WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

Кириллина Мария Петровна

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

ПРИ ОПУХОЛЕВОМ РОСТЕ

В УСЛОВИЯХ РЕСПУБЛИКИ САХА (ЯКУТИЯ)

03.03.04 клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Новосибирск 2012

Работа выполнена в ФГБУ «Якутский научный центр комплексных медицинских проблем» СО РАМН (Якутск) и в ФГБУ «Научно-исследовательский институт региональной патологии и патоморфологии» СО РАМН (Новосибирск)

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор                Лушникова Елена Леонидовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор                Гуляева Людмила Федоровна

                                                       заведующая лабораторией молекулярных

                                                       механизмов канцерогенеза ФГБУ

«НИИ молекулярной биологии

и биофизики» СО РАМН

доктор биологических наук, профессор                Торнуев Юрий Васильевич

главный научный сотрудник лаборатории

функциональной морфологии ФГБУ

«НИИ региональной патологии

и патоморфологии» СО РАМН

Ведущая организация: ФГБУ «Научный центр клинической и экспериментальной медицины» СО РАМН (Новосибирск)

Защита диссертации состоится «_____» ______________ 2012 г. в _____ час. на заседании диссертационного Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 001.037.01 в ФГБУ «Научно-исследовательский институт региональной патологии и патоморфологии» СО РАМН по адресу: 630117, Новосибирск, ул. Тимакова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Научно-исследовательский институт региональной патологии и патоморфологии» СО РАМН.

Автореферат диссертации разослан « _______ » ________________ 2012 г.

Ученый секретарь

Совета по защите докторских

и кандидатских диссертаций

Д 001.037.01                                                Молодых Ольга Павловна

доктор биологических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время одной из актуальнейших проблем не только онкологии, но и здравоохранения в целом является профилактика рака молочной железы (РМЖ), что обусловлено быстрым, неуклонным и повсеместным ростом заболеваемости данной формой рака, вышедшей на первое место в структуре заболеваемости женщин злокачественными новообразованиями (Писарева Л.Ф. и др., 2006). Связано это с лидирующим положением данной опухоли у женщин, опережающим по частоте встречаемости другие злокачественные новообразования (Семиглазов В.Ф., 2004; Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2005; IARC, 1997, 2001). Несмотря на большое количество исследований, посвященных совершенствованию методов диагностики и лечения РМЖ, результаты далеко не всегда остаются удовлетворительными.

На сегодняшний день при оценке особенностей клинического течения, возможного исхода заболевания и выбора наиболее адекватной тактики лечения во внимание принимают такие клинико-морфологические параметры, как возраст, размеры первичного опухолевого очага, гистологический тип опухоли и степень ее злокачественности, наличие метастазов в аксиллярных лимфатических узлах и ряд других показателей (Тюляндин С.А., 2003; Божок А.А. и др., 2005; Писарева Л.Ф. и др., 2010, 2012).

Не вызывает сомнения тот факт, что обнаружение РМЖ на ранних стадиях способствует улучшению отдаленных результатов лечения. Вместе с тем, индивидуальная оценка прогноза РМЖ, даже на ранней стадии опухолевого процесса, считается крайне актуальной. По данным ряда исследователей, выявить больных РМЖ с высокой вероятностью раннего рецидива на ранней стадии позволяет изучение показателей экспрессии некоторых молекулярно-биологических маркеров в первичных опухолях (Герштейн Е.С., Кушлинский Н.Е., 2002; Кушлинский Н.Е., Герштейн Е.С., 2002; Toi M. et al., 1994; Beenken S.W., Bland K.I., 2002).

Иммуногистохимия (ИГХ) – метод выявления точной локализации того или иного клеточного или тканевого антигена, позволяющий проводить иммунологический анализ срезов тканей в условиях сохранения морфологии клеток. ИГХ-идентификация опухолей основана на выявлении в ткани с помощью различных моно- и поликлональных антител экспрессии тех или иных белков, связанных с определенными органами, тканями, типами клеток, специфической функцией, пролиферативной активностью, внеклеточным матриксом и т.д. При этом к наиболее важным биологическим характеристикам опухолей, имеющим значение в прогнозе болезни, относят пролиферативную активность (ПА) (по антигену Ki-67) опухолевых клеток, уровень их дифференцировки, гормонально-рецепторный статус, интенсивность апоптоза (по маркерам bcl-2 и p53), которые определяются с помощью иммуногистохимических методов (Ferrara N., 1995; Adams J. et al., 2000; Biroccio A. et al., 2000).

Несмотря на широкое внедрение иммуногистохимических методик в диагностику онкозаболеваний, следует отметить, что в данной области все еще происходит накопление знаний об изменении экспрессии тех или иных маркеров пролиферации, дифференцировки и гибели клеток. В большинстве исследований оценивается экспрессия ограниченного числа маркеров, что не позволяет выделить наиболее информативные предикторы усиления малигнизации. Важно также отметить необходимость проведения диагностических исследований с учетом этнической принадлежности, поскольку для многих видов злокачественных опухолей, в том числе, и для рака молочной железы установлена существенная роль этнических и генетических факторов (Берштейн Л.М., 2005).

Цель исследования изучить особенности экспрессии молекулярных маркеров в эпителиальных клетках молочной железы при опухолевом росте в зависимости от возраста и этнической принадлежности на примере Республики Саха (Якутия).

Задачи исследования:

1. Изучить содержание и уровень экспрессии рецепторов эстрогена (ER) и прогестерона (PgR) в эпителиальных клетках рака молочной железы в зависимости от возраста.

2. Изучить и выявить особенности маркеров апоптоза и пролиферации в эпителиальных клетках рака молочной железы (Ki-67, р53, bcl-2).

3. Провести сравнительный анализ «иммуногистохимических фенотипов» эпителиальных клеток молочной железы при РМЖ в зависимости от возраста, размера опухоли, степени гистологической злокачественности.

4. Провести сравнительный анализ молекулярно-биологических свойств эпителиальных клеток молочной железы при РМЖ в зависимости от этнической принадлежности.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное иммуногистохимическое исследование эпителиальных клеток молочной железы при опухолевом росте у женщин разной этнической принадлежности в Республике Саха (Якутия). Впервые установлены особенности экспрессии маркеров пролиферативной активности, дифференцировки и апоптоза в зависимости от возраста, этнической принадлежности, характера роста и степени злокачественности опухолей.

Впервые, по данным клинико-морфологического анализа, установлено, что рак молочной железы развивается чаще у представительниц некоренных национальностей Республики Саха (Якутия) (60%), чем у представительниц коренной национальности (40%). Заболевание раком молочной железы с наибольшей частотой регистрируется у женщин коренной и некоренных национальностей в возрастных группах 50 – 59 лет (32,6%) и 60 – 69 лет (21,8%). У женщин некоренных национальностей опухоли с распространением в грудную стенку и кожу развиваются в 2 раза чаще (15,9% случаев), чем у женщин коренной национальности (6,8% случаев).

Впервые показано, что вне зависимости от этнической принадлежности наиболее распространенной гистологической формой рака молочной железы у женщин Республики Саха (Якутия) является инфильтративный протоковый рак (65,3%). В общей группе обследованных преобладают клинические варианты течения IIА и IIБ стадий (58,5% случаев), в то время как у пациенток до 39 лет – IIIБ стадия (43,2%).

Впервые при проведении иммуногистохимического анализа показано, что в общей группе обследованных преобладают опухоли молочной железы, в которых эпителиоциты экспрессируют рецепторы эстрогена и прогестерона (64,9% случаев). Установлено увеличение с возрастом доли рецептор-содержащих опухолей молочной железы. Рецептор-отрицательный профиль рака молочной железы во всех возрастных группах встречается реже вне зависимости от этнической принадлежности. Впервые показано, что у женщин некоренных национальностей повышение уровня экспрессии рецепторов эстрогена с возрастом статистически достоверно, в то время как у представительниц коренной национальности такая закономерность отсутствует. Увеличение доли рецептор-положительных опухолевых клеток с возрастом в большей степени выражено для рецепторов эстрогена, чем прогестерона.

Впервые установлено, что между размерами опухолей и уровнем экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона существует отрицательная корреляционная связь. Опухоли с высокой степенью злокачественности характеризуются низкой экспрессией рецепторов эстрогена и прогестерона. Впервые выявлено, что степень гистологической злокачественности опухолей молочной железы положительно коррелирует с экспрессией антигенов Ki-67 и p53 и отрицательно – с экспрессией антигена bcl-2.

В качестве наиболее информативных критериев повышения злокачественности опухолей молочной железы предложено рассматривать понижение экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона, повышение экспрессии Ki-67 и р53 и уменьшение экспрессии bcl-2.

Теоретическая и практическая значимость. Выявленные новые сведения об иммуногистохимических особенностях эпителиальных клеток при раке молочной железы могут быть использованы в практическом здравоохранении для прогнозирования течения болезни и оптимизации терапевтических подходов, индивидуализации химио-, гормональной, таргетной и лучевой терапии у больных РМЖ. Установленные особенности иммуногистохимических свойств эпителиальных клеток молочной железы при РМЖ позволят дополнить фундаментальные представления о канцерогенезе и позволят улучшить качество и достоверность морфологической оценки степени экспрессии онкомаркеров.

Внедрение результатов исследования в практику. Результаты исследования используются в практической работе патологоанатомического отдела Национального центра медицины ГБУ РС (Я) «Республиканская больница №1 – Национальный центр медицины», в учебном процессе на кафедрах гистологии, цитологии и эмбриологии, нормальной и патологической анатомии Медицинского института Северо-Восточного Федерального университета.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. РМЖ чаще имеет рецептор-положительный статус (64,9%). У женщин некоренных национальностей с возрастом происходит повышение уровня экспрессии рецепторов эстрогена, у женщин коренных национальностей такая закономерность отсутствует.

2. Прогностические факторы РМЖ – степень пролиферации (Ki-67), экспрессия p53 и bcl-2 – имеют достоверную связь со степенью гистологической злокачественности.

3. У женщин коренных национальностей частота выявления гормонозависимых опухолей при РМЖ не зависит от возраста; имеется связь между ПА и уровнем экспрессии гена-супрессора р53.

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на 16-й межрегиональной конференции онкологов «Актуальные вопросы маммологии на Севере» (Якутск, 2008), на III съезде Российского общества патологоанатомов (Самара, 2009), ХVI межрегиональной научно-практической конференции онкологов с международным участием «Актуальные вопросы преканцерогенеза и злокачественных опухолей в различных климато-географических зонах» (Якутск, 2009), на Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 100-летию Российского общества патологоанатомов» (Санкт-Петербург, 2009), на XV Международной научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Современные техника и технологии» (Томск, 2009), Республиканской научно-практической конференции «Медицина в современном мире: взгляд научной молодежи» (Якутск, 2010), XVIII межрегиональной научно-практической конференции онкологов Якутии «Современное состояние и перспективы развития онкологической помощи в различных климатогеографических зонах» (Якутск, 2012), межлабораторной научной конференции в ФГБУ «НИИ региональной патологии и патоморфологии» СО РАМН (Новосибирск, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 21 работа, в том числе 3 в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертационных исследований.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 122 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 32 рисунками (из них 17 микрофотографий), содержит 12 таблиц. Состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, главы собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы. Список литературы включает 277 источников, из них – 161 отечественных авторов и 116 – зарубежных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Общая характеристика клинического материала. Объектом исследования послужили фрагменты тканей молочной железы, полученные от 294 женщин, которым были проведены оперативное лечение и/или пункционные биопсии в Якутском Республиканском онкологическом диспансере и 2-м хирургическом отделении Клинического центра ГБУ РС (Я) «Республиканская больница № 1 – Национальный центр медицины». В проводимом исследовании коренными жителями считали якутов, эвенов и эвенков, некоренными – всех лиц других национальностей, в различные сроки прибывших из регионов России и стран СНГ. По этнической принадлежности женщин коренных национальностей было 118 (40,1%), женщин некоренных национальностей – 176 (59,9%). Вся выборка представлена 294 патологоанатомическими исследованиями. Все исследования проведены с одобрения Локального комитета по биомедицинской этике ФГБУ «Якутский научный центр комплексных проблем» СО РАМН.

Диагноз рака молочной железы устанавливали согласно «Гистологической классификации опухолей молочной железы» (ВОЗ, 2003). Распространенность заболевания определяли согласно международной классификации по системе TNM (2002г.). Степень злокачественности (Grade) определяли по параметрам Elston&Ellis (Elston C.W., Ellis I.O., 1991).

Морфологические (цитологические, гистологические и иммуногистохимические) методы исследования. В исследование вошли данные морфологического исследования операционного материала: удаленная молочная железа с подмышечно–подключично-подлопаточной клетчаткой – при выполнении радикальной мастэктомии и сектор молочной железы с опухолью с подмышечно-подключично-подлопаточной клетчаткой – при выполнении радикальной резекции. В ткани молочной железы измеряли размер опухоли, подсчитывали и измеряли лимфатические узлы. Материал фиксировали в 10% нейтральном формалине в течение 24 ч. Далее фрагменты молочной железы обрабатывали по стандартной методике для получения парафиновых срезов.

Иммуногистохимическое исследование проводили на серийных парафиновых срезах. После демаскировки антигенных детерминант окрашивание проводили непрямым иммунопероксидазным методом. Срезы инкубировали 40 – 60 мин с первичными моноклональными антителами к антигенам эстрогена (ER), прогестерона (PgR), Ki-67, p53, bcl-2 (использованы RTU-ER-6F11, RTU-PGR-312, RTU-Ki-67-MM1, RTU-p53-DO7, RTU-bcl-2/100/D5, «Novocastra», Великобритания). Окрашивание выполняли в соответствии с инструкцией фирмы-производителя.

При оценке результатов исследования для ER и PgR проводили определение доли окрашенных клеток в баллах (Петров С.В., 2004; Leake R.et al., 2000): 0 – полное отсутствие ядерного окрашивания, 1 – до 10% клеток в исследуемом препарате с ядерным окрашиванием, 2 – до 1/3 клеток с ядерным окрашиванием, 3 – от 1/3 до клеток с ядерным окрашиванием, 4 – от до 2/3 клеток с ядерным окрашиванием, 5 – от 2\3 до 100% клеток с ядерным окрашиванием. Определение интенсивности экспрессии антител также выполняли в баллах: 0 – полное отсутствие экспрессии в ядрах клеток опухоли, 1 – слабое ядерное окрашивание, 2 – умеренное ядерное окрашивание, 3 – сильное ядерное окрашивание. При получении суммарного результата, который был меньше или равен 2, реакция считалась негативной (-), 3 и более – позитивной (+).

Индекс Ki-67-положительных клеток (пролиферативную активность – ПА) определяли при анализе не менее 100 ядер по формуле:

Низкая ПА соответствовала индексу Ki-67 менее или равному 15%; высокая ПА – при индексе Ki-67 более 15%.

Низкая экспрессия р53 регистрировалась при наличии экспрессии в менее чем 25% клеток; высокая экспрессия р53 – при наличии экспрессии в более чем 25% ядер опухолевых клеток (ядерное окрашивание). Низкая экспрессия bcl-2 регистрировалась при наличии экспрессии в менее чем 25%; высокая экспрессия bcl-2 – при наличии экспрессии в более чем 25% опухолевых клеток (цитоплазматическое окрашивание).

Статистическая обработка полученных данных. Статистический анализ данных проводили с помощью статистического пакета SPSS STATISTICS 17.0 (SPSS Inc.). Проверка нормальности распределения количественных признаков проведена с использованием критерия Колмогорова-Смирнова с поправкой Лиллиефорса и критерия Шапиро-Уилка. При сравнении независимых групп по количественным признакам применяли непараметрические критерии Манна-Уитни и Краскела-Уоллиса. Сравнение групп по качественным признакам проводили с использованием таблиц сопряженности с определением критерия 2 и точного критерия Фишера. Для анализа взаимосвязи между анализируемыми признаками применяли ранговый корреляционный анализ по Спирмену. Выборочные параметры, приводимые далее в таблицах, имеют следующие обозначения: n – объем анализируемой подгруппы; М – среднее значение; SD – стандартное отклонение; Me (25 и 75%) – медиана и межквартильное распределение; р – достигнутый уровень значимости. Критическое значение уровня значимости принималось равным 5%.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Средний возраст прооперированных женщин составил 54,2±12,1 года. Женщин коренных национальностей (118 случаев) было меньше, чем некоренных национальностей (176 случаев) (р=0,0005). Большинство обследованных составили женщины возрастной группы 50 – 59 лет – 96 человек (32,6%), в возрасте 60 – 69 лет были 64 женщины (21,8%), в возрасте от 40 – 49 лет – 60 женщин (20,4%), до 39 лет – 37 женщин (12,6%), в возрасте 70 лет и старше – 37 женщин (12,6%). Несмотря на то, что РМЖ чаще встречается в возрасте 55 – 65 лет, в последние годы наблюдается тенденция к возрастанию доли молодых женщин по отношению ко всему массиву больных РМЖ (Закиряходжаев А.Д., 2007).

Эта тенденция прослеживается и в нашем исследовании. Среди женщин в возрасте до 39 лет 5 женщин (1,7%) были в возрасте от 20 до 29 лет, от 30 до 39 лет – 32 случая (10,9%). Эти результаты сопоставимы с показателями экономически развитых стран, где примерно 75% случаев РМЖ приходится на женщин в постменопаузе (Anderson W.F. et al., 2002). Полученные нами результаты подтверждают общепринятое мнение, что возраст женщины с РМЖ является одним из прогностических критериев.

Преимущественной гистологической формой РМЖ у обследованных женщин был инфильтративный протоковый РМЖ, который выявлен у 192 (65,3%) женщин. Вторым по частоте встречаемости был смешанный рак (инфильтративный протоково-дольковый) (11,2%), на третьем месте – инфильтративный дольковый рак (7,8%). В 15 (5,1%) случаях был диагностирован нейроэндокринный рак, в 7 (2,4%) случаях был диагностирован инвазивный рак без уточнения формы ввиду выраженности лечебного патоморфоза и в 6 (2,0%) случаях – рак Педжета. Другие формы рака (медуллярный, тубулярный, папиллярный и др.) составили 6,8% (20 случаев).

В нашем исследовании преобладали опухоли размерами от 2 до 5 см – 185 случаев (62,9%). Сравнение по этнической принадлежности показало, что у женщин некоренных национальностей опухоли с распространением в грудную стенку и кожу были выявлены в 28 (15,9%) случаях, тогда как у женщин коренных национальностей – в 8 (6,8%) случаях (2=4,66, df=1, p=0,03).

Нами установлена также зависимость между размерами первичной опухоли и количеством пораженных метастазами лимфатических узлов (р=0,001), которая может рассматриваться в качестве критерия неблагоприятного клинического течения РМЖ. Оценка распространенности заболевания, согласно международной классификации по системе TNM (2002 г.), показала, что у 26 (8,8%) женщин с РМЖ была зарегистрирована I стадия заболевания, у 122 (41,5%) – IIА стадия, у 50 (17,0%) – IIБ стадия, у 20 (6,8%) – IIIА стадия, у 75 (25,5%) – IIIБ стадия и у 1 (0,3%) женщины – IV стадия. В возрастной группе женщин до 39 лет наиболее часто регистрировался РМЖ IIIБ стадии, тогда как в других возрастных группах чаще отмечалась IIА стадия РМЖ (2=5,7, df=1, р=0,01). В совокупных показателях в группах коренных и некоренных женщин при РМЖ выявлено, что в обеих этнических группах наиболее часто встречался РМЖ IIА стадии (52/44,1% и 70/40% соответственно) (2=6,2, df=5, р=0,28).

Полученные данные свидетельствуют о том, что у молодых женщин (до 39 лет) отмечалась более высокая частота выявления РМЖ на поздних стадиях (IIIБ), что можно объяснить низкой клинической настороженностью и тем, что данная возрастная группа не входит в программу скрининга заболеваний молочной железы, в которую в Республике Саха (Якутия) включены женщины в возрасте 40 лет и старше.

Исследование гистологической степени злокачественности РМЖ установило, что большинство больных относились к группе с G2 опухолями (49,6%). Статистически значимые взаимосвязи установлены между размерами опухолей и степенью злокачественности. Так, опухоли Т4 достоверно чаще характеризовались степенью гистологической злокачественности G3 (19,2%), чем G1 (2= 4,6, df=1, р=0,03). Также установлена зависимость между наличием метастазов в лимфатических узлах от степенью злокачественности. Так, при G3 у 61,5% женщин выявлены метастазы в регионарные лимфатические узлы, в то время как при G1 – в 40,6% (2= 5,1, df=1, р1-2= 0,02), а при G2 – в 41,1% случаев (2= 5,6, df=1, р2-3=0,01).

При иммуногистохимическом анализе экспрессии ER и PGR в эпителиоцитах молочных желез нами были сформированы 4 группы с различной комбинацией стероидных рецепторов в опухолевых клетках: ER+/PGR- (7,8%), ER-/PGR+ (5,4%), ER-/PGR- (35%), ER+/PGR+ (51,7%). В совокупности рецептор-положительных опухолевых клеток при РМЖ было достоверно больше, чем рецептор-отрицательных (р<0,05) – 191 случай (64,9%) от общего числа исследований: в возрастной группе до 50 лет – 60 случаев (31,4%), старше 50 лет – 131 случай (68,6%). Эти данные несколько меньше, чем полученные другими исследователями в развитых странах (80%) (Anderson W.F., 2002). Анализ динамики изменения рецепторного статуса РМЖ в зависимости от возраста не выявил статистически достоверных различий (р=0,14), но установлена тенденция к увеличению частоты (доли) рецептор-положительных РМЖ с увеличением возраста. Так, в группе до 39 лет они составили 56,7%, а в группе старше 70 лет – 75,6% (рис. 1).

Рис. 1. Динамика изменения рецепторного статуса РМЖ в зависимости от возраста.

При этом в обеих группах преобладал рецептор-положительный профиль РМЖ (соответственно 48,3 и 54% случаев у коренных и некоренных жительниц); рецептор-отрицательный профиль РМЖ встречался реже (соответственно 38,1 и 32,9% случаев). Установлена связь между возрастом пациенток и экспрессией ER (р=0,03) (рис. 2). Если в возрасте до 39 лет средний суммарный балл оценки доли положительных клеток и интенсивности уровня экспрессии ER был равен 3,2, то в последующих возрастных группах отмечено неуклонное повышение этих показателей до 3,7 баллов у больных РМЖ старше 70 лет. При оценке изменений уровня экспрессии PgR подобной линейной связи не выявлено (р=0,54).

Рис. 2. Изменение уровня экспрессии ER и PgR при РМЖ в зависимости от возраста.

При статистическом анализе данных в соответствии с этнической принадлежностью нами выявлены различия среди женщин коренной и некоренной национальностей. У коренных женщин с возрастом наблюдалась тенденция к незначительному увеличению уровня экспрессии ER, в то время как у женщин некоренных национальностей повышение уровня экспрессии ER было статистически достоверным (r=0,20, p=0,01). Другие авторы также отмечали различия в содержании гормонов в крови у женщин разных этнических групп в регионах Сибири, в частности, более высокий уровень эстрадиола у представительниц коренных народов (тувинок, хакасок, буряток) при меньшей частоте заболеваемости РМЖ (Писарева Л.Ф. и др., 2011). С учетом вышесказанного можно сделать предположение, что одним из последствий этнических различий в особенностях биосинтеза стероидов (конкретно ER) могут быть и различия в частоте «использования» различных механизмов канцерогенеза со сдвигом к более высокой частоте гормон-индуцированных повреждений ДНК у европеоидов по сравнению с представителями азиатской расы. К тому же более высокий уровень этих гормонов у коренных народов может отражать разные адаптивные программы к условиям внешней среды и не служить значимым фактором риска развития РМЖ (Писарева Л.Ф. и др., 2011).

Нами установлена отрицательная статистически значимая связь между размером опухоли и уровнем экспрессии ER (r= -14,1, p=0,016) и PgR (r= -20,5, p<0,001), т.е. чем выше был уровень экспрессии рецепторов, тем меньше оказывался размер опухоли.

Статистический анализ сопоставления степени злокачественности опухолей с наличием ER и PgR выявил корреляцию между степенью гистологической злокачественности РМЖ и рецепторным профилем клеток опухоли (2=20,40, df=6, р=0,002). Опухоли с высокой степенью гистологической злокачественности характеризовались низкой экспрессией ER и PgR (p<0,05). При увеличении степени злокачественности статистически значимо чаще наблюдались рецептор-отрицательные опухоли, а частота рецептор-положительных – снижалась (р<0,05).

Пролиферативная активность опухолевых клеток молочной железы определялась с помощью универсального маркера пролиферации Ki-67, который экспрессируется практически во всех фазах митотического цикла и отражает величину пролиферативного пула опухоли (Пожарисский К.М., Леенман Е.Е., 2000). В нашем исследовании в 272 случаях (92,5%) экспрессия Ki-67 была выявлена в менее чем 15% опухолевых клеток (низкая ПА). Экспрессию Ki-67 в более чем 15% опухолевых клеток (высокая ПА) мы наблюдали у 22 женщин (7,5%). Ввиду значительного количества отрицательных результатов при выявлении маркера Ki-67 (экспрессия была равна «0») и большой вероятности ложноотрицательного результата, нами было принято решение провести анализ с учетом значений индекса больше 1%, для исключения статистических погрешностей.

Анализ характера экспрессии Ki-67 в зависимости от возраста показал, что уровень экспрессии антигена Ki-67 не зависел от возраста (2= 4,1, df=4, р=0,39). Высокая ПА опухолевых клеток встречалась как у пациенток пожилого, так и более молодого возраста. В совокупных показателях в группах коренного и некоренного населения при РМЖ статистически значимых корреляций ПА с этнической принадлежностью установлено не было (2= 1,6, df=1, р=0,20). Многочисленные исследования показали, что ПА опухолевых клеток при РМЖ прямо коррелирует со степенью гистологической злокачественности (Упоров А.В. и др., 2000; Keshgegian A. et al., 1995). Полученные в нашем исследовании результаты свидетельствуют о том, что уровень экспрессии антигена Ki-67 статистически значимо различался при разных гистологических вариантах РМЖ (2=3,58, df=1, р=0,05): наблюдалась тенденция к увеличению степени гистологической злокачественности при увеличении экспрессии Ki-67. Эти результаты не противоречат данным литературы об антигене Ki-67 как маркере неблагоприятного исхода заболевания (Choi D.H., 2005; Costarelli L. et al., 2005; Kronqvist P. et al., 2004).

Важно отметить, что ПА опухолевых клеток служит независимым прогностическим показателем возникновения рецидива, общей и безрецидивной выживаемости (Honkoop A.H. et al., 1998; Imamura H. et al., 1997; Pietilainen T. et al., 1996), а также предсказательным фактором для определения чувствительности к лучевой и химиотерапии (Rozan S. et al., 1998). Проведенный нами анализ подтвердил зависимость между степенью гистологической злокачественности и пролиферативной активностью опухолей, что доказывает необходимость учета ПА опухолевых клеток в оценке злокачественного потенциала и прогноза РМЖ.

При анализе взаимосвязи с другими молекулярными маркерами мы установили, что имеются статистически значимые связи между ПА (по маркеру Ki-67) и уровнем экспрессии мутантного гена-супрессора р53 (r=0,33, p<0,001) в группе коренных женщин. По данным А.В.Упорова и др. (2000), возможно это связано с мутациями супрессорного гена р53, по современным представлениям, играющего ведущую роль в регуляции клеточного деления.

При иммуногистохимическом исследовании мутантного гена-супрессора р53 его низкая экспрессия (в менее чем 25% опухолевых клеток) наблюдалась в 197 (67,0%) случаях, в то время как высокая экспрессия (более 25% опухолевых клеток) – в 97 (33,0%) случаях. При анализе данного показателя с учетом этнической принадлежности нами установлено, что у коренных женщин существует статистически значимая слабая положительная корреляция (r=0,21, p=0,02) между возрастом и экспрессией р53. Низкая экспрессия р53 у представительниц коренного населения наблюдалась в возрасте 40 – 49 лет (27,2%), а у некоренных – в возрасте 50 – 59 лет (36,7%). В совокупных показателях в обеих группах статистически значимых возрастных различий не выявлено (2=1,8, df=4, р=0,76). Установлена положительная зависимость между уровнем экспрессии р53 и увеличением степени гистологической злокачественности опухоли (2=7,9, df=2, р=0,01), что доказывает необходимость учета выраженности процесса апоптоза клеток в оценке злокачественного потенциала опухоли и прогноза РМЖ.

При иммуногистохимическом исследовании экспрессии антиапоптотического гена-супрессора bcl-2 нами выявлена низкая экспрессия bcl-2 в 142 случаях (48,3%), высокая экспрессия – в 152 случаях (51,7%). Анализ данных с учетом этнической принадлежности не выявил различий в частоте встречаемости случаев с низкой и высокой экспрессией bcl -2 (2=0,23, df=1, р=0,64). Низкая экспрессия bcl-2 у коренных и некоренных женщин наиболее часто регистрировалась в возрасте 50 – 59 лет (соответственно 33,9 и 36,1%). Высокая экспрессия bcl-2 у коренных наблюдалась чаще в возрасте 60 – 69 лет (27,1%), у некоренных – в возрасте 50 – 59 лет (37,6%).

По данным литературы, bcl-2 является опухолевым геном-супрессором, влияющим на механизмы клеточной смерти, подавляя апоптоз (Jacobson M.D. et al., 1993). Как считают многие авторы, повышенная экспрессия bcl-2 ассоциируется с увеличением выживаемости пациенток после проведения адъювантной терапии. Возможно, это объясняется тесной связью между экспрессией bcl-2 и экспрессией ER и PgR, а также низкой ПА. Однако bcl-2 не является независимым прогностическим фактором (Buchholtz T.A.et al., 2003; Pusztai I., 2004). Нами установлена отрицательная корреляция между экспрессией антигена bcl-2 и степенью гистологической злокачественности опухолей (r=-12,9, p=0,03), т.е. опухоли с высокой степенью злокачественности характеризовались низкой экспрессией bcl-2 (рис. 3), которая характеризует сохранение регуляции апоптоза на уровне нормы.

 

Рис. 3. Зависимость между экспрессией bcl-2 и степенью гистологической злокачественности опухолей молочной железы.

При оценке уровня экспрессии гена-ингибитора bcl-2 с фенотипом ER-/PgR- выявлены статистически значимые различия между низкой и высокой экспрессией bcl-2 (р<0,05): при дважды отрицательном рецепторном профиле РМЖ низкая экспрессия bcl-2 встречалась в 1,5 раз чаще, чем высокая (соответственно 60 и 42 случая). При дважды-положительном профиле РМЖ (ER+/PgR+), наоборот, в 1,5 раза чаще регистрировался высокий уровень bcl-2, чем низкий (соответственно 92 и 61 случай). То есть при высокой экспрессии bcl-2 статистически значимо чаще наблюдались рецептор-положительные опухоли, а частота рецептор-отрицательных снижалась (р<0,05). Следовательно, такой прогностический благоприятный критерий РМЖ, как наличие ER и PgR, сочетался с достоверно более высоким уровнем bcl-2.

Наши данные также подтверждают исследования многих авторов, утверждающих, что интенсивность реакции при оценке bcl-2 и ее распространенность коррелирует с наличием рецепторов ER и PgR и низкой степенью злокачественности опухолей. Следовательно, такой прогностический благоприятный критерий РМЖ, как наличие ER и PgR на опухолевых клетках, сочетался с достоверно более высоким уровнем экспрессии bcl-2. Таким образом, экспрессия bcl-2 связана с факторами, указывающими на благоприятный прогноз противоопухолевой терапии (Leek R.D. et al., 1994; Silvestrini R. et al., 1994).

Изучение уровня экспрессии bcl-2 позволяет отнести данный показатель к маркерам биологического поведения опухоли и прогноза РМЖ. Кроме того, по данным некоторых исследователей (Владимирская Е.Б. и др., 1997; Лихтенштейн А.В. и др., 1997), резистентность опухолей к воздействию противоопухолевых препаратов и облучению может быть обусловлена повышенной экспрессией bcl-2, поскольку гибель опухолевых клеток при этих воздействиях происходит по механизму апоптоза (Levine A.J. et al., 1991). Исходя из этого, можно сделать вывод, что экспрессия bcl-2 имеет непосредственное отношение и к эффективности химиотерапии (Eliopoulus A.G. et al., 1995). Однако bcl-2 не является независимым прогностическим фактором (Buchholtz T.A. et al., 2003; Pusztai I., 2004).

ВЫВОДЫ

  1. По данным клинико-морфологического анализа, рак молочной железы развивается чаще у представительниц некоренных национальностей Республики Саха (Якутия) (60%), чем у представительниц коренных национальностей (40%). Заболевание раком молочной железы с наибольшей частотой регистрируется у женщин коренных и некоренных национальностей в возрастных группах 50 – 59 лет (32,6%) и 60 – 69 лет (21,8%). У женщин некоренных национальностей опухоли с распространением в грудную стенку и кожу развиваются в 2 раза чаще (15,9% случаев), чем у женщин коренных национальностей (6,8% случаев).
  2. Преимущественной гистологической формой рака молочной железы у женщин Республики Саха (Якутия) является инфильтративный протоковый рак (65,3%). В общей группе обследованных преобладают клинические варианты течения IIА и IIБ стадий (58,5% случаев), в то время как у пациенток до 39 лет – IIIБ стадия (43,2%). В обеих этнических группах наиболее часто встречается рак молочной железы IIА стадии (44 и 40% соответственно некоренных и коренных национальностей).
  3. По данным иммуногистохимического анализа, в общей группе обследованных преобладают опухоли молочной железы, в которых эпителиоциты экспрессируют рецепторы эстрогена и прогестерона (64,9% случаев): в возрастной группе до 50 лет – 31,4% случаев, старше 50 лет – 68,6% случаев. Рецептор-отрицательный профиль рака молочной железы во всех возрастных группах встречается реже вне зависимости от этнической принадлежности. Увеличение доли рецептор-положительных опухолевых клеток с возрастом в большей степени выражено для рецепторов эстрогена, чем прогестерона. У женщин некоренных национальностей повышение уровня экспрессии рецепторов эстрогена с возрастом статистически достоверно, в то время как у представительниц коренных национальностей такая закономерность отсутствует.
  4. Между размерами опухолей и уровнем экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона существует отрицательная корреляционная связь (r=-14,1, p=0,016 и r=-20,5, p<0,001 соответственно). Опухоли с высокой степенью злокачественности характеризуются низкой экспрессией рецепторов эстрогена и прогестерона (p<0,05). Уровень экспрессии антигена bcl-2 и его распространенность положительно коррелируют с наличием рецепторов ER и PgR на опухолевых клетках и низкой степенью злокачественности опухолей.
  5. Степень гистологической злокачественности опухолей молочной железы положительно коррелирует с экспрессией антигенов Ki-67 и p53 и отрицательно – с экспрессией антигена bcl-2 (r=-12,9, p=0,03).
  6. Наиболее информативными критериями повышения злокачественности опухолей молочной железы являются понижение экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона, повышение экспрессии Ki-67 и р53 и уменьшение экспрессии bcl-2.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

  1. С учетом территориальных особенностей, малой плотности населения в Республике Саха (Якутия), ростом заболеваемости РМЖ в молодом возрасте, в целях ранней диагностики РМЖ необходима организация скринингового обследования женского населения в более раннем возрасте (с 30 лет).
  2. Кроме определения ER, PgR, Her-2/neu, необходимо включение в стандарты диагностики РМЖ также маркеров биологической активности (Ki-67, p53, bcl-2), что в конечном итоге является определяющим звеном в оптимизации терапевтических подходов, индивидуализации химио-, гормональной, таргетной и лучевой терапии у больных РМЖ, основанных на результатах исследования маркеров биологической активности опухоли.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ

ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Лоскутова К.С., Иннокентьева А.С., Кириллина М.П., Сивцева Т.П., Аргунов В.А. Особенности экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона клетками рака молочной железы // Материалы 16-й межрегиональной конференции онкологов «Актуальные вопросы маммологии на Севере». – Якутск, 5-6 июня 2008. – С.41-42.
  2. Лоскутова К.С., Иннокентьева А.С., Кириллина М.П., Сивцева Т.П., Аргунов В.А. Определение Her-2 статуса при раке молочной железы // Материалы 16-й межрегиональной конференции онкологов «Актуальные вопросы маммологии на Севере». – Якутск, 5-6 июня 2008. – С.42-43.
  3. Лоскутова К.С., Аргунов В.А., Иннокентьева А.С., Сивцева Т.П., Кириллина М.П. Иммуноморфологическая характеристика гормонального статуса первичного рака молочной железы в Республике Саха (Якутия) // Якутский медицинский журнал. 2009. № 1. С. 46-49.
  4. Лоскутова К.С., Иннокентьева А.С., Сивцева Т.П., Кириллина М.П., Аргунов В.А. Экспрессия Her-2 опухолевыми клетками рака молочной железы // Материалы III съезда Российского общества патологоанатомов. – Самара, 26-30 мая 2009. – Т.2. – С. 610-611.
  5. Лоскутова К.С., Аргунов В.А., Иннокентьева А.С., Сивцева Т.П., Кириллина М.П. Рецепторный статус рака молочной железы в Якутии // Материалы III съезда Российского общества патологоанатомов. – Самара, 26-30 мая 2009. – Т.2. – С. 611-614.
  6. Лоскутова К.С., Аргунов В.А., Иннокентьева А.С., Кириллина М.П., Сивцева Т.П., Труфанов А.С. Новые технологии в онкоморфологии: иммуногистохимическое определение HER2/neu при раке молочной железы // Материалы ХVI межрегиональной научно-практ. конф. онкологов с междунар. участием «Актуальные вопросы преканцерогенеза и злокачественных опухолей в различных климатогеографических зонах». – Якутск, 15 октября 2009. – С. 139-140.
  7. Кириллина М.П., Лоскутова К.С., Аргунов В.А., Иннокентьева А.С., Сивцева Т.П., Труфанов А.С. Новые технологии в онкоморфологии: иммуногистохимическое определение гормонального статуса рака молочной железы // Материалы ХVI межрегиональной научно-практ. конф. онкологов с междунар. участием «Актуальные вопросы преканцерогенеза и злокачественных опухолей в различных климатогеографических зонах». – Якутск, 15 октября 2009. – С. 140-142.
  8. Лоскутова К.С., Кириллина М.П., Иннокентьева А.С., Сивцева Т.П., Аргунов В.А. Иммуногистохимический профиль рака молочной железы в Республике Саха (Якутия) // Материалы Всероссийской конференции с международным участием посвященной 100-летию Российского общества патологоанатомов. – Санкт-Петербург, 9-10 октября 2009. – С. 196-198.
  9. Кириллина М.П., Панова Е.В. Современные методы морфологической диагностики рака молочной железы в Якутии // XV Международная научно-практическая конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Современные техника и технологии». – Томск, 4-8 мая 2009. – С. 560-561.
  10. Лоскутова К.С., Иннокентьева А.С., Аргунов В.А., Сивцева Т.П., Кириллина М.П. Иммуноморфологическое определение Her2/neu (рецептора 2 типа эпидермального фактора роста человека) при раке молочной железы в Республике Саха (Якутия) // Якутский медицинский журнал. 2009. № 4. С. 24-26.
  11. Кириллина М.П., Сивцева Т.П. Иммуногистохимическое исследование рецепторов эстрогенов и прогестерона в раке молочной железы // Материалы республиканской научно-практической конференции «Медицина в современном мире: взгляд научной молодежи» – Якутск, 25 марта 2010. – С. 52-53.
  12. Кириллина М.П., Сивцева Т.П. Иммуноморфологическое определение Her2/neu (рецептора 2 типа эпидермального фактора роста человека) при раке молочной железы в Республике Саха (Якутия) // Результаты исследований получателей грантов Президента Республики Саха (Якутия) и государственных стипендий Республики Саха (Якутия) за 2010 год. – Якутск: ООО «Издательство Сфера», 2011. – С. 31-33.
  13. Кириллина М.П. Иммуногистохимический анализ эпителиальных клеток молочной железы при опухолевом росте в условиях Республики Саха (Якутия) // Результаты исследований получателей грантов Президента Республики Саха (Якутия) и государственных стипендий Республики Саха (Якутия) за 2011 год. – Якутск: ООО «Издательство Сфера», 2012. – С. 178-181.
  14. Макарова У.Е., Лоскутова К.С., Кириллина М.П. Иммуногистохимический метод в диагностике туберкулезного лимфаденита // Якутский медицинский журнал. 2012. № 1. С. 53-54.
  15. Николаева Т.М., Иванов П.М., Лоскутова К.С., Иннокентьева А.С. Кириллина М.П. Значение патоморфологических и иммуногистохимических факторов прогноза при раке молочной железы // Материалы XVIII межрегиональной научно-практической конференции онкологов Якутии «Современное состояние и перспективы развития онкологической помощи в различных климатогеографических зонах». – Якутск, 30 мая 2012. – С. 64-68.
  16. Николаева Т.М., Иванов П.М., Лоскутова К.С., Иннокентьева А.С. Кириллина М.П. Патоморфологическая характеристика рака молочной железы // Материалы XVIII межрегиональной научно-практической конференции онкологов Якутии «Современное состояние и перспективы развития онкологической помощи в различных климатогеографических зонах». – Якутск, 30 мая 2012. – С. 77-81.
  17. Лоскутова К.С., Иннокентьева А.С., Кириллина М.П. Первичный эндокринный рак молочной железы: вопросы иммуногистохимической диагностики // Материалы XVIII межрегиональной научно-практической конференции онкологов Якутии «Современное состояние и перспективы развития онкологической помощи в различных климатогеографических зонах». – Якутск, 30 мая 2012. – С. 105-108.
  18. Кириллина М.П., Лоскутова К.С. Иммуногистохимический анализ эпителиальных клеток молочной железы при опухолевом росте в условиях Республики Саха (Якутия) // Материалы XVIII межрегиональной научно-практической конференции онкологов Якутии «Современное состояние и перспективы развития онкологической помощи в различных климатогеографических зонах». – Якутск, 30 мая 2012. – С. 121-125.
  19. Лоскутова К.С., Кириллина М.П., Иннокентьева А.С., Аргунов В.А. Иммуногистохимическая диагностика первичного нейроэндокринного рака молочной железы // «Современные проблемы доступности и качества высокотехнологической медицинской помощи населению Республики Саха (Якутия)»: Сборник научных трудов республиканской научно-практической конференции. – Якутск, 15 июня 2012. – С. 91-93.
  20. Лоскутова К.С., Кириллина М.П., Иннокентьева А.С., Аргунов В.А., Сивцева Т.П. Иммуноморфологическое исследование гормонального статуса первичного рака молочной железы в Республике Саха (Якутия) // «Современные проблемы доступности и качества высокотехнологической медицинской помощи населению Республики Саха (Якутия)»: Сборник научных трудов республиканской научно-практической конференции. – Якутск, 15 июня 2012. – С. 94-101.
  21. Кириллина М.П., Лоскутова К.С. Иммуногистохимический анализ эпителиальных клеток молочной железы при опухолевом росте в условиях Республики Саха (Якутия) // «Актуальные проблемы лабораторной диагностики и биотехнологии»: Сборник тезисов. – Кемерово, 13-14 сентября 2012. – С. 45-46.

Соискатель                                                М.П.Кириллина







© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.