WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

  На правах рукописи

Форнара Маргарет Сержевна

характеристика аллелофонда и Дифференциация пород и популяций медоносной пчелы с использованием микросателлитов

автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Специальность: 03.02.07 – ГЕНЕТИКА

  Научные руководители:

д.б.н., профессор, академик

РАСХН Н.А. Зиновьева

д.с.-х.н., профессор, академик

РАСХН Н.И. Кривцов

Дубровицы – 2012

Работа выполнена в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики животных Государственного научного учреждения Всероссийского научно-исследовательского института животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук

Научные руководители: 

доктор биологических наук,

профессор, академик РАСХН

Зиновьева Наталия Анатольевна

доктор сельскохозяйственных наук, профессор, академик РАСХН

Кривцов Николай Иванович

Официальные оппоненты: 

доктор биологических наук, профессор,

зав. иммуногенетической лабораторией
ОАО «Московское» по племенной работе

Букаров Нурмагомед Гаджикулиевич

кандидат биологических наук, заместитель директора по научной работе

ГНУ НИИ пчеловодства

Бурмистрова Лилия Александровна

Ведущее учреждение: ФГБОУ ВПО Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина.

Защита состоится «18» декабря 2012 года, в 10 часов, на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 006.013.03 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Россельхозакадемии.

Адрес института:  142132 Московская область, Подольский район,  пос. Дубровицы, ГНУ ВИЖ,  т/факс (4967) 65-11-01

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии.

Автореферат разослан «___» ноября 2012 года.

Ученый секретарь Совета Д 006.013.03                               И.В. Гусев

Актуальность темы. Медоносная пчела (Apis mellifera L.) является наиболее распространенным представителем рода Apis, обитающим на территории России. С использованием многокомпонентного анализа морфометрических признаков A. mellifera подразделяют на четыре эволюционные ветви (Ruttner, 1978, Ruttner, 1988), объединяющие 26 подвидов (Ruttner, 1992, Sheppard et al., 1997, Sheppard, Meixner, 2003, Meixner et al., 2010), а по некоторым данным (Engel, 1999), 28 подвидов (пород). Ряд подвидов, например, A. m. mellifera, по результатам морфометрического анализа (Cornuet J.M. et al., 1975, 1978) подразделяются на дифференцированные локальные популяции. 

Развитие ДНК-технологий открыло новые возможности в дифференциации подвидов и более мелких таксономических единиц (популяций, экотипов) медоносной пчелы. С использованием мтДНК (Smith D.R., 1991, Garnery L. et al., 1992), а в последующем микросателлитов (МС) (Estoup A., 1995, Franck P. et al., 2000) было подтверждено разделение A. mellifera на эволюционные ветви с некоторой перегруппировкой североафриканских подвидов между ветвями. Использование МС позволило дифференцировать африканские и западноевропейские подвиды (Estoup A. et al., 1995), доказать гибридное происхождение пчел Пиренейского полуострова A. m. iberica (De La Rua P. et al., 2002, 2003), установить тенденцию возрастания генетической гомогенности существующих экотипов у иберийских пчел (A. m. iberiensis) Пиренейского полуострова (Canovas F. et al., 2010). Исследования российских популяций медоносной пчелы по МС, в большинстве случаев, ограничены анализом 2-4 локусов (Ильясов Р.А., 2006, Шареева З.В., 2009).

Целью настоящей работы явилась оценка состояния аллелофонда и степени дифференциации пород и популяций медоносной пчелы, обитающих в России, с использованием микросателлитов. Для достижения цели работы были поставлены и решены следующие задачи:

  1. Разработать мультилокусную систему анализа микросателлитов медоносной пчелы, включающую семь локусов; изучить ее функциональные и потребительские свойства.
  2. Дать характеристику аллелофонда среднерусской, карпатской, серой горной кавказской пород медоносной пчелы и дальневосточных пчел по локусам A024, A88, A113, AP043, HB-C16-05, HB-THE-03, HB-C16-01.
  3. Провести оценку степени генетической консолидации и дифференциации изучаемых пород медоносной пчелы на основании анализа их микросателлитных профилей.
  4. Выполнить исследование аллелофонда и изучить внутрипородную дифференциацию различных популяций медоносной пчелы среднерусской и карпатской пород.
  5. Изучить аллелофонд микросателлитов у пчел типа «Приокский» в сравнении с исходными породами (среднерусской и серой горной кавказской), участвующими в его формировании.

Научная новизна исследований. Дана характеристика аллелофонда среднерусской, карпатской и серой горной кавказской пород медоносной пчелы различного происхождения по семи локусам микросателлитов. Проведен анализ наблюдаемой и ожидаемой степеней гетерозиготности, показателей F-статистики, как в целом по панели микросателлитов, так и по отдельным локусам. Выполнен анализ степени генетической дифференциации пород и внутрипородных популяций, охарактеризованы генеалогические связи между ними. Оценена степень интродукции исходных пород в популяции медоносной пчелы типа «Приокский».

Практическая значимость. Разработана мультилокусная система генетического анализа медоносной пчелы по микросателлитам, включающая семь маркеров (A024, A88, A113, AP043, HB-C16-05, HB-THE-03 и HB-C16-01). Показана высокая результативность тест-системы в проведении генетической экспертизы происхождения. Выполнено построение ДНК-профилей и дана характеристика генетической и генеалогической структуры пород медоносной пчелы, разводимых в России: среднерусской, карпатской и серой горной кавказской пород и дальневосточных пчел. Показана возможность дифференциации вышеназванных пород медоносной пчелы на основании анализа их микросателлитных профилей.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены и обсуждены на Международной конференции «ЕС-Россия: 7-я Рамочная программа в области биотехнологии, сельского, лесного, рыбного хозяйства и пищи», г. Уфа, 29.09.-05.10.2010 г.; на конгрессе «Биотехнология: состояние и перспектив развития», г. Москва, 21.-24.03.2011 г.; на ежегодных научных конференциях Центра биотехнологии и молекулярной диагностики ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии (2009-2012).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Предложена мультилокусная система генетического анализа медоносной пчелы, основанная на исследовании полиморфизма 7 локусов микросателлитов, и лабораторный регламент на ее производство.

2. Показана результативность системы в проведении генетической экспертизы происхождения пчел.

3. Установлены различия в аллельных профилях пчел среднерусской, карпатской, серой горной кавказской пород по семи микросателлитам.

4. Выполнена оценка степени генетической дифференциации изучаемых пород и внутрипородных популяций медоносной пчелы.

5. Оценена степень интродукции аллелофонда исходных пород в популяции медоносной пчелы типа «Приокский».

Публикации результатов исследований.  По материалам диссертации опубликовано 7  работ, в т.ч. 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем работы.  Диссертация написана на 144 страницах, состоит из разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы, содержит 39 таблиц и 33 рисунка. Список литературы включает 167 источников, в т.ч. 127 на иностранном языке.

2. Материалы и методы исследований

Исследования проводили в период с 2009 по 2012 гг. в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики животных Государственного научного учреждения Всероссийского научно-исследовательского института животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук по схеме, представленной на рисунке 1.

Рис. 1. Схема исследований

Объектами исследований служили медоносные пчелы Apis Mellifera.

Изучаемая выборка Apis Mellifera была представлена 9 популяциями, в т.ч. пчелами среднерусской породы из Республики Татарстан (8 семей, n=90), Красноярского края (2 семьи, n=33) и Архангельской области (3 семьи, n=68); карпатской породы Майкопского типа (8 семей, n=95), Закарпатья (5 семей, n=61) и Украины (3 семьи, n=28), разводимых во ФГУП ППХ «Майкопский», серой горной кавказской породы из коллекции ГНУ НИИП и дальневосточной пчелы Новосибирской области из коллекции ГНУ СибНИИЖ. Для оценки изменчивости аллелофонда при создании типов в выборку включали пчел типа «Приокский» (n=88) из коллекции ГНУ НИИП.

В качестве материала для исследований были использованы рабочие пчелы, законсервированные в 96% этиловом спирте. Выделение ДНК проводили с помощью колонок фирмы Nexttec (Германия), с использованием набора реагентов для выделения ДНК DIAtomTM DNA Prep100 и с помощью перхлоратного метода (Зиновьева Н.А. и др., 2002).

Анализ ДНК и постановку ПЦР проводили согласно «Методическим рекомендациям …» (Зиновьева Н.А. и др., 1998). Определение микросателлитного профиля пчел проводили с использованием ДНК-анализатора с лазерным детектором ABI3130xl по методикам Центра биотехнологии и молекулярной диагностики ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии.  Для идентификации аллелей использовали программу GeneMapper (ver. 4.0). Данные об аллелях каждой особи суммировали в электронной таблице MS Excel.

Статистическую обработку данных проводили по стандартным методикам (Вейр Б., 1995, Меркурьева Е.А., 1970, Животовский Л.А., 1991).

Расчет популяционно-генетических параметров (среднее число и число эффективных аллелей на локус, степень наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности, анализ распределения популяций по Paetkau D. (2004), показатели F-статистики) выполняли с использованием программного обеспечения GenAlEx (ver. 6.4).

Степень дифференциации популяций оценивали на основании значений Fst (Weir, Cockerham, 1984) и Rst (AMOVA) (Slatkin M., 1995) при парном сравнении, а так же генетических дистанций по Nei M. (1983), средних значений коэффициента Q в соответствующих кластерах (Pritchard J.K. et al., 2000). Для проведения анализа использовали программное обеспечение Structure (ver.2.3.1). Обсчет данных проводили без введения предварительной информации о популяционной принадлежности особей для числа популяций (K-кластеров) от 2 до 3 с параметрами, описанными ранее (Raffaele D’O., 2007). При генетической дифференциации пчел типа «Приокский» (n=88) в качестве групп сравнения были использованы рабочие пчелы среднерусской (n=65) и серой горной кавказской пород (n=70), предварительно оцененные по генетической принадлежности к соответствующей породе (Q=98,6±0,14 и 99,0±0,05, соответственно).

Разработку лабораторного регламента на производство тест-системы анализа полиморфизма семи локусов микросателлитов медоносной пчелы осуществляли согласно ОСТ 9365-001-076-95. Кроме того, при оформлении регламентов учитывали требования ОСТ 64-02-003-2002.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Разработка мультилокусной тест-системы анализа

микросателлитов медоносной  пчелы

Разработанная тест-система основана на амплификации семи локусов МС с использованием праймеров, меченных FAM или R6G (табл. 1).

Табл. 1. Спектр локусов для включения в тест-систему для мультиплексного анализа микросателлитов медоносной пчелы

Локус

Номер в генном банке

Номер хромо-сомы

Размер аллеля

Мини-мальный

Макси-мальный

A024

-

7

(CT)11

95

115

A088

AJ509283.1

8

(CT)10TC(CCTT)2(CTTT)3… (GGA)7

133

159

HB-THE-03

-

13

(TA)11(TC)12

174

212

HB-C16-01

-

16

(GA)35

248

326

HB-C16-05

-

1

(TC)23

65

89

AP043

AJ509329.1

3

(CT)24

127

175

A113

AJ509290.1

6

(TC)2C(TC)2TT(TC)5TT

(TC)8TT(TC)5или (TC)2,5,8,5

200

240

Результаты капиллярного электрофореза продуктов семи выбранных локусов МС, амплифицируемых в одной реакции, показаны на рисунке 2.

Примечание: названия локусов приведены над пикограммами, названия аллелей приведены под пикограммами.

Рис. 2. Результаты капиллярного электрофореза

продуктов мультилокусной ПЦР семи локусов МС медоносной пчелы

Разработан лабораторный регламент с изложением технологического процесса (ТП) производства тест-системы, который включает 13 стадий вспомогательных работ, 15 стадий ТП и 3 стадии подготовительных работ. При описании основных стадий ТП в качестве меры количества сырья использовали единицы объема от конечного продукта, что позволяет рассчитать необходимое количество сырья для производства любого числа наборов тест-систем. Кроме того, был охарактеризован материальный поток для производства 10 наборов тест-систем. Регламентом запланировано 5 контрольных точек ТП, предусматривающих последовательный контроль на пяти стадиях технологического процесса.

Функциональные характеристики и потребительские свойства разработанной тест-системы обобщены в таблице 2.

Табл. 2. Функциональные и потребительские свойства тест-системы анализа микросателлитов медоносной пчелы

Показатель

Значение

Показатель

Значение

Число локусов

7

Ne

3,47±0,44

Число реакций

1

PI

9,7*10-11

Мультиплексность

7

PX1

99,51

Специфичность, %1

99,8

PX2

92,95

Na

7,33±0,83

PX3

99,906

Na5%

3,88±0,49

Q, %

92,1±1,8

Примечание: 1доля генотипированных локусов, %; Na – среднее число аллелей на локус; Na5% - среднее число информативных аллелей на локус; Ne – среднее число эффективных аллелей на локус; PI – вероятность совпадения генотипов животных; PX1 – точность подтверждения происхождения по обоим родителям; PX2 точность подтверждения происхождения по одному родителю; PX3 – точность исключения родителей; Q – средний уровень исключения при определении породной принадлежности, %


3.2. Характеристика аллелофонда медоносной пчелы по микросателлитам

      1. Анализ аллельных профилей

Среднее число аллелей на локус МС варьировало от 7,9±2,2 у пчел серой горной кавказской породы до 12,4±2,7 у пчел карпатской породы. Относительно высокий уровень генетического разнообразия у пчел среднерусской породы был обусловлен, в основном, наличием редких аллелей, на что указывает практически равное число эффективных аллелей у пчел среднерусской и серой горной кавказской пород (3,2±0,5 и 3,4±1,1, соответственно). Наибольшее число эффективных аллелей при среднем уровне генетического разнообразия (10,4±1,9 аллелей на локус) было выявлено в популяции дальневосточных пчел - 5,5±1,0.

Число аллелей в отдельных локусах варьировало от 3 в локусах A024 и A088 у пчел серой горной кавказской породы до 26 в локусе HB-C16-01 у пчел карпатской породы. Наиболее информативными в наличии аллелей, типичных для каждой из пород, оказались локусы A088, A113, HB-C16-05 и HB-THE-03. Было идентифицировано 20 приватных аллелей, в том числе 7 в среднерусской, 8 – в карпатской, 3 – в серой горной кавказской породе, 2 – в дальневосточной популяции с частотой встречаемости от 0,3 до 8,0%.

Расчет информационного индекса Шеннона (I) показал, что наибольшее генетическое разнообразие МС установлено у дальневосточных пчел (1,83±0,18), наименьшее – у серых горных кавказских (1,24±0,26). Значения показателя I у пчел среднерусской и карпатской пород занимали промежуточное положение - 1,50±0,16 и 1,64±0,23, соответственно.


3.2.2. Анализ уровней гетерозиготности и показателей F-статистики

В трех из четырех исследованных породах пчел отмечен дефицит гетерозигот: 20,2% - в среднерусской породе, 12,4% – в карпатской породе и 20,5% - у дальневосточной пчелы. На существенный дефицит гетерозигот указывают так же высокие положительные значения индекса Fis – 0,313, 0,168 и 0,255, соответственно (табл. 3).

Табл. 3. Фактическая и ожидаемая степени гетерозиготности

у исследованных пород медоносной пчелы

Порода

Степень гетерозиготности

Разница

Ho-He

Fis

Фактическая,

Ho

Ожидаемая,

He

Среднерусская

0,447±0,059

0,649±0,049

-0,202

0,313±0,068

Карпатская

0,583±0,042

0,707±0,046

-0,124

0,168±0,052

Серая горная кавказская

0,599±0,043

0,582±0,074

0,016

-0,023±0,015

Дальневосточная

0,581±0,012

0,786±0,030

-0,205

0,255±0,055

Минимальная степень гетерозиготности (0,396) отмечена в локусе HB-C16-05 с вариациями от 0,251 до 0,547 в зависимости от породы, максимальная - в локусе HB-C16-01 (0,671) с вариациями от 0,820 до 0,915.

Проведенный расчет индекса Fst показал, что 88,3% всего разнообразия обусловлено внутрипородными различиями и только 11,7% приходится на межпородные различия. Минимальные межпородные различия отмечены для локуса AP043 (4,7%), максимальные – для локуса A088 (25,9%).

3.2.3. Анализ степени генетической консолидации изучаемых пород медоносной пчелы

Наибольшей степенью генетической консолидации характеризовалась серая горная кавказская порода, в которой 100% изучаемых особей были отнесены к собственной породе, наименьшей - дальневосточные пчелы, среди которых только 76,7% относились к собственной популяции (табл. 4). Анализ распределения особей среднерусской породы, отнесенных по генотипу к другим породам, показал, что большинство из них (9,9%) были генетически сходны с дальневосточными пчелами. В карпатской породе приблизительно равная доля таких особей была распределена между серой горной кавказской и дальневосточной породами (6,5 и 8,7%, соответственно). В популяции дальневосточных пчел большинство генетически «чужих» особей относились к карпатской породе (13,3%).

Табл. 4. Результаты анализа генетической принадлежности особей к популяции (по Paetkau D., 2004)

Порода

Доля особей (%), отнесенных к соответствующей породе

SR

KARP

SGK

DV

SR

86,9

2,6

0,5

9,9

KARP

1,1

83,7

6,5

8,7

SGK

-

-

100,0

-

DV

6,7

13,3

3,3

76,7

Примечание: порода (популяция) пчел: SR – среднерусская, KARP – карпатская; SGK – серая горная кавказская; DV - дальневосточная

Выявлены существенные различия в степени консолидации различных популяций среднерусской породы (табл. 5). 100% особей популяции Республики Татарстан и 97,0% особей красноярской популяции были генетически отнесены к среднерусской породе, в то время как в архангельской поплуяции лишь 64,7% были отнесены к среднерусской породе. Аналогичные данные получены  на карпатской породе: 100% особей украинской популяции и 98,4% особей закарпатской популяции были генетически отнесены к карпатской породе, в то время как в майкопской поплуляции - лишь 69,5% особей.

Табл. 5. Результаты анализа генетической принадлежности особей различных популяций среднерусской и карпатской пород

Популяция

Доля особей (%), отнесенных к соответствующей породе

SR

KARP

SGK

DV

SR_TAT

100,0

-

-

-

SR_KRASN

97,0

-

-

3,0

SR_ARKH

64,7

7,4

1,5

26,4

KARP_MAY

2,1

69,5

12,6

15,8

KARP_Z

-

98,4

-

1,6

KARP_UKR

-

100,0

-

-

Примечание: популяции среднерусской породы пчел: SR_TAT – Республика Татарстан, SR_KRASN – Красноярский край, SR_ARKH – Архангельская область; популяции карпатской породы пчел: KARP_MAY – майкопская, KARP_Z – закарпатская, KARP_UKR – украинская популяции.

Установлены существенные различия в степени генетической консолидации отдельных семей всех исследованных популяций медоносной пчелы.

3.2.4. Оценка степени дифференциации пород медоносной пчелы

Анализ генетических дистанций между исследуемыми породами пчел, рассчитанных по Nei M. (1983), показал, что наибольшей генетической удаленностью характеризуется среднерусская порода. Карпатская и серая горная кавказская породы более близки друг к другу, что проявляется на генеалогическом дереве в формировании ими единого кластера. Популяция дальневосточных пчел наиболее близка карпатской породе (табл. 6).

Табл. 6. Генетические расстояния между исследуемыми породами медоносной пчелы, рассчитанные по Nei M. (1983)

Порода

Генетические дистанции по Nei

SR

KARP

SGK

DV

SR

*

KARP

0,713

*

SGK

0,708

0,393

*

DV

0,360

0,148

0,339

*

Примечание: порода пчел: SR – среднерусская, KARP – карпатская; SGK – серая горная кавказская; DV – дальневосточная.

Генетические расстояния между исследуемыми популяциями медоносной пчелы, рассчитанные по Nei M. (1983), представлены в таблице 7 и в виде дендограммы на рисунке 3.

Табл. 7. Генетические расстояния между исследуемыми популяциями медоносной пчелы, рассчитанные по Nei (1983).

Порода

Генетические дистанции по Nei

SR_

TAT

SR_

KRASN

SR_

ARKH

KARP_

MAY

KARP_

Z

KARP_

UKR

SGK

DV

SR_TAT

*

SR_KRASN

0,182

*

SR_ARKH

0,212

0,280

*

KARP_MAY

0,573

1,041

0,369

*

KARP_Z

1,220

1,994

0,685

0,261

*

KARP_UKR

1,443

1,583

0,830

0,353

0,231

*

SGK

0,715

1,247

0,639

0,200

0,744

0,812

*

DV

0,477

0,689

0,209

0,123

0,268

0,466

0,339

*

Примечание: популяции среднерусской породы: SR_TAT – Республика Татарстан, SR_KRASN – Красноярский край, SR_ARKH – Архангельская область; популяции карпатской породы: KARP_MAY – майкопская, KARP_Z – закарпатская, KARP_UKR – украинская; SGK – серая горная кавказская порода; DV – дальневосточная порода.

Как следует из данных таблицы 7, внутрипопуляционные различия между региональными популяциями среднерусской породы  составили 0,182-0,280, карпатской породы – 0,231-0,353. Вместе с тем, отмечалась близость архангельской популяции среднерусской породы дальневосточным пчелам (0,209). Серая горная кавказская порода, в свою очередь, оказалась генетически наиболее близка майкопской популяции карпатской породы (0,200) по сравнению с другими породами  (0,715-1,247). Дальневосточные пчелы характеризовались наибольшей близостью к майкопской популяции карпатской породы (0,123), при этом степень генеалогических различий между ними была меньше, чем между внутрипородными региональными популяциями, как среднерусской, так и карпатской пород.

Примечание: популяции среднерусской породы пчел: SR_TAT – Республика Татарстан, SR_KRASN – Красноярский край, SR_ARKH – Архангельская область; популяции карпатской породы пчел: KARP_MAY – майкопская, KARP_Z – закарпатская, KARP_UKR – украинская; SGK – серая горная кавказская порода; DV – дальневосточная порода.

Рис. 3. Дендограмма филогенетического родства исследуемых популяций медоносной пчелы (по Nei, 1983)

Полученные экспериментальные данные являются вкладом в характеристику генофонда пород медоносной пчелы, разводимых в Российской Федерации.

3.3. Характеристика аллелофонда внутрипородных популяций медоносной пчелы по микросателлитам

Внутрипородную изменчивость микросателлитов оценивали в популяциях медоносной пчелы среднерусской и карпатской пород, представленных тремя географически изолированными популяциями.


3.3.1. Среднерусская порода медоносной пчелы

Установлено, что среднее число аллелей на локус МС было минимальным в красноярской популяции (4,6±0,6), максимальное - в архангельской популяции (9,6±1,9). Популяция Республики Татарстан, характеризуясь относительно высоким уровнем генетического разнообразия (7,6±1,7), имела практически равное число эффективных аллелей на локус с красноярской популяцией (2,8±0,7 против 2,4±0,4). Это говорит о том, что относительно высокий уровень генетического разнообразия татарской популяции был обусловлен, в основном, наличием редких аллелей.

Во всех исследованных популяциях отмечен дефицит гетерозигот: от 7,6% в татарской популяции до 24,5% в архангельской популяции. На это указывают так же высокие положительные значения индекса Fis – от 0,102 до 0,330, что свидетельствует о заинбредированности популяций.

Показано, что наибольшей степенью генетической консолидации характеризовалась красноярская популяция (100%), наименьшей - архангельская популяция (91,2%). В татарской популяции 96,7% особей генетически представляли собственную популяцию (табл. 8).

Табл. 8. Результаты анализа генетической принадлежности особей различных популяций среднерусской породы (по Paetkau D., 2004)

Порода

Доля особей (%), отнесенных к соответствующей породе

               SR_TAT

SR_KRASN

SR_ARKH

SR_TAT

96,7

1,1

2,2

SR_KRASN

-

100,0

-

SR_ARKH

2,9

5,9

91,2

Примечание: популяции среднерусской породы: SR_TAT – татарская, SR_KRASN – красноярская, SR_ARKH –архангельская

Анализ генетических дистанций, рассчитанных по Nei M. (1983) показал, что наибольшей генетической близостью характеризуются татарская и красноярская популяции (0,182), что в структуре генеалогического дерева отражается в формировании ими общего кластера. Архангельская популяция более близка татарской популяции (0,212) по сравнению с красноярской популяцией (0,280). Относительная генетическая изолированность архангельской популяции, по всей видимости, обусловлена наличием в ней «крови» дальневосточных и карпатских пчел (см. табл. 5).


3.3.2 Карпатская порода медоносной пчелы

Среднее число аллелей на локус МС было минимальным в украинской популяции -  5,7±1,3, максимальное разнообразие отмечено в майкопской популяции - 11,7±2,4. Последнее нашло отражение в более высоком среднем числе эффективных аллелей на локус: 5,1±1,2 против 3,1±1,1 в закарпатской популяции и 2,4±0,3 – в украинской популяции.

Во всех исследованных популяциях отмечен дефицит гетерозигот: от 5,2% - в майкопской популяции до 9,2% – в украинской популяции. О дефиците гетерозигот свидетельствуют так же положительные значения индекса фиксации Fis – от 0,071 до 0,205.

Наибольшей консалидированностью характеризовалась закарпатская популяция, 96,7% особей которой были генетически отнесены к собственной популяции, наименьшей - украинская популяция (85,7%) (табл. 9).

Табл. 9. Результаты анализа генетической принадлежности особей различных популяций карпатской породы (по Paetkau D., 2004)

Порода

Доля особей (%), отнесенных к соответствующей породе

       KARP_MAY

KARP_Z

KARP_UKR

KARP_MAY

88,4

8,4

3,2

KARP_Z

1,65

96,7

1,65

KARP_UKR

10,7

3,6

85,7

Примечание: популяции карпатской породы: KARP_MAY – майкопская, KARP_Z – закарпатская, KARP_UKR – украинская.

Проведенные расчеты генетических дистанций по Nei M. (1983) показали, что наибольшей близостью характеризуются закарпатская и украинская популяции (0,231), что в структуре генеалогического дерева отражается в формировании ими общего кластера. Майкопская популяция более близка закарпатской популяции (0,261) по сравнению с украинской популяцией (0,353). Относительная генетическая изолированность майкопской популяции, по всей видимости, обусловлена наличием в ней «крови» серых горных кавказских и дальневосточных пчел (см. табл. 5).


3.4. Характеристика аллелофонда среднерусской породы медоносной пчелы типа «Приокский»

Анализ аллельных профилей популяции медоносной пчелы типа «Приокский» показывает, что среднее число аллелей на локус МС варьирует от 5 в локусе А024 до 17 в локусе  HB-C16-01. Среднее число аллелей на локус составляет 7,48±1,02, число информативных аллелей – 3,62±0,71, число эффективных аллелей – 3,38±0,56. Установлено более высокое генетическое разнообразие пчел типа «Приокский» по сравнению с исходными породами: среднее число аллелей на локус составляет 9,57±1,88 против 6,86±1,55 и 6,00±1,84 у пчел среднерусской и серой горной кавказской пород, соответственно. По всей видимости, более высокое генетическое разнообразие пчел типа «Приокский» является следствием объединения аллелофонда двух относительно генетически удаленных пород.

Детальный анализ аллельных профилей позволяет проследить интродукцию аллелей исходных пород у пчел типа «Приокский» и показывает, что повышение аллельного разнообразия связано с объединением аллелофонда обеих пород. Указанием на участие двух пород пчел в создании изучаемого типа являются промежуточные значения частот встречаемости большинства аллелей микросателлитов.

Анализ наблюдаемой гетерозиготности показывает практически отсутствие различий между пчелами типа «Приокский» и серой горной кавказской породы (0,583 против 0,581). Однако высокое генетическое разнообразие типа «Приокский» находит отражение в заметно повышенном уровне ожидаемой гетерозиготности (0,711 против 0,529), следствием чего является существенный дефицит гетерозигот (Fis=0,177±0,089) против избытка гетерозигот в популяции серой горной кавказской породы (Fis=-0,084±0,025). По всей видимости, выявленный дефицит гетерозигот при высоком уровне генетического разнообразия в типе «Приокский» является следствием использования инбридинга с целью закрепления желательных экстерьерных и хозяйственно-полезных признаков (табл. 10).

Табл. 10. Фактическая и ожидаемая степени гетерозиготности у пчел типа «Приокский» в сравнении с исходными породами

Популяция

Степень гетерозиготности

Разница

Ho-He

Fis

Фактическая,

Ho

Ожидаемая,

He

Тип «Приокский»

0,583±0,066

0,711±0,051

-0,128

0,177±0,089

Среднерусская порода

0,385±0,088

0,472±0,101

-0,087

0,116±0,101

Серая горная кавказская порода

0,581±0,096

0,529±0,081

0,051

-0,084±0,025

Использование в качестве критерия оценки индекса Rst показывает, что внутрипопуляционные различия составляют 92,1% в общей изменчивости, в том числе 87,4% - различия между индивидуумами и 3,7% - различия внутри индивидуумов, в то время как на межпопуляционные различия приходится 7,9% общей изменчивости (Rst=0,079 при p=0,01).

  1. k=2

Б. k=3

Примечание: ось Х - коэффициент подобия, Q, ед., ось Y -  распределение отдельных особей (n=88) в порядке снижения значения Q.

Рис. 4. Результаты анализа популяционной принадлежности особей в группе пчел типа «Приокский» по Pritchard D. et al. (2000)

Проведенный кластерный анализ по Pritchard D. с соавторами (2000) при k=2 показал, что доли «крови» среднерусской  и серой горной кавказской пород в типе «Приокский» составляют, соответственно, 29,6±3,5 и 71,4±3,5% с вариациями у отдельных особей от 0,6 до 98,7 и от 1,3 до 99,4% (рис. 4 А). При k=3 среднее значение Q в типе «Приокский» составило 72,9±3,3% с вариациями у отдельных особей от 0,9 до 98,8%, при этом у 58 из 88 исследованных особей (65,9%) значение критерия Q было выше 75%, что является указанием на их генетическую изолированность. 46,6% особей были отнесены к собственной популяции при Q90% (рис. 4 Б).

Расчет генетических дистанций по Nei M. (1983) показал  большую близость типа «Приокский» популяции серых горных кавказских пчел (0,256) по сравнению с популяцией среднерусской породы (0,350). Генетические дистанции между серыми горными кавказскими и среднерусскими пчелами составили 1,055.  Анализ значений Rst при парном сравнении изучаемых популяций показал межпопуляционные различия в микросателлитных профилях типа «Приокский» с серой горной кавказской и среднерусской породами на уровне 10,8 и 2,2% (p=0,01), соответственно. Различия между серой горной кавказской и среднерусской породами при этом составили 17,2% (p=0,01). Принимая во внимание селекционную стратегию создания типа, показатель Rst, по всей видимости, является более объективным в оценке различий между данными популяциями. Полученные нами данные указывают на формирование собственного уникального аллелофонда типа, однако процесс генетической консолидации типа пока не завершен.

  1. Выводы

1. Разработана мультилокусная система анализа полиморфизма микросателлитов, включающая семь локусов A024, A88, A113, AP043, HB-C16-05, HB-THE-03, HB-C16-01. Разработан лабораторный регламент на ее производство. Установлена вероятность совпадения генотипов пчел PI=9,7*10-11. Показана результативность тест-системы в проведении генетической экспертизы происхождения (P1X=99,5%, P3X=99,9%) и определении породной принадлежности. Среднее значение принадлежности особи к собственной популяции составило Q=92,1±1,8%.

2. Выполнено исследование аллелофонда 9 популяций медоносной пчелы, в т.ч. пчел среднерусской породы из Республики Татарстан (8 семей, n=90), Красноярского края (2 семьи, n=33) и Архангельской области (3 семьи, n=68); карпатской породы Майкопского типа (8 семей, n=95), Закарпатья (5 семей, n=61) и Украины (3 семьи, n=28), разводимых во ФГУП ППХ «Майкопский», серой горной кавказской породы из коллекции НИИ пчеловодства Россельхозакадемии и дальневосточной пчелы из коллекции ГНУ СибНИИЖ Новосибирской области, с использованием разработанной системы. Установлено, что:

а) число аллелей в отдельных локусах варьировало от 3 в локусах A024 и A088 у пчел серой горной кавказской породы до 26 в локусе HB-C16-01 у пчел карпатской породы. Среднее число аллелей на локус микросателлитов варьировало от 7,9±2,2 у пчел серой горной кавказской породы до 12,4±2,7 у пчел карпатской породы.

б)  в трех породах отмечен дефицит гетерозигот: 20,2% - в среднерусской породе, 12,4% – в карпатской породе и 20,5% - у дальневосточной пчелы, на что так же указывают высокие положительные значения индекса Fis – 0,313, 0,168 и 0,255, соответственно.

3. Выполнена оценка степени генетической консолидации и дифференциации изучаемых пород и популяций медоносной пчелы. Установлено, что:

а) наибольшей степенью генетической консолидации характеризовалась серая горная кавказская порода (100%), наименьшей - дальневосточные пчелы (76,7%);  в среднерусской и карпатской породах, соответственно, 86,9 и 83,7% особей генетически относились к собственной популяции.

б) наибольшей генетической удаленностью характеризуется среднерусская порода (генетические дистанции по Nei 0,360-0,713). Карпатская и серая горная кавказская породы генетически более близки друг к другу (0,393), что проявляется на генеалогическом дереве в формировании ими единого кластера. Дальневосточная популяция пчел наиболее близка карпатской породе (0,148) и приблизительно равноудалена от среднерусской (0,360) и серой горной кавказской пород (0,339).

4. Установлены различия в аллельном разнообразии, степени генетической консолидации и дифференциации внутрипородных популяций медоносной пчелы среднерусской и карпатской пород.

5. Установлено более высокое генетическое разнообразие пчел типа «Приокский» (n=88) по семи МС по сравнению с исходными породами: среднее число аллелей на локус составило 9,57±1,88 против 6,86±1,55 и 6,00±1,84 в группах пчел среднерусской и серой горной кавказской пород, соответственно, что является следствием объединения аллелофонда двух относительно генетически удаленных пород. Межпопуляционные различия в микросателлитных профилях пчел типа «Приокский» с серой горной кавказской и среднерусской породами, оцененные по индексу Rst, составили 10,8 и 2,2% (p=0,01), соответственно.

  1. Практические предложения

Молекулярно-генетическим лабораториям рекомендуем использовать предложенную нами мультилокусную систему анализа семи микросателлитов (A024, A88, A113, AP043, HB-C16-05, HB-THE-03, HB-C16-01) для оценки состояния и динамики популяций медоносной пчелы.

Племенным пчеловодческим предприятиям для генетической экспертизы пород и популяций медоносной пчелы рекомендуем использовать генетические профили по микросателлитам.

Список опубликованных работ по теме диссертации

В журналах, рекомендованных ВАК РФ.

1. Кривцов, Н.И. Дифференциация основных пород пчел с использованием микросателлитов / Н.И. Кривцов, Н.А. Зиновьева, А.В. Бородачев, В.И. Лебедев, М.С. Форнара // Вестник Рязанского Государственного Агротехнологического Университета им. П.А. Костычева. – 2011. – Рязань. – С. 23–27.

2. Кривцов, Н.И. Характеристика аллелофонда трех пород медоносной пчелы России с использованием микросателлитов / Н.И. Кривцов, Е.А. Гладырь, В.В. Волкова, М.С. Форнара, В.И. Лебедев, Н.А Зиновьева // Проблемы биологии продуктивных животных. – 2011. – № 1. – С. 41–45.

3. Зиновьева, Н.А. Оценка изменчивости аллелофонда микросателлитов при создании специализированных линий медоносной пчелы среднерусской породы / Н.А. Зиновьева, Н.И. Кривцов, М.С. Форнара, Е.А. Гладырь, А.В. Бородачев, В.А. Бородачев, А.С. Березин, В.И. Лебедев // Достижения науки и техники АПК. – 2011. – № 10. – С. 51–52.

4. Зиновьева, Н.А. Микросателлиты как инструмент для оценки динамики аллелофонда при создании приокского типа среднерусской породы медоносной пчелы Apis mellifera / Н.А.Зиновьева, Н.И. Кривцов, М.С. Форнара, Е.А. Гладырь, А.В. Бородачев, С.А. Березин, В.И. Лебедев // Сельскохозяйственная биологиях. – 2011. – № 6. – С. 75–79.

5. Кривцов, Н.И. Биологические, морфологические и генетические особенности пчел разных видов / Н.И.Кривцов, А.В. Бородачев, В.И Лебедев, Н.А Зиновьева, М.С. Форнара, Е.А. Гладырь // Пчеловодство. – 2012. - № 1. – С. 14–17.

В других изданиях.

6. Кривцов, Н.И. Создание мультиплексных ДНК–диагностикумов на основе микросателлитов для геномной дактилоскопии в пчеловодстве / Н.И. Кривцов, А.В. Бородачев , Е.А. Гладырь, В.В. Волкова, М.С. Форнара, Н.А. Зиновьева // Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в АПК России / РАСХН. – 2010. – Москва – С. 230–235.

7. Форнара, М.С. Оценка информативности тест–системы анализа микросателлитов мелоносной пчелы / М.С. Форнара, Е.А. Гладырь, В.В. Волкова, Н.И. Кривцов, Н.А. Зиновьева // Сборник материалов Международной конференции: «ЕС – Россия: 7–я Рамочная программа в области биотехнологии, сельского, лесного, рыбного хозяйства и пищи» (29 сент. – 5 окт. 2010). – 2010. – Уфа. – БашГАУ. – С. 317–320.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.