) с концентрациями 0 (1), 0.01 (2), 0.1 (3), взаимодействовать с четвертичными (4) и 10 нМ (5). (в) Относительные изменения аминами ЦТАБ без потери стабильности экстинкции A550 / A550, найденные из ЗНЧ. Добавление комплементарной (+кДНК) спектров 2-5.

мишени приводит к формированию дуплексов дцДНК, которые являютя полианионами и могут действовать как «клей» (He et al., 2008) для агрегации катионных частиц. Заметим, что эта агрегационная модель существенно отличается от модели (Li, Rothberg, 2004), основанной на различных электростатических свойствах оцДНК и дцДНК олигонуклеотидов и на их различной способности адсорбироваться на золотых наночастицах.

Рис. 8. Схематическое представление колориметрического и ДРС метода при добавлении комплементарных кДНК и некомплементарных ДНК с использованием ЦТАБ-покрытых положительно заряженных частиц КЗ.

Как и в случае ЗНС, агрегация положительно заряженных наносфер может быть отслежена по спектрам поглощения и спектроскопии дифференциального рассеяния света или по измерениям распределения частиц по размерам методом ДРС. В случае некомплементарной ДНК, агрегации не происходит. Подчеркнем, что агрегация не термообратима и её механизм отличается от термообратимого механизма перекрестных сшивок, описанного в работе (Mirkin et al., 1996). Экстинкция малых агрегатов частиц КЗ в основном определяется суммой поглощений отдельных частиц, а не их рассеянием или рассеянием агрегата в целом. Поэтому спектры экстинкции показывают слабую Рис. 9. Концентрационная зависимость чувствительность детекции при концентрации среднего диаметра по ДРС, нормированная на мишени 0.1-1 нМ. С другой стороны, ДРС средний диаметр ЦТАБ-покрытых частиц КЗраспределения интенсивности по размерам 16 в смеси гибридизационного буфера и сильно зависят от рассеяния фракции частиц зондовой оцДНК P1. На вставке показаны большого размера. Поэтому, можно ожидать распределения интенсивности по размерам ЦТАБ-покрытых частиц КЗ-25 в смеси повышения чувствительности, применяя гибридизационного буфера и зондовой метод ДРС для систем, показанных на рис. 7.

оцДНК P1 после добавления кДНК-мишени Распределения интенсивности по размерам на рис. 9 (вставка) показывают уширение и сдвиг HIV-1 U5 (T1 ) с концентрациями 0 (1), 1 (2), в область частиц большего размера 10 (3), 100 (4), и 1000 пМ (5).

распределений при 10-100 пМ кДНК.

3.3. Чувствительность и специфичность колориметрического и ДРС тестов Имеются сильные расхождения в оценках чувствительности детекции по нашим данным и данным работы (He et al., 2008) (10-100 пМ) с одной стороны и данным работы (Ma et al., 2010) (0.1 пМ) с другой. Так как оптимизированная низкая концентрация ЦТАБ была ключевой для чувствительного определения ДНК в методе (Ma et al., 2010), мы использовали те же оптимальные условия в обеих версиях с золотыми наностержнями и наносферами. В частности, в работе (Ma et al., 2010) показано тысячекратное увеличение предела детекции до 100 пМ, когда концентрация ЦТАБ составляла 5 мМ вместо оптимального значения 1 мМ. Чтобы исключить возможное влияние особенностей ЦТАБ (производитель, примеси и т.п.) мы протестировали ЦТАБ двух производителей (Fluka и Sigma-Aldrich) и не обнаружили отличий в результатах по регистрации спектров экстинкции. Другая возможная причина возникших противоречий может быть связана с разницей длины пар оснований (21-23-мерные в наших экспериментах и 30-мерные в работе (Ma et al., 2010)). Однако, вряд ли такая разница в моделях ДНК может привести к различию в пределах детекции на два-три порядка.

Рассмотрим модели агрегации вместе с количественным соотношением между числом частиц ЗНС, КЗ и молекулами кДНК при концентрации 1 нМ в реакционной смеси.

Средний диаметр частиц КЗ составлял 16 нм, а средняя длина и средняя толщина частиц ЗНС были 42 нм и 13 нм, соответственно. Концентрация золота свежеприготовленных растворов была эквивалентна 57 мкг/мл для частиц КЗ и 95 мкг/мл для ЗНС. Полагая, что частицы КЗ имели сферическую форму и ЗНС – сигарообразную, масса одной частицы составляет MS = 0.410-16 г и MR = 0.8310-16 г для частицы КЗ и ЗНС, соответственно. С учетом данных выше концентраций золота, числовая концентрация частиц КЗ и ЗНС составляет NS =1.41012 NR =1.11012 частиц/мл, соответственно, а финальная концентрация наночастиц в реакционной смеси составляет NS = 0.47 1012 и NR = 0.37 1012 частиц/мл, соответственно. Для концентрации кДНК 1 нМ в реакционной смеси, число молекул ДНК в 1 мл составляет NDNA = 0.61012 мл-1. Таким образом, отношение числа молекул ДНК к числу частиц в 1 мл составляет R = NDNA / NS =1.3 для частиц КЗ и R = NDNA / NR = 1.6 для частиц ЗНС.

Соответственно, экспериментальный предел 10 пМ, означает, что только 3% всех стержней могут быть связаны всеми молекулами кДНК, исходя из того, что каждая молекула кДНК может образовать дуплексы наночастиц. Для больших агрегатов, общий процент агрегации будет ниже. В терминах вышеупомянутой модели «клея» кДНК, столь малое соотношение R может образовать лишь малый процент агрегатов от всех частиц и, соответственно, крайне малые оптические эффекты. Если же мы рассмотрим описанный в (Ma et al., 2010) 0.1 пМ предел детектирования кДНК, то получим соотношение R около 0.0002, которое означает, что все молекулы кДНК в реакционной смеси могут связать лишь 0.04% всех наностержней для образования дуплексов частиц. Для полидисперсных агрегатов с соотношением «одна молекула/две частицы», общий процент агрегированных частиц будет меньше, чем 0.04%. Однако из рисунка 3 работы (Ma et al., 2010) (UV-vis спектры абсорбции комплексов ЗНС-ДНК при различных концентрациях кДНК) и концентрации кДНК 0.1 пМ, можно обнаружить абсолютное изменение экстинкции около 0.02 или 4% от максимума. Если мы исключим все дуплексы из суспензии, ее экстинкция снизится на 0.04 %, что на два порядка меньше чем 4%.Таким образом, существующие модели (He et al., 2008, Ma et al., 2010) не могут объяснить предел детекции 0.1 пМ.

Для возможности определения точечных мутаций, важно протестировать, может ли система ДНК детекции различить молекулы ДНК-мишеней с одним и более неспаренными основаниями. В связи с этим, мы сравнили изменения экстинкции и ДРС, полученные из измерений для комплементарной мишени кДНК T1 и мишеней ДНК, содержащих одно- и трехбуквенные несоответствия, M11 и M13, соответствующим модели HIV-1 U5 (рис. 10а). Аналогичные эксперименты были проведены для мишеней Tи M21, M23, соответствующих модели ДНК Bacillus anthracis (рис. 10б). Для обеих серий экспериментов мы использовали ЦТАБРис. 10. Нормированные z-средние покрытые частицы КЗ-25 при постоянной диаметры dz / dz (Ti) (i = 1, 2) ЦТАБконцентрации зондовой оцДНК 15 нМ и покрытых частиц КЗ-25 в смеси с концентрации кДНК 1 нМ.

гибридизационным буфером и 15 нМ Для сравнения данных ДРС для различных зондовой оцДНК P1 HIV-1 U5 (а) и P2 B.

мишеней, мы нормировали z-средние диаметры anthracis (б) после добавления кДНК на диаметр, соответствующий измерениям мишени T1 (а) и T2 (б), мишеней M11 (а), смеси, содержащей кДНК-мишень Ti. Такая M21 (б), M13 (а) и M23 (б) при постоянной процедура минимизировала ошибки в концентрации 1 нМ.

абсолютных значениях средних размеров, которые типичны для независимых измерений ДРС. Более того, наш метод оказался удобной количественной характеристикой для сравнения с точечными мутациями. Как следует из рис. 10, нормированные средние размеры по ДРС убывают для мишеней, содержащих одно- и трехбуквенные несоответствия, в сравнении с размерами агрегатов в случае полностью комплементарной мишени. Более того, измерения смеси зондовой оцДНК и некомплементарных ДНК не выявило агрегацию, а полученные данные экстинкции и ДРС оказались схожими с таковыми для оцДНК. Полученные изменения в размерах агрегатов по ДРС как функция несоответствий оснований согласуется с механизмом агрегации, предложенным в работе (He et al., 2008). Введение несоответствий оснований приводит к неполной гибридизации и, соответственно, к возрастанию отталкивающих сил и уменьшению среднего размера агрегатов.

В Главе 4 описано применение цитратных частиц КЗ для исследования корреляции «золотого числа» РНК из зрелого зерна злаковых и бобовых растений с морозостойкостью сорта и для детектирования олигонуклеотидов флуоресцентным методом.

4.1. Исследование корреляции значения «золотого числа» долгоживущей РНК из зрелого зерна злаковых и бобовых растений с морозостойкостью сорта Известны некоторые молекулярно-биологические особенности молекул РНК, определяющие морозостойкость сорта. К ним относятся варьирующая длина поли-А мРНК, соотношение фракций 18S и 25S рРНК в клетке, соотношение содержания сайтспецифических и диффузных катионов магния в рРНК (Плотников, 2003). В предварительных экспериментах [15] было обнаружено феноменологическое различие значений «золотого числа» (минимального количества полимера, необходимого для защиты коллоидного золота против солевой агрегации) для РНК, выделенной из зрелого зерна разных сортов ячменя, гороха и пшеницы. Было показано, что значения «золотого числа» различаются в 2-4 раза для контрастных по морозостойкости сортов. Целью данного раздела было более детальное исследование корреляции значения «золотого числа» РНК с данными селекции на примере 11 контрастных по морозостойкости сортов ячменя. Экспериментальные условия выращивания растений были таковы, что зерно сравниваемых сортов было одного года репродукции и получено с одного поля (одинаковый агрофон).

Результаты определения значения «золотого числа» были плохо воспроизводимы, что мешало определить его абсолютное значение. Были проведены дополнительные эксперименты по более точному определению «золотого числа» путем титрования РНК с 10%-ным шагом. Для каждого препарата были зафиксированы значения «золотого числа», определенные как визуально, так и спектрофотометрически. Эти данные также подтвердили разброс значений для разных сортов и для экспериментов, проведенных в разные дни. Возможно, это связано с нестабильностью препаратов РНК, поскольку с течением времени РНК имеет тенденцию к распаду и деградации.

В табл. 2 приведены результаты визуального определения значения «золотого числа» для РНК зрелого зерна приведенных выше сортов растений, в сопоставлении с данными селекционеров по морозостойкости сорта. В последнем столбце приведены средние значения по группам более и менее морозостойких сортов. Из таблицы видно, что прямой корреляции между морозостойкостью сортов и значением «золотого числа» для РНК не наблюдается. Нестабильность препаратов РНК усложняет работу с ними, поскольку результаты определения золотого числа могут зависеть не только от морозостойкости сорта, но и от кинетики деградации материала в процессе хранения и самого эксперимента. Возможно, важными параметрами являются температурный режим хранения РНК (т.к. он влияет на её магний-зависимый распад), соотношение связанных или диффузных катионов магния, pH реакционной среды и др. Таким образом, более детальное исследование предварительных данных [15] показало, что вопрос о корреляции «золотого числа» и морозостойкости остается открытым и требует дальнейшего исследования.

Таблица 2. Сопоставление данных по морозостойкости со значениями «золотого числа» для РНК сортов ячменя (КНИИСХ).

Степень Золотое Среднее по Сорт морозостойкости* число, мкг 1-6 и 7-1 NB 1.2 Самсон 0.3 Бастион 2.1.5±0.4 Ларец 2.5 Траминер 1.6 Андрюша 1.7 Спринтер 0.8 Секрет 2.9 Абориген 0.1.4±0.Достойный 10 2.Vanesse 11 0.*- степень морозостойкости указана от наибольшей величины к наименьшей 4. 2. Исследование возможности детектирования олигонуклеотидов на основе взаимодействия частиц КЗ с флуоресцентным красителем родамином В Недавно был предложен новый метод чувствительного количественного детектирования ДНК с использованием частиц КЗ и родамина В (RB) без процедуры мечения (Zhang et al., 2011). В данном методе фактически реализуется та же схема определения ДНК-мишеней за счет дестабилизации коллоида при реакции гибридизации, что и описанная выше схема в колориметрическом тесте. Однако в отличие от колориметрического теста, реакция гибридизации отслеживается по возобновлению флуоресценции, которая была полностью потушена в системе без мишеней. Возможные механизмы, лежащие в основе флуоресцентного метода детектирования ДНК, состоят в следующем. Родамин В имеет максимум возбуждения на длине волны 520 нм, и при взаимодействии с частицами КЗ происходит тушение флуоресценции красителя. При агрегации частиц поверхность, доступная для адсорбции молекул RB, уменьшается, что приводит к увеличению свободных молекул RB в растворе, и, следовательно, к увеличению интенсивности флуоресценции. Вторым фактором является эффект внутреннего фильтра, обусловленный изменением интенсивности возбуждающего и флуоресцентного света за счет изменения спектра поглощения системы при агрегации частиц. В частности, при агрегации частиц КЗ поглощение на длине волны 520 нм уменьшается, и интенсивность возбуждающего света на пути в кювете до места возбуждения соответственно увеличивается. В результате интенсивность флуоресценции RB также увеличивается. Кроме этого, эффект внутреннего фильтра проявляется в поглощении флуоресцентного света на пути от места излучения в кювете до приемника.

Важно отметить, что в работе (Zhang et al., 2011) не было показано, какой же из двух механизмов (или оба) работают в данном варианте флуоресцентного теста. Для решения этого вопроса необходимо было оценить влияние оцДНК, NaCl гибридизационного буфера и концентрации диспергированных частиц КЗ на флуоресценцию. Ниже излагаются результаты этих экспериментов и выводы, сделанные из анализа полученных данных.

Рис. 11. (а) Кривые зависимости (I0 - Is ) / I0 и Is / I0, I0 – интенсивность флуоресценции раствора RB в воде в отсутствие тушителя, Is – интенсивность флуоресценции супернатантов после центрифугирования смесей частиц КЗ и RB. (б) Кривые зависимости интенсивности флуоресценции I/I0 от оптической плотности А520 препаратов смесей раствора частиц КЗ в воде с раствором RB.

Кривые 1 и 2 построены по данным до и после корректировки на эффект внутреннего фильтра, соответственно. (в) Зависимость изменения интенсивности флуоресценции RB от концентрации добавленной комплементарной мишени с финальными концентрациями 0.3 пМ, 3 пМ, 30 пМ, 3пМ, 3 нМ, 30 нМ, 300 нМ (кДНК-мишень T1).

Во-первых, мы показали, что добавление оцДНК к раствору RB не изменяет интенсивности флуоресценции. Это указывает на отсутствие взаимодействия между этими молекулами. Во всяком случае, даже если какое-то взаимодействие имеет место, оно не изменяет интенсивности флуоресценции. Следовательно, этот фактор можно не принимать во внимание при анализе флуоресцентного теста. Во-вторых, наши эксперименты показали небольшое (не более 15%) увеличение интенсивности флуоресценции при добавлении гибридизационного буфера. Таким образом, влияние буфера приводило к эффекту, противоположному тушению на частицах КЗ (см. ниже), однако в целом этот фактор не был доминирующим.

Для оценки эффекта тушения флуоресценции частицами КЗ растворы с постоянной концентрацией RB инкубировали с частицами КЗ разной концентрации (в терминах оптической плотности А520) и после центрифугирования частиц измеряли отношение интенсивности флуоресценции супернатантов Is к интенсивности исходного раствора I0.

Из рис. 11а видно, что при оптической плотности 1.5 в супернатанте молекулы родамина отсутствуют. При этом, как видно из рис. 11б, флуоресценция в системе частицы+краситель также отсутствует. Следовательно, происходит полное тушение флуоресценции. Зависимость (I0 - Is)/ I0 от оптической плотности коллоида А520 (рис.

11а) имеет смысл изотермы адсорбции. Таким образом, данный эксперимент показывает количественное соотношение между концентрациями молекул RB и частиц КЗ при полном тушении, обусловленном именно адсорбцией красителя на частицах. Очевидно, что данный механизм играет важную роль во флуоресцентном тесте, основанном на агрегации.

На рис. 11б показано изменение интенсивности флуоресценции раствора красителя с добавленными частицами в зависимости от концентрации частиц. Уменьшение интенсивности, как было показано выше, связано с тушением на частицах. Однако это не единственный механизм уменьшения флуоресценции. Необходимо провести также коррекцию данных на эффект внутреннего фильтра (Лакович, 1986). В идеальном случае возбуждающий и излучаемый свет проходят примерно половину длины кюветы при регистрации. Тогда измеренная интенсивность флуоресценции Iexp должна быть скорректирована на поглощение системы на длинах волн возбуждения и флуоресценции (Лакович, 1986): Icorr = Iexp10( Aex + Afl ) / 2, где Aex и Afl суть оптические плотности системы на длинах волн возбуждения и флуоресценции. Из рис. 11б видно, что корректировка на эффект внутреннего фильтра существенно изменяет концентрационную зависимость тушения. В целом, полученные данные показывают, что в данном случае оба фактора (тушение на частицах и эффект внутреннего фильтра) влияют на измеряемый сигнал флуоресценции.

В дальнейших экспериментах с модельными олигонуклеотидами измеренные значения интенсивности корректировались, как указано выше. На рис. 11в показана зависимость интенсивности флуоресценции смесей частиц КЗ с раствором RB и раствором ДНК в гибридизационном буфере от концентрации ДНК-мишени. Следует отметить, что нижний предел обнаружения находится в области 0.1 нМ ДНК, что согласуется с данными колориметрического теста. С учетом всех обсужденных факторов, мы полагаем, что использование флуоресцентного детектирования ДНК-мишеней достаточно сильно зависит от условий проведения реакции гибридизации. В целом, наши данные показывают, что флуоресцентный метод (Zhang et al., 2011) более сложен в исполнении, требует применения спектрофлуориметра и имеет примерно ту же чувствительность, что и колориметрический тест.

В заключении к работе отмечается, что исследования по комплексам ДНК-ЗНЧ продолжаются, в том числе уже в 2012 г. появились новые публикации по развитию колориметрического, флуоресцентного и ДРС тестов. Таким образом, тематика диссертационной работы остается актуальной и заслуживает продолжения, в особенности в отношении повышения чувствительности, специфичности и воспроизводимости указанных тестов.

Основные результаты и выводы:

1. Предложен новый метод колориметрического определения молекул ДНК-мишеней, основанный на изменении цвета взвеси положительно заряженных наночастиц золота в результате агрегации, индуцированной гибридизацией олигонуклеотидов в растворе.

Агрегационные изменения могут быть зарегистрированы визуально, с помощью спектров экстинкции или методом динамического светорассеяния.

2. Метод динамического рассеяния имеет большую чувствительность в определении ДНКмишеней по сравнению со спектроскопией поглощения. Соответствующие минимальные концентрационные пределы детектирования равны 10 пМ и 100 пМ при объеме пробы порядка 100 мкл. ДРС-тест с положительно заряженными наночастицами золота позволяет дифференцировать наличие одно- и трехбуквенных несоответствий в исследованных модельных молекулах ДНК-мишеней.

3. Коллоидная стабильность препаратов золотых наностержней в гибридизационном буфере зависит от морфологии частиц. В отличие от наностержней с морфологией типа «dog-bone», частицы с идеальной цилиндрической формой практически непригодны для колориметрического теста вследствие их низкой агрегационной устойчивости к добавлению соли.

4. Определены значения «золотого числа» для 11 препаратов РНК, выделенных из зрелых зерен ячменя для сортов с различной морозостойкостью. Показано, что значения «золотого числа» отличаются для разных сортов, но не коррелируют с морозостойкостью сорта.

5. Флуоресцентный метод определения ДНК-мишеней, основанный на изменении интенсивности флуоресценции родамина B при агрегации наночастиц золота, индуцированной гибридизацией мишеней и зондов, имеет чувствительность, сравнимую с колориметрическим тестом. Изменение интенсивности флуоресценции обусловлено изменением степени тушения флуорофора при адсорбции на частицах золота и агрегатах, а также эффектом «внутреннего фильтра», связанным с изменением спектра поглощения коллоида при агрегации.

Список публикаций по теме работы:

1. Pylaev T.E., Khanadeev V.A., Khlebtsov B.N., Dykman L.A., Bogatyrev V.A., Khlebtsov N.G. Colorimetric and dynamic light scattering detection of DNA sequences by using positively charged gold nanospheres: A comparative study with gold nanorods // Nanotechnology. – 2011. – V. 22, No. 28. – P. 285501 (11 pp.).

2. Пылаев Т.Е., Ханадеев В.А., Хлебцов Б.Н., Дыкман Л.А., Богатырев В.А., Хлебцов Н.Г.. Эффекты формы и заряда коллоидных наночастиц золота при колориметрическом определении ДНК–последовательностей // Коллоидный журнал.

– 2011. – Т. 73, № 3. – С. 364–374.

3. Khlebtsov B., Khanadeev V., Pylaev T., Khlebtsov N. A new T–matrix solvable model for nanorods: TEM–based ensemble simulations supported by experiments // J. Phys. Chem. C.

– 2011. – V. 115. – P. 6317–6323.

4. Способ колориметрического детектирования олигонуклеотидов с использованием катионных золотых наносфер. Патент РФ № 2439161, опубл. 10.01.2012 БИ № 1, Авторы: Хлебцов Б.Н., Пылаев Т.Е., Хлебцов Н.Г.

5. Pylaev T.E., Khlebtsov B.N., Khlebtsov N.G. Detection of biomolecular binding using localized surface plasmon resonance–based gold and silver nanoparticle microarray nanochip on glass substrate // Saratov Fall Meeting 2007, International School for Young Scientists and Students on Optics, Laser Physics & Biophotonics. – Саратов (25–сентября). – 2007. URL: http://optics.sgu.ru/SFM/2007/report/475.

6. Khlebtsov N., Khlebtsov B., Khanadeev V., Mel’nikov A., Pylaev T. Depolarized light scattering spectra from gold nanorods and nanosphere clusters // Extended Abstracts of 11th Elerctromagnetic and Light Scattering Conference, – De Havilland Campus: Hertfordshire Univ. – (7–12 сентября). – 2008. – p. 349–352.

7. Khlebtsov B., Khanadeev V., Pylaev T., Khlebtsov N. Depolarized light scattering by gold nanostructures // Saratov Fall Meeting 2008, International School for Young Scientists and Students on Optics, Laser Physics & Biophotonics. – Саратов (23–26 сентября). – 2008.

URL: http://optics.sgu.ru/SFM/2008/report/684.

8. Хлебцов Н.Г., Богатырев В.А., Дыкман Л.А., Хлебцов Б.Н., Староверов С.А., Бурыгин Г.Л., Максимова И.Л., Терентюк Г.С., Акчурин Г.Г., Ханадеев В.А., Пылаев Т.Е., Видяшева И.В. Создание биомаркеров на основе наночастиц с настраиваемым плазмонным резонансом для биомедицинских применений // Конференции и семинары по научным направлениям Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине», – М.: Слово. – 2009. – С.

94–95.

9. Pylaev T.E., Khlebtsov B.N., Khanadeev V.A., Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Khlebtsov N.G. The use of colloidal gold nanospheres and nanorods for colorimetric detection of HIV–related DNA sequences: the particle shape and charge effects // Saratov Fall Meeting 2009, International School for Young Scientists and Students on Optics, Laser Physics & Biophotonics. – Саратов (21–24 сентября). – 2009. URL:

http://optics.sgu.ru/SFM/2009/report/798.

10. Пылаев Т.Е., Ханадеев В.А., Хлебцов Б.Н., Богатырев В.А., Хлебцов Н.Г.

Использование золотых наностержней и наносфер для биомедицинской и сельскохозяйственной генодиагностики // Всероссийская молодежная выставка– конкурс прикладных исследований, изобретений и инноваций. – Саратов: Изд-во Сарат. ун-та. – 2009. – Ч. 2. – С. 9.

11. Pylaev T.E., Khanadeev V.A., Khlebtsov B.N., Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Khlebtsov N.G. The use of gold nanorods for oligonucleotide detection // Abstr. the Second Int.

Competition of Scientific Papers in Nanothechnology for Young Scientists, – Moscow:

Rusnanotech 09. – Москва (6–8 октября). – 2009. – P. 501–504.

12. Евтушенко Я.Ю., Пылаев Т.Е., Насонов А.И., Кузембаева Н.А., Богатырёв В.А., Плотников В.К. «Золотое число» для долгоживущей РНК из зрелого зерна отражает морозостойкость сорта // III всероссийская научно–практическая конференция молодых ученых. – Краснодар. – 2009. – С. 676.

13. Хлебцов Н.Г., Ханадеев В.А., Пылаев Т.Е., Видяшева И.В., Панфилова Е.В., Гасина О.А., Хлебцов Б.Н., Богатырев В.А., Дыкман Л.А., Староверов С.А., Максимова И.Л., Терентюк Г.С., Тучин В.В. Золотые и композитные наночастицы для применений в качестве термосенсибилизаторов, биомаркеров и адъювантов // Конференции и семинары по научным направлениям Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине», – М.: Слово. – 2010. – С.

104–105.

14. Евтушенко Я.Ю., Пылаев Т.Е., Насонов А.И., Кузембаева Н.А., Богатырёв В.А., Плотников В.К. Нанобиотехнологический метод оценки морозостойкости сортов пшеницы, ячменя и гороха на основе сортоспецифичности “золотого числа” долгоживущей РНК из зрелого зерна // 14 Международная Пущинская школа– конференция молодых ученых. – Пущино. – 2010. – С. 245.

15. Пылаев Т.Е., Евтушенко Я.Ю., Насонов А.И., Плотников В.К., Богатырев В.А., Хлебцов Н.Г. Корреляция значения «золотого числа» долгоживущей РНК из зрелого зерна злаковых и бобовых растений с морозостойкостью сорта. // Cтратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой. Материалы V Всероссийской конференции молодых ученых. – Саратов (28 сентября–1 октября). – 2010. – С. 66.

16. Пылаев Т.Е., Хлебцов Б.Н., Богатырев В.А., Хлебцов Н.Г. Золотые катионные наночастицы в детекции ДНК–последовательностей // 2–я Ежег. Отч. Конф.

Нанотехнологического общества России. – Москва (9 ноября). – 2010, URL:

http://www.ntsr.info/science/library/2901.htm.

17. Khlebtsov B.N., Panfilova E.V., Pylaev T.E., Khanadeev V.A., Terentyk G.S., Tuchin V.V., Dykman L.A., Khlebtsov N. G., Tunable plasmonic nanoparticles for biomedical applications // Proc. of III Int. Symp. Topical Problems of Biophotonics: Inst. Appl. Phys.

RAS Publ. – Санкт–Петербург – Нижний Новгород (16–22 июля). – 2011. – P. 160–161.

18. Pylaev T.E., Khanadeev V.A.,Khlebtsov B.N., Dykman L.A., Bogatyrev V.A., Khlebtsov N.G. Extinction spectroscopy and dynamic light scattering detection of DNA sequences by using cationic gold nanospheres // Saratov Fall Meeting, International School for Young Scientists and Students on Optics, Laser Physics & Biophotonics. – Саратов (27–сентября). – 2011. URL: http://sfm.eventry.org/report/20.

19. Khlebtsov B.N., Khanadeev V.A., Pylaev T.E., Khlebtsov N.G. Simulations of the optical properties of gold nanorods using a new TEM–based T–matrix solvable model: calculations and experiment // Saratov Fall Meeting, International School for Young Scientists and Students on Optics, Laser Physics & Biophotonics. – Саратов (27–30 сентября). – 2011.

URL: http://sfm.eventry.org/report/138.

Работы №1 – 3 опубликованы в печатных изданиях, состоящих в списке журналов, рекомендованных ВАК РФ.

Формат 6084 1/16. Гарнитура Times New Roman 10, Объем 1 п. л. Тираж 100. Заказ 57.

Отпечатано в ИБФРМ РАН Саратов, пр. Энтузиастов 13.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.