WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

АЛУТИНА Эльвира Львовна

ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЯ  ДИФТЕРИИ  И НАПРЯЖЕННОСТИ  ПРОТИВОДИФТЕРИЙНОГО  ИММУНИТЕТА У НАСЕЛЕНИЯ  В  СОВРЕМЕННЫХ  УСЛОВИЯХ

Специальность 03.02.03 – Микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва – 2012

       Работа выполнена в ГБОУ ВПО Ростовский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научные руководители: 

доктор медицинских наук, доцент Харсеева Галина Георгиевна;

доктор медицинских наук, профессор Сависько Алексей Алексеевич.

Официальные оппоненты:

Пашков Евгений Петрович, Лауреат государственной премии РФ,  доктор медицинских наук, профессор кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова;

Червинец Вячеслав Михайлович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой микробиологии и вирусологии ГБОУ ВПО Тверская государственная медицинская академия.

 

Ведущая организация: ГБОУ ВПО Московский государственный медико-стоматологический университет Минздравсоцразвития России.

Защита состоится «  » 2012 г. в «  » часов на заседании диссертационного совета Д 208.040.08 в ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России» по адресу: 119992, г. Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНМБ ГБОУ ВПО «Первого МГМУ им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России» по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49.

Автореферат разослан « __» __________ 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета  Миронов Андрей Юрьевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время заболеваемость дифтерией стабилизировалась и почти не регистрируется как в России в целом [Максимова Н. М. и соавт., 2010], так и на территории г. Ростова-на-Дону и Ростовской области [Харсеева Г. Г., 2006]. Однако, особенности эпидпроцесса дифтерии не позволяют ослабить внимание к этой инфекции [Костюкова Н. Н., 1999; Максимова Н. М., 2006]. В этих условиях большое значение приобретает серологический мониторинг, позволяющий оценить популяционный иммунитет на конкретной территории.

Принимая во внимание, что в постэпидемический период происходит циркуляция штаммов С.diphtheriae со скрытыми токсигенными свойствами [Борисова О. Ю., 2009], заболеваемость дифтерией почти не регистрируется и, как следствие, снижена высеваемость возбудителя, особую важность приобретает разработка питательных сред, обеспечивающих оптимальные условия для выделения и накопления дифтерийных микробов при минимальном их содержании в аналите. Кроме того, важным является поиск и разработка эффективных методов индикации дифтерийного токсина (ДТ), позволяющих выявлять штаммы коринебактерий с низким уровнем токсинопродукции и  наличием «молчащего» гена токсигенности [Краева Л. А., 2011].

Помимо ДТ, являющегося главным фактором вирулентности возбудителя, его патогенные свойства обусловлены и способностью к адгезии [Костюкова Н. Н., 1999; Макаренкова И. Д. и соавт., 1999]. Интересным и перспективным является использование веществ, блокирующих поверхностные структуры  коринебактерий, и, как следствие, предотвращающих процесс их адгезии и колонизации [Макаренкова И. Д. и соавт., 1999; Hladka et al., 1998]. Известно, что при комплексном лечении острых и хронических инфекционных заболеваний эффективным является использование препарата «Полиоксидоний» (ПО), что связано не только с его иммуномодулирующей активностью [Хаитов Р. М. и соавт., 2003], но и способностью  воздействовать на биологические свойства микроорганизмов [Кириллов Д. И. и соавт., 2003].

Особый интерес представляет повреждающее воздействие возбудителя дифтерии на иммунокомпетентные клетки. В опытах invitro показана способность как токсигенных, так и нетоксигенных штаммов C.diphtheriae  вызывать апоптоз и некроз макрофагов благодаря наличию ДТ и других факторов патогенности [Cintia S. еt al., 2010; H.Morimoto et al., 1993].

Все вышеизложенное подтверждает необходимость непрерывного мониторинга напряженности противодифтерийного антитоксического иммунитета у населения и биологических свойств возбудителя, а также разработки эффективных питательных сред для культивирования дифтерийных микробов.

Цель исследования: изучить особенности биологических свойств штаммов C.diphtheriae и  показателей противодифтерийного антитоксического иммунитета у населения  для совершенствования методов культивирования  возбудителя и мониторинга дифтерии.

Задачи исследования:

  1. Оценить противодифтерийный антитоксический иммунитет и выделить группы риска развития дифтерии среди населения г. Ростова-на-Дону и Ростовской области в постэпидемический период (2003-2009 г.г.).
  2. Охарактеризовать биологические свойства и факторы патогенности возбудителя дифтерии, циркулировавшего на территории г. Ростова-на-Дону и Ростовской области в постэпидемический период (2006-2011 г.г.).
  3. Установить влияние и механизм воздействия ПО на биологические свойства и факторы патогенности штаммов  C.diphtheriaе.
  4. Разработать питательную среду для культивирования дифтерийных микробов с улучшенными ростовыми свойствами.

Научная новизна полученных результатов:

  • выделены группы риска  развития дифтерии среди населения г. Ростова-на-Дону и Ростовской области в постэпидемический период (2003-2009г.г.),
  • впервые исследована способность возбудителя дифтерии в монокультуре и ассоциации с представителями условно-патогенной микрофлоры (УПМ)верхних дыхательных путей (ВДП) индуцировать процессы апоптоза макрофагов белых мышей,
  • исследован механизм  ингибирующего воздействия ПО на биологические свойства штаммов C. diphtheriae,
  • разработана новая питательная среда для культивирования дифтерийных микробов с улучшенными ростовыми свойствами (положительное решение Роспатента по заявке на изобретение № 2011123264 от 03.02.2012 г.).

Практическая значимость исследований. Работа является фрагментом плановой темы НИР кафедры микробиологии и вирусологии № 2 ГБОУ ВПО РостГМУ Минздравсоцразвития России «Научно-организационные основы профилактики, диагностики и лечения женщины, матери и ребенка» и «Научно-организационные основы профилактики, диагностики и лечения важнейших заболеваний внутренних органов», № госрегистрации 01. 2. 006. 06352.

Обоснована целесообразность проведения мониторинга противодифтерийного антитоксического иммунитета в постэпидемический период среди контингентов повышенного риска развития дифтерии.

Разработана и внедрена в практику питательная среда для культивирования дифтерийных микробов с улучшенными ростовыми свойствами, позволяющая сократить сроки культивирования, повысить чувствительность среды и показатель прорастания микроорганизмов(положительное решение Роспатента по заявке на изобретение № 2011123264 от 03.02.2012 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

  1. В постэпидемический период, как и в период эпидемии, в ростовском регионе на фоне высокого уровня антитоксического иммунитета у населения контингент повышенного риска развития дифтерии составляют лица 3-9, 50 лет и старше, а также дети с хронической патологией.
  2. Патогенные свойства штаммов C.diphtheriae, выделенных в постэпидемический период, обусловлены помимо дифтерийного экзотоксина и другими факторами патогенности, усиливающими свое действие в ассоциации с представителями УПМ.
  3. Механизм ингибирующего воздействия ПО на адгезивную, ДНК-азную и апоптогенную активность C.diphtheriae связан с его экранирующим эффектом на поверхностные структуры бактериальной клетки.
  4. Разработанная двухфазная питательная среда для выделения и культивирования дифтерийных микробов имеет преимущество перед используемой в настоящее время питательной средой (КТА).

Внедрение результатов исследования.

Результаты исследования внедрены в работу лаборатории бактериологических методов исследования ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Ростовской области», МЛПУЗ «Городской детский диагностический центр» г. Ростова-на-Дону; использованы при чтении лекций и проведении лабораторных занятий со студентами, интернами, курсантами ФПК и ППС на кафедре микробиологии и вирусологии №2 и кафедре поликлинической педиатрии ГБОУ ВПО РостГМУ Минздравсоцразвития России.

Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, автором лично было проведено моделирование процессов, мониторинг основных параметров, аналитическая и статистическая обработка, научное обоснование и обобщение полученных результатов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: постановка задач, способы их решения,  обсуждение результатов в научных публикациях и докладах, их внедрение в практику.

Апробация диссертации.Апробация диссертационной работы проведена на кафедре микробиологии и вирусологии №2 ГБОУ ВПО РостГМУ Минздравсоцразвития России 06.09.2011 г.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на научно-практических конференциях: «59-ая Итоговая научная конференция молодых ученых РостГМУ», 22 апреля 2005 г., г. Ростов-на-Дону;        Юбилейная научно-практическая конференция врачей ЮФО, посвященная 50-летию кафедры детских инфекционных болезней РостГМУ,  8-9 ноября  2006 г., г.  Ростов-на-Дону; «60-ая Итоговая научная конференция молодых ученых РостГМУ», 21 апреля 2006 г., г. Ростов-на-Дону;«62-ая Итоговая научная конференция молодых ученых РостГМУ», 25 апреля 2008 г.,  г. Ростов-на-Дону;        «V Научная сессияРостГМУ, посвященная 95-летию высшего медицинского образования на Дону и 80-летию РостГМУ, 11 февраля 2010 г., г. Ростов-на-Дону; 64-ая Итоговая научная конференция молодых ученых РостГМУ», 26 апреля 2010 г.,  г. Ростов-на-Дону;         «65-ая Итоговая научная конференция молодых ученыхРостГМУ», 22 апреля 2011 г., г. Ростов-на-Дону;        X Межвузовская конференция с международным участием. Дни медицинской лабораторной диагностики Южного Федерального Округа «Обмен веществ при адаптации и повреждении», 20-21 мая 2011 г., г. Ростов-на-Дону; Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием, посвященная 90-летию ФБУН «Омский научно-исследовательский институт природно-очаговых инфекций» Ростпотребнадзора, 1-2 ноября 2011 г., г. Омск.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 3 статьи в ведущих рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК РФ. По материалам работы получено положительное решение Роспатента по заявке на изобретение № 2011123264 от 03.02.2012г.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций, списка цитируемой литературы, списка сокращений. Работа включает  124 страницы текста, 22 таблицы, 1 рисунок, 1 фото. Список литературы содержит  197 источников, из них  146 отечественных и  51 зарубежных.

CОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Микробные штаммы и их характеристики

При проведении исследований использовали штаммы C. Diphtheriae gravis tox+, ВН, серотип 2, C. Diphtheriae gravis tox+ № 665, S.aureus АТСС 25923, полученные из ГКПМ ФГБУ ГИСК им. Л.А. Тарасевича Минздравсоцразвития России; 50 штаммов C.diphtheriae (C.diphtheriae gravis tox+ - 11 шт., C.diphtheriae mitis tox– - 39 шт.), предоставленные лабораторией бактериологических методов исследования ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Ростовской области», 218 штаммов Corynebacterium nondiphtheriae (С.pseudodiphtheriticum- 143 шт.,  C.pseudotuberculosis – 34 шт.,  C.ulcerans – 4 шт., C.xerosis – 32 шт. и С.amycolatum – 5 шт.), полученные из лаборатории бактериологических методов исследования МУЗ «Городская больница №1» г. Гуково Ростовской области  и ГУЗ КДЛ ОДБ г. Ростова-на-Дону, штаммы S.aureus (25 шт.), S.epidermidis (2 шт.), S.pyogenes (26 шт.), S.viridans (15 шт.) и P.aeruginosae (1 шт.), полученные из лаборатории бактериологических методов исследования  МЛПУЗ ЦГБ № 1 им. Н. А. Семашко.

Культивирование и дальнейшее исследование по идентификации штаммов C.diphtheriae и C. Non diphtheriae проводили согласно общепринятым методикам (руководство по лабораторной диагностике дифтерии, Копенгаген, 1994 г.; методические указания «Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции», Москва, 1998 г., Приказ Минздрава СССР № 535, Москва, 1985 г.). Идентификацию штаммов  C.non diphtheriae  проводили и с помощью тест-системы ApiCoryne (производства фирмы «bioMerieux, Inc», Франция) согласно прилагаемой инструкции.

Для тестирования гена ДТ использовали ПЦР со специфическими праймерами, комплементарными двум участкам гена ДТ, последовательность которого была опубликована в работе [Kaczorek M. Et al., 1985] с помощью программы Vector NTI: прямой ТСАТТGАGGАGТАGGТСССGАТТGG-for Dt и обратный GССАСGТТТТССАСGGGТТТС-rev Dt. Праймеры были синтезированы в НПО «Литех» (г. Москва).

Дезоксирибонуклеазную (ДНК-азную) активность  коринебактерий определяли с помощью специальной среды – агара для теста на ДНК-азу с толуидиновым синим (производства фирмы «HIMedia Laboratories Pvt. Ltd.», Индия).

Адгезивную активность коринебактерий исследовали с помощью метода полуколичественного титрования гемагглютинирующей активности дифтерийных культур (Костюкова Н. Н. и соавт., 1985 г. ), в котором результаты учитывали по 4-х (+) системе.

Апоптогенную активность штаммов С.diphtheriae и C. Non diphtheriae определяли на белых беспородных мышах (18-20 г) из питомника ФГУЗ РостНИПЧИ Роспотребнадзора. Объектом исследования послужили перитонеальные макрофаги мышей. Для исследования использовали 24-х часовую агаровую и бульонную культуры дифтерийных микробов, агаровые культуры C. Non diphtheriae, S.aureus, S.epidermidis, S.pyogenes. Мазки окрашивали по Май-Грюнвальду с докрашиванием по Романовскому-Гимзе.

Антагонистические свойства коринебактерий и представителей УПМ исследовали на сывороточном агаре (Биргер М. О., 1973 г.).

Для изучения способности препарата  ПО (производства ООО «Иммафарма», г. Москва) влиять на биологические свойства штаммов C.diphtheriae добавляли его в сывороточный агар в концентрации  240 мкг/мл. Морфологические свойства выросших культур определяли при окраске синькой Леффлера, по методу Нейссера и Грама.

Влияние ПО на адгезивные свойства штаммов С.diphtheriae исследовали при добавлении этого препарата в сывороточный агар в концентрации 60 мкг/мл и в опытах по прерыванию адгезии в количестве 1200 мкг/мл, 600 мкг/мл и 300 мкг/мл в лунки полистироловых планшет; на апоптогенные свойства - с помощью методики, описанной выше.

Компоненты для приготовления двухфазной питательной среды для культивирования дифтерийных микробов

Для приготовления питательной среды для культивирования дифтерийных микробов использовали гидролизат панкреатический рыбной муки (ТУ 480-00001927-27-93, производства ФБУН ГНЦ ПМБ, п. Оболенск), пептон ферментативный (ГОСТ 13805-76, производства ФБУН ГНЦ ПМБ, п. Оболенск), стимулятор роста гемофильных микроорганизмов (ТУ 480-00001927-28-93,  производства ФБУН ГНЦ ПМБ, п. Оболенск), натрий хлористый (ГОСТ 4233-77, производства ООО «Агат-Мед», г. Москва), экстракт дрожжевой (производства фирмы «HiMedia Laboratories Pvt.Limited», Индия), глюкозу (ГОСТ 975-88, производства ООО «Вита Реактив», г. Дзержинск), агар (производства фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited», Индия),  сыворотку КРС (производства ООО «Биолот», г. Санкт-Петербург), теллурит калия - 2% раствор (производства Мосхимфармпрепараты им. Н. А. Семашко, г. Москва), воду дистиллированную (ГОСТ 6709-72, производства ООО МЦ «Эллара», г. Покров).

Объем и характеристика групп обследованных

С целью изучения показателей противодифтерийного антитоксического  иммунитета  были обследованы:        дети  (883 чел.)  в возрасте 3-15 лет, не имевшие в анамнезе хронической соматической патологии и указаний за последние 3 месяца на перенесенные острые заболевания, привитые АКДС-вакциной и ревакцинированые АДС-М-анатоксином в соответствии с Национальным календарем профилактических прививок;        дети с хроническими заболеваниями (1693 чел.): отягощенный аллергологический  анамнез (лекарственная, пищевая аллергия, атопический дерматит, респираторный аллергоз) - 1100 чел., бронхиальная астма – 315 чел., патология нервной системы (детский церебральный паралич, эпилепсия, судорожный синдром, хронический церебральный арахноидит) – 175 чел., вторичные ИДС - 103 чел.;взрослые в  возрасте  16-50 лет и старше – 1314 чел. Обследование детей проводилось с информированного согласия родителей.

Определение антитоксических противодифтерийных антител проводили с помощью РПГА с использованием тест-системы «Микроанализ – дифтерия», НПК «Микроанализ», г. Москва.        Защитный титр антител к дифтерийному анатоксину составлял 1:20. Напряженность иммунитета оценивали следующим образом: уровень антител 1:20-1:40 считали низким, 1:80–1:160 – средним, 1:320 и более – высоким.

Статистические методы

Статистическую обработку полученных данных осуществляли  с помощью персонального компьютера IBM РC/XT и статистического пакета «Statistica 6.0» для Windows XP с использованием параметрических и непараметрических методов статистики.

Результаты исследования и их обсуждение

Изучение состояния противодифтерийного антитоксического иммунитета у населения г. Ростова-на-Дону и Ростовской области в 2003-2009 г.г. свидетельствовало о том, что все обследованные имели высокий уровень защищенности от дифтерии (рис. 1, рис. 2).

Высокая напряженность противодифтерийного антитоксического иммунитета коррелировала с показателями заболеваемости дифтерией, которая носила спорадический характер и стабилизировалась на низких цифрах с тенденцией к дальнейшему снижению. Результаты серологического мониторинга антитоксического иммунитета показали, что количество серопозитивных к дифтерии среди детей (97,9±0,5%) было несколько выше, чем среди взрослых (94,7±0,6%). Причем, уровень напряженности противодифтерийного антитоксического иммунитета, оцениваемый по СГТ, был выше среди взрослого населения (1:426,6), чем среди детей (1:263,0).

Возможно, высокая доля защищенных против дифтерии среди детей связана  с достаточным охватом прививками детского населения.

Что касается противодифтерийного антитоксического иммунитета у взрослых, то его формирование обусловлено, по всей видимости, не только проводимой вакцинацией, но и естественной циркуляцией штаммов С. diphtheriae.

При анализе состояния противодифтерийного иммунитета среди различных возрастных групп детского населения (рис. 1) серонегативные к дифтерийному анатоксину были обнаружены только среди детей 3, 4-6 и 9 лет.

В проведенном  ранее исследовании [Харсеева Г. Г. и др., 2006] по изучению противодифтерийного антитоксического иммунитета у населения нашего региона в период вспышки дифтерийной инфекции в 1994-1996 г.г. дети 3 и 4-6 лет были выделены как группа риска по дифтерии, так как среди них был наиболее высок процент неиммунных и чаще регистрировали формирование тяжелых токсических форм дифтерии.

Полученные данные могут быть связаны с особенностями формирования иммунной системы у детей и развитием четвертого критического периода на 4-6 году жизни [Стефани Д. В., 1996], характеризующегося высокой частотой развития атопических, паразитарных и иммунокомплексных заболеваний. Дети старшего возраста отвечали более стабильной реакцией на дифтерийный анатоксин: среди них не выявляли серонегативных, и, в то же время, было меньше лиц с высоким уровнем антител. Учитывая, что дифтерийное бактерионосительство формируется у лиц с повышенными титрами антитоксина,  полученные результаты, возможно, свидетельствовали о более надежной степени защищенности детей 10-15 лет.

При анализе состояния противодифтерийного иммунитета у взрослых (рис. 2) было установлено, что лица 16-17 и 18-19 лет имели высокий уровень защиты против дифтерии. Группу риска формировали взрослые 50 лет и старше, среди которых, в основном, обнаруживали лиц с низкими и средними  титрами антитоксина, хотя по числу серонегативных и количеству лиц с высокими титрами антител они не имели отличий от обследованных 20-29 и 40-49 лет. Учитывая, что наличие низких титров антитоксина обеспечивает  лишь относительную защиту от дифтерии, полученные результаты указывали на низкий уровень защиты от дифтерии обследованных 50 лет и старше. Возможно, это связано с недостаточным охватом прививками этого контингента лиц и их отказами от вакцинации. С другой стороны, вполне вероятно, что у обследованных в возрасте 50 лет и более отсутствовал первичный комплекс вакцинации в детстве, а впоследствии, в условиях спада заболеваемости дифтерией, вплоть до конца 80-х годов, они редко встречались с инфекцией. Резкая активизацияэпидпроцесса  дифтерии в 90-годы не привела к выработке естественного иммунитета у людей этого возраста, что могло быть связано с начинающим формироваться у них физиологическим иммунодефицитом.

При рассмотрении показателей противодифтерийного антитоксического иммунитета у детей с хронической патологией установили, что вне зависимости от конкретного диагноза число защищенных от инфекции было низким, колебалось в пределах  72,6-78,9% детей и коррелировало с величиной СГТ противодифтерийных антитоксических антител (1:33,8-1:79,4). Указанный факт, несомненно, был обусловлен отказами и медицинскими отводами от вакцинации ввиду имеющейся у них патологии, и, как следствие, низким охватом прививками (рис. 3).

- привитые (%) - привитые с нарушением графика прививок (%)  - не привитые (%) 

Рис. 3. Уровень привитости АКДС- и АДС-М препаратами у детей с  хронической патологией.

Так, среди детей с аллергическими заболеваниям количество привитых составило 50,0±1,5%, с бронхиальной астмой  - 37,8±2,7%, с патологией нервной системы - 38,9±3,7%, с вторичными ИДС - 24,3±4,3%. Причем, среди данного контингента обследованных 35,9-42,0%  детей были привиты с отклонениями от графика вакцинации, что является  нежелательным, так как ни одна из схем иммунокоррекции не может довести качество антитоксического иммунитета до уровня, который обеспечивает плановая вакцинация по календарю [Демиховская Е. В., 2001]. При несоблюдении данного условия происходит формирование прослойки не иммунных, что и создает условия для циркуляции штаммов токсигенных коринебактерий и усилению их токсигенных свойств [Харит С. М., 2004].

Таким образом, полученные результаты свидетельствовали о достаточно высокой степени защищенности населения г. Ростова-на-Дону и Ростовской области от дифтерии. Однако, в наблюдающийся в настоящее время постэпидемический период, как и во время вспышки дифтерийной инфекции, необходимо выделить контингент повышенного риска развития дифтерии – лиц 3-9 и 50 лет и старше. Особое внимание необходимо уделять проведению вакцинации против дифтерии детей с хроническими заболеваниями, среди которых зарегистрировано  наибольшее количество не иммунных вследствие низкого охвата прививками. Учитывая низкую частоту регистрации бактерионосительства среди населения и особенности формирования противодифтерийного иммунитета у лиц различных возрастов, проведение вакцинопрофилактики дифтерии в постэпидемический период является  важным и необходимым.

Ввиду невозможности полного искоренения дифтерии [Костюкова Н. Н., 2001], в постэпидемический период помимо мониторинга напряженности антитоксического иммунитета необходимо проводить исследования, направленные на характеристику патогенных свойств циркулирующих штаммов возбудителя.

Изучение штаммов возбудителя дифтерии, циркулировавших в г. Ростове-на-Дону и Ростовской области в последние годы  постэпидемического периода (2006-2011 г.г.), показало, что из 50 свежевыделенных штаммов С.diphtheriae по данным иммунопреципитационного теста Элека 11 были токсигенными. Ген токсигенности, определяемый в ПЦР, был обнаружен у 6 (15,4 %) штаммов С.diphtheriae mitis tox-,выделенных при профилактических осмотрах населения (4 шт.) и воспалительных заболеваниях ВДП (2 шт.).

Принимая во внимание, что в современных условиях происходит циркуляция штаммов С.diphtheriae mitis tox-со скрытыми токсигенными свойствами [Комбарова С. Ю. и соавт., 2009, Борисова О. Ю., 2009], заболеваемость дифтерией почти не регистрируется [Максимова Н. М. и соавт., 2010] и, как следствие, снижена высеваемость возбудителя, особую важность приобретает разработка питательных сред, обеспечивающих оптимальные условия для выделения и накопления дифтерийных микробов при минимальном их содержании в аналите.

Разработанная двухфазная питательная среда для культивирования дифтерийных микробов (положительное решение Роспатента по заявке на изобретение № 2011123264 от 03.02.12 г.) полностью обеспечивала питательные потребности С. diphtheriaе.  Добавленный в среду 2% раствор теллурита калия (13 мл/л) ингибировал рост микробов-ассоциантов, содержащихся в большом количестве в аналите.

Анализ результатов сравнительного изучения основных ростовых свойств разработанной и контрольной питательных сред (таблица), полученных при проведении лабораторных испытаний, свидетельствовал о том, что разработанная питательная среда обладала высокой чувствительностью (10-8) в отношении всех испытуемых штаммов, в то время как показатель чувствительности контрольной среды составил 10-7.

Таблица

Ростовые свойства питательных сред для культивирования дифтерийных микробов

Показатели ростовых свойств среды

Питатель-ные среды

Вид

С. diphtheriae gravis tox+, ВН, серотип 2

С. diphtheriae gravis tox+ (циркулиро-вавший)

С. diphtheriaе

Mitis tox-

(циркулиро-вавший)

С. pseudodiphtheri-ticum

(циркулиро-вавший)

Чувствитель-ность среды

Двухфазная питательная среда

10-8

10-8

10-8

10-8

КТА

10-7

10-7

10-7

10-7

Скорость роста дифтерийных микробов (час)

Двухфазная питательная среда

13-14

13-14

13-15

13-14

КТА

24

22-24

24

19-20

Показатель прорастания дифтерийных микробов (%)

Двухфазная питательная среда

214,3

269,3

342,8

187,5

КТА

21,4

41,2

29,2

53,3

Повышенная скорость роста коринебактерий на предлагаемой среде проявлялась при меньшем времени культивирования. Так, на разработанной питательной среде визуально обнаруживали колонии коринебактерий через 13-14 часов культивирования, тогда как на КТА - только через 24-48 часов.

Помимо этого, количество колоний, выросших на предлагаемой среде, было больше, чем на КТА. Так, при культивировании взвеси коринебактерий из разведения 10-7 на разработанной питательной среде количество колоний составило 20-60, на контрольной среде – 5-20. Показатель прорастания коринебактерий разработанной питательной среды (187,5-342,8%) достоверно (р0,05) отличался от такового контрольной среды (21,4-53,3%).

Двухфазность питательной среды и введение дополнительных стимуляторов роста способствовали повышению показателей ростовых свойств предлагаемой питательной среды за счёт сокращения логарифмической фазы роста дифтерийных микробов в процессе культивирования. Кроме того, в жидкой фазе разработанной питательной среды возможно определять наличие дифтерийного экзотоксина, что позволит проводить предварительную диагностику дифтерийной инфекции.

ДТ, безусловно,  является основным фактором патогенности С.diphtheriae. Однако, патогенное действие возбудителя может быть связано и с другими структурами и ферментами бактериальной клетки [Фаворова Л. А. и соавт., 1988; Иванова В. В., 2000], обусловливающими адгезию, колонизацию и инвазию возбудителя.

При исследовании адгезивной активности установлено, что данный фактор патогенности был более выражен у циркулировавших токсигенных штаммов  (С.diphtheriaе gravis  - СГТ-1:10,0) по сравнению с музейными (С.diphtheriaе gravis tox+, ВН, серотип 2; С.diphtheriaе gravis tox+ № 665 - СГТ-1:2,8) и нетоксигенными  (С.diphtheriaе mitis - СГТ-1:4,2) штаммами. Все исследованные штаммы C. Non diphtheriae гемагглютинирующей активностью не обладали, что свидетельствовало о роли в генезе вызываемых ими заболеваний иных факторов патогенности.

Штаммы С. diphtheriae как токсигенные, так и нетоксигенные, в 100% случаев обладали высокой степенью ДНК-азной активности. Среди штаммов C. Non diphtheriae  только 35,5% штаммов продуцировали фермент ДНК-азу.

Одним из механизмов развития инфекционного процесса, вызываемого дифтерийными микробами, является их способность индуцировать процессы апоптоза иммунокомпетентных клеток [Morimoto H. et al., 1993;Sims K. Et al., 1993], обусловленная как ДТ, так и другими факторами патогенности. Поэтому было проведено исследование апоптогенной активности invitro дифтерийного экзотоксина, содержащегося в  надосадочной жидкости бульонных культур штаммов С.diphtheriaе, и  штаммов токсигенныхкоринебактерий, выросших на  плотной питательной  среде.  Полученные данные (рис. 4) свидетельствовали о том, что запрограммированная гибель макрофагов мышей, вызванная  возбудителем дифтерии, осуществлялась, главным образом, за счет действия ДТ.

Однако,апоптоз клеток наступал и под влиянием нетоксигенных штаммов С.diphtheriae mitis, но в более отдаленные сроки (3 часа) по сравнению с токсигенными штаммами (1час) (рис. 5).  По-видимому, гибель макрофагов происходила в результате воздействия поверхностных структур микробов и дальнейшей активизации ферментов патогенности.

Возбудитель дифтерии, попадая на слизистую ВДП, вступает во взаимодействие с представителями нормальной и УПМ, которое может проявляться в виде синергизма, антагонизма или комменсализма.  Результаты исследований свидетельствовали об отсутствии антагонистических взаимоотношений между штаммами  С.diphtheriae и микроорганизмами, входящими в состав микрофлоры ВДП (С.diphtheriae mitis tox-, C.pseudodiphtheriticum, S.aureus, S.pyogenes, P.aeruginosae). Синергичные взаимодействия были обнаружены при исследовании апоптогенной активности  штаммов коринебактерий в ассоциации с микроорганизмами (рис. 6), населяющими ВДП, что, возможно, способствовало усилению патогенных свойств как самого возбудителя, так и УПМ. Усиление апоптогенной активности циркулировавшего токсигенного штамма С.diphtheriae gravis (52,8±6,4%)  в ассоциации с  S.pyogenes (71,0±5,8) и циркулировавшего нетоксигенногоштамма С.diphtheriae mitis (51,5±5,8%) с C.pseudodiphtheriticum (74,4±5,5%), S.aureus (71,5±6,0%), S.pyogenes (70,9±5,4) может играть роль в процессах персистенции коринебактерий и формирования затяжной формы бактерионосительства коринебактерий дифтерии.

Причем, на длительность бактерионосительстватоксигенных штаммов коринебактерий дифтерии оказывает влияние наличие сопутствующей хронической ЛОР-патологии [Кветная А. С., 2000; Быценко Д. С., 2000; Иванова В. В., 2000].

Все штаммы C. Non diphtheriaе, выделенные из ВДП, обладали апоптогенной активностью в отношении макрофагов белых мышей. Причем, апоптогенный эффект C. Non diphtheriaе имел дозозависимый характер. Наиболее выраженным апоптогенным действием (t2) обладали штаммы C.amycolatum (100%) и  С.pseudotuberculosis (100%) по сравнению со штаммом C.pseudodiphtheriticum (88,5±4,2%). Причем, данные штаммы выделены в диагностически значимом количестве в ассоциации с другими микроорганизмами (S.aureus, S.viridians,  Enterococcusspp.).

Cпособность штаммов недифтерийных коринебактерий в зависимости от исследования в монокультуре или в ассоциациис представителями УПМ и между собой вызывать в разной степени программированную гибель клеток может быть обусловлена особенностями их симбиотических взаимодействий. Механизмы апоптогенного действия микроорганизмов различны и могут быть связаны с угнетением процессов синтеза белка, повреждением цитоплазматической и митохондриальной мембран, проникновением эффекторных молекул в клетки хозяина и др. [Cintia S. et al., 2010; Sims K. Et al., 1993].

Причем, микроорганизмы могут использовать одномоментно несколько механизмов апоптогенного действия, интерференция которых при сочетанном воздействии на клетки и обусловливает повышение или снижение процессов программированной гибели клеток [Sims K.etal., 1993]. Процессы апоптоза, индуцируемого C. Non diphtheriae, связаны, по-видимому, с их персистентными и, как следствие, патогенными свойствами.

Учитывая, что  первый этап развития дифтерии обусловлен адгезией возбудителя на эпителиоцитах ВДП, интересным является использование веществ, блокирующих адгезины микроорганизмов [Макаренкова И. Д., 1999; Hladka O.A. etal., 1998]. Одним из веществ с подобным действием является ПО, который обладает не только иммуномодулирующей активностью, но и регуляторным влиянием на биологические свойства микробов [Кириллов Д. И. и соавт., 2003]. В связи с этим было проведено изучение влияния ПО на свойства штаммов С.diphtheriae.

Полученные результаты  показали отсутствие какого-либо воздействия ПОна  морфологические, культуральные и биохимические свойства дифтерийных бактерий. ПО не оказывал влияния на рост С.diphtheriae на жидких и плотных питательных средах, что, возможно, свидетельствовало о неспособности требовательных к условиям культивирования дифтерийных бактерий использовать данный препарат в качестве субстрата. Культивирование С.diphtheriae на среде с добавлением ПО не влияло на их последующую способность к токсинопродукции. Однако, при проверке токсигенных свойств на мартеновскомагаре с добавлением к нему ПО, образования линий преципитации не происходило. Вероятно, данный факт связан с блокадой ПОактивных центров токсина по типу сложного ионного взаимодействия, а также с подавлением диффузии компонентов реакции токсин-антитоксин в питательную среду.

В то же время, при добавлении ПОв среду культивирования (рис. 7) данный препарат полностью, в 100% случаев нивелировал адгезивные свойства С. diphtheriae, как токсигенных, так и  нетоксигенных.

В опытах по прерыванию адгезии блокирующий эффект ПО на адгезивные свойства дифтерийных бактерий густотой 10 КОЕ/мл имел дозозависимый характер и был выражен при использовании ПОв количестве 1200 мкг/мл (рис. 8).

Результаты изучения влияния ПО на апоптогенную активность штаммов C.diphtheriae показали его ингибирующее воздействие на способность как бульонных, так и агаровых культур C.diphtheriae индуцировать процессы апоптоза макрофагов мышей. Причем, данный эффект наблюдали независимо от экспозиций инкубации всех исследованных штаммов C.diphtheriae с макрофагами.

Возможно, ингибирующее влияние ПОна способность дифтерийных  микробов индуцировать адгезивную, ДНК-азную и апоптогенную активность объясняется химическим взаимодействием этого препарата (N-оксидированное производное полиэтиленпиперазина), а, точнее, его аминогрупп, с кислотными остатками белков, входящих в состав поверхностных структур С. diphtheriae. В результате такого взаимодействия происходит, по всей видимости, блокада адгезинов дифтерийных бактерий активными группами ПО, являющегося веществом с выраженной сорбционной активностью.С другой стороны, ПО, возможно, ингибирует рецепторы эритроцитов, что и приводит к феномену торможения адгезии С. diphtheriae в опытах по прерыванию адгезии.

Выводы:

  1. Уровень защищенности от дифтерии населения г. Ростова-на-Дону и Ростовской области в постэпидемический период является высоким (97,9±0,5% серопозитивных среди детей и 94,7±0,4% - среди взрослых). Группы риска развития дифтерии составляютобследованные различных возрастов (3-9, 50 лети старше) и дети с хронической патологией,
  2. В постэпидемический период (2006-2011 г.г.) в г. Ростове-на-Дону и Ростовской области увеличилась доля нетоксигенных  штаммов С. diphtheriae с «молчащим» tox-геном.  Наиболее выраженными патогенными свойствами (адгезивная и апоптогенная активность) обладали циркулировавшие в постэпидемический период в Ростовском регионештаммы С. diphtheriaе tox+по сравнению с музейными токсигеными и циркулировавшими нетоксигенными штаммами коринебактерий.
  3. Иммуномодулятор ПОобладает способностью ингибировать адгезивную, ДНК-азную и апоптогенную активность дифтерийных микробов за счет экранирования их поверхностных структур.
  4. Разработанная питательная среда для культивирования дифтерийных микробов обладает улучшенными ростовыми свойствами, позволяя повысить чувствительность среды, скорость роста и показатель прорастания дифтерийных микробов за счет двухфазности и введения дополнительных стимуляторов роста.

Практические рекомендации:

  1. В условиях постэпидемического периодав г. Ростове-на-Дону и Ростовской области необходимо провести вакцинацию АКДС- и АДС-М препаратами лиц групп риска развития дифтерии.
  2. Разработанная питательная среда для культивирования дифтерийных микробов рекомендуется к применению в практическом здравоохранении для лабораторной диагностики дифтерии при выделении возбудителя из первичного материала.
  3. Ингибирующее воздействие препарата ПОна патогенные свойства возбудителя дифтерии указывает на возможность использования его для неспецифического лечения и профилактики дифтерийной инфекции.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации:

  1. Кириллова Э. Л. Адгезивная активность штаммов C.diphtheriae, циркулирующих в г. Ростове-на-Дону // 59-я Итоговая научная конференция молодых ученых. – Ростов-на-Дону: РостГМУ. – 2005. – С. 96.
  2. Кириллова Э. Л. Патогенные свойства C.diphtheriaе, циркулирующих в межэпидемический период // 60-я Итоговая научная конференция молодых ученых. – Ростов-на-Дону: РостГМУ. – 2006. – С. 41.
  3. Харсеева Г.Г., Москаленко Е.П., Кириллова Э.Л. Использование полиоксидония для снижения адгезивной активности C.diphtheriaе // Материалы юбилейной научно-практической конференции врачей ЮФО, посвященной 50-летию кафедры детских инфекционных болезней РостГМУ.  - Ростов-на-Дону: РостГМУ. - 8-9 ноября 2006. -  С. 181-183.
  4. Алутина Э. Л., Поляйкина М. Влияние иммуномодулятора полиоксидония на биологические свойства штаммов C.diphtheriae // 62-я итоговая научная конференция молодых ученых. – Ростов-на-Дону: РостГМУ. – 2008. – С. 30
  5. Харсеева Г. Г., Москаленко Е. П., Алутина Э. Л., Бревдо А. М. Влияние полиоксидония на адгезивные свойства C.diphtheriae // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. – 2009. - № 2. -  С. 11-15.
  6. Харсеева Г. Г., Квасов А. Р., Алутина Э. Л., Митрофанова Т. В., Москаленко Е. П., Никонова Н. Т. Состояние иммунитета при дифтерии у населения г. Ростова-на-Дону и Ростовской области в последние годы // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. – 2009. - № 6. -  С. 80-83.
  7. Алутина Э. Л., Мамычева Н. И. Характеристика свойств штаммов коринебактерий, выделенных из верхних дыхательных путей // 64-я Итоговая научная конференция молодых ученых РостГМУ. – Ростов-на-Дону: РостГМУ. – 2010. – С. 80.
  8. Алутина Э.Л., Коробова Е.П. Противодифтерийный антитоксический иммунитет у детского населения г. Ростова-на-Дону и Ростовской области // 65-я Итоговая научная конференция молодых ученых РостГМУ. – Ростов-на-Дону: РостГМУ. – 2011. – С. 85-86.
  9. Алутина Э. Л. Характеристика свойств штаммов возбудителя дифтерии и условно-патогенных микроорганизмов, выделенных из верхних дыхательных путей // 65-я итоговая научная конференция молодых ученых РостГМУ. – Ростов-на-Дону: РостГМУ. – 2011. – С. 86-87.
  10. Алутина Э. Л., Харсеева Г. Г., Мамычева Н. И. Особенности биологических свойств штаммов коринебактерий, циркулировавших в г. Ростове-на-Дону и Ростовской области в период с 2004 по 2010 г. г. // Материалы X межвузовской конференции с международным участием «Обмен веществ при адаптации и повреждении (Дни медицинской лабораторной диагностики). -  г. Ростов-на-Дону: РостГМУ.  – 2011. – С. 6-8.
  11. Алутина Э. Л., Харсеева Г. Г. Апоптогенная активность токсигенных штаммов коринебактерий дифтерии в отношении перитонеальных макрофагов мышей // Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 90-летию ФБУН «Омский научно-исследовательский институт природно-очаговых инфекций» Ростпотребнадзора. – г. Омск: ФБУН «Омский научно-исследовательский институт природно-очаговых инфекций» Ростпотребнадзора. – 2011. – С. 199-200.
  12. Алутина Э. Л., Харсеева Г. Г., Миронов А. Ю. Отечественная двухфазная питательная среда для культивирования дифтерийных бактерий. – Астраханский медицинский журнал. – 2011. - № 4. – С. 33-36.
  13. Положительное решение Роспатента по заявке на изобретение «Питательная среда для культивирования дифтерийных микробов» № 2011123264 от 03.02.2012г.

Список сокращений

АДС-М - адсорбированный дифтерийно-столбнячный анатоксин с уменьшенным содержанием антигена

АКДС - адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина

ВДП - верхние дыхательные пути

ДТ – дифтерийный токсин

ИДС - иммунно-дефицитное состояние

КРС - крупный рогатый скот

КТА - кровянно-теллуритовыйагар

ПО - полиоксидоний

ПЦР -  полимеразная цепная реакция

РПГА - реакция пассивной гемагглютинации

СГТ - средняя геометрическая титров антител

УПМ - условно-патогенные микроорганизмы




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.