WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


На правах рукописи

КОМАРОВА Наталья Владимировна

ИНЖЕНЕРИЯ КАТАЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ И ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТИ ОКСИДАЗЫ D-АМИНОКИСЛОТ

03.01.04 – биохимия 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2012

Работа выполнена в лаборатории молекулярной инженерии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН и на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научный консультант:

доктор химических наук, профессор Тишков Владимир Иванович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор зав. лабораторией физиологически активных биополимеров Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт элементорганических соединений им. В.Н. Несмеянова РАН Ямсков Игорь Александрович доктор химических наук, профессор главный научный сотрудник НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова Готтих Марина Борисовна

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится “_____” декабря 2012 года в 15 часов на заседании Совета Д 501.001.59 по защите докторских и кандидатских диссертаций по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д.1, стр.11, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 23 ноября 2012 года.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 501.001.59, кандидат химических наук Сакодынская И.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность проблемы. Оксидаза D-аминокислот относится к классу FAD-содержащих оксидоредуктаз и катализирует окислительное дезаминирование D-аминокислот в соответствующие -кетокислоты (КФ 1.4.3.3, DAAO). Фермент играет исключительно важную роль в метаболизме микроорганизмов. В организме животных и человека DAAO отвечает за поддержание определенного уровня D-аминокислот в клетке. Например, в тканях мозга фермент контролирует содержание D-серина, который участвует в регуляции деятельности нервной системы. В настоящее время установлено, что повышенная активность DAAO в мозге служит одной из причин возникновения шизофрении. У пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера, наблюдается снижение активности фермента, в результате чего в тканях мозга значительно возрастает содержание D-аланина. Пониженная активность DAAO характерна также для некоторых почечных заболеваний. Кроме того, оксидаза D-аминокислот принимает участие в регуляции процессов старения.

На практике этот фермент используется главным образом в биокаталитическом процессе окисления цефалоспорина С в 7-аминоцефалоспорановую кислоту (7-АЦК) - исходное соединение для производства полусинтетических цефалоспоринов различных поколений (доля бета-лактамных антибиотиков составляет 10% от стоимости всех производимых в мире фармацевтических препаратов). Помимо этого, DAAO активно применяется в аналитической биотехнологии, хиральном синтезе, получении неприродных L-аминокислот и -кетокислот и имеет большое потенциальное значение для создания систем диагностики и мониторинга ряда психосоматических (шизофрения, амиотрофический боковой склероз, болезни Альцгеймера и Паркинсона и др.) и онкологических заболеваний.

Несмотря на высокую теоретическую и практическую значимость, оксидаза D-аминокислот до недавнего времени была малоизученным ферментом. Фактически в настоящее время накоплен достаточно большой объем экспериментальных данных для DAAO из почки свиньи (pkDAAO) и из дрожжей Rhodotorula gracilis (RgDAAO).

Трехмерные структуры этих ферментов были определены в 1996 и 2000 годах соответственно. Для pkDAAO и RgDAAO в литературе имеются данные по детальному изучению механизма действия этих ферментов методом направленного мутагенеза. В 2006 году была опубликована структура еще одной DAAO – фермента из человека (hDAAO). Интерес ученых к этому ферменту активно растет в последние годы в связи с открытием новых аспектов, связанных с физиологической ролью hDAAO в организме человека.

Среди всех известных оксидаз D-аминокислот наиболее широкое применение на практике находит фермент из дрожжей Trigonopsis variabilis (TvDAAO), поскольку по сравнению с известными ферментами из других источников TvDAAO обладает самой высокой температурной стабильностью и активностью с цефалоспорином С.

Создание высокоэффективных биокатализаторов на основе TvDAAO невозможно без проведения фундаментальных исследований по изучению взаимосвязи структуры и - 3 функции этого фермента и направленной инженерии его свойств, в частности, температурной стабильности и субстратной специфичности. Другой очень важной задачей по инженерии TvDAAO является повышение активности фермента в реакции окисления цефалоспорина С.

Одним из самых эффективных методов как для фундаментального исследования структуры и функции ферментов, так и для направленного изменения их каталитических свойств и стабильности является метод рационального дизайна.

Этот метод сочетает анализ трехмерной структуры фермента с последующим введением выбранных на основе анализа аминокислотных замен с помощью направленного мутагенеза. В настоящее время в литературе имеется небольшое количество публикаций по белковой инженерии TvDAAO. Это связано с отсутствием у исследователей данных по трехмерной структуре фермента, хотя эксперименты по кристаллизации TvDAAO проводились во многих лабораториях более 20 лет. В 20году в нашей лаборатории была решена первая структура мутантной TvDAAO, которая остается единственной до настоящего времени. Наличие трехмерной структуры TvDAAO создает основу для проведения экспериментов по белковой инженерии этого фермента с помощью рационального дизайна.

Цели исследования. Основной целью работы было изучение взаимосвязи структура-функция в оксидазе D-аминокислот из дрожжей T.variabilis методами белковой инженерии. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

- исследование роли водородных связей в области межсубъединичного контакта TvDAAO;

- оптимизация структуры FAD-связывающего домена;

- повышение температурной стабильности TvDAAO;

- улучшение каталитических параметров TvDAAO в реакции окисления цефалоспорина С.

Научная новизна. В ходе выполнения данной работы проведен анализ структуры оксидазы D-аминокислот из дрожжей T.variabilis, и выбраны перспективные положения для введения аминокислотных замен. Методом направленного мутагенеза получены 27 мутантных ферментов c аминокислотными заменами в области субстрат- и кофактор-связывающих доменов, а также в области межсубъединичного контакта. Кроме этого, к TvDAAO для повышения термостабильности впервые применен подход гидрофобизации -спиралей. Введение точечных аминокислотных замен позволило увеличить каталитическую эффективность с рядом D-аминокислот в 2-16 раз. Показано, что введение различных аминокислотных замен в одно и то же положение приводит к получению мутантных форм фермента с различным профилем субстратной специфичности. Методом рационального дизайна получены мутантные TvDAAO с улучшенной эффективностью в реакции окисления цефалоспорина С. Ряд замен привел к повышению температурной стабильности фермента.

Практическая значимость работы. Получение мутантных TvDAAO с измененным узким спектром субстратной специфичности открывает перспективы для - 4 создания селективных биосенсоров на D-аминокислоты для целей медицинской диагностики и аналитической биотехнологии. Мутантные ферменты с повышенной термостабильностью и улучшенной эффективностью в реакции окисления цефалоспорина С могут быть успешно использованы в биферментом биокаталитическом процессе получения 7-АЦК из цефалоспорина С.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на международных конгрессах, конференциях и школах: International Conference “Biocatalysis: Fundamentals & Applications” (Arkhangelsk, 2009), Пятый, Шестой и Седьмой Московский международный конгресс “Биотехнология: состояние и перспективы развития” (Москва, 2009, 2011, 2012), XI Международная конференция молодых ученых «Леса Евразии – Брянский лес» (Брянск, Россия, 2011), 14th International Biotechnology Symposium. (Rimini, Italy, 2010), Международный молодежный форум «Ломоносов-2011» (Москва), 2-я международная школа «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах. Безопасность и наномедицина» (Пансионат «Заря», Московская область, Россия, 2011), Международная конференция «Ломоносов и Гумбольдт: научное сотрудничество России и Германии – от истоков до наших дней» (2011), XIX Молодежная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2012), The 20th INPEC Conference “Engineering Protein - Systems, Functions and Applications”, (Taipei, Taiwan, 2012), 9th International Conference on Protein Stabilization - ProStab20"From Molecular Level to market applications" (Lisbon, Portugal, 2012), V International Meeting “Early events in Human Pathologies” (Listvyanka, Baikal, Russia, 2012).

По результатам выполненных исследований автор в 2012 г. был удостоен почетного звания «Лауреат стипендии имени В.Л.Кретовича».

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 5 статей в ведущих международном и российских журналах (все журналы входят в Перечень рецензируемых научных журналов ВАК РФ), 14 тезисов докладов конференций и подана одна заявка на патент РФ на изобретение.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 166 страницах и содержит 41 рисунок, 31 таблицу и 164 ссылки.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ Инженерия в области межсубъединичного контакта Оксидазы D-аминокислот из разных источников в нативном состоянии существуют в различном олигомерном состоянии. Как правило, DAAO из микроорганизмов существуют в димерной форме. Ферменты, выделенные из человека и почек свиньи, напротив, являются мономерами. В литературе известен пример изменения олигомерного состояния RgDAAO с помощью направленного мутагенеза. В случае TvDAAO такого рода эксперименты не проводились.

- 5 Для исследования влияния межсубъединичных взаимодействий на стабильность и каталитические свойства, а также изучения возможности получения мономерных форм этого фермента нами был выполнен анализ структуры TvDAAO для идентификации аминокислотных остатков, принимающих участие в образовании димера. Затем были проведены эксперименты по замене некоторых из этих остатков на другие аминокислоты. Анализ структуры TvDAAO свидетельствует, что в области межсубъединичного контакта имеется 12 водородных связей, которые участвуют в образовании димера. Данные об остатках, образующих эти связи, приведены в таблице 1. Поскольку TvDAAO состоит из двух идентичных субъединиц, то количество уникальных водородных связей составляет половину от общего числа. Наибольший вклад в стабилизацию димерной структуры вносят два остатка аргинина - Arg169 и Arg220. Они участвуют в образовании 8 водородных связей (67% от общего числа).





Для выяснения влияния этих остатков на олигомеризацию фермента было решено заменить остаток Arg220 на остаток глутаминовой кислоты, а также оба остатка аргинина - Arg169 и Arg220, на остатки аланина.

Таблица 1.

Водородные связи в межсубъединичном контакте димера TvDAAO.

Мономер A Мономер B Расстояние, атом остаток атом остаток O E32 NE R220 2,O E32 NH2 R220 3,O E80 OG S157 2,N K168 O D249 2,NH2 R169 O G250 3,NH1 R169 O G250 3,NE R220 O E32 2,NH2 R220 O E32 3,OG S157 O E80 2,O D249 N K168 2,O G250 NH2 R169 3,O G250 NH1 R169 3,Пробное культивирование штаммов E.coli – продуцентов мутантных ферментов, показало, что мутанты TvDAAO R220E и TvDAAO R169A/R220A синтезируются полностью в нерастворимой форме, сохраняя при этом ферментативную активность.

Нами были проведены эксперименты по оптимизации условий культивирования и по солюбилизации с помощью детергентов, однако перевести мутантные ферменты в растворимую форму не удалось.

Поскольку осадок суспензии клеток проявлял активность, было решено измерить кинетические параметры фермента, связанного с мембранами клеток.

Введение аминокислотных замен R169A/R220A и R220E в молекулу TvDAAO приводит к резкому изменению профиля субстратной специфичности (табл. 2). В - 6 частности, фермент потерял активность с D-Leu, D-Thr, D-Tyr и D-Ala. Кроме того, мутант TvDAAO R220E также не проявляет активности с D-Ser и D-Phe. Наибольшие изменения кинетических параметров оказались для мутанта TvDAAO R220E, у которого значительно возросли константы Михаэлиса с большинством изученных D-аминокислот (табл. 2). С некоторыми из субстратов наблюдалась практически линейная зависимость скорости реакции от концентрации D-аминокислоты вплоть до максимальной растворимости последней. Поэтому было возможно определить только отношение Vm/KM, но не сами параметры в отдельности.

Таблица 2.

Кинетические параметры TvDAAO R169A/R220A и R220E.

Форма фермента TvDAAO R169A/R220A TvDAAO R220E0 wt-TvDAAO АминоVm/ Vm/KM/ Vm/ Vm/KM/ Vm/ Vm/KM/ кислота KM, мМ KМ, мМ KМ, мМ VmMet, VmMet, VmMet, (Vm/KM)Met, (Vm/KM)Met, (Vm/KM)Met, % % % % % % D-Met 3,0±0,9 100 100 0,7±0,5 100 100 0,46±0,03 100 1D-Ser 105±33 62 2 нет реакции 36,6±3,3 25 0,D-Val 4,3±0,9 69 48 >100 н.д. н.д. 14,4±1,2 106 3,D-Phe 38 ± 5 100 8 нет реакции 0,37±0,04 34 D-Asn 5,6±0,7 85 42 30±4 74 2 22,6±1,5 78 1,D-Lys 27 ± 7 25 3 >100 н.д. н.д. 29,3±3,4 4 0,D-Trp >50 н.д. н.д. >50 н.д. н.д. 0,49±0,04 53 D-Leu нет реакции нет реакции 0,78±0,02 36 D-Thr нет реакции нет реакции 11,1±0,8 2 0,D-Tyr нет реакции нет реакции 0,45±0,06 28 D-Ala нет реакции нет реакции 16,7±0,7 135 3,* - Полужирным шрифтом на сером фоне выделены кинетические параметры мутантных TvDAAO, лучшие по сравнению с таковыми для wt-TVDAAO.

В случае двойного мутанта TvDAAO R169A/R220A c некоторыми D-аминокислотами наблюдалось улучшение значений константы Михаэлиса, в частности, с D-Val, D-Asn и D-Lys (табл. 2).

Температурная стабильность TvDAAO R220E была измерена в интервале температур 32 - 40С, TvDAAO R169A/R220A – в интервале 20 - 28 С. Это было связано с тем, что данные мутантные TvDAAO обладали гораздо меньшей стабильностью, чем фермент дикого типа. Значения T1/2 (температура, при которой за 30 минут теряется 50% активности фермента) для TvDAAO R220E, TvDAAO R169A/R200A и wt-TvDAAO составили 28, 20 и 54°С, соответственно. Ранее было показано, что термоинактивация фермента дикого типа протекает по двухстадийному диссоциативному механизму: на первой стадии происходит диссоциация димера на мономеры, а на второй – необратимая инактивация мономера, а зависимость остаточной активности от времени описывается суммой двух экспонент.

Наблюдаемые зависимости для мутантных TvDAAO с заменами R169A/R220A и - 7 TvDAAO R220E также описываются суммой двух экспонент, однако, выяснить, протекает ли их инактивация по диссоциативному механизму, не представлялось возможным, т.к. для этого было необходимо изучение кинетики термоинактивации при различных концентрациях фермента, что, как уже отмечалось выше, невозможно изза связывания фермента с клеточной мембраной.

Данные по направленному мутагенезу в TvDAAO остатков Arg169 и Arg2свидетельствуют о том, что связи, образованные этими остатками, играют очень важную роль в общей стабильности фермента. Их разрушение приводит к сильной дестабилизации TvDAAO и не позволяет получить мономерную форму фермента в растворимой форме.

Инженерия кофермент-связывающего домена Каждая субъединица DAAO содержит одну молекулу FAD, который необходим для осуществления каталитической функции. В DAAO FAD связан с ферментом нековалентно. Константа диссоциации FAD-DAAO меняется в зависимости от источника фермента. Считается, что температурная стабильность фермента, помимо многих других факторов, зависит от прочности связывания FAD. Поэтому введение аминокислотных замен, улучшающих связывание FAD, может привести к повышению термостабильности TvDAAO. Нами был выполнен анализ структуры TvDAAO в области FAD-связывающего домена, который показал, что в связывании кофактора принимают участие 14 аминокислотных остатков: Ala9, Ala12, Ser31, Glu32, Phe33, Thr43, Ser44, Asn50, Val171, Ala329, Gly330, Gly332, Tyr333, Gln334. Для введения мутаций в качестве наиболее перспективных были выбраны аминокислотные остатки Glu32 и Phe33, которые образуют три водородные связи с молекулой FAD: азот амидной группы пептидной связи остатка Glu32 образует связь с азотом N3 аденина в молекуле FAD, кислород карбонила пептидной связи остатка Phe33 – с 3’-ОН-группой рибозы, и азот амидной группы остатка Phe33 – с 2’-ОН-группой рибозы. Эти связи изображены на рис. 1.

Рис. 1. Положение остатков Glu32 и Phe33 в структуре TvDAAO и водородные связи, образованные различными аминокислотными остатками в положении 32 и - 8 По результатам компьютерного моделирования мутаций этих остатков было решено получить 8 мутантых форм со следующими аминокислотными заменами:

– 6 точечных мутантов М1, М2, М3, М4, M5, M6, и – 2 двойных мутанта M7 и M8.

Во всех этих мутантах сохраняются водородные связи, изначально существующие в ферменте дикого типа. Кроме того, в случае введения аминокислотных замен M4 и M5 возможно образование дополнительных водородных связей. В случае двойной замены M7 возможно образование нескольких новых водородных связей между вводимым остатком и молекулой FAD. Таким образом, в случае последнего мутанта можно было ожидать повышения стабильности фермента.

Все мутантные TvDAAO за исключением TvDAAO M6 синтезировались в активной и растворимой формах. В случае мутанта TvDAAO M6 активность отсутствовала в бесклеточных экстрактах и в культуральной жидкости, но присутствовала в клеточном дебрисе, получаемого после разрушения клеток. Это свидетельствует о том, что этот мутантный фермент синтезируется в активной форме в виде телец включения. Перевести в раствор этот фермент не удалось. Введение замены M5 привело к существенной потере стабильности фермента - уже на стадии разрушения клеток TvDAAO M5 полностью теряла активность. Остальные мутантные TvDAAO с заменами M1, M2, M3, M4, M7 и M8 были получены в высокоочищенном состоянии и для них были изучены температурная стабильность и субстратная специфичность.

Рис. 2. Относительная каталитическая эффективность мутантных форм TvDAAO с заменами M1, M2, M3, M4, M7 и M8. Каталитическая эффективность фермента дикого типа принята за 100%.

- 9 Изучение субстратной специфичности показало, что все мутанты не проявляли активность с D-Lys, и только два из них (с двойными заменами M7 и M8) сохранили способность окислять D-Thr (рис. 2). Для всех мутантов происходит существенное улучшение каталитической эффективности с D-Leu, а для обоих двойных мутантов и точечного мутанта TvDAAO M3 – c D-Phe (рис. 2). У нерастворимого мутанта TvDAAO M6 наблюдается улучшение величины KМ практически со всеми изученными субстратами. Наиболее важным результатом этой части работы является увеличение по сравнению с ферментом дикого типа каталитической эффективности двойного мутанта TvDAAO M7 практически со всеми исследованными D-аминокислотами.

Как и в случае фермента дикого типа, для всех шести изученных мутантов наблюдается диссоциативный механизм температурной инактивации, так как:

- кривая термоинактивации описывается суммой двух экспонент (рис. 3);

- зависимости остаточной активности от времени инактивации при различных температурах представляются собой кривые с изломов в полулогарифмических координатах (рис. 4 А);

- при различных концентрациях фермента и одной температуре кривые инактивации в полулогарифмических координатах имеют одинаковый наклон начального прямолинейного участка до точки излома, а наклон второго прямолинейного участка увеличивается с уменьшением начальной концентрации фермента (рис. 4 Б).

Equation: y = a*exp(b*x) 0,Chi^2/DoF = 0.005R^2 = 0.8850,a 0.71822±0.020,7 b -0.01772 ±0.001A*exp(-k1*x)+B*exp(-k2*x) 0,Chi^2/DoF = 0.00R^2 = 0.9950,A 0.45211±0.015k1 0.00861±0.0000,B 0.45365±0.015k2 0.1262 ±0.0100,0,0,0,0 20 40 60 80 100 1Время, мин Рис. 3. Зависимость остаточной активности TvDAAO M7 от времени при концентрации фермента 6,9 мкг/мл. 0,1 М КФБ, рН 8,0, 56 °С. Аппроксимация экспериментальных данных моноэкспоненциальной (- -) и биэкспоненциальной (—) функциями.

- 10 Остаточная активность, A/Ao 0, 6,9 мкг/мл 0, 10,0 мкг/мл -0,5 20,0 мкг/мл 30,0 мкг/мл -0,-1, 50 0C -1,-1, 52 0C 54 0C -2, 56 0C -1, 58 0C 60 0C -2,-2,-3,0 20 40 60 80 100 120 140 160 0 20 40 60 80 100 120 140 1Время, мин Время, мин А Б Рис. 4. Кривые инактивации TvDAAO M7 в полулогарифмических координатах: А – при одной концентрации фермента (10 мкг/мл) и различных температурах; Б – при одной температуре (56 оС) и различных концентрациях фермента.

M1, M M M0, wt-TvDAAO 0,0,0,0,0 20 40 60 80 100 120 140 1Время, мин Рис. 5. Зависимость остаточной активности от времени инактивации для TvDAAO с заменами M1, M2, M7 и M8. [E0]=10 мкг/мл, 0,1 М КФБ, рН 8,0, 54°С.

В случае большинства введенных замен произошло ухудшение стабильности ферментов, однако в случае двойной замены M7 удалось добиться существенного повышения стабильности (рис. 5). Отметим, что такое повышение термостабильности TvDAAO M7 было предсказано по результатам компьютерного моделирования структуры этого мутанта (см. выше). Кроме того, полученные результаты свидетельствует, что введение аминокислотных замен даже вдали от активного центра TvDAAO может привести к улучшению каталитических свойств фермента.

- 11 ln(A /A o) ln(A/Ao) Остаточная активность, А/Ао Повышение стабильности TvDAAO гидрофобизацией спиралей Для повышения стабильности белковой глобулы кроме рационального дизайна широко используются и универсальные подходы. Одним из таких подходов является гидрофобизация -спиралей, например, за счет замены остатков Ser на остатки Ala.

Анализ белковой глобулы TvDAAO показал, что в -спиралях находится 12 остатков Ser, которые можно разделить на две группы: находящиеся внутри белковой глобулы (положения 67, 105, 44, 334 и 335) и на ее поверхности (77, 78, 270, 277, 128, 157, 161). Остаток Ser44 является высококонсервативным, поэтому заменять его на другие аминокислоты нецелесообразно. Из остальных 11 остатков Ser для замены были выбраны восемь: четыре внутри белковой глобулы - Ser67, Ser105, Ser335 и Ser336, и четыре - на ее поверхности, Ser77, Ser78, Ser270 и Ser277.

Все мутантные ферменты экспрессировались в растворимой и активной форме.

TvDAAO Ser78Ala инактивировался в ходе разрушения клеток. Остальные препараты после очистки имели чистоту не менее 99%. TvDAAO Ser270Ala после заморозки и разморозки полностью теряла активность. Для остальных шести мутантных TvDAAO с заменами остатков Ser67, Ser77, Ser105, Ser277, Ser335 и S336 на остаток Ala были изучены кинетические свойства и термостабильность.

Рис. 6. Относительная каталитическая эффективность мутантных форм TvDAAO с заменами Ser/Ala в положениях 67, 77, 105, 277, 335, 336. Каталитическая эффективность фермента дикого типа принята за 100%.

Результаты измерения кинетических параметров мутантных ферментов показали, что произошло изменение спектра субстратной специфичности мутантных форм TvDAAO по сравнению с таковым у фермента дикого типа. Из всех мутантных форм активность с D-Thr сохранил только мутеин TvDAAO Ser335Ala, с D-Lys – только TvDAAO Ser77Ala (рис. 6). Практически для всех мутантных TvDAAO наблюдается повышение активности с D-Leu. Мутанты TvDAAO с заменами Ser277Ala, Ser336Ala не обладают активностью с D-Ser, но способны при этом окислять D-Ala (рис. 6).

- 12 Ферменты с такой субстратной специфичностью могут быть использованы для определения уровня D-Ala в нервных тканях в присутствии высоких концентраций D-Ser, например, для диагностики и мониторинга болезни Альцгеймера.

Анализ кинетики потери активности от времени свидетельствует, что механизм термоинактивации мутантных TvDAAO с заменами Ser67Ala, Ser77Ala, Ser105Ala, Ser335Ala, Ser336Ala и Ser277Ala не отличается от такового для фермента дикого типа: инактивация протекает в две стадии через диссоциацию димера на мономеры с последующей денатурацией мономеров.

Зависимости остаточной активности полученных мутантов от времени представлены на двух рисунках. Четыре мутанта были сравнимы по стабильности в ферментом дикого типа. Для них данные приведены при температуре 56 оС (рис. 7).

Для двух менее стабильных мутантов данные по инактивации приведены при более низкой температуре – 52 оС (рис. 8). Как видно из рис. 7, увеличение стабильности произошло только при введении замены Ser/Ala в 105 положении.

1,0 wt-TvDAAO TvDAAO Ser67Ala TvDAAO Ser77Ala TvDAAO Ser105Ala 0, TvDAAO Ser335Ala 0,0,0,0,0 10 20 30 40 50 Время, мин Рис. 7. Зависимость остаточной активности от времени для TvDAAO S77A, S67A S105A и TvDAAO дикого типа при 56 °С. 0,1 М КФБ, рН 8,0, концентрация ферментов - 15 мкг/мл.

1,0 wt-TvDAAO TvDAAO Ser277Ala TvDAAO Ser336Ala 0,0,0,0,0,0 20 40 60 80 100 120 1Время, мин Рис. 8. Зависимость остаточной активности от времени для TvDAAO S277A и TvDAAO дикого типа при 52 °С. 0,1 М КФБ, рН 8,0, концентрация ферментов - 10 мкг/мл.

- 13 Остаточная активность, А/Ао Остаточная активность, А/Ао Таким образом, методом гидрофобизации -спиралей повысить стабильность TvDAAO удалось только при введении замены Ser105Ala. Невысокая эффективность мутагенеза при применении данного подхода объясняется его статистическим характером – добиться повышения стабильности с помощью этого метода удается лишь в случае введения большого числа замен. В нашей работе эффект дала одна из восьми введенных аминокислотных замен, что является типичным результатом при применении метода гидрофобизации -спиралей для повышения стабильности белковой глобулы, однако даже одна замена позволила повысить термостабильность фермента в два раза.

Повышение активности TvDAAO с цефалоспорином С Инженерия субстратной специфичности TvDAAO наряду с повышением стабильности является одной из наиболее практически важных задач. Наиболее актуальным с этой точки зрения является повышение активности фермента в реакции окисления цефалоспорина С.

Оксидазы D-аминокислот из различных источников имеют ряд консервативных участков, однако в области субстрат-связывающего домена высокой гомологии в первичной структуре DAAO не наблюдается. Это может быть связано с тем, что субстратная специфичность фермента из различных источников варьируется в широком диапазоне. Особенностью TvDAAO является большая протяженность аминокислотной последовательности участка, отвечающего за связывание субстрата, благодаря чему формируется объемный субстрат-связывающий участок активного центра и TvDAAO проявляет высокую активность с D-аминокислотам с большой боковой группой, в том числе и с цефалоспорином С.

Рис. 9. Наложение структур TvDAAO до и после докинга молекулы цефалоспорина С.

Серым цветом выделено положение остатков Phe54 и Phe258 (два возможных положения по данным РСА) до докинга, малиновым – после; зеленым цветом показана молекула FAD, голубым – молекула цефалоспорина С.

- 14 Выбор положений для введения аминокислотных замен был выполнен на основе компьютерного анализа трехмерной структуры TvDAAO. Результаты этого анализа показали, что в области субстрат-связывающего домена находятся два остатка фенилаланина – Phe54 и Phe258 (рис. 9). Эти остатки расположены на входе в активный центр и не участвуют непосредственно в катализе, однако их замена может повлиять на связывание субстратов. Особенностью остатка Phe258 является его высокая подвижность: данные рентгеноструктурного анализа показывают для него две возможных конформации (рис. 9).

Для оценки роли остатков Phe54 и Phe258 в связывании цефалоспорина С было выполнено встраивание молекулы субстрата в активный центр фермента (докинг) с помощью пакета молекулярной графики Insight II (Accelrys Inc., San Diego, CA, USA). На рис. 9 приведено наложение структур TvDAAO до и после докинга. Из рис. 9 хорошо видно, что при встраивании молекулы цефалоспорина С в активный центр фермента происходит значительное отклонение боковых групп остатков Pheи Phe258 от своего первоначального положения, открывая путь молекуле цефалоспорина C к активному центру TvDAAO. Для увеличения размера входа в субстрат-связывающий участок активного центра остатки Phe54 и Phe258 заменили на остатки Ala и Ser. Кроме того в эти положения был введен наиболее близкий структурный аналог остатка Phe - остаток Tyr. Таким образом было получено шесть мутантных TvDAAO с точечными заменами Phe54Ala, Phe54Ser, Phe54Tyr, Phe258Ala, Phe258Ser и Phe258Tyr. Результаты экспериментов показали, что большой положительный эффект наблюдался в случае замен остатка Phe54 (см. ниже).

Поскольку компьютерное моделирование структур мутантных ферментов проводили на основе трехмерной структуры мутантной TvDAAO Cys108Phe, которая сама по себе обладает улучшенной активностью с цефалоспорином C, поэтому также были получены мутантные формы с двойными заменами Phe54Tyr/Cys108Phe, Phe54Ala/Cys108Phe и Phe54Ser/Cys108Phe.

При культивировании полученных шести точечных мутантов в случае TvDAAO Phe54Ala наблюдался самый низкий выход по активности, что, по-видимому, было связана с его низкой стабильностью, так как после разрушения клеток этот мутант полностью инактивировался. Остальные мутантные TvDAAO были получены в высокоочищенном виде и были изучены их свойства.

Введение всех замен привело к резкому сужению спектра субстратной специфичности фермента (рис. 10). Все полученные мутанты были неактивны с D-Ser и D-Thr. Активность с D-Lys сохранилась только у TvDAAO Phe54Ser. TvDAAO с заменами Phe258Ala, Phe258Ser, Phe258Tyr и Phe54Ser, потеряли активность с D-аланином. Кроме того, мутант TvDAAO Phe258Tyr был также неактивен с D-Val и D-Tyr. Отсутствие активности с D-Val наблюдается также для TvDAAO Phe54Ser, а с D-Tyr – для TvDAAO Phe54Tyr. Каталитическая эффективность мутантов с рядом других D-аминокислот упала более, чем в 10 раз. При этом в случае мутеинов TvDAAO Phe258Ala и TvDAAO Phe258Ser существенно возросла активность с D-Tyr D-Leu и особенно с D-Phe. Мутантная TvDAAO Phe54Ser в дополнение к D-Ser и D-Thr - 15 была неактивна и с D-Ala и D-Val (отметим, что D-Ala и D-Val наряду с D-Met являются наиболее "хорошими" субстратами TvDAAO дикого типа). Кроме того, сужение спектра субстратной специфичности TvDAAO Phe54Ser сопровождалось значительным улучшением каталитических параметров с D-аминокислотами, имеющими объемный боковой радикал. Наиболее сильный эффект наблюдался для D-Lys и D-Leu - каталитическая эффективность возросла в 7,3 и 7 раз соответственно.

В случае двойных мутантов также происходило сужение спектра субстратной специфичности, при этом введение замен Phe54Ala и Phe54Ser в комбинации с Cys108Phe также приводило к улучшению каталитической эффективности с D-аминокислотами с большим гидрофобным радикалом, а замена Phe54Tyr по-прежнему вызывала существенное ухудшене кинетических констант со всеми изученными субстратами (рис. 10).

Рис. 10. Относительная каталитическая эффективность мутантных форм TvDAAO с заменами Phe258Ala, Phe258Ser, Phe258Tyr, Phe54Ser, Phe54Tyr, Phe54Ala/Cys108Phe, Phe54Ser/Cys108Phe, Phe54Tyr/Cys108Phe. Каталитическая эффективность фермента дикого типа принята за 100%.

Изучение температурной стабильности полученных мутантов показало, что, как и в случае фермента дикого типа, их инактивация также протекает по диссоциативному механизму. Исключение составила только TvDAAO Phe258Ala, для которой наблюдался первый порядок кинетики инактивации, однако величина константы скорости инактивации первого порядка зависела от концентрации фермента. В случае трех мутантов (один с точечной заменой Phe54Tyr и два с двойными заменами Phe54Ala/Cys108Phe и Phe54Ser/Cys108Phe) был достигнуто повышение температурной стабильности (рис. 11).

- 16 TvDAAO Phe54Ala/Cys108Phe 1, TvDAAO Phe54Ser/Cys108Phe TvDAAO Phe54Tyr TvDAAO Phe54Tyr/Cys108Phe 0,8 wt-TvDAAO TvDAAO Phe54Ser TvDAAO Phe258Tyr TvDAAO Phe258Ala 0, TvDAAO Phe258Ser 0,0,0,0 20 40 60 80 100 120 140 1Время, мин Рис. 11. Зависимость остаточной активности от времени инактивации для мутантных форм и фермента дикого типа в одинаковых условиях. 0,1 М КФБ, рН 8,0, 56 оС, концентрация ферментов - 15 мкг/мл.

Для фермента дикого типа и мутантных TvDAAO с заменами Phe258Ala, Phe258Ser, Phe258Tyr, Phe54Ser, Phe54Tyr, Cys108Phe, Phe54Ala/Cys108Phe, Phe54Ser/Cys108Phe и Phe54Tyr/Cys108Phe были определены кинетические параметры в реакции окисления цефалоспорина С. Расходование субстрата и накопление промежуточного и конечного продуктов реакции регистрировали с помощью ВЭЖХ. На рис. 12 представлена хроматограмма с результатами анализа реакционной смеси в случае двойного мутанта TvDAAO Phe54Tyr/Cys108Phe.

Цефалоспорин С 140 min 9 min 15 min 1221 min 30 min + H2O10864КА-7-АЦК ГЛ-7-АЦК 20 2 4 6 8 10 12 14 Время, мин Рис. 12. Хроматограмма продуктов окисления цефалоспорина С, катализируемого оксидазой D-аминокислот для различных времен протекания реакции. Условия протекания реакции: 10 мкг/мл фермента TvDAAO Phe54Tyr/Cys108Phe, 20 мМ цефалоспорин С, 0,1 М КФБ, рН 8,0, 30 oC. Элюция в 20 мМ CH3COONH4, 2% CH3CN, pH 4,9. ВЭЖХ детекция: 125x4,0 мм Silasorb С18, 4 мкм.

- 17 Остаточная активность, А/Ао Поглощение, mAU При окислении цефалоспорина С с помощью TvDAAO продуктами являются H2O2 и -кетоадипил-7-АЦК (КА-7-АЦК), которая затем неферментативно окисляется пероксидом водорода до глутарил-7-АЦК (ГЛ-7-АЦК). Из рис. 12 видно, что по мере расходования исходного субстрата наблюдается образование промежуточного продукта КА-7-АЦК и конечного ГЛ-7-АЦК, причем, полного превращения промежуточного КА-7-АЦК в целевой ГЛ-7-АЦК из-за разложения части образующего пероксида водорода не происходит. Однако, при добавлении в реакционную смесь 0,05 мас% экзогенного H2O2 происходит полная конверсия КА-7-АЦК в ГЛ-7-АЦК (рис. 12).

Аналогичные хроматограммы были получены для всех остальных мутантных TvDAAO и фермента дикого типа. Кинетика окисления цефалоспорина С представлена на рис. 13. Из рисунка видно, что мутантные TvDAAO с заменами Phe258Tyr, Phe54Ser, Phe54Tyr, Phe54Ala/Cys108Phe, Phe54Ser/Cys108Phe, Phe54Tyr/Cys108Phe, Cys108Phe имеют более высокую активность, чем фермент дикого типа. Наилучшими каталитическими свойствами (в порядке убывания) обладали ферменты с заменами Phe54Ser/Cys108Phe, Phe54Tyr/Cys108Phe и Phe54Ser.

TvDAAO Phe258Ala TvDAAO Phe258Ser wt-TvDAAO TvDAAO Phe258Tyr TvDAAO Cys108Phe TvDAAO Phe54Ala/Cys108Phe TvDAAO Phe54Tyr TvDAAO Phe54Ser TvDAAO Phe54Ser/Cys108Phe TvDAAO Phe54Tyr/Cys108Phe 0 10 20 30 Время, мин Рис. 13. Кинетика окисления цефалоспорина С, катализируемого мутантными TvDAAO и ферментом дикого типа. 20 мМ цефалоспорин С, 10 мкг/мл TvDAAO, 0,1 М КФБ, рН 8,0, 30 oC.

Расчет кинетических параметров проводили на основе анализа интегральной кинетики изменения концентрации исходного субстрата от времени методом Уокера-Шмидта. На рис. 14 представлены результаты обработки экспериментальных данных окисления цефалоспорина С для двойного мутанта TvDAAO Phe54Tyr/Cys108Phe. Максимальную скорость определяли из величины отсекаемого на оси ординат отрезка, а константу Михаэлиса - из тангенса угла наклона прямой (рис. 14). Каталитическая константа была получена делением максимальной скорости - 18 [CPC], мМ на концентрацию активного фермента, которую рассчитывали по поглощению связанного FAD на 455 нм. Полученные значения каталитических констант, констант Михаэлиса и каталитической эффективности (отношение kcat/KM) представлены в таблице 3.

1,1,1,Equation y = a + b*x Weight No Weightin 0,8 Residual Sum of Squares 0,001Pearson's r -0,99Adj. R-Square 0,993Value Standard Error Intercept 1,97961 0,02Slope -7,4906 0,2420,0,08 0,10 0,12 0,14 0,1/t*ln(S0/S), мин-Рис. 14. Линеаризация экспериментальных данных реакции окисления цефалоспорина С в координатах Уокера-Шмидта. 20 мМ цефалоспорин С, 10 мкг/мл TvDAAO Phe54Tyr/Cys108Phe, 0,1 М КФБ, рН 8,0, 30 oC.

Таблица 3.

Кинетические параметры окисления цефалоспорина С.

kcat, KM, kcat/KM, Форма фермента c-1 мМ мМ-1c-wt-TvDAAO 32,0 ± 1,1 4,6 ± 0,5 7,TvDAAO Cys108Phe 107 ± 9 12 ± 3 8,TvDAAO Phe258Tyr 73 ± 3 18,4 ± 1,4 3,TvDAAO Phe258Ala 21,2 ± 0,5 7,4 ± 0,6 2,TvDAAO Phe258Ser 28,4 ± 0,7 8,7 ± 0,7 3,TvDAAO Phe54Tyr 93 ± 3 6,4 ± 0,6 14,TvDAAO Phe54Ser 92 ± 3 3,4 ± 0,4 26,TvDAAO Phe54Tyr/Cys108Phe 130 ± 2 6,0 ± 0,3 21,TvDAAO Phe54Ala/Cys108Phe 76 ± 2 4,5 ± 0,5 17,TvDAAO Phe54Ser/Cys108Phe 118 ± 5 6,3 ± 0,7 18,* Полужирным шрифтом на сером фоне отмечены кинетические параметры мутантных TvDAAO, лучшие по сравнению с таковыми для wt-TvDAAO.

Анализ данных, приведенных в таблице 3, показывает, что в большинстве случаев улучшение каталитической эффективности произошло за счет повышения каталитической константы, и только в одном случае, TvDAAO Phe54Ser, было улучшено значение константы Михаэлиса. Однако, несмотря на то, что среди полученных мутантных TvDAAO фермент с заменой Phe54Ser обладает самой высокой каталитической эффективностью, в наших экспериментах мутанты с - 19 P/t, мМ/мин заменами Phe54Tyr/Cys108Phe и Phe54Tyr/Cys108Phe демонстрировали более высокую скорость окисления цефалоспорина C (рис. 13). Это связано с тем, что при проведении процесса стараются использовать максимально возможные концентрации субстрата, которые являются для фермента «насыщающими» (т.е.

[S] >> KM). В этом случае при одинаковой концентрации фермента скорость процесса зависит от величины каталитической константы kcat, а не каталитической эффективности kcat/KM. Именно такой случай и наблюдается для рассматриваемых мутантов – чем больше величина kcat, тем быстрее идет реакция. Вторым очень важным результатом является аддитивность (суммирование положительного эффекта) улучшения каталитических свойств при объединении замен в 54 и 1положениях. Третьим важным результатом данного раздела является то, что большинство полученных мутантных TvDAAO, обладающих улучшенными каталитическими свойствами с цефалоспорином С, одновременно имеют более высокую термостабильность, чем фермент дикого типа.

Таким образом, подход рационального дизайна продемонстрировал эффективные результаты для улучшения каталитических свойств TvDAAO. В результате тщательного анализа трехмерной структуры фермента и экспериментов по компьютерному моделированию были получены мутантные формы, перспективные для применения в промышленном процессе окисления цефалоспорина С.

ВЫВОДЫ 1. Изучена роль водородных связей в стабильности димера TvDAAO. Показано, что остатки Arg169 и Arg220 играют важную роль в поддержании димерной структуры фермента. Разрушение водородных связей, образованных этими остатками, приводит к получению активного, но нерастворимого фермента, и при этом происходит резкое снижение термостабильности.

2. Проведена оптимизация структуры кофактор-связывающего домена за счет замены остатков в 32-м и 32-м положениях. Получены мутантные TvDAAO, которые обладают как улучшенными каталитическими свойствами, так и повышенной температурной стабильностью.

3. Проведены эксперименты по стабилизации TvDAAO с помощью гидрофобизации -спиралей. Получено 8 мутантных форм фермента. Показано, что замена Ser105Ala приводит к повышению стабильности фермента.

4. Изучена роль остатков Phe54 и Phe258, расположенных на входе в активный центр фермента. Показана важная роль этих остатков как в проявлении каталитических свойств, так и в термостабильности TvDAAO. Их замена на другие остатки позволяет резко сузить спектр субстратной специфичности. Кроме того, введение замен в 54 и 258 положении позволяет получить фермент с повышенной температурной стабильностью.

5. Показано, что остаток Phe в 54 положении играет важную роль в реакции окисления цефалоспорина С. Получены мутантные TvDAAO, обладающие более высокими каталитической активностью и каталитической эффективностью.

- 20 Объединение замен в 54 и 108 положении привело к дальнейшему улучшению каталитических свойств TvDAAO в ходе окисления цефалоспорина С.

6. Изучена кинетика термоинактивации для всех полученных мутантных форм TvDAAO. Показано, что за исключением одного фермента, термоинактивация мутантных TvDAAO протекает по двухстадийному диссоциативному механизму.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Черскова Н.В. (Комарова Н.В.), Хороненкова С.В., Тишков В.И. Роль остатков Arg169 и Arg220 в межсубъединичном контакте дрожжевой оксидазы D-аминокислот. Известия Академии наук. Серия Химическая, 2010, т.59, №1, c.262-268.

2. Тишков В.И., Хороненкова С.В., Черскова Н.В., Савин С.С., Упоров И.В.

Моделирование трехмерной структуры дрожжевой оксидазы D-аминокислот.

Вестник Московского Университета, Серия 2: Химия, 2010, т.51, №3, с.149-155.

3. Комарова Н.В., Голубев И.В., Хороненкова С.В., Тишков В.И Мутантная оксидаза D-аминокислот с улучшенной каталитической эффективностью к D-аминокислотам с объемными боковыми заместителями. Известия Академии наук. Серия Химическая, 2012, т.61, №7, с.1472-1479.

4. Комарова Н.В., Голубев И.В., Чубарь Т.А., Хороненкова С.В., Тишков В.И Инженерия субстратной специфичности оксидазы D-аминокислот Trigonopsis variabilis: направленный мутагенез остатка Phe258. Биохимия, 2012, т.77, №10, с.1424-1433.

5. Cherskova N.V. (Komarova N.V.), Khoronenkova S.V., Panteleev M.A., Tishkov V.I.

Site-directed mutagenesis of D-amino acid oxidase from yeast Trigonopsis variabilis.

J. Biotechnol. 2010, v.150, N S1, p.442.

6. Тишков В.И., Комарова Н.В., Савин С.С., Савина Л.И., Балдин С.М. Мутантная оксидаза D-аминокислот (варианты). Заявление о выдаче патента Российской Федерации на изобретение № 2012140816 от 25.09.2012.

7. Ясная А.С., Хороненкова С.В., Черскова Н.В. (Комарова Н.В.), Федорчук В.В., Федорчук Е.А., Панин Н.В., Швядас В., Тишков В.И. Новые биокатализаторы для синтеза антибиотиков. Материалы Пятого Московского международного конгресса “Биотехнология: состояние и перспективы развития”, Март 16-20, 2009, Москва, ч.2, с.286-287.

8. Tishkov V.I., Cherskova N.V. (Komarova N.V.), Savin S.S., Khoronenkova S.V. Mutant D-Amino Acid Oxidases for Diagnostics. Abstracts of International Conference "Biocatalysis-2009. Fundamentals & Applications", Arkhangelsk, June 19-24, 2009, p.41.

9. Cherskova N.V. (Komarova N.V.), Khoronenkova S.V., Tishkov V.I. Role of Arg1and Arg220 in Dimer Stability of D-Amino Acid Oxidase. Abstracts of International Conference "Biocatalysis-2009. Fundamentals & Applications", Arkhangelsk, June 1924, 2009, p.65.

10. Комарова Н.В., Голубев И.В., Хороненкова С.В., Тишков В.И. Направленный мутагенез остатка Phe54 в окcидазе D-аминокислот из Trigonopsis variabilis:

влияние на каталитические свойства и стабильность. Материалы международного молодежного форума «Ломоносов-2011», секция «Химия», Москва, 2011, с.409.

11. Тишков В.И., Хороненкова С.В., Алексеева А.А., Гончаренко К.В., Серенко А.А., Комарова Н.В., Голубев И.В., Рыженкова К.В., Газарян И.Г., Хушпульян Д.М., - 21 Березин А.И., Степашкина А.В., Федорчук В.В., Федорчук Е.А., Чубарь Т.А., Савина Л.И., Савин С.С.. Генно-инженерные ферменты для медицинской диагностики и фарамацевтики. Материалы Шестого Московского международного конгресса “Биотехнология: состояние и перспективы развития”, Март 21-25, 2011, Москва, ч.1, с.37-38.

12. Комарова Н.В., Голубев И.В., Хороненкова С.В., Тишков В.И. Генно-инженерные формы оксидазы D-аминокислот с улучшенными свойствами. Международная школа-конференция молодых ученых по молекулярной биологии и биотехнологии леса: материалы конференции, г. Брянск, Россия, 12-18 сент. 2011 г. – М.: изд.

МГУ Леса, 2011. с.262-263.

13. Березин А.И., Комарова Н.В., Голубев И.В., Хороненкова С.В., Савин С.С., Тишков В.И. Температурная стабильность оксидазы D-аминокислот.

Международная школа-конференция молодых ученых по молекулярной биологии и биотехнологии леса: материалы конференции, г. Брянск, Россия, 12-18 сент.

2011 г. – М.: изд. МГУ Леса, 2011, с.257-258.

14. Комарова Н.В., Голубев И.В., Хороненкова С.В., Тишков В.И. Новые мутантные оксидазы D-аминокислот с улучшенными свойствами. 2-я международная школа «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах. Безопасность и наномедицина»: материалы конференции, Пансионат «Заря», Московская обл., Россия, 19-24 сент. 2011 г. – М., 2011, с.79.

15. Комарова Н., Голубев И., Тишков В.И. Белковая инженерия оксидазы D-аминокислот для повышения эффективности в реакции окисления цефалоспорина С. Ломоносов и Гумбольдт: научное сотрудничество России и Германии – от истоков до наших дней: материалы международной конференции, г. Москва, Россия, 14-17 нояб. 2011 г. – М.: Институт энергии знаний, 2011, с.217-218.

16. Рыженкова К.В., Комарова Н.В. Стабилизация оксидазы D-аминокислот из дрожжей Trigonopsis variabilis гидрофобизацией -спиралей методом направленного мутагенеза. Материалы Международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии», Март 20-22, 2012, Москва, ч.1, с.143-144.

17. Голубев И.В., Комарова Н.В., Тишков В.И. Белковая инженерия оксидазы D-аминокислот из дрожжей Trigonopsis variabilis. Материалы XIX Молодежной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Международного молодежного научного форума «ЛОМОНОСОВ-2012»), Москва, 9-13 апреля 2012 г. - М.: МАКС Пресс, 2012, ISBN 978-5-317-04041-3, с.516.

18. Savin S., Komarova N., Golubev I., Ryzhenkova K., Savina L., Khoronenkova S., Tishkov V. Engineering of substrate specificity of yeast D-amino acid oxidase. Abstracts of The 20th INPEC Conference “Engineering Protein - Systems, Functions and Applications”, April 18-20, 2012, Taipei, Taiwan, P6, p. 39.

19. Komarova N.V., Golubev I.V., Ryzhenkova K.V., Tishkov V.I. Improvement of stability of D-amino acid oxidase using rational mutagenesis approach. 9th International Conference on Protein Stabilization. Book of Abstracts. May 2-4, 2012, Lisbon, Portugal, P24.

20. Tishkov V.I., Komarova N.V., Golubev I.V., Baldin S.M., Savin S.S. Engineered D-amino acid oxidase for medicine diagnostics. Programme & Abstracts of V International Meeting “Early events in Human Pathologies”, Listvyanka, Baikal, Russia, July 9-12, 2012, p.37.

- 22






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.