WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

На правах рукописи

АГУМАВА АСЛАН АНЗОРОВИЧ

Характеристика цитомегаловируса представителей отряда приматов.

03.02.02. - Вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении научно-исследовательском институте медицинской приматологии РАМН.

Научный консультант:

Профессор, академик РАМН Лапин Борис Аркадьевич

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук Еропкин Михаил Юрьевич Доктор медицинских наук Лаврентьева Ирина Николаевна

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова» РАМН

Защита состоится « 29» мая 2012 г. в 10.00 часов на заседании диссертационного совета при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт гриппа» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 197376 Санкт-Петербург, ул. профессора Попова 15/17.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБГУ НИИ ГРИППА Минздравсоцразвития РФ.

Автореферат разослан « ____» ______________2012 года

Ученый секретарь диссертационного совета Д 001.043.01:

кандидат медицинских наук Суховецкая Вера Федотовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В связи с широким распространением цитомегаловирусной инфекции (ЦМВИ) и связанной с ней патологией в акушерстве, неонатологии, педиатрии, клинической вирусологии, трансфузиологии и трансплантологии, проблема ЦМВИ приобретает большое значение в медицине.

Список заболеваний, связанных с цитомегаловирусом (ЦМВ) постоянно расширяется и включает в себя, в числе прочих, иммунодефицитные и онкологические заболевания.

ЦМВ таксономически относится к семейству Herpesviridae подсемейству Betaherpesvirinae роду Cytomegalovirus и широко распространен в человеческой популяции, передаваясь через кровь, слюну, мочу, фекалии, семенную жидкость, секрет шейки матки и через молоко кормящих женщин.

Инфицирование ЦМВ в большинстве случаев (80%) протекает бессимптомно. Особенностью ЦМВИ является длительный период инкубации и широкий клеточный тропизм. Активная продуктивная форма ЦМВИ в лимфоцитах, фибробластах, клетках тканей слюнной железы вызывает деструкцию клеток, морфологически определяемую как цитомегалия. Деструкция иммунокомпетентных клеток (ИКК), вызванная ЦМВ, может привести к вторичному иммунодефициту по Тклеточному типу. Снижение уровня интерферона, наблюдаемое при ЦМВИ, ведет к повышению восприимчивости организма к вирусным, бактериальным и грибковым инфекциям. В отличие от острой инфекции, латентная форма обычно не проявляется четкими клиническими симптомами и лишь иногда вызывает легкие гриппоподобные заболевания.

Инфицирование беременных женщин ЦМВ может привести к тяжелым уродствам плода и мертворождению (1%). Врожденная ЦМВИ в большинстве случаев проявляется острой формой с поражением печени, головного мозга, костного мозга, развитием геморрагического синдрома, анемии, эритробластоза. При внутриутробном заражении ЦМВ генерализованная ЦМВИ может привести к развитию у ребёнка микроцефалии, двигательных расстройств, замедлению умственного развития и может заканчивается гибелью.

У взрослых людей ЦМВ может активироваться при иммуносупрессии, в том числе и у ВИЧ инфицированных пациентов (90%), вызывая у них генерализованную ЦМВИ. В последнее время было показано, что ЦМВ является причиной развития сиалоаденита (40%), мононуклеоза (20%) и, в единичных случаях, шока, вызванного деструкцией надпочечников. Предполагается, что ЦМВ принимает участие в индукции некоторых онкологических заболеваний - в частности рака толстой и прямой кишки, а также аденокарциномы простаты.

Таким образом, молекулярно- биологические особенности вируса, его способность трансформировать клетки человека, тератогенность, способность к реактивации при иммуносупрессии и иммунодефицитных состояниях с последующим развитием генерализованной ЦМВИ, позволяют отнести ЦМВИ, в определенных условиях, к опасной для здоровья человека и ставят изучение ЦМВ, в разряд актуальных задач современной медицины и здравоохранения.

Изучение ЦМВИ обезьян, разновидности патологии вызываемой этим вирусом, его эпидемиология, филогенез ЦМВ позволяют предложить эту инфекцию обезьян как адекватную модель аналогичной патологии человека и в дальнейшем подойти к решению вопросов профилактики и, возможно, специфического лечения.

Целью настоящей работы являлось: мониторинг ЦМВИ обезьян и сотрудников НИИ Медицинской Приматологии; проведение сравнительного филогенетического анализа ЦМВ в отряде приматов; определение возможности межвидовой трансмиссии вируса.

Задачи исследования.

1. На основе выбранных консервативных участков нуклеотидных последовательностей подсемейства Betaherpesvirinae, разработать универсальную ПЦР тест-систему для качественного обнаружения ЦМВ приматов - обезьян разных видов и человека.

2. Провести ИФА и ПЦР для обнаружения антител и самого вируса в сыворотках крови и других биологических материалах (соскобы из глотки, ткани слюнных желез, урогенитальные соскобы и т.д.) собранных у обезьян разных видов и сотрудников ФГБУ НИИ МП РАМН для сравнительного определения распространения ЦМВ.

3. Провести амплификацию и секвенирование участков ДНК ЦМВ, выделенных от людей и разных видов обезьян, с целью проведения филогенетического анализа ЦМВ в отряде приматов.

4. Определить влияет ли наличие у обезьян других инфекций (на примере урогенитальных заболеваний) на частоту вирусоносительства ЦМВ.

5. Проверить возможность межвидовой передачи ЦМВ.

Научная новизна.

1. Впервые разработана универсальная тест система для качественного определения подсемейства Betaherpesvirinae у приматов, включая человека.

2. Впервые проведена ПЦР детекция ЦМВ в разных биологических материалах у обезьян разных видов в сравнительном аспекте.

3. Впервые проведено секвенирование фрагментов последовательности гена UL56 ЦМВ у Macaca fascicularis, Papio hamadryas, Papio anubis, Macaca nemestrina.

4. Впервые проведен филогенетический анализ гена UL56 ЦМВ приматов.

5. Впервые определена взаимосвязь ЦМВ с урогенитальными инфекциями.

6. Подтверждена циркуляция штамма вируса цитомегалии зелёных мартышек (ВЦМЗ) в популяции людей и макаков резусов.

Теоретическая значимость работы Филогенетический анализ ЦМВ в отряде приматов имеет большое теоретическое значение в понимании принципов эволюционной дивергенции генов цитомегаловирусов разных видов приматов.

Показанная, в ходе диссертационной работы, циркуляция штамма ВЦЗМ в популяции людей и макак резус позволяет сделать теоретически значимый вывод в возможной межвидовой передачей ЦМВ.

Практическая значимость работы Разработанная универсальная тест система для качественного определения подсемейства Betaherpesvirinae приматов может быть использована для диагностики ЦМВ людей и обезьян разных видов.

Примененный в работе подход разработки диагностической системы может быть использован для создания родоспецифических ПЦР тест- систем для других вирусных агентов.

Проведённый скрининг ЦМВИ у обезьян разных видов Адлерского питомника методом ПЦР позволил установить степень распространенности вируса у разных видов приматов. Филогенетический анализ ЦМВ с использованием данных секвенирования фрагментов консервативных участков pol и UL56 генов ЦМВ, позволил определить степень родства между цитомегаловирусами разных видов приматов.

Полученные результаты могут быть использованы при постановке модельных экспериментов, связанных с изучением ЦМВ.

Положения, выносимые на защиту.

1. Разработанная ПЦР тест-система является универсальной для определения ЦМВ у разных видов приматов включая человека.

2. Частота обнаружения ЦМВ методом ПЦР зависит от вида исследуемого биологического материала (кровь, соскобы из глотки, ткани слюнных желёз и т.д.) 3. Филогенез участка гена UL56 ЦМВ приматов даёт полную информацию о степени родства вирусов разных видов обезьян.

4. При наличии урогенитальных инфекций у обезьян, частота вирусоносительства ЦМВ возрастает.

6. Штамм ВЦЗМ обнаруживается у людей и макаков резусов.

Внедрение результатов работы Результаты исследования диссертационной работы внедрены в практику лаборатории молекулярной биологии ФГБУ НИИ МП РАМН. Разработанная тест-система для ПЦР детекции betaherpesvirinae приматов используется для мониторинга ЦМВИ обезьян адлерского питомника.

Апробация работы.

Апробация диссертационной работы проведена на заседании учёного совета ФБГУ НИИ Медицинской Приматологии РАМН 2 декабря 2011 г.

Результаты исследования доложены на всероссийской научной конференции «Перспективные направления использования лабораторных приматов в медико-биологических исследованиях» (Сочи-Адлер, 8-10 августа 2006г.) Личный вклад автора Автор участвовал в наборе биологического материала у людей и обезьян разных видов Адлерского Питомника. Автором разработаны праймеры к консервативному участку Betaherpesvirinae, а так же проведён филогенетический анализ сиквенсов полученных в ПЦР с помощью молекулярно-билогических компьютерных программ. Вклад автора в разработку ПЦР тест-системы для качественного определения подсемейства Betaherpesvirinae приматов является определяющим. Автором проанализированы результаты исследований и проведена статистическая обработка полученных данных.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано работ, в том числе 4 статьи в журналах, включённых в перечень ВАК Минобрнауки РФ.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 104 листах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 18 таблицами и 24 рисунками. Библиографический указатель включает 161 источник.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Исследование проводили на базе Адлерского питомника обезьян Федерального Государственного Бюджетного Института Медицинской Приматологии РАМН. Материалом для исследования служили 377 образцов взятых от обезьян разных видов (176 образцов крови, 68 соскобов из слизистой глотки, 46 соскобов из уретры, 86 образцов тканей слюнных желёз) и 190 образцов полученных от людей (137 образцов крови клинически здоровых людей, 53 образца тканей головного мозга людей). Кровь, соскобы из глотки и ткани слюнных желёз были взяты от разных животных (таблица 1).

Обезьяны, у которых был взят биологический материал, были разного пола, разного возраста (от новорожденных до 25 лет) и содержались в клетках и вольерах.

Люди, у которых была взята кровь являлись сотрудниками ФБГУ НИИ МП РАМН, были клинически здоровы, разного пола в возрасте от 21 до 86 лет.

Образцы тканей головного мозга были получены в НИИ нейрохирургии РАМН при операциях, у людей разного пола и возраста.

Таблица 1.

Материалы исследования Соскобы Ткани Соскобы Характер Кров Ткани итоиз глот- слюнных из уретматериала ь мозга го ки желёз ры Макака резус 50 20 25 46 - 1 (Macaca mulatta) Макака яванская (Macaca 38 12 15 - - fascicularis) Павиан гамадрил 30 13 20 - - (Papio hamadryas) Павиан анубис 20 6 8 - - (Papio Anubis) Зелёная мартышка (Cercopitecus 30 14 14 - - aehtiops) Макака лапундер 8 4 4 - - (Macaca nemestrina) люди 137 - - - 53 1Итого 313 69 86 46 53 5Молекулярно-биологические компьютерные программы Сравнительный анализ и выравнивание нуклеотидных последовательностей были проведены с помощью пакета программ: BioEdit Sequense Alignment Editor (version 7.0.5.2 Copyright ©1997-2005), GeneStudio (TM) Professional Edition (version 1.03.72 1999-20GeneStudio Inc) с использованием алгоритма ClustalW multiply alignment. Филогенетический анализ секвенированных ампликонов выделенных после положительных результатов ПЦР на ЦМВ в материалах от людей и обезьян разных видов проводили с помощью алгоритмов:

DNAdist Neighbor phylogenic tree; DNAmlk DNA maximum likelihood program with molecular clock; FastDNAml DNA maximum likelihood;

NEIGHBOR - Neighbor joining and UPGMA methods; Protdist – Neighbor phylogenic tree.

Подбор праймеров к участкам гена ЦМВ проводился с помощью программы Primer Premier (Premier Biosoft International version 5.00) и программы Primer Premier 3 (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primerblast).

Проверка праймеров на специфичность к определённым участкам вирусной ДНК, а так же проверка секвенированных ампликонов на таксономическую принадлежность проводили с помощью BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) с использованием алгоритмов: blastn, megablast, discontiguous megablast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

Иммуноферментный анализ В качестве материала для исследования при проведении ИФА использовали сыворотку крови, полученную из цельной крови людей и обезьян разных видов. Для постановки ИФА использовали коммерческую тест систему для определения IgG человека к ЦМВ, фирмы «Вектор Бест» (Новосибирск, Россия).

Результаты ИФА регистрировали с помощью спектрофотометра, измеряя оптическую плотность (ОП) на длине волны 450 нм. Результаты анализа считали положительными, если значение ОП в соответствующей лунке было равно или превышало критическое значение (ОПКрит), которое вычисляли по формуле: ОП Крит = ОП ср К- + 0,Экстракция ДНК Экстракцию ДНК из материалов проводили двумя методами:

1. модифицированным гуанидинтиоционатным методом (GuSCN) - при экстракции ДНК из цельной крови, лимфоцитов, соскобов из глотки и урогенитальных соскобов; 2. Протеиназным методом (с использованием фермента протеиназы – К) при экстракции ДНК из тканей слюнных желёз и тканей мозга.

При гуанидинтиоционатном методе материал (100 мкл крови, соскобы из глотки, урогенитальные соскобы) переносили в пробирку, содержащую 300 мкл 5М GuSCN, 1% тритон X-100(v/v), 20 мМ ЭДТА, 50 мМ трис-HCl (pH 6.4), 10 мкл SiO2. Пробирки инкубировали 30 мин в шейкере, центрифугировали и отмывали осадок однократно 500 мкл промывочного раствора, содержащего 5М GuSCN, 50мМ Tрис-HCl (pH 6.4) и двукратно 500 мкл промывочного раствора, содержащего 10 мМ Трис-HCl (pH 7.3), 50 мМ NaCl, 50% этилового спирта. Полученный осадок сорбента с ДНК подсушивали 5 мин. при 650С в твердотельном термостате. ДНК элюировали в 50мкл 0.1 М Трис-ЭДТА (TE) буфера (pH8.3) При протеиназном методе материал (100 – 200 мг образцов тканей слюнных желёз или тканей мозга) переносили в пробирку с мл раствора, содержащего 2.5 мМ MgCl2, 20 мкг протеиназы-К (еа/мг), инкубировали 24 часа при 540С до полного растворения ткани, инактивировали протеиназу нагреванием до 950С 5 мин, центрифугировали 3 мин при 13000 об/мин, надосадочную жидкость переносили в отдельные пробирки с 300 мкл 5М GuSCN, 1% тритон X-100(v/v), мМ ЭДТА, 50 мМ трис-HCl (pH 6.4), 20 мкл SiO2. Пробирки инкубировали 30 мин в шейкере, центрифугировали и отмывали осадок однократно 500 мкл промывочного раствора, содержащего 5М GuSCN, 50мМ Tрис-HCl (pH 6.4) и двукратно 500 мкл промывочного раствора, содержащего 10 мМ Трис-HCl (pH 7.3), 50 мМ NaCl, 50% этилового спирта. Полученный осадок сорбента с ДНК подсушивали 5 мин. при 650С в твердотельном термостате. ДНК элюировали в 200 мкл 0.1 М Трис-ЭДТА (TE) буфера (pH 8.3). Для ПЦР амплификации использовали 5 мкл элюата, остаток хранили при -200С.

ПЦР Амплификацию проводили несколькими модифицированными методами:

1. в 25 мкл раствора, содержащего 50 мМ KCI; 10 мМ Tрис-HCI (pH 8,4); 3.0 мМ MgCl2; 0,01% желатина; 100 нг каждого праймера; 0,2 мМ каждого дНТФ и 2,5 единицы Taq ДНК полимеразы.

2. в 45 мкл ПЦР смеси следующего состава: 67мM Трис-HCl (pH 8.3); мM (NH4)2SO4; 2,5 мM MgCl2; 0,1% Твин 20; 0,12 мг/мл БСА; 8% глицерина 0,2 мM каждого дНТФ; 0,25 мM каждого праймера; 2,5 единицы Taq ДНК полимеразы.

ПЦР проводили с использованием техники "горячего старта", в качестве разделителя использовали легкоплавкий парафин.

Синтез праймеров был произведен в фирме ЗАО «Синтол» (г. Москва).

В качестве положительного контроля использовали ДНК, выделенную из культуральной среды клеток фибробласта человека, заражённых лабораторным штаммом AD169 ЦМВ человека. Отрицательным контролем служила дистиллированная, деионизированная вода.

Амплификация проводилась в амплификаторе модели Терцик (ДНК Технология, г. Москва).

Продукты амплификации визуализировали с помощью трансиллюминатора, при длине волны УФ 330 нм.

Секвенирование амплифицированных в ПЦР фрагментов ДНК Секвенирование нуклеотидных последовательностей проводили в ЗАО «Постгеномные и нанотехнологические инновации» и «Синтол» г.

Москва. Нуклеотидную последовательность продуктов ПЦР определяли методом циклического секвенирования с использованием набора ABI PRISM. Секвенирование проводили дважды с использованием прямого и обратного праймеров.

Статобработка данных и корреляционный анализ Для оценки корреляции ЦМВ с урогенитальными инфекциями использовали непараметрические методы исследования: определяли коэффициент ассоциации Кас Девида Юла и коэффициент контингенции Ккон Карла Пирсона. Коэффициент ассоциации рассчитывали по формуле:

Коэффициент контингенции рассчитывали по формуле:

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1.Поиск консервативных участков в полногеномных сиквенсах Betaherpesvirinae и разработка универсальных праймеров к фрагменту гена UL56 (DNA binding gen) ЦМВ.

На первом этапе исследований, используя базу данных GenBank, был проведён поиск известных полногеномных нуклеотидных последовательностей ЦМВ человека и обезьян разных видов. Для анализа были выбраны последовательности, указанные в табл.2, в частности 5 полногеномных сиквенсов ЦМВ человека, один полногеномный сиквенс ЦМВ макаки резус и один полногеномный сиквенс ЦМВ шимпанзе.

Таблица 2.

Последовательности ДНК ЦМВ, использованные для поиска консервативных участков генов.

№ доступа в Номенклатурное название Название штамма вируса GeneBank вируса Pongine herpesvirus 4 (PoHVAF480884 Chimpanzee cytomegalovirus 4) Macacine herpesvirus AY18619 Rhesus cytomegalovirus (RhCMV) Human Herpesvirus 5 PH-BAC isoAC146904 Human Herpesvirus 5 (HCMV) late Human Herpesvirus 5 Towne-BAC AC146851 Human Herpesvirus 5 (HCMV) isolate Human cytomegalovirus strain X17403 Human Herpesvirus 5 (HCMV) AD1Human Herpesvirus 5 Toledo-BAC AC146905 Human Herpesvirus 5 (HCMV) isolate FJ616285 Human Herpesvirus 5 strain Towne Human Herpesvirus 5 (HCMV) Мы исходили из предположения, что сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей позволит выявить консервативные фрагменты ДНК, специфичные для всего подсемейства Betaherpesvirinae.

Анализ проводили в два этапа. На первом этапе было проведено сравнение всех полногеномных последовательностей ЦМВ человека и получена консенсусная последовательность (HCMV consensus). На втором этапе проводилось сравнительное выравнивание HCMV consensus с полногеномными последовательностями ЦМВ шимпанзе (PoHV4) и макака резуса (RhCMV). Проценты гомологии вирусов представлены в табл. 3.

Таблица 3.

Гомология полногеномных сиквенсов ЦМВ разных видов приматов.

Гомология % Вирус HHV-5 PoHV-4 RhCMV HCMV consensus (HHV-5) - 60,2 45,Pongine herpesvirus 4 (PoHV-4) 60,2 - 45,Rhesus cytomegalovirus (RhCMV) 45,9 45,2 - Как следует из таблицы, процент гомологии между ЦМВ человека и ЦМВ обезьян достаточно низок, что указывает на довольно большое различие между цитомегаловирусами выделенными от разных видов приматов. Этот факт может объясняться, по всей видимости, ранней эволюционной дивергенцией ЦМВ в отряде приматов, что также указывает на видовую специфичность вируса.

Выравнивание полногеномных сиквенсов ЦМВ шимпанзе (AF480884) и макаки резуса (AY18619) с консенсусной последовательностью HCMV consensus позволило выбрать максимально гомологичные участки нуклеотидных последовательностей.

В результате поиска консервативных регионов с минимальной длинной 26 оснований по всей длине консенсусной последовательности было найдено 11 регионов с 100% гомологией. Особое внимание обратил на себя регион с локацией 91721 – 9194, который включал в себя 2 консервативных региона из вышеупомянутых 11-ти. Общая гомология данного участка составляла 90%, (рис.1).

Нуклеотидная последовательность этого региона кодирует один ген, в номенклатуре обозначенный как UL56. Этот ген экспрессирует белок, который играет ключевую роль в упаковке вирусной ДНК (DNA binding gen).

По результатам выравнивания полногеномных сиквенсов ЦМВ, видно, что фрагмент гена UL56 содержит самые длинные гомологичные участки и является наиболее консервативным среди остальных генов.

На основании полученных данных по сравнительному выравниванию полногеномных сиквенсов были подобраны праймеры к консервативному фрагменту гена UL56 DNA binding gen ЦМВ с помощью программы Primer Premier (version 5.00).

В результате поиска в последовательности гена UL56 указанным характеристикам соответствовало несколько олигонуклеотидных сиквенсов. Однако дальнейший анализ олигонуклеотидов на образование шпилек, димеров, кросс-димеров, а также ложный отжиг, выявил наиболее стабильную пару праймеров следующей последовательности - левый праймер: 5’-ctc cac gtc ctc ccc gta- 3’; правый праймер: 5’-agg cgc tga ggg ata caa c- 3’. Длина ампликона составляет 200 п.о. (рис.1). Проверка последовательности праймеров на их специфичность проводилась интерактивно с помощью BLAST и показала 100% гомологию только к гену UL56 цитомегаловирусов приматов.

Рис. 1. Участок выравнивания ЦМВ человека, макаки и шимпанзе включающий ген UL56 и подобранные праймеры к консенсусной последовательности фрагмента гена UL56.

Для проверки работоспособности праймеров были поставлены ПЦР реакции с ДНК, выделенной из культуральной среды клеток фибробластов человека, заражённых лабораторным штаммом AD169 ЦМВ человека. Отрицательным контролем служила дистиллированная вода.

Оптимизацию ПЦР проводили по следующим параметрам: температуру отжига меняли от 610С до 670С с шагом в 10С; концентрацию ионов магния - от 2,0 мМ до 3,5 мМ с шагом 0,5 мМ. Электрофореграммы продуктов ПЦР представлены на рис.2.

Рис. 2. Электрофореграмма продуктов ПЦР с использованием положительного контроля.

М – маркёр молекулярного веса (ДНК фага лямбда/HindIII); К- – отрицательный контроль; 1-28 положительный контроль; 1-4 температура отжига – 610С;

5-8 – 620С; 9-12 – 630С; ; 13-16 – 640С; ; 17-20 – 650С; 21-24 – 660С; 25-28 – 670С; 1,5,9,13,17,21,25 - концентрация ионов магния – 2,0 мМ;

2,6,10,14,18,22,26 – 2,5 мМ; 3,7,11,15,19,23,27 – 3,0 мМ; 4,8,12,16,20,24,28 – 3,мМ.

В процессе оптимизации ПЦР было показано, что система работает в широком температурном диапазоне и различных концентрациях ионов Mg2+.

Чтобы уменьшить возможность неспецифического связывания праймеров с ДНК-мишенью, были выбраны следующие условия проведения ПЦР: концентрация Mg2+ - 3,0 мM, температурный режим: 950С - 2 мин;

далее 5 циклов: 950С - 50 с, 640С - 50 с, 720С - 50с; далее 40 циклов: 950С - 40с, 620С – 35с, 720С – 35с; хранение 100С. Обязательным условием в ходе ПЦР было использование техники "горячего старта".

Для проверки возможности данной ПЦР тест-системы выявлять ЦМВ разных видов приматов, были протестированы 137 образцов ДНК, выделенных из крови людей и 331 образец ДНК, выделенных из крови, соскобов из зева и слюнных желёз обезьян следующих видов:

M. mulatta, M. fascicularis, P. hamadryas, P. anubis, C. aetiops, M.

nemestrina. Результаты амплификации отдельных образцов ДНК разных видов приматов, включая людей, представлены на рис. 3.

Рис. 3. Электрофореграммы рандомного скрининга на ЦМВ образцов ДНК, выделенных от разных видов приматов, включая людей.

М – маркёр молекулярного веса, ДНК фага лямбда/HindIII; К- – отрицательный контроль; К+ – положительный контроль; 1-3 – M. nemestrina; 4-8 – C.

aetiops; 9-13 – P. hamadryas; 14-17 – M. fascicularis; 18-22 – M. mulatta; 23-25 – P. anubis; 26-30 – люди.

Как видно на рис.3 положительные образцы на ЦМВ обнаруживаются у разных видов приматов: M. nemestrina (№2);

C. aetiops (№4,№5,№7,№8); P. hamadryas (№9, №10, №11, №12); M.

fascicularis (№14, №15, №17); M. mulatta (№19, №20, №22); P. anubis (№24, №25); люди (№28, №29, №30).

Для подтверждения положительных результатов ПЦР было проведено секвенирование полученных ампликонов. Анализ сиквенсов обнаружил 95% гомологию с фрагментом гена UL56 ЦМВ человека.

Таким образом, разработанная нами тест-система позволяет выявлять ЦМВ разных видов приматов и может быть рекомендована для дальнейшего использования.

2. Определение антител к ЦМВ в сыворотке людей и обезьян разных видов Для определения инфицирования людей и обезьян цитомегаловирусом был проведён иммуноферментный анализ, для определения IgG к ЦМВ.

При исследовании сывороток людей общий процент серопозитивных по ЦМВ составил 91% Проведенное исследование корреляции между возрастом и процентом сывороток, положительных на антитела к ЦМВ у людей, показало, что в разных возрастных категориях процент серопозитивных был различен (Рис. 4).

Рис. 4. Процент ЦМВ серопозитивных людей в разных возрастных группах.

Как видно из рис. 4, чем старше возрастная группа, тем выше процент ЦМВ серопозитивных людей, т.е. чем старше возраст, тем больше вероятность инфицирования данным вирусом.

Также было проведено ИФА тестирование на наличие антител к ЦМВ у обезьян разных видов (рис. 5). Как видно из диаграммы, % обнаружения IgG к ЦМВ у обезьян в 2-3 раза меньше таковых показателей у людей (25 до 37%).

137% 33% 30% 32% 25% 25% макаки макаки павианы павианы зелёные макаки резус яванские гамадрил анубис мартышки лапундер Рис. 5. Процент серопозитивных на ЦМВ обезьян, объединенных по видам.

3. Определение ЦМВ методом ПЦР в крови у людей.

Для оценки цитомегаловирусной виремии была поставлена ПЦР с использованием ДНК, выделенной из цельной крови 137 клинически здоровых людей, у которых ранее определялись IgG к ЦМВ. Амплификацию проводили методом однораундовой ПЦР с горячим стартом. Температурный режим амплификации: 950С - 2 мин; далее 5 циклов: 950С - 50 с, 640С - 50 с, 720С - 50с; далее 40 циклов: 950С - 40с, 620С – 35с, 720С – 35с; хранение 100С. В реакции использовали праймеры к фрагменту гена MIE (major immediate-early protein) ЦМВ человека: левый 5’-CCACAATTACTGAGGACAGAGG-3’ и правый 5’TATGATGACCATGTACGGGGGC-3’ длина ампликона - 376 п.о., и разработанные нами праймеры к фрагменту гена UL56 (DNA binding gen) ЦМВ: левый 5’-CTCCACGTCCTCCCCGTA-3’ и правый 5’AGGCGCTGAGGGAGTACAAC-3’ длина ампликона - 200 п.о.

Частота выявления методом ПЦР вируса в крови незначительна, несмотря на выявление антител к ЦМВ у 90% случаев. Это, по видимому, обусловлено низкой вирусной нагрузкой в крови (табл. 4).

Таблица 4.

Определение последовательностей ЦМВ методом ПЦР в крови у клинически здоровых людей Общее количество Положитель- Процент положительных обследованных людей ные на ЦМВ на ЦМВ 137 7 5% 4. Определение ЦМВ методом ПЦР в крови, соскобах из глотки и тканях слюнных желёз у обезьян разных видов.

В данном исследовании было проведено ПЦР-тестирование, направленное на качественную детекцию вируса в разных биологических материалах: в крови, соскобах из глотки и в тканях слюнных желёз. Для проведения ПЦР были использованы праймеры к общему консервативному участку гена UL56 цитомегаловирусов человека и обезьян по протоколам, описанным ранее. При ПЦР детекции ЦМВ в крови у обезьян была использована ДНК, выделенная из цельной крови.

В ходе ПЦР-тестирования образцов крови обезьян разных видов было обнаружено, что процент вирусемии, так же, как и у людей, был достаточно низок и составлял около 4%. (табл.5). При исследовании 8-ми образцов крови макаков лапундеров методом ПЦР выявить вирус не удалось.

Таблица 5.

Общие результаты ПЦР тестирования образцов крови обезьян разных видов на наличие ЦМВ Положительные на ЦМВ Общее количеВид ство обследованных Абсолют. Относит.

Макаки резус 50 2 4% Павианы гамадрилы 30 1 3% Макаки яванские 38 2 5% Зелёные мартышки 30 1 3% Павианы анубисы 20 1 5% Макаки лапундеры 8 - 0% Всего 176 7 4% При использовании в качестве биологического материала соскобов из глотки общий процент ЦМВ положительных составил 16%, что в 3 раза выше процентных показателей тестирования образцов крови (табл. 6). Это может объясняться тем, что содержание вируса в клетках эпителия глотки выше, чем в клетках крови.

Таблица 6.

Результаты ПЦР тестирования соскобы из глотки клинически здоровых обезьян разных видов на наличие ЦМВ Вид Общее коли- Положительные на ЦМВ чество обсле- дованных Абсолют. Относит.

Макаки резусы 20 3 15% Павианы гамадрилы 13 2 15,4% Макаки яванские 12 2 16,7% Зелёные мартышки 14 3 21,4% Павианы анубисы 6 1 16,6% Макаки лапундеры 3 - 0% ВСЕГО 68 11 16% Проводили детекцию ЦМВ в тканях слюнных желез обезьян разных видов взятых на аутопсиях (табл.7).

Высокий процент присутствия вируса наблюдался в тканях слюнных желез, инфицированность которых составляет 50 – 70%.

Данный факт объясняется тропностью ЦМВ к тканям слюнных желез и персистенцией вируса в клетках в латентной форме.

Таблица 7.

Результаты ПЦР - тестирования образцов слюнных желёз обезьян разных видов взятых на аутопсии Вид Общее коли- Положительные на ЦМВ чество обсле- дованных Абсолют. Относит.

Макаки резусы 25 16 64% Павианы гамадрилы 20 13 65% Макаки яванские 15 9 60% Зелёные мартышки 14 10 71% Павианы анубисы 8 4 50% Макаки лапундеры 4 2 50% ВСЕГО 86 54 63% 5. Взаимосвязь ЦМВ с урогентальными инфекциями.

Было проведено исследование взаимосвязи урогенитальных инфекций, в частности хламидиоза, микоплазмоза и уреаплазмоза с наличием ЦМВИ. Материалом для исследования служили соскобы из уретры 46 макаков резусов.

Для анализа корреляции ЦМВИ с урогенительными инфекциями были сформированы 2 группы: в группу №1 входили ЦМВ положительные, а в группу №2 - ЦМВ отрицательные (Рис. 6).

100% 80% 60% Хламидиоз 40% Микоплазмоз 50% Уреаплазмоз 20% 33% 33% 25% 20% 17,5% 0% ЦМВ ЦМВ положительные отрицательные Рис. 6. Инфицированность урогенитальными инфекциями ЦМВ положительных и ЦМВ отрицательных макаков резусов.

При наличии урогенитальных инфекций у обезьян, частота обнаружения ЦМВ была выше в 1,5-2 раза, чем у здоровых. Так же при наличии ЦМВ, частота выявления урогенитальных инфекций была выше.

Большая частота выявления ЦМВ при заболеваниях урогенитальными инфекциями обусловлена иммуносупрессией, вызванной этими инфекциями, что в свою очередь приводит к активации ЦМВ из латентной формы в активную.

Была проведена статистическая обработка полученных данных (табл. 8).

Таблица 8.

Непараметрическая статобработка данных с определением коэффициента ассоциации Девида Юла и коэффициента контингенции Пирсона.

а. Связь ЦМВ с Chlamydia tracomatis Наличие ЦМВ Положительные Отрицательные Итого на хламдиоз на хламидиоз ЦМВ положительные 2 4 ЦМВ отрицательные 8 32 Итого 10 36 N=Коэффициент ассоциации Кас = 0,33 Ккон = 0,б. Связь ЦМВ с Micoplasma genitalium Наличие ЦМВ Положительные Отрицательные Итого на микоплазмоз на микоплазмоз ЦМВ положительные 2 4 ЦМВ отрицательные 7 33 Итого 9 37 N=Коэффициент ассоциации Кас= 0,4 Ккон = 0,в. Связь ЦМВ с Ureaplasma urealiticum Наличие ЦМВ Положительные Отрицательные Итого на уреаплазмоз на уреаплазмоз ЦМВ положительные 3 3 ЦМВ отрицательные 9 31 Итого 12 34 N=Коэффициент ассоциации Кас= 0,55 Ккон = 0, Как видно из табл. 16. коэффициент ассоциации в пределах 0,< Кас < 0,55 и является для ассоциации ЦМВ с хламидиозом и микоплазмозом статистически слабой положительной связью (0,2 < Кас < 0,49), а для ассоциации ЦМВ с уреаплазмозом статистически средней положительной связью (0,5 < Кас < 0,69). Максимальный коэффициент контингенции (Ккон) наблюдается у связи уреаплазмоза с ЦМВ и составляет Ккон = 0,21. Однако для числа наблюдений N=46 критическое значение коэффициента контингенции Пирсона, при уровне значимости p<0,05 составляет Ккон критич = 0,29 и вследствие этого нельзя утверждать о статистической достоверности корреляции процента выявления ЦМВ с процентом выявления урогенитальных инфекций.

6. Филогенетический анализ секвенированных фрагментов генов UL56 и pol ЦМВ обезьян разных видов и человека.

Для определения филогенетического родства цитомегаловирусов выделенных от людей и обезьян разных видов, секвенированные фрагменты консервативного участка гена UL56 анализировали с использованием программы BioEdit Sequense Alignment Editor (рис. 7).

Сравнительное выравнивание позволило установить разную степень гомологии ЦМВ разных видов приматов Рис. 7. Сравнительное выравнивание сиквенсов фрагмента гена ULцитомегаловирусов человека и обезьян.

Гомология аминокислотного состава несколько выше нуклеотидного и составляла 90-100%. (рис. 8).

У сиквенсов фрагмента гена UL56 ЦМВ Macaca mulatta и ЦМВ Macaca fascicularis аминокислотный состав абсолютно идентичен, так же как у ЦМВ Papio hamadryas и Papio Anubis.

Рис. 8. Аминокислотные последовательности просеквенированных фрагментов гена UL56 цитомегаловирусов человека и обезьян.

На основании данных сравнительного выравнивания сиквенсов было построено филогенетическое древо по алгоритму DNAdist Neighbor phylogenic tree (рис.9).

Филогенетический анализ позволил выделить несколько групп кластеров по степени родства. Так в общие кластеры входят: Macaca mulatta и Macaca fascicularis (кластер 3), Papio hamadryas и Papio anubis (кластер 6). ЦМВ макака лапундера (macaca nemestrina) по данным филогенетического анализа находиться между кластерами 3 и 6, т.е.

между ЦМВ павиана и ЦМВ макака (резуса и яванского). Более того филогенез гена UL56 выявил более высокую степень гомологии ЦМВ человека с ЦМВ зелёной мартышки, чем с ЦМВ других видов обезьян.

Рис. 9. Филогенетическое древо нуклеотидных последовательностей фрагмента гена UL56 ЦМВ приматов и человека.

Таким образом, проведенный нами сравнительный молекулярногенетический анализ последовательностей ЦМВ приматов показал, что участок гена UL56, является наиболее перспективным для проведения филогенетического анализа.

Для сравнения результатов, полученных при филогенетическом анализе гена UL56, был проведён аналогичный анализ pol гена, считающегося наиболее консервативным среди вирусов. Для анализа использовали уже имеющиеся данные по секвенированию в базе данных сиквенсов GeneBank (табл.9).

Таблица 9.

Сиквенсы из базы данных GenBank, содержащие pol ген ЦМВ Gene Bank № ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИРУС ВИД Human Human herpesvirus 5 Homo AY114174 herpesvirus pol-gene, partial cds. sapience 5 (HHV-5) Pongo pygmaeus CMV Pongo pygmaeus Pongo AY12931 pol-gene, partial cds CMV 1 pygmaeus Rhesus CMV glycoprotein B Cercopithecine Macaca AF0331gene, and pol-gene. herpesvirus 8 mulatta Macaca fascicularis CMV 1 pol- Macaca fascicularis Macaca AY7281gene, partial cds. CMV 1 fascicularis Mandrillus CMV pol-gene, partial Mandrillus AF282941 Mandrillus CMV cds sphinx Baboon CMV strain OCOM4-37 Papio AF387664 Baboon CMV type B, pol-gene cynocephalus Vervet CMV CSG type B, pol- Cercopithecu AY049066 Vervet CMV CSG gene, partial cds. s pygerythrus Cercopithecine herpesvirus 5 pol- Cercopithecine Cercopithecu AY1177gene, partial cds herpesvirus 5 s aethiops Colobus guereza CMV 1 pol- Colobus guereza Colobus AY1293gene, partial cds CMV 1 guereza Colobus badius CMV 1 pol-gene, Colobus badius Colobus AY1294partial cds. CMV 1 badius Cercocebus agilis CMV 1 pol- Cercocebus agilis Cercocebus AY6087gene partial cds. CMV 1 agilis Cercopithecus cephus CMV 1 Cercopithecus Cercopithecu AY7281pol- gene, partial cds. cephus CMV 1 s cephus Анализ нуклеотидных последовательностей был проведён с помощью программы GeneStudio, используя алгоритм ClustalW version 1.4. При этом выявилась высокая степень гомологии по pol-гену среди цитомегаловирусов различных видов приматов, включая человека.

(Рис.10). Ещё большая степень гомологии была обнаружена на аминокислотном уровне. Было обнаружено, что фрагмент длиной 3-69 pb абсолютно идентичен по аминокислотному составу. Аминокислотные сиквенсы участка pol гена идентичны у ЦМВ Cercocebus agilis и Cercopithecus cephus, у ЦМВ Macaca mulatta и Macaca fascicularis, и так же ЦМВ Mandrillus sphinx и Papio cynocephalus. Это говорит о высокой консервативности pol гена ЦМВ (Рис. 11).

Рис. 10. Сравнение последовательностей консервативного участка гена ДНК-полимеразы цитомегаловирусов человека и обезьян.

Рис. 11. Сравнение первичной аминокислотной последовательности участка pol-гена.

Для определения филогенетического родства цитомегаловирусов, фрагменты участка pol гена анализировали с использованием программы Neighbor-Joining/UPGMA method (version 3.6a2.1) (рис.12).

Рис.12. Филогенетическое древо нуклеотидных последовательностей фрагмента pol- гена ЦМВ приматов и человека.

Филогенетический анализ позволил выделить несколько групп кластеров по степени родства. Так в общие кластеры входят: ЦМВ Macaca mulatta и ЦМВ Macaca fascicularis (кластер 1); ЦМВ человека и ЦМВ Pongo pygmaeus (кластер 2); ЦМВ Colobus guereza и ЦМВ Colobus badius (кластер 5); ЦМВ Cercopithecus pygerythrus и ЦМВ Cercopithecus aethiops (кластер 3); ЦМВ Mandrillus sphinx и ЦМВ Papio cynocephalus (кластер 4). Некоторые кластеры можно объединить в группы, так кластеры 4 и 9 входят в общую группу 10, которая вместе с кластером 3 образует группу 8 и т.д.

7. Возможность межвидовой передачи ЦМВ.

Для изучения межвидовой трансмиссии ЦМВ среди обезьян все образцы ДНК, экстрагированные из разных биологических материалов были проанализированы на присутствие ЦМВ методом ПЦР с универсальными праймерами (к участку гена UL56), затем с праймерами, специфичными для ЦМВ макака резуса, праймерами, специфичными для ЦМВ зелёной мартышки и праймерами специфичными для гена MIE ЦМВ человека (табл. 10).

Таблица 10.

Структура праймеров использованных для выявления ЦМВ человека, макаки резус и зелёной мартышки.

Длина Праймер Правый Левый ампликона К гену MIE ЦМВ CCACAATTACTG TATGATGACCATGTA 3человека AGGACAGAGG CGGGGGC К гену UL56 ЦМВ CTCCACGTCCTCCC AGGCGCTGAGG 2(универсальные) CGTA GAGTACAAC GCTCGATTCCACC TCAATGAACGGTC TG К ВЦЗМ 5GAACTC CATTG К гену MIE ЦМВ CCCTTCCTGACT TTGGGGAATCTCTGCA 4макаки резус ACTAATGTAC CAAG При тестировании ДНК выделенных от обезьян разных видов на наличие RhCMV, с праймерами к гену MIE ЦМВ макака резуса положительными оказались только образцы от макаков резусов.

В качестве положительного контроля была использована ДНК, экстрагированная из слюнной железы м.р. №35184, в ткани которой был ранее обнаружен и просеквенирован ЦМВ.

Однако, при тестировании этих же образцов с праймерами к ВЦЗМ, помимо образцов, выделенных от зелёной мартышки, положительным был образец, выделенный от макака резуса №11 (рис. 13).

Рис. 13. Электрофореграмма ПЦР тестирования образцов взятых от обезьян разных видов с праймерами к ЦМВ зелёной мартышки (ВЦЗМ).

Номера с 1по 3 - макаки яванские, с 4 по 11 - макаки резус, с 12 по 13 - павианы анубис, 14 - макак лапундер, с 15 по 18 - зелёные мартышки, с 19 по 24 - павианы гамадрил.№11, №16, №18 – положительные.

При ПЦР тестировании на ВЦЗМ в качестве положительного контроля использовали ДНК, экстрагированную из слюнных желёз зелёной мартышки № 36118 инфицированной ВЦЗМ Проведённое исследование показало, что у макака резус №было обнаружено 2 вируса (RhCMV и ВЦЗМ). Секвенирование подтвердило наличие ЦМВ зелёной мартышки у этой макаки резус. Таким образом, был зафиксирован случай циркуляции штамма ВЦЗМ у макака резуса.

Для проверки присутствия ВЦЗМ в популяции людей были исследованы 53 образца тканей головного мозга полученные из НИИ нейрохирургии РАМН. ПЦР проводили с использованием «универсальных» праймеров к общему консервативному фрагменту гена ULЦМВ, а также праймеров специфичных только к ЦМВ человека, праймеров специфичных только к ВЦЗМ и праймеров специфичных только к ЦМВ макаки резус.

При ПЦР тестировании ДНК, выделенной из образцов тканей мозга, на наличие последовательностей ЦМВ с использованием праймеров к гену MIE ЦМВ человека и «универсальных» праймеров к гену UL56 ЦМВ были получены одинаковые результаты: 16 образцов из 53 оказались положительными (рис. 14).

Рис. 14. Электрофореграмма ПЦР тестирования образцов тканей мозга людей на наличие ЦМВ человека (с праймерами к MIE гену HCMV.

ПЦР тестирование данных 16 образцов с праймерами, специфичными к ЦМВ макака резуса, дало отрицательные результаты. Исследование образцов на наличие ЦМВ зелёных мартышек выявило положительный образец (№45) (рис. 15).

Рис. 15. Электрофореграмма ПЦР тестирования 16 положительных на ЦМВ образцов тканей мозга людей на наличие ЦМВ зелёной мартышки. Примечание: №45 – положительный.

Для подтверждения результатов исследования ампликоны были просеквенированы. Анализ сиквенсов обнаружил 95% гомологию только с участком ЦМВ зелёной мартышки, тем самым, подтвердив результаты ПЦР анализа. Таким образом, был подтверждён случай циркуляции штамма ВЦЗМ у человека.

Тот факт, что у макаки резус и у человека был обнаружен штамм ВЦЗМ, говорит в пользу того, что ЦМВ способен преодолевать межвидовой барьер.

Пути проникновения ЦМВ зелёных мартышек в популяцию людей обсуждаются. Есть предположения, что могла произойти контаминация данным вирусом живыми аттенуированными вакцинами, созданными с использованием культуры клеток зелёных мартышек.

ВЫВОДЫ 1. Разработана ПЦР тест-система на основе праймеров к консервативному участку гена UL56 (DNA binding gene) которая выявляет ДНК ЦМВ всех видов приматов, включая человека.

2. При однорауновой ПЦР наибольшая частота выявления ЦМВ наблюдается в тканях слюнных желёз, несколько меньше – в соскобах из глотки и с наименьшей частотой в периферической крови.

3. У обезьян с урогенитальными инфекциями ЦМВ выявляется в среднем в 1,5- 2 раза чаще, чем у здоровых животных.

4. Филогенетический анализ гена UL56 ЦМВ обезьян и человека позволил выделить в один кластер ЦМВ макаков резусов и макаков яванских, а так же ЦМВ павианов анубисов и павинов гамадрилов. Анализ показал более высокую гомологию ЦМВ человека с ЦМВ зелёной мартышки, чем с ЦМВ других видов обезьян.

5. Подтверждена циркуляция штамма ВЦЗМ среди людей и макаков резусов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Агумава А.А. Филогенез цитомегаловируса в отряде приматов // Журнал "Наука Кубани" Всероссийская научная конференция «Перспективные направления использования приматов в медикобиологических исследованиях» 2006, стр.41- 45.

2. Агумава А. А., Чикобава М. Г., Лапин Б. А. Лабораторная диагностика цитомегаловируса у людей и обезьян Адлерского питомника // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2010, т.

149, №5, стр. 566-568.

3. Агумава А. А., Чикобава М. Г., Лапин Б. А. Разработка ПЦР тестсистемы для диагностики вирусов подсемейства Betaherpesvirinae приматов // Молекулярная генетика, вирусология, микробиология, 2010, №3, стр. 36-39.

4. Агумава А. А., Чикобава М. Г., Лапин Б. А. и др. Филогенетический анализ цитомегаловирусов выделенных от людей и разных видов приматов // Вопросы вирусологии, 2011 №2 стр. 28-32.

5. Чикобава М. Г., Джикидзе Э.К., Задорожный Д.В., Кебу Т.И., Аршба И.М., Калашникова В.А., Агумава А.А. Филогенетический анализ микоплазмы, выделенной от макаки яванской (m/ fascicularis) // Молекулярная генетика, вирусология, микробиология, 2008, №1, стр. 23-36.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ GuSCN – гуанидинтиоизоцианат IgG – иммуноглобулин класса G АТ – антитела БСА – бычий сывороточный альбумин ИФА – иммуноферментный анализ ОП – оптическая плотность ПЦР – полимеразно-цепная реакция ТМБ – тетраметилбензидин ЦМВ – цитомегаловирус ЦМВИ – цитомегаловирусная инфекция ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота ВЦЗМ – вирус цитомегалии зелёных мартышек




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.