WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

Денискова Татьяна Евгеньевна

Характеристика аллелофонда свиней различных пород с использованием ISSR-маркеров

03.02.07 – генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Дубровицы 2012

Работа выполнена в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики животных ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук.

Научный руководитель:  доктор биологических наук,

профессор, академик РАСХН

Зиновьева Наталия Анатольевна

Официальные оппоненты:  доктор биологических наук, профессор

Букаров Нурмагомед Гаджикулиевич,

ОАО «Московское» по племенной работе,

начальник лаборатории иммуногенетической экспертизы

доктор биологических наук, профессор

Калашникова Любовь Александровна,

ФГУ ВНИИплем, Лесные поляны,
заведующая лабораторией ДНК-технологий

Ведущая организация: ФГОУ ВПО Московская государственная
  академия ветеринарной медицины и
  биотехнологии имени К. И. Скрябина

Защита состоится «____» ____________ 2012 г. в  10-00 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 006.013.03 при Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук.

Адрес института: 142132, Московская область, Подольский район, п. Дубровицы, ГНУ ВИЖ, тел./факс (4967) 65-11-01. www.vij.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВИЖ.

Автореферат разослан «____»  _________ 2012 г.

Ученый секретарь Совета Д 006.013.03                                         И.В. Гусев

  1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Оценка значения породы с точки зрения ее консервации требует синтеза информации из целого ряда источников, в том числе из молекулярно-генетических исследований, дающих объективные критерии  изучения разнообразия в породе и между породами [Отчет FAO, 2007]. Использование молекулярных маркеров значительно расширяет возможности генетического анализа, позволяет установить межпородную и внутрипородную изменчивость отдельных участков генома и составить представление о генетической структуре пород [Калашникова Л.А., 2004; Букаров Н.Г., 2010].

Хорошо изученным и широко распространенным для характеристики генетического разнообразия видов сельскохозяйственных животных, в частности свиней, является метод микросателлитного анализа [Зиновьева Н.А. и др., 2009], однако  для объективной оценки состояния и динамики аллелофонда популяций животных необходимо расширение спектра высокополиморфных ДНК-маркеров. Одним из таких типов маркеров являются межмикросателлитные последовательности, ISSR [Сулимова Г. И., 2004]. В геномах животных количество микросателлитных повторов довольно велико, что делает метод удобным для генетического анализа [Zietkiewicz E. et al., 1994].

Традиционно для обнаружения ISSR-полиморфизма применяется электрофоретическое разделение амплифицированных фрагментов в  полиакриламидном геле с последующей визуализацией с помощью нитрата серебра или радиоизотопов. Информативность, чувствительность и производительность ISSR-анализа могут быть существенно увеличены посредством использования ДНК-анализаторов [Nagaraju J. et al., 2002; Archibald J.K., 2006].

Цель и задачи исследований. Целью диссертационной работы явилось исследование информативности системы анализа ISSR-маркеров для характеристики аллелофонда свиней различных пород.

Для достижения указанной цели сформулированы следующие задачи:

  1. Разработать систему анализа ДНК-маркеров доминантного типа – межмикросателлитных маркеров (ISSR), основанную на использовании флуоресцентно меченных праймеров и лазерной детекции полиморфных фрагментов.
  2. Выполнить сравнительный анализ информативности разработанной системы ISSR-маркеров и генетических маркеров на основе эритроцитарных антигенов групп крови.
  3. Провести сравнительное исследование системы ISSR-маркеров с другим типом доминантных ДНК-маркеров на основе полиморфизма длин амплифицированных фрагментов (AFLP).
  4. Дать сравнительную оценку информативности разработанной системы ISSR-маркеров и кодоминантных ДНК-маркеров – микросателлитов.
  5. Выполнить построение ISSR-профилей и дать характеристику аллелофонда свиней различных пород.

Научная новизна. Впервые смоделирована система мультиплексного генотипирования ISSR-маркеров свиней, основанная на использовании  флуоресцентно меченных праймеров и лазерной детекции продуктов амплификации. Выполнено сравнительное исследование информативности системы ISSR-маркеров с генетическими маркерами на основе эритроцитарных антигенов групп крови, с другим доминантным типом ДНК-маркеров, базирующимся на полиморфизме длин амплифицированных фрагментов (AFLP), и с кодоминантными ДНК-маркерами – микросателлитами. Выполнено построение ISSR-профилей свиней пород крупная белая, ландрас и дюрок различного происхождения.

Практическая значимость. Предложена высокопроизводительная система мультиплексного анализа свиней по ISSR-маркерам, пригодная для массового скрининга животных. Дана характеристика аллелофонда свиней трех основных пород, разводимых в России: крупная белая, ландрас и дюрок, - по ISSR-маркерам. Создана база данных ISSR-профилей свиней. Показана информативность ISSR-маркеров в характеристике аллелофонда свиней.

Основные положения, выносимые на защиту:

  • Система мультиплексного анализа ISSR-маркеров свиней, основанная на использовании флуоресцентно меченных праймеров и лазерной детекции продуктов амплификации.
  • Сравнительная оценка ISSR-маркеров с генетическими маркерами на основе эритроцитарных антигенов групп крови, AFLP-маркерами и микросателлитами.
  • ISSR-профили свиней пород крупная белая, ландрас и дюрок различного происхождения.
  • Популяционно-генетические параметры свиней трех пород, рассчитанные по ISSR-маркерам.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на следующих научных мероприятиях:

  • Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития – 2011», г. Москва, 21- 24 марта 2011 г.
  • Конференция в рамках финала конкурса «У.М.Н.И.К», г. Пущино, 2 июня 2011 г.
  • Конференция в рамках отборочного этапа конкурса «У.М.Н.И.К», п. Дубровицы, 7 октября 2011 г.
  • Конференции Центра биотехнологии и молекулярной диагностики животных ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии, п. Дубровицы, 2010-2012 гг.

Структура и объем работы. Диссертация написана на 112 страницах, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы. Диссертационная работа содержит 25 таблиц и 25 рисунков. Список литературы включает 167 источников, в том числе 124 источника на иностранном языке.

Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликованы 2 научные работы, в том числе 1 в журнале, рекомендованном ВАК РФ («Достижения науки и техники АПК», 2011, № 10)

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики Центра биотехнологии и молекулярной диагностики животных ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института животноводства Россельхозакадемии в период с 2009 по 2012 гг. по схеме, приведенной на рисунке 1.

Молекулярно-генетические исследования были проведены на 307 головах племенных свиней пород крупная белая (3 популяции (КБ-1, КБ-2, КБ-3), n=112), ландрас (Л-1, Л-2, Л-3, n=113) и дюрок (Д-1, Д-2, Д-3, n=82).

В качестве образцов ДНК исследуемых животных были использованы пробы ткани (ушные выщипы). Выделение ДНК проводили перхлоратным методом [Зиновьева Н.А. и др., 2004]. Амплификация фрагментов ДНК проводилась согласно «Методическим рекомендациям по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве» [Зиновьева Н.А. и др., 1998]. Праймеры для исследования были подобраны на основании анализа литературных данных о наиболее распространенных микросателлитных повторах в геноме животных [IHGSC, 2001;Марзанов Н.С. и др. 2004; Abbot P., 2001; Cotti C., 2008; Сулимова Г.Е., 2009]. Анализ полиморфизма ISSR-маркеров выполняли на 16-ти капиллярном генетическом анализаторе АВI3130xl Genetic Analyzer с помощью  программы Gene Mapper 4.0.

Для сравнения информативности ISSR-маркеров с другими типами маркерных систем из базы данных Центра биотехнологии и молекулярной диагностики животных были выбраны профили исследуемого поголовья свиней по 16 эритроцитарным антигенам шести закрытых систем групп крови (ГК): В, D, E, F, G и L [Проскурина Н.В. и др., 2007; Проскурина Н.В., 2008]; 12 локусам микросателлитов [Тихомирова Т.Н., 2008; Сизарева Е.И., 2010] и AFLP-маркерам [Логвинова Т.И., Зиновьева Н.А., 2011].

Аллельные профили включали следующие показатели: среднее число аллелей, частоты встречаемости аллелей, число информативных аллелей, число эффективных аллелей, число приватных аллелей. Генетические дистанции рассчитывали по Nei [1983]. Индивидуальное соответствие особи породе оценивали по методу Pritchard J.K. с соавторами [2000].

Рис. 1. Схема исследований

Статистическую обработку данных генотипирования проводили с использованием программ MS Excel, Structure 2.3.1, GenAIEx 6.4.1, PAST.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Разработка системы мультиплексного генотипирования ISSR-маркеров свиней

Создание системы молекулярно-генетического анализа  проводилось в два этапа. На первом этапе осуществляли подбор праймеров, экспериментальное моделирование системы и исследование спектра получаемых ампликонов. На втором этапе методика была адаптирована для изучения полиморфизма ISSR-маркеров с использованием метода капиллярного электрофореза.

В качестве праймеров были выбраны 6 нуклеотидных последовательностей, состоящих из ди- или тринуклеотидных повторов и «якорного» нуклеотида.

В результате апробации различных последовательностей были отобраны праймеры ISSR-2 и ISSR-6, которые затем были маркированы флуоресцентными метками R6G и FAM, соответственно.

Следующим этапом исследования явилась адаптация методики генотипирования ISSR-маркеров для детекции продуктов амплификации на лазерном ДНК-анализаторе. Полученный в результате анализа ISSR-фингерпринт представлен набором пиков разной высоты (рис. 2).

Рис. 2. Результаты ISSR-анализа на генетическом анализаторе ABI Prism 3130xl на примере праймера ISSR-6 (фрагмент)

Вследствие доминантного характера наследования ISSR-маркеров для обработки полученных данных была сформирована бинарная матрица.

3.2. Сравнительный анализ  ISSR-маркеров и генетических маркеров на основе групп крови

ISSR-анализ позволил идентифицировать 567 аллелей, среднее число которых на локус составило 1,48 ±0,02 аллелей: 1,66±0,03, 1,27±0,04 и 1,56±0,04  аллелей для свиней пород крупная белая, ландрас и дюрок, соответственно. Для исследуемых групп крови (ГК) было выявлено всего 17 аллелей. Среднее их число на локус составило 1,75±0,11 аллелей:1,88±0,13,1,50±0,19 и 1,88±0,13 аллелей для свиней породы крупная белая, ландрас и дюрок, соответственно (табл. 1).

Анализ степени полиморфизма ISSR-маркеров и ГК для исследуемого поголовья показал, что в среднем по трем изучаемым породам ISSR-маркеры характеризовались на 3% большим количеством полиморфных локусов по сравнению с ГК - 73,7 и 70,8%, соответственно (рис. 3).

Табл. 1. Анализ полиморфизма ISSR и ГК у исследуемых групп свиней

Порода

n

Число аллелей ISSR

Число аллелей ГК

Всего

В среднем на локус

Всего

В среднем на локус

Крупная белая

22

471

1,66±0,03

15

1,88±0,13

Ландрас

6

350

1,27±0,04

12

1,50±0,19

Дюрок

10

444

1,56±0,04

15

1,88±0,13

Итого*

567

1,48±0,02

17

1,75±0,11

Примечание:* число выявленных аллелей в трех породах (значение не является средней арифметической) 

Рис. 3. Доля полиморфных локусов ISSR-маркеров и групп крови у исследуемых групп свиней

Наименьшим уровнем полиморфизма характеризовались животные породы  ландрас как по ISSR-маркерам (60,7%  и 1,27±0,04 аллелей на локус), так и по ГК (50,0% и 1,50±0,19 аллелей на локус). Возможно, низкий уровень полиморфизма в данной группе животных был связан с небольшой их численностью. В отношении остальных пород наблюдались значительные различия в зависимости от типа маркеров. Наивысший уровень полиморфизма по ISSR-маркерам был отмечен у свиней породы крупная белая (83,1% и 1,66 ±0,03 аллелей на локус), в то время как по ГК наибольшей долей полиморфных локусов характеризовались животные породы дюрок (87,5% и 1,88±0,13 аллелей на локус).

Результаты сравнительного генетического структурирования популяций на основании расчета коэффициента подобия (Q) с использованием ISSR-профилей и генетических профилей по ГК приведены на рисунке 4. В качестве критерия оценки принадлежности животных к популяции был выбран 75% уровень исключения. На основании анализа ДНК-профилей по ISSR-маркерам корректное отнесение индивидуумов к породе достигалось в 28,6% случаев – у крупной белой породы, 50,0% случаев – у свиней породы ландрас и в 9,1% случаев – у свиней породы дюрок.

А) ISSR маркеры

Б) Группы крови

Примечание: Ось Х – племенные свиньи соответствующих пород.

Ось Y – критерий Q принадлежности особи к породе.

Рис. 4. Результаты сравнительного генетического структурирования популяций свиней с использованием критерия Q, рассчитанного по ISSR-профилям (А) и генетическим профилям групп крови (Б)

На основании данных эритроцитарных антигенов ГК корректное отнесение индивидуумов к популяции достигалось в 14,3% случаев  у свиней крупной белой породы, в 16,7% случаев у  животных породы ландрас и в 54,5 % случаев у свиней породы дюрок.

3.3. Сравнительный анализ ISSR-маркеров и ДНК-маркеров, основанных на полиморфизме длин амплифицированных фрагментов (AFLP)

Табл. 2.Анализ полиморфизма ISSR и AFLP у исследуемых групп свиней

Порода

n

Число аллелей ISSR

Число аллелей AFLP

Всего

В среднем на локус

Всего

В среднем на локус

Крупная белая

16

531

1,74± 0,03

481

1,77 ±0,03

Ландрас

24

587

1,93 ±0,02

389

1,43 ±0,04

Дюрок

9

492

1,62± 0,03

396

1,46± 0,04

Итого*

609

1,76 ±0,02

543

1,55± 0,02

Примечание:* число выявленных аллелей в трех породах (значение не является средней арифметической) 

В таблице 2 представлены результаты сопоставления полиморфизма двух доминантных маркерных систем. Анализ ISSR-маркеров позволил детектировать 609 аллелей. Для пород крупная белая, ландрас и дюрок  было выявлено 531, 587 и 492 аллелей, соответственно. Для AFLP-маркеров было отмечено меньшее число аллелей: 543 в целом и 481, 389 и 396 – для пород крупная белая, ландрас и дюрок, соответственно.

Исследование показало, что по среднему числу аллелей на локус ISSR-маркеры превосходили AFLP-маркеры (1,76±0,02 и 1,55±0,02, соответственно). Число аллелей ISSR варьировало в зависимости от породной принадлежности животных: 1,74±0,03 – для крупной белой породы, 1,93±0,02 - для породы ландрас и 1,62±0,03 – для породы дюрок, а по данным AFLP-анализа значения этого показателя составили 1,77±0,03, 1,43±0,04 и 1,46±0,04, соответственно.

Примечание:* комбинированная система ISSR- AFLP

Рис. 5. Доля полиморфных локусов у исследуемых групп свиней

Как показано на рисунке 5, ISSR-маркеры характеризовались  на 11,0% большим количеством полиморфных локусов по сравнению с AFLP-маркерами в среднем по трем породам (88,1 и 77,7%, соответственно). Комбинирование аллельных профилей по ISSR и AFLP повышало средний процент полиморфных локусов до 83,2%.

Наибольшей долей полиморфных локусов по ISSR-маркерам (96,4%) характеризовались животные породы ландрас, в то время как  по AFLP-маркерам для них было выявлено 71,7% полиморфных локусов. Такая же закономерность была отмечена и для свиней породы дюрок (80,8 % и 72,9% по ISSR- и  AFLP-маркерам, соответственно).

На рисунке 6 представлена структура пиков ISSR- и AFLP-маркеров в исследуемых породах свиней.

А)

Б) Рис. 6. Структура пиков в исследуемых породах свиней по ISSR- (А) и AFLP-маркерам (Б)

А) ISSR-маркеры

Б) AFLP-маркеры

Рис. 7. Результаты определения породной принадлежности племенных свиней с использованием ISSR-  и AFLP- маркеров

У свиней пород дюрок и крупная белая, независимо от типа маркерной системы, все идентифицированные аллели встречались с частотой более 5,0%, что свидетельствует об их информативности. У ландрасов 91,0% аллелей по ISSR- и 70,2% аллелей по AFLP-маркерам являлись информативными.

Результаты сравнительного генетического структурирования популяций на основании расчета критерия Q по ISSR- и AFLP-профилям показали, что при использовании ISSR-маркеров корректное отнесение индивидуумов к популяции достигалось в 12,5% случаев у свиней породы крупная белая, в 12,5%  случаев – у ландраса и в 11,1% случаев  - у дюроков (рис. 7А). По данным AFLP-маркеров значения данного показателя составили 22,2% - у свиней породы дюрок и 75,5% - у свиней породы ландрас. Ни у одного животного крупной белой породы критерий Q не достигал 75% (рис. 7Б).

3.4. Сравнительный анализ ISSR-маркеров и микросателлитов

ISSR-анализ позволил идентифицировать 638 аллелей, причем наибольшим генетическим разнообразием характеризовались свиньи породы ландрас: было детектировано 618 аллелей. По трем породам число аллелей, приходящихся на один локус, составило 1,85±0,01. Наибольшее количество аллелей на локус было отмечено для породы ландрас (1,94±0,01) (табл. 3).

Исследование 12 локусов микросателлитов (МС) показало более высокую степень полиморфизма: 5,36±0,25 аллелей на локус. Наибольшим аллельным разнообразием характеризовались животные породы крупная белая: 5,83±0,32 аллелей на локус.

Табл. 3. Анализ полиморфизма ISSR и МС у исследуемых групп свиней

Порода

n

Число аллелей ISSR

Число аллелей МС

Всего

В среднем на локус

Всего

В среднем на локус

Крупная белая

34

593

1,86± 0,02

70

5,83±0,32

Ландрас

40

618

1,94±0,01

67

5,58±0,50

Дюрок

19

558

1,75± 0,03

56

4,67± 0,41

Итого*

638

1,85±0,01

91

  5,36± 0,250

Примечание:* число выявленных аллелей в трех породах (значение не является средней арифметической) 

Анализ степени полиморфизма ISSR-локусов в исследованных группах свиней показал, что количество полиморфных локусов варьировало в зависимости от породной принадлежности животных от 87,5% - у породы дюрок до 96,9%  - у ландраса (табл. 4).

Все микросателлитные локусы характеризовались 100% полиморфизмом, что было на 8,0% выше среднего уровня ISSR-полиморфизма по трем изучаемым породам.

Табл. 4. Доля полиморфных локусов ISSR и МС у исследуемых групп свиней

Порода

n

Доля полиморфных локусов, %

ISSR

МС

Крупная белая

34

93,0

100

Ландрас

40

96,9

100

Дюрок

19

87,5

100

В среднем

92,4

100

Результаты сравнительного генетического структурирования популяций по значению критерия Q с использованием ISSR-маркеров и микросателлитов представлены на рисунке 8.

А) ISSR маркеры

Б) Микросателлиты

Рис. 8. Результаты анализа индивидуальной принадлежности к породе на основании анализа ISSR-маркеров (А) и микросателлитов (Б)

По данным ISSR-анализа корректное отнесение индивидуумов к популяции при уровне исключения в 75,0% достигалось в 2,9% случаев у животных породы крупная белая, в 15,0% случаев - у свиней породы ландрас и в 47,4% случаев – у породы дюрок (рис. 8А). Значения данного показателя, рассчитанные на основании ДНК-профилей свиней по МС, составили 88,2, 80,0 и 89,5%, соответственно  (рис. 8Б).

3.5. Характеристика аллелофонда свиней пород крупная белая, ландрас и дюрок по ISSR-маркерам

3.5.1. Анализ ISSR-профилей

В таблицах 5 и 6 представлены результаты анализа полиморфизма ISSR-маркеров в исследуемых группах свиней.

В среднем по трем породам было идентифицировано 620 аллелей, что составляет 1,90±0,01 аллелей на локус.

Табл. 5. Результаты анализа полиморфизма ISSR-маркеров в исследуемых группах свиней

Число аллелей ISSR-маркеров

Крупная белая

Ландрас

Дюрок

В среднем

КБ-1

515

Л-1

390

Д-1

493

466

КБ-2

601

Л-2

626

Д-2

595

607

КБ-3

477

Л-3

463

Д-3

490

477

Итого*

629

615

617

620

Примечание:* число выявленных аллелей в трех популяциях (значение не  является средней арифметической) 

Табл. 6. Анализ полиморфизма количества аллелей, приходящихся в среднем на один локус, в исследуемых группах свиней

Число аллелей ISSR-маркеров

Крупная белая

Ландрас

Дюрок

В среднем

КБ-1

1,81±0,03

Л-1

1,37±0,04

Д-1

1,73±0,03

1,64±0,02

КБ-2

1,88±0,02

Л-2

1,96±0,01

Д-2

1,86±0,02

1,90±0,01

КБ-3

1,71±0,03

Л-3

1,66±0,03

Д-3

1,76±0,03

1,71±0,02

Итого*

1,93±0,01

1,89±0,02

1,89±0,02

1,90±0,01

Примечание:* число выявленных аллелей в трех популяциях (значение не  является средней арифметической) 

Наибольшим уровнем полиморфизма характеризовались свиньи крупной белой породы (629 аллелей или 1,93±0,01 аллелей на локус). Для пород ландрас и дюрок  различия в уровне полиморфизма были незначительными: 1,89±0,02 и 1,89±0,02 аллелей на локус, соответственно.  Заметные различия в уровне аллельного разнообразия были выявлены между популяциями свиней внутри пород. Так, например, у свиней породы ландрас в группе Л-2 были идентифицировано 1,96±0,01 аллелей на локус, в то время как в группах Л-1 и Л-3 - 1,37±0,04 и 1,66±0,03 аллелей на локус, соответственно.

Все три породы характеризовались высоким уровнем полиморфизма от 94,6% для пород дюрок и ландрас до 96,5% у породы крупная белая.

Анализ структуры аллелей в изучаемых породах свиней показал, что все породы характеризуются относительно большим количеством информативных аллелей (табл. 7).

Табл. 7. Анализ распределения информативных аллелей в изучаемых группах свиней

Число аллелей ISSR-маркеров

Крупная белая

Ландрас

Дюрок

В среднем

КБ-1

410

Л-1

390

Д-1

493

431

КБ-2

520

Л-2

563

Д-2

536

540

КБ-3

311

Л-3

293

Д-3

392

332

Итого*

507

496

497

332

Примечание:* число выявленных аллелей в трех популяциях (значение не  является средней арифметической) 

В среднем по трем породам 80,6% аллелей встречались с частотой более 5%. В группах Д-1 и Л-1 все аллели были информативными, в то время как у свиней КБ-1 этот показатель составлял 79,6% аллелей.

В таблице 8 представлен анализ наличия приватных аллелей в изучаемых группах свиней. В породном отношении наибольшим числом приватных аллелей характеризовалась крупная белая порода (21 аллель), а наименьшим – порода ландрас (4 аллеля).

Табл. 8.Анализ распределения приватных аллелей в изучаемых группах

Число аллелей ISSR-маркеров

Крупная белая

Ландрас

Дюрок

В среднем

КБ-1

55

Л-1

4

Д-1

36

32

КБ-2

6

Л-2

12

Д-2

4

7

КБ-3

20

Л-3

21

Д-3

32

24

Заметные различия в количестве приватных пиков были отмечены между популяциями внутри пород. Так, в крупной белой породе количество приватных аллелей варьировало от 6 до 55, у свиней породы дюрок - от 4 до 36 и у свиней породы ландрас – от 4 до 21. Вероятно, высокая вариабельность в количестве приватных аллелей может быть связана с тем, что не все пики являются строго породоспецифичными, а отражают принадлежность животных к определенной популяции.

3.5.2. Анализ генетических дистанций, рассчитанных на основе  ISSR-маркеров между исследуемыми популяциями свиней

Результаты анализа генетических дистанций между исследуемыми группами свиней, рассчитанные по Nei M. [1983], в виде генеалогического древа представлены на рисунке 9.

Анализ структуры филогенетического древа выявил формирование двух основных кластеров, один из которых представлен животными одного хозяйства, а второй включает в себя групп свиней двух других хозяйств. Внутри второго кластера выделяется самостоятельная ветвь КБ-2 и два подкластера, представленные группами свиней двух остальных пород второго предприятия (Л-2 и Д-2) и тремя породами свиней третьего предприятия (КБ-3, Л-3 и Д-3, соответственно).

Рис. 9. Дендрограммы генетических связей девяти исследуемых популяций свиней пород крупная белая, ландрас и дюрок.

Таким образом, структура генеалогического дерева, в большей степени, отражает принадлежность свиней к предприятию, чем к породе.

4. ВЫВОДЫ

1. Разработана система мультиплексного генотипирования ISSR-маркеров свиней с использованием флуоресцентно меченных праймеров и лазерной детекции продуктов амплификации на ДНК-анализаторе. Оценка системы, выполненная на свиньях трех пород (n=307), показала, что ISSR-маркеры характеризовались высоким уровнем полиморфизма - от 94,6 до 96,5% в зависимости от породы. В среднем по трем породам было идентифицировано 620 аллелей, что составляет 1,90±0,01 аллелей на локус.

2. Сравнительный анализ аллельных профилей свиней трех пород по ISSR-маркерам и группам крови (ГК) показал более высокую степень полиморфизма ISSR-маркеров по сравнению с ГК - 73,7 и 70,8%, соответственно. Установлено, что корректное отнесение особей к породе при 75% уровне исключения (Q) по данным ISSR-анализа достигалось в 9,1% случаев у свиней породы дюрок, в 28,6% случаев – у свиней крупной белой породы и в 50% случаев – у свиней породы ландрас, в то время как при использовании ГК значения данного показателя составили 54,5, 14,3 и 16,7%, соответственно.

3. Сравнительное исследование системы ISSR-маркеров с AFLP-маркерами показало их более высокий уровень полиморфизма: доля полиморфных локусов в среднем по трем породам составила 88,1 и 77,7%, соответственно. Идентификация породной принадлежности свиней при  Q75% при использовании ISSR- и AFLP-маркеров достигалась, соответственно,  в 12,5 и 0,0% случаев у свиней крупной белой породы, 12,5 и 75,5% случаев - у свиней породы  ландрас и в 11,1 и 22,2% случаев - у свиней породы дюрок.

4. Сравнительная оценка полиморфизма ISSR-маркеров и микросателлитов показала более высокую долю полиморфных локусов микросателлитов (100,0 против 92,4%). Доля животных с корректно идентифицированной породной принадлежностью при использовании ISSR-маркеров и микросателлитов составила, соответственно, 2,9 и 88,2% у свиней крупной белой породы, 15,0 и 80,0% - у свиней породы ландрас 47,4 и 89,5% - у свиней породы дюрок.

5. Дана характеристика аллелофонда свиней пород крупная белая, ландрас и дюрок трех свиноводческих предприятий России по ISSR-маркерам. Показано, что наибольшим уровнем полиморфизма характеризовались свиньи крупной белой породы: 629 аллелей или 1,93±0,01 аллелей на локус. Для свиней пород ландрас и дюрок значения данных показателей составили 615 аллелей (1,89±0,02 аллелей на локус) и 617 аллелей (1,89±0,02 аллелей на локус), соответственно. Установлено наличие приватных аллелей во всех трех исследованных породах свиней: 21 - у свиней крупной белой породы, 4 - у свиней породы ландрас и 10 - у свиней породы дюрок.

6. Основываясь на полученных ISSR-профилях, установлены генеалогические связи девяти  популяций свиней трех пород. Показано, что формирующаяся структура филогенетического дерева, в большей степени, является отражением популяционной, а не породной принадлежности изучаемых групп свиней.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Молекулярно-генетическим лабораториям для повышения производительности ISSR-анализа рекомендуем использовать разработанную нами систему, основанную на использовании флуоресцентно-меченных праймеров и лазерной детекции продуктов амплификации на ДНК-анализаторе.

Лабораториям, занимающимся вопросами изучения генофондов сельскохозяйственных животных, в частности свиней, рекомендуем использовать ISSR-маркеры в качестве одного из критериев оценки состояния популяций.

Список опубликованных работ по теме диссертации

Статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ

1. Денискова, Т.Е. Моделирование системы мультиплексного анализа ISSR-маркеров свиней / Денискова Т.Е., Гладырь Е.А., Зиновьева Н.А., Сизарева Е.И. // Достижения науки и техники АПК. – 2011, № 10. – С.55-56.

Статьи в других изданиях

2. Денискова, Т.Е. Сравнительный анализ ISSR-маркеров и ДНК-маркеров, основанных на полиморфизме длин амплифицированных фрагментов (AFLP) / Денискова Т.Е., Логвинова Т.И. // Актуальные проблемы гуманитарных и естественных наук. – 2012, № 04 (39). – С. 27-29.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.