WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

СВАРВАЛЬ

Алена Владимировна

Характеристика популяции возбудителя и изучение цитокинового звена иммунитета у лиц, инфицированных Helicobacter pylori.

03.02.03 – микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Санкт – Петербург - 2012

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера»

Научный руководитель:

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор  Жебрун Анатолий Борисович

Официальные оппоненты:

Королюк Александр Михайлович – доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра микробиологии, заведующий кафедрой.

Бойцов Алексей Геннадьевич - доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра медицинской микробиологии.

Ведущее учреждение: ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита диссертации состоится 26 декабря 2012 года в 13-00 часов на заседании диссертационного совета Д 215.002.08 на базе ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации (194044, Санкт-Петербург, ул. Акад. Лебедева, дом 6).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации.

Автореферат разослан  «  » ноября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Доктор медицинских наук, профессор Митин Юрий Алексеевич

                               

Общая характеристика работы.



Актуальность проблемы.

Helicobacter pylori - это доказанный этиологический агент инфекционного гастрита типа В и других гастрит-ассоциированных заболеваний, таких как язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, карцинома желудка, первичная В-клеточная лимфома желудка (Аруин Л.И., 1997; Ивашкин В.Г., 2001; Blaser M., 1994; Lambert J., 1994).

Инфекция H. pylori является актуальной проблемой здравоохранения в России и во многих странах мира. Уровень инфицированности людей H. pylori в некоторых развитых странах достигает 50 % и 90% в развивающихся странах (Go M., 2002). Для Российской Федерации характерны достаточно высокие уровни превалентности H. pylori (Беляева О.И., 1995; Решетников О.В., 2000; Жебрун А.Б., 2006).

На территории стран Западной Европы и США наблюдается «когортный эффект» снижения превалентности инфекции H. pylori и связанных с ней заболеваний. Каждое новое поколение, рожденное после 40-х годов, менее инфицировано, чем когорты предыдущих лет рождения (Marshall B., 1994). «Когортный эффект» сопровождается важным изменением структуры циркулирующей популяции возбудителя: наиболее патогенные по современным представлениям, CagA-позитивные штаммы H. pylori, исчезают из циркуляции первыми. За рубежом ведется динамическое наблюдение за превалентностью инфекции H. pylori среди различных групп населения. В нашей стране такие исследования не проводятся.

Актуально изучение инфицированности H. pylori детей и подростков, поскольку среди них высока частота заболеваний, ассоциированных с данным микробом. Так, по данным официальной статистики, заболеваемость гастритами и гастродуоденитами детей от 0 до 14 лет с 1991 по 2010 года возросла в 1,5 раза, а подростков 15-17 лет более, чем в 4 раза. Инфицированность H. pylori детского и подросткового населения в Северо-Западном регионе изучена недостаточно.

  В период возросшей заболеваемости населения гастритами и язвенной болезнью остается слабо исследованным состояние популяции H. pylori, циркулирующей в Санкт-Петербурге. Неизвестна ее структура, динамика и тенденции развития в количественном и качественном отношении. Также слабо изучены современные генотипические характеристики штаммов H. pylori, их связь с патологией желудка и двенадцатиперстной кишки. Особенно важен вопрос адекватной этиотропной терапии инфекции, обусловленной  H. pylori. Применение имеющихся схем лечения часто не дает желаемых результатов из-за широкого распространения штаммов H. pylori, устойчивых к применяемым антимикробным препаратам (Кудрявцева Л.В., 2002; Жебрун А.Б., 2006). Это ставит вопрос о необходимости постоянного изучения свойств антибиотикорезистентности циркулирующих штаммов H. pylori с помощью новых молекулярно-генетических методов, что позволит  вносить коррективы в схемы лечения и повысит эффективность эрадикационной терапии гастрита и гастрит-ассоциированных заболеваний.

Известно, что клинический исход инфекции, обусловленной H. pylori, зависит от особенностей микро - и макроорганизма. Важен характер иммунного ответа на наличие H. pylori. В одних случаях развивается иммунный ответ по Т-1-хелперному типу, при котором наблюдается провоспалительный профиль цитокинов, в других случаях, по Т-2-хелперному типу, при котором вырабатывается противовоспалительный профиль цитокинов (Mohammadi M., 1997; Bamford K.B., 1998; Smythies L.E., 2000; Guiney D.G., 2003). Предполагается, что при втором типе ответа развивается менее разрушительное воспаление в слизистой желудка. Имеются различия в характере иммунного ответа у населения разных географических зон. (Fox J.G., 2000; Blaser M.J., 1993). Эти характеристики инфекции, обусловленной H. pylori, у жителей России практически не исследованы. 

Цель исследования.

Охарактеризовать популяцию возбудителя и изучить изменения цитокинового звена иммунитета у лиц, инфицированных H. pylori, в Санкт-Петербурге в современный период.

Задачи исследования.

  1. Исследование штаммов H. pylori, циркулирующих среди пациентов с гастродуоденальной патологией в Санкт-Петербурге, в том числе их генотипических характеристик.
  2. Определение чувствительности к антимикробным препаратам штаммов H. pylori, изолированных от больных с различной патологией желудка и двенадцатиперстной кишки.
  3. Изучение превалентности инфекции, обусловленной H. pylori, среди населения Санкт-Петербурга в 2007-2011 годах.
  4. Анализ инфицированности H. pylori детей и подростков в организованном детском коллективе.
  5. Выявление особенностей цитокинового звена иммунитета у лиц, инфицированных H. pylori.

Научная новизна.

Впервые исследована генотипическая структура популяции H. pylori в период возросшего уровня заболеваемости населения в России и Санкт-Петербурге гастритами, дуоденитами, язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки. Выявлен, преимущественно, «европейский» характер структуры популяции возбудителя – с умеренным содержанием наиболее патогенных CagA-позитивных штаммов. Доля CagA-позитивных штаммов у больных в Санкт-Петербурге максимальна при раке желудка (90,8%), тогда как при язвенной болезни и гастритах она равна 64,7% и 72,2%, соответственно. По данным сероэпидемиологического маркирования выявлено достоверное возрастание доли CagA-позитивных штаммов в циркуляции среди детского и взрослого населения в период с 2007 по 2011 годы.

Получены новые знания об антибиотикорезистентности штаммов H. pylori, циркулирующих у больных с гастродуоденальной патологией Санкт-Петербурга в современный период. Установлена высокая частота резистентности к метронидазолу – 80,00%, к кларитромицину частота резистентности достигает 36,67%, к амоксициллину равна 6,67%. Впервые использованы молекулярно-биологические подходы для характеристики антибиотикорезистентности российских штаммов H. pylori («полугнездовая ПЦР», лимитированный сиквенс генов). При этом впервые получены научные данные о частоте мутаций генов, обуславливающих резистентность к кларитромицину, выявлена комбинация подобных мутаций, не описанная в литературе.

При изучении превалентности инфекции, обусловленной H. pylori, у детей от 0 до 17 лет впервые выявлена новая закономерность – увеличение частоты данной инфекции в целом и CagA-позитивных штаммов в определенных возрастных группах: 4-5 лет, 7-8 лет, 14-15 лет.

Впервые получены новые знания о типе иммунного ответа на H. pylori у населения России (по материалам Санкт-Петербурга и Северо-Запада Российской Федерации) на основании изучения профиля цитокинов у инфицированных лиц. Полученные данные могут свидетельствовать о преобладании Тh1-типа иммунного ответа при инфекции, обусловленной H. pylori, у населения Санкт-Петербурга.

Практическое значение работы.

Выявлена необходимость дальнейшего улучшения специфической лабораторной диагностики инфекции, обусловленной H. pylori, за счет применения комплекса методов (бактериологических, иммунологических, основанных на ПЦР-технологиях) при первичной диагностике и контроле эрадикации возбудителя.

Сведения о выделении штаммов резистентных к наиболее часто применяемым антимикрабным препаратам подтверждают необходимость мониторинга антибиотикорезистентности H. pylori в рамках деятельности Национального и региональных центров контроля антибиотикорезистентности бактерий.

Полученные данные о возрастании доли CagA-позитивных штаммов в циркуляции среди детского и взрослого населения определяют важность проведения эрадикации при наличии заболеваний, ассоциированных с H. pylori, и последующего контроля ее эффективности.

Положения, выносимые на защиту:

  1. Структура популяции H. pylori, циркулирующей у больных с гастродуоденальной патологией в Санкт-Петербурге, наиболее близка к «европейскому» типу с умеренным преобладанием генотипа cagA+/vacAs1m1. Отмечено достоверное возрастание доли CagA-позитивных штаммов по данным серологического маркирования среди населения Санкт-Петербурга в 2007-2011 гг.
  2. Частота резистентных штаммов H. pylori к кларитромицину в Санкт-Петербурге достигает 36,67%, что значительно превышает пороговый уровень, установленный Четвертым  Маастрихским соглашением, и требует контроля этого показателя перед назначением схем эрадикации H. pylori.
  3. У 72,5% инфицированных H. pylori лиц цитокиновый иммунный ответ развивается преимущественно по Тh1-типу.

Апробация работы.

Основные теоретические и практические положения диссертационной работы прошли апробацию на 19 Европейском Конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Хельсинки, Финляндия, 2009),  на Европейском Конгрессе эпидемиологов (Варшава, Польша, 2009), на 12 международном конгрессе МАКМАХ/ESCMID по антимикробной терапии (Москва, 2010), на 20 Европейском Конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Вена, Австрия, 2010).

Публикации.

По материалам диссертационного исследования опубликовано 16 печатных работ, из них 11 в материалах конференций с международным участием, 2 в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ. Две статьи направлены в печать в журналы, рекомендованные ВАК Минобразования и науки РФ.

Личный вклад автора в проведенное исследование.

В получении научных результатов, излагаемых в диссертационной работе, на всех этапах работы. Автором проведена разработка плана исследования, определены основные направления диссертационного исследования, которые реализованы в процессе углубленного изучения и анализа клинического и лабораторного материала. Выполнена математическая обработка, оценка, обобщение и анализ полученных результатов.

Внедрение результатов.

В Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКМП - Оболенск» депонированы 2 штамма H. pylori для использования в качестве тест-штаммов для идентификации микроорганизма H. pylori и определении его генотипа (свидетельства №163, 164 от 14.12.2010; регистрационные номера штаммов В-6714, В-6715).

Нуклеотидная последовательность участка гена cagA штамма H. pylori № 700 депонирована в GenBank под номером JQ241175 (05.02.2012).

Комплексный метод лабораторной диагностики инфекции, обусловленной H. pylori, апробированный в ходе работы над диссертацией, опубликован в национальном руководстве «Клиническая лабораторная диагностика» (Жебрун А.Б., Сварваль А.В., Гончарова Л.Б., Ферман Р.С. «Хеликобактериозы» в: «Клиническая лабораторная диагностика: национальное руководство» - М.: ГЭОТАР-Медиа – 2012. – Т. II. – С. 394 - 406).

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на  122 страницах и состоит из введения, четырех глав (обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований), заключения, выводов, списка литературы и приложений, иллюстрирована 19 таблицами и 13 рисунками, 5 приложениями. Указатель литературы включает  182 источников, из них 42 отечественных и 140 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы исследования.

Работа выполнена на базе ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера. Обследовано с помощью серологического метода 2072 человека, из них 860 детей и подростков в возрасте от 0 до 17 лет (средний возраст 9,8±1,01) и 1212 взрослых в возрасте от 18 до 80 лет (средний возраст 38,17±1,4). Обследованы субъективно здоровые лица, доноры крови, а также пациенты, имеющие различную патологию желудочно-кишечного тракта: хронический гастрит, гастродуоденит, язвенную болезнь желудка или  двенадцатиперстной кишки, злокачественные новообразования различной локализации. Изучено наличие в сыворотке крови антител (IgG) к бактериальному  антигену H.pylori и IgG к его токсину-CagA. Исследования поведены с использованием тест-систем для ИФА производства DRG (Германия), “Biohit”(Финляндия). Постановку реакции ИФА осуществляли в строгом соответствии с инструкцией производителей. Критерии оценки серопозитивности и серонегативности исследуемых образцов сыворотки крови выбраны в соответствии с  инструкциями по применению тест-систем. При анализе данных был использован интегративный показатель: серопозитивными считали лиц, у которых обнаружены антитела к суммарному антигену H. pylori и к CagA, или хотя бы к одному из них, серонегативными – лиц, у которых отсутствовали оба типа антител.

В рамках данной работы обследовано 390 детей и подростков 1-11 классов (средний возраст 12,34±1,7), 34 преподавателя и работника пищеблока (средний возраст 51,7±8,6) одного организованного коллектива  Санкт-Петербурга. У данной группы обследованных изучали наличие в сыворотке крови антител (IgG) к бактериальному антигену H.pylori и IgG к его токсину - CagA. У 222 детей (случайная выборка) из разных классов исследованы образцы фекалий. Определение наличия антигена H. pylori в кале проводили с помощью тест-системы Helicobacter pylori Antigen ELISA Kit, Immundiagnostik.

С целью изучения особенностей иммунного ответа обследовано 40 человек: с  заболеваниями желудка (10) и субъективно здоровых лиц (30). Средний возраст обследованных составил 44,15±7,8 лет. У всех обследованных обнаружены иммуноглобулины класса G к H. pylori и/или его токсину CagA. Концентрацию IL2, IL4, IL6, IL10, IL18, TNF-, INF, IgE в сыворотке крови определяли методом ИФА с использованием тест-систем ООО «Вектор-Бест».

Бактериологически обследовано 129 пациентов с диагнозами: хронический гастрит, гастродуоденит, язвенная болезнь желудка и/или двенадцатиперстной кишки, злокачественные новообразования различной локализации. Посевы осуществляли в соответствии с методикой, описанной в пособии для врачей «Диагностика, профилактика и лечение заболеваний, ассоциированных с Helicobacter pylori-инфекцией» (Жебрун А.Б., Александрова В.А., Гончарова Л.Б., Ткаченко Е.И., 2002). Бактериологическому исследованию подлежали биоптаты слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки, которые были взяты во время эндоскопии в условиях строгой асептики.





Антибиотикорезистентность 30 выделенных штаммов H. pylori изучали по методике, описанной в Методических указаниях МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам». Исследование проводили с помощью диско-диффузионного метода, который основан на регистрации диаметра зон ингибиции роста микроорганизма вокруг бумажного диска с антибиотиком. Определяли чувствительность к антимикробным препаратам - метронидазолу, кларитромицину, амоксициллину, которые наиболее часто используются в схемах эрадикации инфекции, обусловленной H. pylori. Критериями оценки результатов определения чувствительности штаммов H. pylori были следующие: для амоксициллина и кларитромицина зона задержки роста менее 30 мм – резистентный штамм, равная 30 мм и более – чувствительный штамм; для метронидазола – зона задержки роста менее 16 мм – резистентный штамм, 16 мм и более – чувствительный штамм. (Boyanova L., 1999). Контроль чистоты роста культуры оценивали по посеву штамма H. pylori на чашку Петри с селективной кровяной средой.

Выборочно с 7 культурами резистентными к кларитромицину проводена «полугнездовая ПЦР реакция» гена 16 S рРНК и 23 S рРНК H. pylori  с последующим рестрикционным анализом, для выявления мутаций, кодирующих устойчивость к кларитромицину. Регион, соответствующий 23 S рРНК, был амплифицирован методом ПЦР с Mboll, Bsal и Hhal и подвержен ДНК-секвенированию (работа проводилась совместно с ФГБУ «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» СЗО РАМН).

Для изучения штаммов H. pylori (49) и биоптатов (36) слизистой оболочки желудка применяли метод ПЦР в формате реального времени. Проводили исследования с помощью эксперементальных серий новой тест-системы для ПЦР-РВ, разработанной совместно с ЗАО «Синтол», г. Москва. Изучали наличие генов cagA и vacA. По гену vacA проводили генотипирование 14 штаммов H. pylori. ДНК выделяли с помощью набора «ДНК-сорбА». Использованы праймеры и зонд на 16S рРНК, на cagA, vacA (Sобщ, s1, s2, mобщ, m1, m2 регионы) гены.

Статистическая обработка полученных данных проводили с использованием методов статистического анализа при помощи стандартных статистических пакетов программ Statistica 6.0, Microsoft Excel XP. При создании базы данных использовали редактор электронных таблиц MS Exel 7.0, получены средние значения параметров и определены их доверительные интервалы. Средние значения переменных в таблицах представлены в виде p ± m (относительная величина ± стандартная ошибка относительной величины), вне зависимости от использовавшегося критерия. Для оценки достоверности различий между несколькими группами наблюдений использовали методы дисперсионного анализа. Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента (t) и величины вероятности (p). За достоверность различий принимали значение p<0,05, вероятность различий составляла 95% и более.

Основные результаты исследования и их обсуждение.

При бактериологическом обследовании больных с хроническим гастритом, гастродуоденитом, язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки выделено 49 штаммов H. pylori. Штаммы имели характерный для  Н. pylori рост на селективных кровяных питательных средах. При постановке уреазного теста колонии давали положительный результат в течение первых пяти - десяти минут. При микроскопии бактерии H. pylori представляли собой Грам-отрицательные тонкие изогнутые палочки.

При исследовании данных штаммов с помощью метода ПЦР обнаружено, что 40 (81,63±5,6%) из них имеют ген cagA. Имеющиеся культуры были разделены на группы в зависимости от патологии обследованных больных, у которых они были выделены. Установлено, что штаммы, полученные от больных с язвенной болезнью, в 83,33% имеют cagA. При хронических гастритах и гастродуоденитах доля штаммов, содержащих cagA, в общей структуре популяции возбудителя составила 86,21% и 71,43%, соответственно.

Ранее, в 1998-2003 годах, в лаборатории иммунологии НИИЭМ имени Пастера получены результаты, которые свидетельствуют, что доля cagA-позитивных штаммов  H. pylori по данным генотипирования составляла 76±5,6% (Жебрун А.Б. с соавт., 2003). Таким образом, за последние годы выявлена тенденция к нарастанию в популяции доли токсигенных (cagA+) штаммов H. pylori.

Используя метод ПЦР в режиме реального времени, проведено генотипирование по гену vacА 14 штаммов H. pylori. Доля культур с vacAs1 составила 85,71%, vacAs2 – 14,29%. Частота обнаружения штаммов с генотипом vacAm1 составила 57,14%, vacAm2 – 35,74%, один штамм имел генотип vacАm1m2. При генотипировании vacA установлено, что преобладал генотип s1m1 (57,14% штаммов), который  в 87,5% случаях был ассоциирован с наличием cagA гена. Генотип vacAs1m2 встречался у 21,43% штаммов H. pylori, а vacАs2m2 – у 14,29%. Один штамм, выделенный от больного с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки, обладал генотипом cagA+/s1m1m2.  Генотип cagA+/s2m2vacA H. pylori определен у пациента с раком желудка, хотя по литературным данным этот генотип рассматривается, как низкопатогенный (Athertoon JC et al., 1997) (рис.1).

Рис. 1. Результаты генотипирования гена vacA H. pylori.

Таким образом, проведенный анализ показал, что на территории Санкт-Петербурга циркулируют преимущественно штаммы H. pylori, имеющие ген cagA. Данный ген обнаружен у 81,63±5,6% исследованных культур. При генотипировании штаммов H. pylori по  гену vacA обнаружено, что преобладают штаммы H. pylori имеющие генотип cagA+/s1m1vacA.

Была проведена работа по изучению антибиотикорезистентности штаммов H. pylori, циркулирующих в настоящий период в Санкт-Петербурге. Ранее при изучении этих свойств у штаммов H. pylori было определено, что, в 2001 году к метронидазолу были резистентны 55,5% изолятов данного микроба, к кларитромицину 13,8%, к амоксициллину – 0% (Кудрявцева Л.В. с соавт., 2002). Также результаты, проведенных этим автором исследований, свидетельствуют о росте резистентности к данным антимикробным препаратам. Так в 1997 году к метронидазолу и кларитромицину были устойчивы 42% и 8% штаммов H. pylori, соответственно.

Как известно, резистентность к кларитромицину может быть обусловлена точечными хромосомными мутациями в 23S рибосомальной РНК. Большинство claR мутаций описаны в научной литературе, при этом наиболее часто встречаются мутации A2142G или A2143G. Для определения этих мутаций существуют коммерческие тест-системы для метода ПЦР. Однако в некоторых случаях у кларитромицин-резистентных штаммов этих мутаций не находят.

Исследовано 30 штаммов H. pylori на наличие резистентности к антимикробным препаратам, которые традиционно используются для эрадикации заболеваний, ассоциированных с хеликобактериями - амоксициллину, кларитромицину и меторонидазолу. Все изучаемые штаммы были выделены от пациентов с хроническим гастритом, хроническим гастродуоденитом, язвенной болезнью желудка или двенадцатиперстной кишки. У всех больных был позитивен уреазный дыхательный тест. Изучение штаммов проводили с помощью бактериологического и генетического (ПЦР и ПЦР-РВ) методов. Чувствительность к антимикробным препаратам определяли диско-диффузионным методом. Данные представлены в таб.1.

Таблица 1. Результаты изучения чувствительности штаммов H. pylori к антимикробным препаратам.

Антимикробный препарат

Характер чувствительности

Количество штаммов

H. pylori

абс. число

%

Кларитромицин

чувствительные

19

63,33

резистентные

11

36,67

Амоксициллин

чувствительные

28

93,33

резистентные

2

6,67

Метронидазол

чувствительные

6

20

резистентные

24

80

Обнаружена высокая чувствительность выделенных штаммов H. pylori к амоксициллину. Чувствительность к данному антибиотику имели 28 (93,33%) изученных штаммов, резистентными были 2 (6,67%) культуры.

При изучении чувствительности выделенных штаммов H. pylori к метронидазолу выявлено, что 24 (80,00%) штамма имели резистентность к данному антимикробному препарату, 6 (20,00%) штаммов были чувствительными к нему. Безусловно, такой высокий процент резистентных штаммов H. pylori к метронидазолу должен учитываться при назначении схем эрадикационной терапии при заболеваниях, обусловленных данным микробом. Согласно Маастрихтскому соглашению 2005 года включение метронидазола в схему эрадикационной терапии H. pylori-инфекции имеет смысл лишь при уровне резистентности к метронидазолу менее 40% (Malfertheiner P. et al., 2005).

При исследовании кларитромицин-резистентности установлено, что 19 (63,33%) штаммов H. pylori имели чувствительность к данному антибиотику и 11 изученных штаммов (36,67%) были резистентностны к кларитромицину.

Проведен анализ штаммов, устойчивых к кларитромицину, с помощью молекулярно-генетических методов с дальнейшим типированием генов устойчивости. Работа осуществлялась совместно с ФГБУ «Научно-исследовательским институтом экспериментальной медицины» СЗО РАМН.

Выборочно с 7 культурами резистентными к кларитромицину проводена «полугнездовая ПЦР реакция» гена 16 S рРНК и 23 S рРНК H. pylori  с последующим рестрикционным анализом, для выявления мутаций генов, кодирующих устойчивость к кларитромицину. Регион, соответствующий 23 S рРНК, был амплифицирован методом ПЦР с Mboll, Bsal и Hhal и подвержен ДНК-секвенированию. У  изучаемых штаммов были обнаружены мутации в генах 16 S рРНК, 23 S рРНК.  Наиболее распространенными были мутации A2142G, A2143G, T2717C. У 4-х устойчивых к кларитромицину штаммов не было обнаружено этих мутаций, то есть они были резистентны к реакциям с Mboll, Bsal и Hhal, показывающим отсутствие указанных мутаций. При дальнейшем изучении с помощью ДНК секвенирования определено, что остальные штаммы несли разные claR мутации: Т2182С, С2195Т, С2288Т. Мутация T2182C  описана в научной литературе ранее (Khan R., 2004; Kim J. M., 2002; Posteraro P., 2006; Chihu L., 2005), мутации C2195T и C2288T были найдены прежде лишь в сочетании с A2142G или A2143G (Posteraro P., 2006; Pimbara E., 2007).

Таким образом, результаты изучения чувствительности штаммов H. pylori, к антимикробным препаратам, применяемым для эрадикационной терапии инфекции, обусловленной H. pylori, показывают, что резистентность к кларитромицину в Санкт-Петербурге достигает 36,67%, к метронидазолу – 80,00%, амоксициллину - 6,67%. Выявлено, что мутация A2143G в гене 23 S рРНК встречалась в 75% случаев у кларитромицин-резистентных штаммов.  Обнаружены мутации Т2182С, С2195Т, С2288Т. При этом выявлена новая, не описанная ранее в литературе комбинация мутаций генов, кодирующих резистентность H. pylori к кларитромцину.

Так как H. pylori является трудно культивируемым микроорганизмом, изучена возможность определения его факторов патогенности непосредственно в биопсийном материале.  Биоптаты слизистой оболочки желудка, взятые у пациентов во время фиброгастроскопии, исследованы с помощью бактериологического и молекулярно-биологического методов. Для сравнительного исследования были отобраны 36 пациентов, у которых Хелпил-тест дал положительный результат. Изучена возможность использования экспериментальной тест-системы для метода ПЦР-РВ производства ЗАО «Синтол» для определения детерминант патогенности H. pylori - генов cagA, vacA. Кроме того, эти же биоптаты изучали с помощью культурального метода и метода ПЦР-РВ с использованием тест-системы производства «ДНК-технология».

Известно, что ген vacA имеется у всех штаммов H. pylori, поэтому он может быть использован, как достоверный критерий наличия генома данного микроорганизма. Напротив, ген cagA H. pylori присутствует не всегда. В связи с этим ген vacA был использован как критерий для определения частоты обнаружения гена cagA. В результате проведенного исследования установлено, что ген vacA H. pylori присутствовал в 21 образце (58,33% из числа всех позитивных в Хелпил-тесте пробах), при этом доля  cagA+ составила 76,2%.

В ходе исследования биоптатов слизистой оболочки желудка с помощью культурального метода выделено 14 штаммов H. pylori (у 38,9% пациентов с позитивным результатом Хелпил-теста, у 66,7% пациентов с позитивным результатом ПЦР-РВ). При этом 13 из этих биоптатов оказались позитивны в ПЦР-РВ (92,86%).

Из 22 проб отрицательных при культуральном исследовании, 8 были позитивны при исследовании с помощью метода ПЦР-РВ, то есть методом ПЦР-РВ с помощью данной тест-системы обнаружено на 19,44 %  больше позитивных результатов. Доля совпадающих результатов, полученных культуральным методом и методом ПЦР-РВ, составила 75%. Таким образом, наиболее оптимальным является сочетанное использование этих методов для диагностических целей, поскольку метод ПЦР обладает большей чувствительносью, а бактериологический метод дает возможность получить штамм, который можно исследовать в тесте определения чувствительности к антибиотикам.

В ходе изучения биоптатов слизистой оболочки желудка проведено сравнение результатов, полученных с помощью экспериментальной тест-системы для обнаружения H. pylori методом ПЦР-РВ производства ЗАО «Синтол» и тест-системы для определения H. pylori методом ПЦР-РВ производства «ДНК-технология». Установлено, что при исследовании 36 проб совпадающие результаты получены в 34 случаях (94,44%). В 2-х случаях (5,56%) тест-система производства «ДНК-технология» дала позитивный результат, в отличие от тест-системы ЗАО «Синтол», при этом культуральный метод в одном случае был негативным, в другом – позитивным. При исследовании 3 контрольных штаммов H. pylori обе тест-системы дали положительные результаты. Обе эти тест-системы могут быть использованы в диагностике.

При исследовании биоптатов слизистой оболочки желудка с помощью бактериологического метода выявлена его невысокая чувствительность, которая может быть связана не только с трудной культивируемостью данного микроба, но и с локальным его расположением в слизистой желудка. С очаговостью персистирования микроба в слизистой оболочке желудка может быть связана и относительно невысокая чувствительность молекулярно-генетических методов.

Проведено обследование 60 больных с хроническим гастритом и язвенной болезнью желудка и/или двенадцатиперстной кишки с помощью бактериологического и серологического методов. В результате этого исследования выделено 24 штамма H. pylori (у 40% обследованных). Данный микроб выделен от 18 (39,13%) больных с хроническим гастритом и 6 (42,86%) больных с язвенной болезнью.

Антитела в сыворотке крови к суммарному антигену H. pylori (IgG) обнаружены у 48 обследованных (80%), а к CagA H. pylori (IgG) – у 32 (53,33%). Таким образом, доля CagA-позитивности  у пациентов с данной патологией составила 66,7%. Интегративный показатель H. pylori - серопозитивности в группе больных с хроническим гастритом практически не отличалась от такого же показателя группы больных с язвенной болезнью (80,43% и 78,57%, соответственно). При этом CagA-серопозитивность оказалась несколько выше у пациентов с язвенной болезнью (57,14% против 52,17%).  Доля CagA-позитивности среди больных с язвенной болезнью составила 72,73%. Это выше аналогичного показателя в группе больных с хроническим гастритом (64,86%).

Отдельно были рассмотрены результаты серологического обследования  группы больных, у которых выделены штаммы H. pylori. Установлено, что в 24 случаях (у 100% этих пациентов) наблюдался антительный ответ на наличие H. pylori, при этом доля CagA-позитивности в этой группе больных достигала 87,5%.

В ходе этого фрагмента работы проведено исследование сывороток крови 162 пациентов с различными хроническими заболеваниями желудка и двенадцатиперстной кишки (таб. 2). В результате исследования установлено, что, в целом,  серопозитивность к H. pylori больных, имеющих различную патологию желудка или двенадцатиперстной кишки, равна 83,95±2,9%, при этом серопозитивность к CagA H. pylori составила 67,28±3,7%.

Серопозитивность к H. pylori среди пациентов с хроническими гастритами и гастродуоденитами равна 87,1±4,3%, серопозитивность к CagA H. pylori - 62,9±6,1%. Максимальной оказалась превалентность инфекции H. pylori среди больных с язвенной болезнью желудка или двенадцатиперстной кишки. Среди пациентов данной категории серопозитивность к H. pylori составила 94,44±15,4%; серопозитивность к CagA H. pylori - 61,11±11,5%. При обследовании больных со злокачественными новообразованиями желудка выявлено, что серопозитивность к H. pylori составила 79,27±4,5%, серопозитивность к CagA H. pylori равна 71,95±4,9%. То есть, доля CagA-позитивных штаммов в структуре H. pylori инфекции у данной категории больных максимальна и составила 90,77±3,6%, тогда как у больных гастритами она равна 72,2±6,1%, у больных с язвенной болезнью - 64,7±11,6%.

Таблица 2. Частота выявления антител к H. pylori и CagA H. pylori среди больных с различными заболеваниями желудочно-кишечного тракта.

Диагноз

Всего обследова

но

(чел)

Наличие IgG к H.pylori

Наличие Ig G к CagA H. pylori

Доля CagA в структуре инфекции

абс.число (%±m)

абс.число (%±m)

  %±m

Хронический гастрит и гастродуоденит

62

54 (87,10±4,3)

39 (62,90±6,1)

72,2±6,1

Язвенная болезнь желудка и/или двенадцатиперст-ной кишки

18

17 (94,44±15,4)

11 (61,11±11,5)

64,7±11,6

Рак желудка

82

65 (79,27±4,5)

59 (71,95±4,9)

90,8±3,6

Рак кишечника

73

48 (65,75±5,5)

41 (56,15±5,8)

85,4±5,1

При сравнении серопозитивности к H. pylori больных, имеющих злокачественные новообразования желудка и различных отделов кишечника, выявлено, что рассматриваемые показатели последних значительно ниже. В данной группе больных серопозитивность к H. pylori равна 65.75±5,5%, при этом серопозитивность к CagA H. pylori - 56,15±5,8%. Однако доля CagA специфических антител в этой группе также достаточно велика и составляет 85±5,1%.

При сравнении данных серопозитивности к H. pylori среди лиц с различной патологией желудка и кишечника, а также взрослых лиц общей популяции установлено, что у последних рассматриваемые показатели ниже. Среди взрослых серопозитивность к H. pylori составила 65,0±1,59%; серопозитивность к CagA H. pylori – 52,89±1,5%. Различия в показателях серопозитивности к H. pylori в группе лиц с патологией желудка и общей популяцией взрослых статистически достоверны (p<0,05).

При изучении инфицированности H. pylori населения Санкт-Петербурга в 2007-2011 годах установлено, что среди детей и подростков (в возрасте от 0 до 17 лет) инфицированность H. pylori составила 48,95±1,7%; при этом инфицированность CagA+ штаммами была равна 35,81±1,6%. Доля серопозитивных к CagA в структуре инфицированных лиц составила 73,2±1,5%. Средний показатель инфицированности взрослого населения H. pylori равнялся 65,09±1,5%, инфицированности CagA-позитивными штаммами – 52,89±1,5%. Доля серопозитивных к CagA равна 81,25±1,5% в структуре взрослых инфицированных лиц. Различия в инфицированности H. pylori детей и взрослых статистически достоверны (p<0.01).

Таблица 3. Частота определения серопозитивных к H. pylori лиц среди детей 0-17 лет Санкт-Петербурга в 2007-2011 гг.

Год наблю-дения

Всего

обсле-довано

Интегративный показатель инфицированности H.pylori

Наличие Ig G к CagA

H. pylori

абс. число

%±m

абс. число

%±m

2007

50

21

42±6,9

9

18±5,4

2008

116

60

51,72±4,6

41

35,34±4,4

2009

158

64

40,51±3,9

54

34,18±3,7

2010

396

214

54,04±2,5

149

37,63±2,4

2011

140

62

44,29±4,2

55

39,29±4,1

Итого

860

421

48,95±1,7

308

35,81±1,6

Среди детской популяции за 2007-2011 годы наблюдений отмечается неравномерная динамика изменений показателей серопревалентности к H. pylori. Годы повышения серопозитивности сменялись ее снижением. Показатели колебались в пределах 40,51-54,04% без явного тренда к повышению или понижению за этот период  (таб.3).

Число серопозитивных к CagA H. pylori лиц в 2008 году возросло по сравнению с 2007 годом на 17,34% (p<0,05). В последующем, с 2008 по 2011 годы количество серопозитивных к CagA H. pylori лиц практически не изменялось, однако отмечена тенденция к возрастанию доли CagA-позитивности в общей структуре инфекции. В 2007 году доля CagA H. pylori составила 42,86±6,9%, тогда как в 2011 году этот показатель равен 88,71±2,7% (p<0,01).

Таким образом, среди детей и подростков от 0 до 17 лет за указанный период наблюдения отмечалась стабилизация показателей серопозитивности к CagA H. pylori на уровне 34,18-39,29% и статистически достоверное возрастание доли  CagA в общей структуре инфекции.

Среди взрослого населения пятилетний период наблюдений выявил рост серопозитивности к H. pylori: с 52,72±3,8% в 2007 году до 74,09±2,9% в 2010.  В 2011 году отмечена тенденция к снижению показателей серопревалентности до уровня 64,32±3,3% (таб.4).

Подобная картина наблюдается и с динамикой серопозитивности к CagA+ штаммам: 34,54%±3,7 - в 2007 году, 61,36%±3,3 – в 2010. Различия обоих показателей серопозитивности между 2007 и 2010-2011 годами статистически значимы (p<0,05).

При рассмотрении доли CagA в структуре инфекции среди взрослых, отмечается тенденция к ее росту с 2007 по 2011 года наблюдения. Так в 2007 году она составляла 65,52±3,7%, в 2011 году – 86,13±1,9%, различия статистически достоверны (p<0,01).

Таблица 4. Частота определения серопозитивных к H. pylori лиц среди взрослых Санкт-Петербурга в 2007-2011 гг.

Год наблю-дения

Всего

обсле-довано

Интегративный показатель инфицированности H.pylori

Наличие Ig G к CagA

H. pylori

абс. число

%±m

абс. число

%±m

2007

165

87

52,72±3,8

57

34,54±3,7

2008

183

106

57,92±3,6

83

45,36±3,7

2009

276

195

70,65±2,7

166

60,14±2,9

2010

220

163

74,09±2,9

135

61,36±3,3

2011

213

137

64,32±3,3

118

55,40±3,4

Итого

1057

688

65,09±1,5

559

52,89±1,5

Таким образом, динамика серопозитивности взрослого населения к H. pylori за 5 лет указывает на ее рост и стабилизацию значений на достаточно высоком уровне, а также увеличение доли CagA-позитивной инфекции в ее общей структуре среди взрослого населения.

При более детальном рассмотрении данных о серопревалентности инфекции  H. pylori среди детей и подростков можно отметить, что увеличение числа серопозитивных лиц происходит неравномерно (рис. 2).

Рис. 2. Серопозитивность к H. pylori среди детей разного возраста в Санкт-Петербурге в 2007-2011 годах.

Из представленных данных видно, что отмечаются несколько подъемов числа серопозитивных к H. pylori детей. Первый отчетливый подъем наблюдается среди детей 4-х лет: по сравнению с детьми 3-х летнего возраста уровень серопозитивности  увеличился на 25,81% (p<0.01). Можно предположить, что он связан с тем, что большая часть детей в этом возрасте начинает посещать организованные детские коллективы и, соответственно, возрастает объем общения между ними, что способствует распространению данной инфекции. Второй небольшой подъем отмечен в 7-8 лет (увеличение частоты выявления антител к H. pylori до 47,62% и 47,54%, соответственно). Он приходится на начало посещения детьми общеобразовательных школ и увеличением новых контактов между детьми. Подобное явление – повышение уровня инфицированности детей в организованных коллективах было отмечено и другими исследователями. Так, при изучении превалентности инфекции, вызванной H. pylori, в Израиле выявлено, что инфицированность данным микробом детей дошкольного возраста составляет 49,7%, а среди школьников - 58,9% (Muhsen K., 2010). Третий подъем инфицированности H. pylori отмечен в возрасте 14-16 лет (64,56%). По сравнению с показателем серопозитивности к H. pylori среди детей 10 лет рост составил 24,21%. Различия в серопозитивности к H. pylori в 10 и 14 лет статистически достоверны (p<0,01). Можно предположить, что это связано с началом посещения объектов общественного питания (кафе, учреждений быстрого питания), что очень популярно в подростковых возрастных группах. Контакт с новыми штаммами и генетическими линиями H. pylori, циркулирующими за пределами организованного коллектива, мог вызвать новую волну роста инфицированности школьников.

Те же тенденции можно подтвердить, рассматривая серопозитивность к CagA H. pylori у детей разного возраста: увеличение показателей с возрастом и волновой характер нарастания. Отмечены подъемы серопозитивности к CagA H. pylori у детей в 4, 7-9 и 14-16 лет (35,29%, 37,26% и 46,6%, соответственно). Доля CagA в структуре инфекции, обусловленной H. pylori, у детей изменялась неравномерно. Этот показатель максимален в младшем возрасте: среди детей от 0 до 3-х лет составляет 83,34-86,67%. Возможно, что это связано с высокой иммуногенностью CagA белка и активной выработкой антител к нему при первичном инфицировании H. pylori. Далее этот показатель колеблется от 62,89% у детей 17-ти лет до 79,17% - у 7-9-летних.

По данным официальной статистики заболеваемость гастритами и гастродуоденитами в 1,5 раза, а заболеваемость язвенной болезнью в 2 раза выше в возрастной группе 15-17 лет, чем в группе 0-14 лет. Аналогичную направленность и статистическую достоверность имеют различия в инфицированности H. pylori этих возрастных категорий. Рассматривая уровни серопозитивных к H. pylori детей 0-14 и 15-17 лет установлено, что в группе детей он равен 45,05±1,9%, а среди подростков достигал 61,58±3,4% (p<0,01). Различия в значениях серопозитивности к CagA H. pylori между этими группами менее выражены (33,64±1,8% и 42,86±3,5%, соответственно) (p<0,05).

Таким образом, анализ динамики инфицированности H.pylori детского и подросткового населения разного возраста показал статистически достоверное увеличение серопозитивности с возрастом (p<0,05). Отмечены три подъема частоты серопозитивности к H. pylori у детей (в 4, 7-8, 14-16 лет). Доля CagA в структуре инфекции, обусловленной H. pylori, изменяется неравномерно и максимальна у детей от 0 до 3-х лет.

При изучении инфицированности H.pylori взрослых разных возрастных групп установлено, что наименьшая серопозитивность к H. pylori и CagA H. pylori обнаружена среди лиц молодого возраста (18 - 29 лет), у которых эти показатели составляли 59,22±2,5% и 54,09±2,5%, соответственно. Показатели серопозитивности несколько выше среди лиц среднего возраста (30-39 лет) и составляли 72,94±3,0%, серопозитивность к CagA при этом равнялась 56,42±3,4%. Среди взрослых 40-49 лет показатели практически также высоки и равны 70,69±3,5% и 68,97±3,5%, соответственно. Среди лиц возрастной категории 50 лет и старше отмечено некоторое снижение серопозитивности к CagA H. pylori до 39,56±3,6%, тогда  как серопозитивность к H. pylori практически не изменилась (66,48±3,4%).

Был проведен сравнительный анализ повозрастной превалентности инфекции, обусловленной H. pylori, в начале и конце периода наблюдения, в 2007 и 2011 годах (рис.3).

Рис. 3. Динамика инфицированности H. pylori населения разных возрастных групп в Санкт-Петербурге в 2007 и 2011 годах (% серопозитивных лиц).

Видно, что среди детской популяции за это время сохранилась тенденция к повышению значений серопозитивности к H. pylori с увеличением возраста обследуемых. Среди взрослой популяции прослеживаются некоторые различия. В 2007 году максимально была инфицирована возрастная категория лиц от 30 до 39 лет (67,44±7,1%), затем отмечалось снижение превалентности H. pylori: 51,29±8,0% в группе 40-49летних и 50,00±9,8% среди лиц старше 50 лет. Таким образом, максимально инфицированы лица 30-39 лет. В 2011 году прослеживается тенденция к увеличению инфицированности в возрастных категориях 20-29 лет (65,35±4,2%), 30-39 лет (77,55±5,9%) и максимальное значение достигалось в группе 40-49 лет (86,11±5,7%). Тенденция к снижению инфицированности H. pylori отмечалась только в группе «50 лет и выше» (76,92±6,7%). Различия в количестве серопозитивных к H. pylori лиц в возрастных категориях 40-49 в 2007 и 2011 годах статистически достоверны (p<0.05).

Таким образом, при рассмотрении различий в серопревалентности инфекции, вызванной H. pylori, отмечается смещение максимальных значений серопозитивности с возрастной группы 30-39 лет в 2007 году на возрастную группу 40-49 лет в 2011 году.

Учитывая полученные данные о характере распределения серопревалентности к H. pylori среди населения разных возрастов, было проведено обследование детей одного организованного детского коллектива Санкт-Петербурга.

В результате исследования установлено, что интегративный показатель серопозитивности к H. pylori у детей 7-и лет оказался равным 36,84±11,1%, он нарастал с возрастом и достиг максимального значения в группе детей 14-и лет (66,67±7,0%) (р<0,05).

Из полученных результатов следует отметить двухволновой характер распределения инфицированности H. pylori в зависимости от возраста детей. Первый пик – в 11-летнем возрасте (60±8,3% серопозитивности), с последующей тенденцией к снижению и далее новая волна роста инфицированности с 13 до 14-и лет и последующая тенденция снижения частоты инфекции к 17-и годам (51,61±8,9). Очевидно, что периоды роста инфицированности в 7-11 и затем с 13-14 лет свидетельствуют о преобладании темпа заражения над темпом элиминации инфекции в этих возрастных группах. Можно предположить, что первая волна может быть обусловлена местным  “проэпидемичиванием” детей за счет обмена штаммами H. pylori внутри школьного коллектива. Как было отмечено выше, вторая волна, предположительно, может быть связана с началом посещения объектов общественного питания (кафе, учреждений быстрого питания), что очень популярно в подростковых возрастных группах. Контакт с новыми штаммами и генетическими линиями H. pylori, циркулирующими за пределами организованного коллектива, мог вызвать новую волну роста инфицированности школьников.

Кроме сероэпидемиологического обследования школьников проведено определение наличия антигена H. pylori в фекалиях. В целом данный показатель был позитивным у 22,4±2,8% учащихся. Во всех возрастных группах чувствительность этого исследования уступала чувствительности серологических методов. В силу особенностей детской психологии и по организационным причинам (например, таким как, удаленность школы от лаборатории) не удалось быстро собрать и исследовать пробы стула в массовых количествах. Образцы хранили при комнатной температуре по 12 часов и более, затем доставляли в лабораторию и помещали в рефрижератор с температурой минус 200 С. Образцы размораживали и серийно исследовали по мере их накопления. Все эти обстоятельства могли повлиять на информативность теста, и на более низкие результаты, по сравнению с серологическим тестом.

Таким образом, тест на наличие антигена H. pylori в стуле, признанный наряду с уреазным дыхательным тестом наиболее чувствительным методом клинической диагностики, не всегда может быть приемлем в массовых эпидемиологических исследованиях в силу отмеченных выше организационных трудностей.

Таким образом, выявлен достаточно высокий уровень инфицированности H. pylori учащихся этого коллектива. Установлено, что превалентность инфекции, обусловленной H. pylori, статистически достоверно увеличивается с возрастом учащихся. Отмечается два пика подъема позитивных ответов к H. pylori, в 11 и 14 лет. Превалентность инфекции среди подростков достоверно выше, чем среди детей 7-14 лет. Эти данные согласуются с высокой заболеваемостью детей и подростков Санкт – Петербурга гастритами, гастродуоденитами и язвенной болезнью желудка и с различными ее уровнями в отмеченных возрастных группах.

Принципиальное значение при инфекции, обусловленной H. pylori, имеет характер поляризации иммунного ответа по Тh1 или Тh2 типу (Mithell H. et al., 2002). При Тh2 типе иммунного ответа инициируется набор цитокинов с преимущественной противовоспалительной активностью: IL4, IL5, IL6, IL9, IL10, IL13. Его маркером может служить усиленная продукция антител субкласса IgG1 и заметная продукция IgE (Toellner K. et al., 1998). Th1-тип иммунного ответа стимулирует интерлейкины провоспалительного профиля: TNF, IF, IL12, IL2, IL18. Маркером этого типа иммунного ответа является преимущественная продукция антител субкласса IG2 (Toellner K. et al., 1998). По данным многочисленных исследований показано, что Тh1-тип иммунного ответа ассоциируется с более частым развитием гастрита в язвенную болезнь и атрофию желудка (Lanas A. et al., 2001; Permin H. et al., 2005).

Изучены особенности цитокинового звена иммунного ответа у лиц, инфицированных бактериями рода H. pylori. Обследовано 40 человек: субъективно здоровых лиц (n=30) и больных с патологией  желудка (n=10), у которых были обнаружены антитела к суммарному антигену H. pylori и/или его токсину CagA. Изучали наличие следующих факторов: IL2, IL4, IL6, IL10, IL18, FNO, IF, IgE.

При рассмотрении величин цитокинов с преимущественной провоспалительной активностью у серопозитивных к H. pylori лиц выявлено, что у 22 человек (55%) показатели IL2 превышали референтные значения. IL18 был повышен у 11 обследованных (27,5%). Значение IF у 37 человек (92,5%) превышало норму. 13 обследованных лиц (32,5%) имели повышенное значение FNO.

При рассмотрении величин цитокинов с преимущественной противовоспалительной активностью выявлено, что значения IL4 были выше референтных значений у 12 человек (30,00%), IL6 – у 11 обследованных (27,5%). IL10 превышал допустимое значение только у 1 человека (2,5%). У 15 человек (37,5%) IgE превышал норму.

При исследовании сывороток крови лиц, инфицированных H. pylori, на наличие различных подклассов IgG выявлено, что значения IgG1 ниже референтных значений обнаружены у 11 человек (27,5%), IgG2 были повышены у 2 человек (5%), IgG3 был выше нормального уровня у 6 обследованных (15%). Значения IgG4 соответствовали референтным значениям у всех обследованных. Рассматривая значения цитокинов в комплексе установлено, что 29 обследованных (72,5%) имели цитокиновый ответ, протекающий преимущественно по Тh1-типу, 8 (20%) обследованных имели цитокиновый ответ смешанного типа (Тh1-Тh2), у 3 (7,5%) обследованных  цитокиновый ответ протекал по Тh2-типу.

При сравнительном изучении особенностей цитокинового звена иммунитета у лиц с патологией желудка и лиц, без клинических проявлений заболеваний, ассоциированных с H. pylori установлено, что тип Тh1 иммунного ответа встречается чаще в первой группе, чем во второй (80% и 70%, соответственно). Смешанный тип иммунного ответа встречается одинаково часто в рассматриваемых группах (20% при патологии желудка и 20% у субъективно здоровых лиц). Тh2 типа иммунного ответа у лиц с патологией желудка не найдено. Таким образом, у лиц, инфицированных H. pylori, цитокиновый иммунный ответ развивается преимущественно по Тh1-типу.

Выводы

  1. На территории Санкт-Петербурга в 2007-2011 годах преобладали штаммы H. pylori, имеющие ген токсигенности cagA (81,63±5,6% выделенных штаммов). При генотипировании штаммов по vacA установлено, что чаще встречался генотип vacA s1m1.
  2. Установлено, что резистентность штаммов H. рylori в Санкт-Петербурге к метронидазолу составила 80,00%, к кларитромицину – 36,67%, к амоксициллину – 6,67%. Выявлено, что среди штаммов H. pylori, резистентных к кларитромицину, наиболее распространенной была мутация A2143G, которая встречалась в 75% случаев. Также определены мутации Т2182С, С2195Т, С2288Т. Выявлена новая комбинация мутаций С2195Т, С2288Т.
  3. По данным сероэпидемиологического маркирования выявлено достоверное возрастание доли CagA-позитивных штаммов среди детского и взрослого населения Санкт-Петербурга в период с 2007 по 2011 годы.
  4. Доля CagA-позитивных штаммов у лиц с гастродуоденальной патологией в Санкт-Петербурге максимальна при раке желудка (90,77±3,6%), тогда как при язвенной болезни и гастритах она равна 64,7±11,6% и 72,2±6,1%, соответственно. У пациентов, имеющих патологию желудка и двенадцатиперстной кишки, уровень серопозитивности к H. pylori достоверно выше, чем у лиц без клинических проявлений данной инфекции (83,95±2,9% против 62,5±1,6%) (p<0,05).
  5. При изучении превалентности инфекции, обусловленной H. pylori, у детей от 0 до 17 лет впервые выявлена новая закономерность – высокая частота серопозитивности к данной инфекции в целом и CagA-позитивных ее вариантов в определенных возрастных группах: в 4-5 лет, 7-8 лет, 14-15 лет.
  6. Установлено, что 72,5% обследованных лиц, серопозитивных к H. pylori, имели  цитокиновый профиль иммунного ответа, который может свидетельствовать о преобладании Тh1-типа иммунного ответа при данной инфекции на территории Санкт-Петербурга.

Практические рекомендации

Для улучшения специфической лабораторной диагностики инфекции, обусловленной H. pylori, рекомендуется использовать при первичной диагностике серологический метод исследования – определение антител IgG к H. pylori и его токсину CagA H. pylori.

При плановой фиброгастроскопии, проводимой пациентам, имеющим гастродуоденальную патологию, желательно брать биоптаты слизистой оболочки желудка для дальнейшего их исследования с помощью бактериологического метода и методов, основанных на ПЦР - технологиях, с определением cagA H. pylori. Наличие cagA-позитивных штаммов H. pylori определяет важность проведения эрадикации и последующего динамического наблюдения  за инфицированными лицами.

Учитывая широкую циркуляцию в Санкт-Петербурге штаммов H. pylori резистентных к кларитромицину и метронидазолу, рекомендуется осуществлять мониторинг антибиотикорезистентности данного микроба.

Изучение молекулярной структуры гена 23 S рРНК выявило, что обычно используемые методы ПЦР с последующим рестрикционным анализом могут определять не все кларитромицин-резистентные штаммы. Это нужно учитывать при использовании молекулярно-генетических методов диагностики для изучения антибиотикорезистентности штаммов H. рylori.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

  1. Жебрун, А.Б. Сравнительный анализ инфицированности Helicobacter pylori населения различных возрастных групп Северо-Западного региона и Якутии / А.Б. Жебрун, А.В. Сварваль, Р.С. Ферман // Вестник Российской Военно-медицинской академии. – СПб., 2008. - №2 (22). – С. 653-654.
  2. Жебрун, А.Б. Исследование антибиотикорезистентности штаммов Helicobacter pylori, циркулирующих в Санкт-Петербурге в современный период / А.Б. Жебрун, А.В. Сварваль, Р.С. Ферман // Х Международный Конгресс по антибиотикомикробной терапии, МАКМАХ. – Москва, 2008.
  3. Жебрун, А.Б. Изучение влияния препарата «Биоэффектив А» на бактерии рода Helicobacter (вид Helicobacter pylori) в модельной системе in vitro / А.Б. Жебрун, В.С. Султанов, А.В. Сварваль, Р.С. Ферман, В.И. Рощин, Т.В. Никитина // Четвертая Международная Конференция «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями». – СПб., 2008. - С.119-120.
  4. Сварваль, А.В. Инфицированность Helicobacter pylori населения Северо-Западного Региона Федерального Округа / А.В. Сварваль, Р.С. Ферман, А.Б. Жебрун // Четвертая Международная Конференция «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями». – СПб., 2008. - С.136.
  5. Тарасова, Е.А. Анализ клинических штаммов H. pylori, изолированных в Санкт-Петербурге, на предмет устойчивости к кларитромицину / Е.А. Тарасова, М.А. Суворова, А.В. Сварваль, Р.С. Ферман, А.Б. Жебрун, А.Н. Суворов // Четырнадцатая Российская гастроэнтерологическая неделя. Материалы конференции. – СПб., 2008. - С. 38.
  6. Tarasova, E.A. Molecular genetic analysis of 23S RNA mutations associated with clarythromycin resistance in Helicobacter pylori strains isolated in St. Petersburg, Russia. / E.A. Tarasova, M.A. Suvorova, A.V. Svarval, R.S. Ferman, A.B. Zhebrun, A. N. Suvorov // Аbstract 19th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. – Helsinki, 2009. – P. 830.        
  7. Ferman, R. The prevalence of diseases associated with Helicobacter pylori in St. Petersburg, Russia at present. / R. Ferman, A. Zhebrun, O. Balabash, A. Svarval // Abstract 19th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. – Helsinki, 2009. – P.1254.
  8. Svarval, A. The prevalence of H. pylori infection in St. Petersburg at present. / А. Svarval, R. Ferman, A. Zhebrun, O. Balabash // Аbstract IEA-EEF European Congress of Epidemiology. European Jornal of Epidemiology. – Warsaw, 2009. – v. 24. - Р. 76-77.
  9. Svarval, A. Genotypic analysis of Helicobacter pylori strains circulating in St.Petersburg, Russia at present / A. Svarval, A. Zhebrun, Y.Alypkina, R.Ferman // Clinical Microbiology and Infection. / 20th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. – Vienna, 2010. – V. 16. – S. N2. – P. S509.
  10. Сварваль, А.В. Изучение инфицированности Helicobacter pylori больных с различными злокачественными новообразованиями желудочно-кишечного тракта / А.В. Сварваль, О.А. Балабаш, Р.С. Ферман, А.Б. Жебрун // Материалы международной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями». – С.Петербург, 2010. – С.107.
  11. Сварваль, А.В. Изучение штаммов Helicobacter pylori с помощью культурального метода и метода ПЦР в формате реального времени / А.В. Сварваль, Р.С. Ферман, Ю.С. Аляпкина, Е.О. Познякова, А.Б. Жебрун // Материалы международной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями». – С.Петербург, 2010. – С. 107-108.
  12. Жебрун, А.Б. Изучение резистентности к кларитромицину штаммов H. pylori, выделенных от больных с хронической патологией желудочно-кишечного тракта / А.Б. Жебрун, А.В. Сварваль, Р.С. Ферман, М.А. Суворова // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. – Москва, 2010. – Т. 12. - №2. – прил. 1. -  С. 28.
  13. Жебрун, А.Б. Особенности цитокинового звена иммунитета при инфекции H. pylori / А.Б. Жебрун, А.В. Сварваль, Р.С. Ферман // Материалы 2 Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням. – Москва, 2010. – Т. 8. - №1. -  С.110.
  14. Сварваль, А.В. Определение Helicobacter pylori в биоптатах слизистой оболочки желудка с помощью культурального метода и метода ПЦР в формате реального времени / А.В. Сварваль, Р.С. Ферман, Ю.С. Аляпкина, Е.О. Познякова, А.Б. Жебрун // Материалы VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010». – Москва, 2010. – Т. 2. – С. 386-387.
  15. Сварваль А.В. Распространенность инфекции Helicobacter pylori среди населения Северо-Западного Федерального Округа Российской Федерации / А.В. Сварваль, Р.С. Ферман, А.Б. Жебрун // Журн. микробиол. 2011. - №4. С. 84-88.
  16. Сварваль А.В. Анализ превалентности инфекции Helicobacter pylori среди детей в современный период / А.В. Сварваль, Р.С. Ферман, А.Б. Жебрун // Журн. микробиол. 2012. - №1. С. 83-88.
  17. Сварваль А.В. Изучение динамики превалентности инфекции, обусловленной H. pylori, среди различных возрастных групп населения Санкт-Петербурга в 2007-2011 годах / А.В. Сварваль, Р.С. Ферман, А.Б. Жебрун // Инфекция и иммунитет. Направлена в печать.
  18. Жебрун А.Б. Характер популяции Helicobacter pylori у больных с заболеваниями желудочно-кишечного тракта / Жебрун А.Б., Сварваль А.В., Балабаш О.А., Ферман Р.С. // Журн. микробиол. Направлена в печать.

Список сокращений, использованных в автореферате.

cagA - ген, кодирующий один из основных факторов патогенности H. pylori – цитотоксин-ассоциированный белок

IgG – иммуноглобулин класса G сыворотки крови

IgG CagA - иммуноглобулин класса G к цитотоксин-ассоциированному белоку

IgE - иммуноглобулин класса Е

IL2, IL4, IL6, IL10, IL18 – интерлейкины 2, 4, 6, 10, 18

S1/m1, s1/m2 – регионы гена вакуолизирующего цитотоксина H. pylori

TNF- – фактор некроза опухолей альфа

INF – интерферон гамма

vacA – ген, кодирующий один из факторов патогенности - вакуолизирующий цитотоксин H. pylori

ИФА – иммуноферментный анализ

ПЦР – полимеразная цепная реакция

ПЦР-РВ – полимеразная цепная реакция в формате реального времени

СЗФО – Северо-Западный Федеральный Округ

Тh1, Тh2 –  типы иммунного ответа






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.