WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи 

Гумерова Аниса Азатовна

Гисто- и цитогенез печени человека и крысы

в ходе пренатального развития и

репаративной регенерации

03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

диссертации на соискание учёной степени

доктора медицинских наук

Казань – 2012

Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития России

Научный консультант:                 доктор медицинских наук, профессор

                                Киясов Андрей Павлович

Официальные оппоненты:        доктор медицинских наук, профессор

               Дубовая Татьяна Клеониковна

               доктор медицинских наук, профессор

               Онищенко Нина Андреевна

               доктор медицинских наук, профессор

               Челышев Юрий Александрович

               

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Минздравсоцразвития России (г. Москва).

Защита диссертации состоится «___» _______________ 2012 г. в «___» часов на заседании диссертационного совета Д 208.034.01 при ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития России (420012, Казань, ул. Бутлерова, 49).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» (420012, Казань, ул. Бутлерова, 49, корпус Б).

Автореферат разослан «___» ________________ 2012 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор                                        Залялютдинова Л.Н.

общая характеристика работы

Актуальность. Центральной проблемой современной гепатологии является идентификация региональной стволовой клетки печени. Необходимость решения этой проблемы продиктована значительной распространённостью хронических диффузных заболеваний печени, недостаточной эффективностью существующих методов их лечения, и, как следствие, – высокой частотой развития фиброза и цирроза печени в исходе этих заболеваний. В этом случае единственным методом лечения становится трансплантация печени. Однако существующий дефицит донорских органов, большие листы ожидания, высокая стоимость трансплантации и необходимость последующей иммуносупрессивной терапии (Lorenzini, Andreone, 2007) диктуют необходимость поиска новых подходов к терапии данной группы заболеваний. Идентификация стволовой клетки печени позволила бы перейти к разработке принципиально новых методов лечения хронических диффузных заболеваний печени, основанных на стимуляции собственных стволовых клеток в печени больного и применении клеточной терапии, в том числе и генетически модифицированными стволовыми клетками.

Изучению проблемы поиска региональной стволовой клетки печени посвящено значительное число исследований, выполняемых, как правило, на разнообразных моделях регенерации печени у животных (Evarts et al., 1990; Fausto, 1990; Sell, 1990; Фактор, Радаева, 1991; Sigal et al., 1992; Dabeva, Shafritz, 1993; Factor et al., 1994; Sarraf  et al., 1994; Урываева, 1997; Braun, Sandgren, 2000) или путём культивирования различных популяций клеток, изолированных из печени животных и человека (Yin et al., 2002; Herrera et al., 2006). При этом из печени выделяют клетки, несущие те или иные маркёрные признаки стволовых клеток, или подобные признаки были выявлены или индуцированы у каких-либо клеток печени в процессе культивирования (Wang et al., 2003; Herrera et al., 2006). Однако, как это ни странно, вопрос о принадлежности этих стволовых клеток к какой-либо из описанных ныне клеточных популяций печени практически не обсуждается, и причина этого  кроется, по-видимому, в самом подходе – клетки изучаются «сами по себе», вне связей с органом, из которого они были извлечены. Очевидно также, что если клетки были лишены своего привычного микроокружения, их свойства существенно отличаются от тех, которые они проявляют, находясь в естественной среде. Только исследования, проведённые in vivo, в условиях естественного микроокружения и взаимодействия клеток и межклеточного вещества, могут приблизить нас к  идентификации региональной стволовой клетки печени. При этом основное внимание должно быть уделено, с одной стороны, изучению процессов внутриутробного развития органа, когда происходит первичная дифференцировка его клеток и закладка стволового компартмента, а с другой стороны – изучению фенотипа клеток во время репаративной регенерации органа, когда происходит активация его стволовых клеток.

Долгие годы одной из наиболее распространённых была теория, рассматривающая в качестве стволовых клеток печени так называемые овальные клетки, предположительно располагающиеся в начальных отделах желчевыводящих путей – канальцах Геринга (Theise et al., 1999). Однако в последнее десятилетие опубликовано значительное количество работ, посвященных  идентификации и/или изоляции других популяций стволовых клеток из взрослой печени, которые, как и эмбриональные, способны к многократным делениям и являются бипотентными (Wang et al., 2003). Особый интерес в этой связи вызывают данные, свидетельствующие о возможности развития как гепатобластов/гепатоцитов, так и холангиоцитов из кроветворных (Lagasse et al., 2000; Theise et al., 2000; Schwartz et al., 2002; Fiegel et al., 2003; Zhan et al., 2006) и мезенхимных (Schwartz et al., 2002; Sato et al., 2005; Lange et al., 2006; Talens-Visconti et al., 2006; Sgodda et al., 2007) стволовых клеток, что также не укладывается в традиционные представления о развитии эпителиальных клеток печени исключительно из энтодермального эпителия передней кишки (Wells, Melton, 1999), а значит, оставляет открытым вопрос о клеточных источниках развития печени как органа, и, в первую очередь, её паренхиматозных клеток и клеток внутрипечёночных желчных протоков.

Самым интригующим, безусловно, является факт развития гепатоцитов из стволовой кроветворной клетки, т.е. клетки мезенхимной, а не энтодермальной. Также накапливается все больше сведений о ключевом влиянии на развитие печени окружающей ее мезенхимы (Le Douarin, 1975; Fukuda-Taira, 1981; Jung et al., 1999). В связи с этим возникает вопрос, могут ли постоянно присутствующие в печени мезенхимные синусоидные клетки быть источником образования гепатоцитов в ходе развития и регенерации, и какие именно клетки в составе окружающей печень мезенхимы являются главными для формирования её микроокружения. Для ответа на эти вопросы необходимы комплексные морфологические исследования эмбрионов и плодов человека и крысы различных сроков гестации с использованием иммуногистохимического выявления белков, специфических для определённых клеточных популяций печени и стволовых клеток. Особое внимание предполагается уделить изучению фенотипа мезенхимных синусоидных клеток печени и их взаимоотношений с эпителиальными клетками на ранних этапах развития печени человека, что позволит установить, какие из синусоидных клеток в наибольшей степени обладают признаками стволовых клеток и могут быть источником развития гепатоцитов. Наиболее перспективным кандидатом на эту роль может стать популяция звёздчатых клеток печени, поскольку именно они находятся в зрелой печени в непосредственном контакте с гепатоцитами, вырабатывают важнейшие факторы, регулирующие пролиферацию и дифференцировку клеток (Bachem et al., 1992; Schirmacher et al., 1992; Maxwell et al., 1994; Eckardt, 1996; Asahina et al., 2002; Friedman, 2008), и могут быть получены из кроветворной стволовой клетки (Baba et al., 2004). В этой связи исследования по изучению стволовых потенций данной клеточной популяции как в онтогенезе, так и при репаративной регенерации, а также в условиях in vitro, представляются весьма актуальными. Однако вопрос о клеточных источниках развития самих звёздчатых клеток до сих пор нерешён. Помимо мезенхимного, в литературе обсуждается как энтодермальное (Vassy et al., 1993; Suskind, Muench, 2004), так и нейральное (Geerts, 2001; Friedman, 2008) происхождение этих клеток. Детальное изучение фенотипа звёздчатых клеток печени в пренатальном онтогенезе позволит прояснить накопившиеся противоречия.

Еще один чрезвычайно важный вопрос, на который и сегодня нет однозначного ответа, – это вопрос о развитии внутрипечёночных желчных протоков. Причиной этого, по сути, является нерешённость проблемы, связанной с клеточными источниками развития холангиоцитов. Для её решения требуется детальный сравнительный анализ фенотипов предполагаемых клеток-предшественниц на разных этапах пренатального онтогенеза человека. Кроме того, поскольку желчные протоки являются важнейшим, но не единственным компонентом портальной системы печени, очевидно, что их развитие вряд ли может происходить независимо от развития кровеносных сосудов портальных трактов – воротной вены и печёночной артерии. Однако до сих пор взаимодействия портальных структур  друг с другом в процессе развития исследованы крайне недостаточно (Shiojiri, Nagai, 1992; Libbrecht et al., 2002; Lemaigre, 2003; Roskams, Desmet, 2008). Поэтому весьма актуальным представляется изучение формирования внутрипечёночных желчных протоков во взаимосвязи с развитием кровеносных сосудов портальных трактов. Понимание источников и  закономерностей формирования внутрипечёночного билиарного русла позволит прояснить механизмы развития врождённых атрезий и мальформаций желчных протоков, а изучение развития и регенерации печени с позиций поиска её стволовой клетки откроет наиболее перспективные направления разработки принципиально новых методов терапии хронических диффузных заболеваний печени с использованием клеточных технологий.

Работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки РФ (госконтракт 16.512.11.2101), РФФИ (гранты 04-04-49164-а; 09-04-97013-р_поволжье_а) и фонда НИОКР РТ (грант 03-3.1-6/2006 (Г)).

Цель исследования:

Установить закономерности дифференцировки основных клеточных типов печени (гепатоцитов, холангиоцитов и синусоидных клеток), выяснить возможные клеточные источники их развития и значение в этом процессе мезенхимных клеток, а также ключевые этапы формирования сосудистых систем печени в пренатальном и раннем постнатальном онтогенезе и в ходе репаративной регенерации печени человека и крысы.

Задачи исследования:

  1. Выяснить основные фенотипические характеристики эпителиальных и мезенхимных клеток человека, участвующих в первичной и вторичной печёночной индукции, и установить сроки мезенхимально-эпителиальных взаимодействий в процессе вторичной печёночной индукции.
  2. Установить, какие типы синусоидных клеток печени человека могут развиваться из мезенхимных клеток поперечной перегородки и вентральной брыжейки желудка.
  3. На основании иммуногистохимического анализа экспрессии белков, специфичных для мезенхимных и эпителиальных клеточных типов печени человека, установить, проявляют ли какие-либо из мезенхимных клеток  признаки дифференцировки в эпителий в пренатальном онтогенезе. Установить возможность дифференцировки выявленных клеточных популяций, изолированных из печени крысы, в гепатоциты in vitro.
  4. Установить, какие клеточные типы способны экспрессировать маркёры стволовых клеток в процессе пренатального и раннего постнатального  развития печени человека и в ходе репаративной регенерации печени человека и крысы.
  5. Выяснить, какие клеточные типы образуют микроокружение для дифференцирующихся эпителиальных клеток и клеток кроветворных островков в пренатальном гистогенезе печени человека.
  6. Охарактеризовать фенотипы дифференцирующихся и зрелых эпителиальных клеток печени человека (гепатобластов/гепатоцитов, холангиобластов/холангиоцитов) и сроки приобретения ими дефинитивного фенотипа в пренатальном онтогенезе.
  7. Установить участие процессов пролиферации, апоптоза и миграции клеток при формировании протоковой пластинки и внутрипечёночных желчных протоков в пренатальном онтогенезе человека и в ходе репаративной регенерации печени человека и крысы.
  8. Изучить с помощью специфических маркёров сроки появления эндотелиальных клеток в печени эмбрионов и плодов человека и проследить динамику изменений фенотипа данных клеток в пренатальном онтогенезе.
  9. Установить этапы дифференцировки внутрипечёночных кровеносных сосудов (воротной и центральной вен, печёночной артерии) путём изучения экспрессии маркёров эндотелиальных и гладкомышечных клеток и провести анализ взаимодействий между развивающимися кровеносными сосудами и желчными протоками в пренатальном онтогенезе человека.

Научная новизна. В работе установлены новые данные о динамике  экспрессии маркёров отдельных клеточных популяций в печени человека в ходе пренатального онтогенеза, которые позволили охарактеризовать закономерности формирования дефинитивного фенотипа эпителиальных и синусоидных клеток печени и возможные клеточные источники их развития. Результаты исследования показали, что в развивающейся печени человека все клетки могут быть разделены на группы в зависимости от продолжительности их дифференцировки: 1) клетки, приобретающие дефинитивный фенотип быстро, в течение 1-4 недель (эпителий желчного пузыря, эндотелиальные и гладкомышечные клетки сосудов); 2) клетки, приобретающие дефинитивный фенотип в течение длительного срока (8-10 недель) и в ряде случаев экспрессирующие в процессе дифференцировки белки, нехарактерные для них в зрелом состоянии (гепатоциты, холангиоциты, звёздчатые клетки печени, мезотелиальные клетки капсулы печени).

Впервые установлено, что эмбриональные гепатобласты человека имеют общие фенотипические признаки как с окружающими печень мезенхимными клетками и звёздчатыми клетками печени (десмин, цитокератины (cytokeratin, СК) 18 и 19), так и с энтодермальными эпителиальными клетками передней кишки (СК18 и СК19, эпителиальный специфический антиген (ESA)), что может указывать на возможность развития эпителиальных клеток печени (гепатоцитов и холангиоцитов) из двух источников – энтодермы и мезодермы. Кроме того, было продемонстрировано, что клетки мезенхимы вентральной брыжейки и звёздчатые клетки печени имеют практически идентичный фенотип, что позволяет говорить о происхождении последних именно из мезенхимы, а не из других источников. Сами же звёздчатые клетки печени – единственный клеточный тип, имеющий сходные с эмбриональными гепатобластами фенотипические признаки (десмин, СК18 и СК19) и экспрессирующий маркёры стволовых/прогениторных клеток в пренатальном периоде (Bcl-2) и в процессе репаративной регенерации (C-kit).

Данный факт, наряду с впервые установленной нами возможностью дифференцировки десмин-позитивных звёздчатых клеток крысы в гепатобласты/гепатоциты in vitro, позволяет рассматривать именно этот клеточный тип в качестве основного кандидата на роль региональной стволовой клетки печени. Принципиально новым является то, что основным фактором, определяющим возможность дифференцировки звёздчатых клеток в гепатоциты в культуре, является образование монослоя, то есть установление плотных межклеточных контактов между клетками. Стволовые потенции звёздчатых клеток крысы подтверждают и полученные нами экспериментальные данные, демонстрирующие способность этих клеток экспрессировать рецептор к фактору стволовых клеток C-kit в ходе регенерации печени, вызванной токсическим воздействием нитрата свинца или частичной гепатэктомией.

В работе впервые показано, что популяция эпителиальных клеток печени человека с самых ранних этапов эмбрионального развития неоднородна по форме, размерам и способности экспрессировать СК18 и СК19, что свидетельствует о раннем разделении путей дифференцировки гепатоцитов и холангиоцитов. Установлены последовательность, основные этапы и сроки формирования дефинитивного фенотипа гепатоцитов и клеток внутрипечёночных желчных протоков. Критическим для развития гепатоцитов является период с 3-й до 8-й недели гестации (НГ), когда они, выселяясь из передней кишки, утрачивают способность экспрессировать характерный для кишечного эпителия эпителиальный мембранный антиген (ЕМА) и транзиторно экспрессируют ряд маркёров, которые отсутствуют в зрелых гепатоцитах (десмин, C-met, C-kit, ESA). После 8-й НГ экспрессия этих маркёров в большинстве гепатобластов существенно снижается, тогда как экспрессия специфических для гепатоцитов гепатоцитарного специфического антигена (HSA) и CD66a интенсивно нарастает. Несомненно, к новым следует отнести данные о центрах дифференцировки гепатоцитов в течение различных периодов онтогенеза. Так, если на ранних этапах ключевым фактором для запуска дифференцировки гепатоцитов является взаимодействие между гепатобластами и десмин-позитивными клетками мезенхимы поперечной перегородки и вентральной брыжейки желудка, а затем звёздчатыми клетками печени, и этот процесс наиболее активно происходит на периферии печени, то в последующем центры дифференцировки гепатоцитов смещаются к кровеносным сосудам.

Впервые показано, что критическим для дифференцировки холангиоцитов человека является период с 5-й по 13-ю НГ, когда эти клетки, расположенные среди гепатобластов, впервые можно отличить от последних по морфологии и набору выявляемых маркёров. Так, для них, в отличие от гепатобластов, не характерно присутствие десмина, C-met, HSA и CD66a. Установлено, что первые дифференцированные холангиоциты, экспрессирующие ЕМА и СК7, появляются при образовании просвета протоков на 12-13-й НГ, что на 2 месяца раньше, чем считалось ранее (Van Eyken et al., 1988). Впервые показано, что микроокружение для дифференцирующихся холангиобластов у человека образуют десмин-позитивные звёздчатые клетки, а не миофибробласты портальных трактов. Становление системы внутрипечёночных желчных протоков связано с формированием кровеносных сосудов портального тракта. Так, формирование протоковой пластинки начинается сразу после появления фенотипических отличий между афферентными и эфферентными венами внутри печени на фоне формирования системы воротной вены, а ремоделирование протоковой пластинки и образование первых желчных протоков неразрывно связано с предшествующим этому появлением в печени артериальных сосудов и формированием портальных трактов.

В проведённом исследовании впервые установлено, какие клеточные типы в развивающейся печени человека проявляют признаки стволовых клеток. Оказалось, что на разных этапах развитиях такие свойства можно выявить у весьма широкого круга клеток. Однако только звёздчатые клетки печени и сами гепатоциты сохраняют такую способность практически на всем протяжении пренатального развития, и именно эти клетки проявляют свойства прогениторных в ходе репаративной регенерации печени у человека и у крысы, экспрессируя C-kit, что позволяет говорить о возможности существования в печени как минимум двух типов региональных стволовых клеток – гепатоцитов и звёздчатых клеток.

Важнейшим фактом, установленным в результате исследования, стало то, что микроокружение кроветворных островков в первую очередь представлено десмин-позитивными звёздчатыми клетками печени.

Теоретическая и практическая значимость. Проведённые исследования позволили получить новые факты, которые раскрывают закономерности гистогенеза и межклеточных взаимодействий между эпителиальными и мезенхимными клетками печени в ходе пренатального развития печени человека. Фенотипическая характеристика дифференцирующихся и зрелых клеток развивающейся печени будет иметь несомненное значение для изучения процессов регенерации и канцерогенеза печени человека, а так же при проведении экспериментов in vitro, поскольку позволит выявлять и отличать клетки, имеющие разную степень дифференцированности. Данные сведения имеют и практическое значение для диагностики заболеваний печени и прогнозирования возможности развития первичного рака печени и/или степени его злокачественности.

Полученные в ходе исследования факты, указывающие на возможность развития эпителиальных клеток печени человека как из эпителия передней кишки, так и из мезенхимных клеток поперечной перегородки и вентральной брыжейки, позволяют внести коррективы в устоявшуюся теорию развития печени, рассматривающую в качестве клеточного источника развития гепатоцитов только эпителий кишки. Кроме того, и наиболее распространённая теория развития внутрипечёночных желчных протоков – теория трансформации – также нуждается в коррекции. С учётом полученных фактов сегодня вряд ли можно говорить о трансформации гепатобластов в холангиоциты. Более вероятным представляется другая последовательность событий: энтодермальная эпителиальная клетка-предшественница из передней кишки на самых ранних этапах развития печени (не позднее 4-й-5-й НГ) даёт начало двум популяциям: клеткам-предшественницам гепатоцитов (гепатобластам) и клеткам-предшественницам холангиоцитов (холангиобластам, сначала образующим протоковую пластинку, а затем – собственно желчные протоки). Кроме того, проведённый анализ развития внутрипечёночных желчных протоков и кровеносных сосудов свидетельствует о необходимости афферентного кровотока для формирования холангиоцитов и желчных протоков, что позволяет по-новому взглянуть на механизмы развития билиарной системы печени и приблизиться к пониманию причин развития атрезий внутрипечёночных желчных протоков.

Чрезвычайно важными как с теоретической, так и с практической точки зрения являются результаты комплексных исследований по выявлению клеточных популяций печени, обладающих свойствами  стволовых клеток, которые позволили выделить звёздчатые клетки печени в качестве главных претендентов на роль региональной стволовой клетки печени. Совокупность полученных данных о значении звёздчатых клеток для дифференцировки гепатоцитов, холангиоцитов и кроветворных клеток позволяет по-другому взглянуть на биологию этой популяции синусоидных клеток и рассматривать их не только как депо ретиноидов и основной источник компонентов межклеточного матрикса, но, в первую очередь, как ключевой элемент в морфогенезе и регенерации печени. Имеющиеся на сегодняшний день данные о морфологии и физиологии звёздчатых клеток печени позволяют перейти к экспериментам по моделированию применения данного клеточного типа в качестве стволовых клеток для терапии различных заболеваний и повреждений печени.

Внедрение результатов исследования. Полученные данные о закономерностях экспрессии фенотипических и линейных маркёров различными клеточными типами печени человека используются в качестве диагностических и прогностических критериев в работе гастроэнтерологического отделения Республиканской клинической больницы МЗ РТ и отделения вирусных гепатитов Республиканской клинической инфекционной больницы МЗ РТ в морфологической диагностике хронических заболеваний печени. В ходе проведения данного исследования был модифицирован ряд методов иммуногистохимического выявления антигенов, и эти модификации внедрены в исследовательскую работу кафедры нормальной анатомии и кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии Казанского государственного медицинского университета, а также в работу лаборатории Регионального центра коллективного пользования физико-химических исследований веществ и материалов (РЦКП ФХИ) при Казанском (Приволжском) федеральном университете.

       Материалы диссертации включены в лекционные курсы для студентов кафедр гистологии, нормальной анатомии, инфекционных болезней и детских инфекционных болезней Казанского государственного медицинского университета, слушателей цикла повышения квалификации «Молекулярная и клеточная медицина» Казанского государственного медицинского университета и курсантов кафедры инфекционных болезней Казанской государственной медицинской академии.

Апробация работы состоялась на совместном научном заседании сотрудников кафедр нормальной анатомии, гистологии, цитологии и эмбриологии Казанского государственного медицинского университета (10 января 2012 года).

               Материалы диссертации доложены и обсуждены на: итоговой научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых учёных, посвящённой 40-летию КГМА (Кемерово, 1996); II-IV Республиканских  конференциях молодых учёных и специалистов (Казань, 1996, 1997, 2001); IV Всероссийской научной конференции «Влияние антропогенных факторов на структурное состояние органов, тканей и клеток организма человека и животных» (Казань, 1997); II Российской научно-практической конференции с международным участием «Гепатиты В, С, D и G – проблемы диагностики, лечения и профилактики» (Москва, 1997, 1999); Съезде физиологов Сибири (Новосибирск, 1997); научной конференции, посвящённой 35-летию ЦНИЛ КГМУ (Казань, 1997); конференции молодых учёных России с международным участием, посвящённой 240-летию ММА им. И.М.Сеченова (Москва, 1998); международных симпозиумах «Progress in basic, applied and diagnostic histochemistry» (Братислава, 1995, 1998); IV, VIII, IX, XIV, XVI Российских конференциях «Гепатология сегодня» (Москва, 1999, 2003, 2004, 2009, 2011); IV Съезде Российских морфологов с международным участием (Ижевск, 1999); XI международном конгрессе по заболеваниям печени (Базель, 1999); XI и XIII  международных конгрессах по гистохимии и цитохимии (Йорк, 2000; Сан-Диего, 2004); XVIII Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Казань, 2001); научно-производственной конференции по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии (Казань, 2001); XXXVII, XXXXIV-XXXXVI встречах Европейской ассоциации по изучению печени (Мадрид, 2002; Копенгаген, 2009; Вена, 2010; Берлин, 2011); VI конгрессе международной ассоциации морфологов (Уфа, 2002); V общероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (Казань, 2004); XII, XIII международных гепатологических неделях (Фрайбург, 2003, 2006); I-IV международных конгрессах по гастроэнтерологии (Фрайбург, 2004, 2010; Дрезден, 2007; Майнц, 2008); XVI конгрессе международной федерации анатомических обществ (Киото, 2004); Всероссийской научной конференции с международным участием, посвящённой 10-летию медицинского факультета и кафедры анатомии и гистологии человека БелГУ (Белгород, 2006); Британско-Российском совещании в сотрудничестве с Европейской комиссией по стволовым клеткам (Москва, 2007); научно-практической конференции, посвящённой 100-летию со дня рождения профессора Л.И. Фалина (Санкт-Петербург, 2007); объединённой европейской гастронеделе (Вена, 2008); международной конференции европейской ассоциации по изучению печени (Будапешт, 2009); Всероссийской школе-конференции «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования» (Москва, 2009); 10-м юбилейном съезде научного общества гастроэнтерологов России (Москва, 2010); IV Всероссийском симпозиуме с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (Санкт-Петербург, 2010); III Международном симпозиуме «Актуальные вопросы клеточных технологий» (Москва, 2010); II Международной научно-практической конференции «Достижения, инновационные направления, перспективы развития и проблемы современной медицинской науки, генетики и биотехнологий» (Екатеринбург, 2011), международной Интернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии» (Казань, 2011).

Положения, выносимые на защиту

  1. Гепатоциты человека развиваются из двух клеточных источников:  энтодермального эпителия передней кишки и десмин-позитивных клеток мезенхимы поперечной перегородки и вентральной брыжейки и их потомков – звёздчатых клеток печени, имеющих смешанный мезенхимально-эпителиальный фенотип и экспрессирующих маркёры стволовых клеток. Звёздчатые клетки печени крысы проявляют свойства прогениторных клеток печени также в процессе её репаративной регенерации, экспрессируя C-kit, и способны дифференцироваться в гепатоциты in vitro в чистой культуре при образовании монослоя.
  2. Разделение путей дифференцировки потомков общей эпителиальной кишечной клетки-предшественницы на две клеточные линии – гепатоциты и холангиоциты – происходит в течение первой недели после закладки печени человека, когда в ней выделяются две популяции эпителиальных клеток, отличающихся размерами, формой и экспрессией фенотипических маркеров (СК19, десмин, C-met, CD66a, HSA, ЕМА, СК7). При этом основным клеточным типом, образующим микроокружение для дифференцирующихся гепатобластов и холангиобластов, а также кроветворных стволовых клеток, являются мезенхимные десмин-позитивные клетки поперечной перегородки и вентральной брыжейки и звёздчатые клетки печени.
  3. Формирование системы внутрипечёночных желчных протоков у человека связано с развитием афферентных кровеносных сосудов: дифференциация ветвей воротной вены и центральных вен предшествует формированию протоковой пластинки, затем в печень прорастают ветви печёночной артерии, после чего начинается перестройка протоковой пластинки, приобретение холангиобластами дефинитивного фенотипа и их миграция в мезенхиму портального тракта и вдоль афферентных кровеносных сосудов. У человека и у крысы основными механизмами восстановления внутрипечёночных желчных протоков после повреждения являются пролиферация холангиоцитов и ветвление протоков одновременно с ветвлением внутрипечёночных  кровеносных сосудов.

Публикации результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 86 научных работ, в том числе 17 статей в ведущих российских научных рецензируемых журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией для публикации результатов научных исследований. Общий объём публикаций – 12,16 условно печатных листа, в т.ч. авторский вклад – 8,99 условно печатных листа.

Личное участие диссертанта. Приведённые в работе данные получены при личном участии соискателя на всех этапах работы, включая составление плана исследования, постановку задач, выбор методов исследования, проведение экспериментов, забор материала для исследования и его обработку, анализ экспериментальных данных. Автор провел подбор и анализ литературы, определил и применил наиболее адекватные условия проведения экспериментов, методы, позволяющие решить поставленные задачи. Теоретическое обобщение результатов исследования, их анализ и оформление, публикации результатов исследования, формулирование выводов и рекомендаций также проведены лично диссертантом.

Объём и структура диссертации. Работа изложена на 364 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, включающего 511 источников: 33 отечественных и 478 иностранных. Диссертация содержит 136 рисунков и 4 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

материалы и методы исследования

В соответствии с целями и задачами работы закономерности дифференцировки различных клеточных типов печени в гисто- и органогенезе печени человека и крысы были изучены в комплексе с изменениями фенотипа основных клеточных типов печени в процессе репаративной регенерации печени при хронических гепатитах у человека и на двух моделях регенерации у крысы – после частичной гепатэктомии (ЧГ) и после токсического повреждения нитратом свинца (НС). В условиях in vitro была проверена выдвинутая в процессе выполнения работы гипотеза о возможной принадлежности звёздчатых клеток печени к региональным стволовым клетках этого органа.        

При выполнении работы были использованы гистологические методы, методы культивирования клеток, иммуноцито- и гистохимические методы (Полак, Ван Норден, 1987; Угрюмов, 1991; Киясов, 1998). Проведение исследований одобрено Республиканским комитетом по этическим вопросам при проведении клинических испытаний-исследований лекарственных средств при Министерстве здравоохранения Республики Татарстан (протоколы № 2 от 21.02.2006, № 3 от 04.04.2006, № 3 от 21.03.11).

1. Изучение пренатального и раннего постнатального онтогенеза человека проведено на эмбриональном, плодовом и аутопсийном материале печени человека первых месяцев жизни (пациентов, умерших от причин, не связанных с патологией печени). Материал для исследования был получен в результате легальных медицинских абортов, самопроизвольных выкидышей и индуцированных преждевременных родов по медицинским показаниям на сроках от 3,5 до 36-ти НГ. Для определения сроков гестации измеряли теменно-копчиковый размер и длину эмбриона/плода, срок гестации определяли по таблицам (Фалин, 1976) с учётом анамнеза. До 14-ти НГ включительно интервал между сроками гестации материала, полученного для исследования, составил 3-4 дня, на более поздних сроках – 1-2 недели. На каждом сроке было изучено не менее трёх образцов. Ткани фиксировали в формалине и заливали в парафин по стандартной методике (Меркулов, 1961). Парафиновые срезы окрашивали гематоксилин-эозином и иммуногистохимически с использованием антител к различным антигенам (таблица).

2. Изучение пренатального и раннего постнатального онтогенеза крысы проведено на крысах линии Вистар, находящихся на стандартном рационе вивария и имеющих свободный доступ к воде. Для получения датированной беременности самок подсаживали на ночь к самцам. День обнаружения спермиев во влагалищных мазках считали первым днём беременности (Бакунина, 1975). Начиная с 14-х суток гестации, крыс декапитировали под эфирным наркозом, у плодов извлекали печень. Кроме печени плодов, для исследования брали печень новорождённых, 1-, 3-,  6-, 8-, 9-, 11-, 13-, 14-дневных крысят и взрослых крыс (не менее трёх животных на каждом сроке развития). Кусочки органов замораживали в жидком азоте и готовили криостатные срезы. Срезы окрашивали иммуногистохимически (таблица).

3. Изучение регенерации печени человека проведено на 221 образце ткани печени, полученном с помощью прижизненной пункционной биопсии печени больных хроническими гепатитами различной этиологии (хронические вирусные гепатиты В и С, хронический алкогольный гепатит) биопсийными иглами типа Менгини (Подымова, 1993) в Республиканской клинической больнице РТ1. Биоптаты печени фиксировали в формалине и заливали в парафин, как описано выше. Парафиновые срезы печени человека окрашивали гематоксилин-эозином и иммуногистохимически (таблица).

4. Изучение регенерации печени крысы на модели частичной гепатэктомии2 было проведено на 15 белых беспородных крысах-самцах весом 180-220 г, находящихся на стандартном рационе вивария и имеющих свободный доступ к воде. Операция ЧГ печени проведена в условиях операционной под эфирным наркозом по методике Хиггенса и Андерсона (Higgins, Anderson, 1931) с небольшими модификациями в интервале между 9-ю и 12-ю часами дня для исключения суточных колебаний митотической активности клеток печени (Беляева, 1973). Удалённые во время операции доли печени взвешивали, фотографировали и использовали  в

Таблица

Антитела и визуализационные системы, использованные в работе

Антиген,

краткая характеристика

Эксперименты

Клон, разведение, фирма-производитель

1

2

3

Первичные антитела

Виментин – белок промежуточных филаментов цитоскелета мезодермальных клеток

Онтогенез (человек)

Культура клеток крысы

Клон 3В4, 1:75

DAKO, Denmark

Коллаген I – белок межклеточного матрикса

Культура клеток крысы

Кроличьи поликлональные, 1:20

Sanbio, Netherlands

Коллаген III – белок межклеточного матрикса

Культура клеток крысы

Кроличьи поликлональные, 1:20

Sanbio, Netherlands

Коллаген IV – белок межклеточного матрикса

Культура клеток крысы

Кроличьи поликлональные, 1:20

Sanbio, Netherlands

Ламинин – белок межклеточного матрикса

Культура клеток крысы

Кроличьи поликлональные, 1:50

Sanbio, Netherlands

Десмин – белок промежуточных филаментов цитоскелета мышечных клеток, маркёр звёздчатых клеток печени

Онтогенез (человек)

Регенерация (человек, крыса)

Культура клеток крысы

Клон D33, 1:30-1:40

DAKO, Denmark

Цитокератин 18 – белок промежуточных филаментов цитоскелета эпителиальных клеток (гепатоциты, холангиоциты)

Онтогенез (человек)

Культура клеток крысы

Клон DC10, 1:20

DAKO, Denmark

Цитокератин 8 – белок промежуточных филаментов цитоскелета эпителиальных клеток (гепатоциты, холангиоциты)

Культура клеток крысы

Клон 4.1.18, 1:5

Boehringer, Germany

Цитокератин 19 – белок промежуточных филаментов цитоскелета эпителиальных клеток (холангиоциты, гепатобласты, овальные клетки)

Онтогенез (человек)

Регенерация (человек, крыса)

Клон BA17, 1:20 

DAKO, Denmark

Онтогенез (крыса)

Культура клеток крысы

Клон 170.2.4, 1:10

Boehringer, Germany

Онтогенез (крыса)

Регенерация (крыса)

Клон LP2K 1:10

Amersham, UK

Цитокератин 7 – белок промежуточных филаментов цитоскелета эпителиальных клеток (холангиоциты)

Онтогенез (человек)

Регенерация (человек)

Клон OVTL12/30, 1:20

DAKO, Denmark

Онтогенез (крыса)

Регенерация (крыса)

Клон Ks7.18, 1:5

Boehringer, Germany

Поли-цитокератины – белки промежу-точных филаментов цитоскелета эпителиальных клеток

Онтогенез (крыса)

Кроличьи поликлональные 1:400

DAKO, Denmark

ESA – эпителиальный специфический антиген

Онтогенез (человек)

Регенерация (человек)

Клон VU-1D9, 1:50

Novocastra, UK

1

2

3

EMA – эпителиальный мембранный антиген

Онтогенез (человек)

Клон GF1.4, 1:200

Novocastra, UK

HSA – специфический антиген гепатоцитов

Онтогенез (человек)

Клон OCH1E5, 1:50

Novocastra, UK

CD66a – билиарный гликопротеин

Онтогенез (человек)

Клон 29H2, 1:50

Novocastra, UK

-ФП (-фетопротеин) – секреторный протеин гепатобластов

Культура клеток крысы

Клон С3, 1:50

Novocastra, UK

А-ГМА (-гладкомышечный актин) – маркёр миофибробластов, гладкомышечных клеток

Онтогенез (человек, крыса)

Регенерация (человек, крыса) 

Культура клеток крысы

Клон 1A4, 1:50 

DAKO, Denmark

Кальпонин – функциональный протеин гладкомышечных клеток

Онтогенез (человек)

Клон Calp 1:75

Novocastra, UK

CD31 – маркёр эндотелия

Онтогенез (человек)

Клон 1A10

1:20

Novocastra, UK

CD34 – маркёр кроветворных стволовых клеток и эндотелия

Онтогенез (человек)

Клон QBEnd/10

1:75

Novocastra, UK

CD117 (C-kit) – рецептор к фактору стволовых клеток, маркёр стволовых и прогениторных клетки

Онтогенез (человек)

Регенерация (человек, крыса) 

Клон T595, 1:20

Novocastra, UK

CD133 – маркёр стволовых клеток

Онтогенез (человек)

Клон mAbcam27699, 1:100, Abcam, UK

C-met – рецептор к фактору роста гепатоцитов, рассеивающий фактор

Онтогенез (человек)

Регенерация (человек)

Клон 8F11, 1:15

Novocastra, UK

Bcl-2 – анти-апоптозный белок, маркёр стволовых и опухолевых клеток

Онтогенез (человек)

Клон 124, 1:15

DAKO, Denmark

Bcl-rambo – маркёр апоптоза

Онтогенез (человек)

Клон 13E6, 1:50

Novocastra, UK

PCNA – ядерный антиген пролиферирующих клеток

Онтогенез (человек)

Регенерация (крыса)

Клон PC10, 1:100

DAKO, Denmark

Макрофагальный антиген – маркёр тканевых макрофагов и моноцитов крови

Онтогенез (человек)

Клон LN-5, 1:50

Novocastra, UK

Визуализационные системы

Иммуноглобулины кролика к иммуно-глобулинам мыши – вторичные антитела, меченые пероксидазой

Онтогенез (крыса)

Регенерация (крыса)

Культура клеток крысы

1:100, DAKO, Denmark

Иммуноглобулины свиньи к иммуно-глобулинам кролика – вторичные антитела, меченые пероксидазой

Онтогенез (крыса)

Культура клеток крысы

1:100

DAKO, Denmark

Иммуноглобулины кролика к иммуно-глобулинам мыши – вторичные антитела (часть системы меченых иммунных комплексов щелочная фосфатаза/анти-щелочная фосфатаза)

Онтогенез (крыса)

1:25, DAKO, Denmark

1

2

3

Мышиный комплекс ЩФАЩФ – комплекс щелочной фосфатазы с моноклональными мышиными антителами к щелочной фосфатазе (часть системы меченых иммунных комплексов щелочная фосфатаза/анти-щелочная фосфатаза)

Онтогенез (крыса)

Клон  АР7/6/7, 1:50

DAKO, Denmark

LSAB2 – визуализационная система, меченая пероксидазой

Онтогенез (человек)

Регенерация (человек, крыса)

Готовые к использованию

DAKO, Denmark

Novolink Polymer Detection System – визуализационная система, меченая пероксидазой

Онтогенез (человек)

Регенерация (человек, крыса)

Готовые к использованию

Novocastra, UK

Novolink Polymer Detection System – визуализационная система, меченая щелочной фосфатазой

Онтогенез (человек)

Регенерация (человек, крыса)

Готовые к использованию

Novocastra, UK

Catalyzed Signal Amplification (CSA) System – визуализационная система, меченая пероксидазой

Онтогенез (человек)

Регенерация (человек, крыса)

Готовые к использо-ванию

DAKO, Denmark

Catalyzed Signal Amplification (CSA) System – визуализационная система, меченая щелочной фосфатазой

Онтогенез (человек)

Регенерация (крыса)

Готовые к использо-ванию

DAKO, Denmark

качестве контроля. Объём удалённых долей составлял 68% от общего объёма печени.

Животных забивали под эфирным наркозом декапитацией через 1, 2, 3, 5, 7 суток после операции. После забоя у животных извлекали печень для морфологического исследования. Кусочки ткани печени фиксировали в формалине, обезвоживали  и  заливали в  парафин, как описано выше. Парафиновые срезы печени крысы окрашивали гематоксилин-эозином и иммуногистохимически (таблица). Также было проведено двойное иммуногистохимическое окрашивание для выявления экспрессии С-kit и десмина.

       5. Изучение регенерации печени крысы на модели токсического повреждения НС было проведено на белых беспородных лабораторных крысах-самцах весом 180-210 г, находящихся на стандартном рационе вивария и имеющих свободный доступ к воде. НС растворяли в воде для инъекций и вводили внутривенно однократно в хвостовую вену в дозе 100 мкМ/кг веса животного (Shinozuka et al., 1994). Животным контрольной группы вместо раствора НС вводили внутривенно соответствующий объём растворителя. Чтобы исключить влияние суточных биологических ритмов на пролиферативные процессы, все инъекции НС были проведены в период с 9 до 12 ч утра (Беляева, 1973). Животных забивали под эфирным наркозом декапитацией через 1, 2, 3, 4, 5, 7 суток после введения НС или воды для инъекций. В каждой группе было не менее трёх животных. После забоя у животных извлекали для морфологического исследования печень. Для морфологического анализа часть ткани печени в виде кусочков размерами 4х4х5 мм замораживали в жидком азоте. Другую часть ткани печени фиксировали в формалине, обезвоживали  и  заливали в  парафин, как описано выше. Криостатные и парафиновые срезы печени человека окрашивали гематоксилин-эозином и иммуногистохимически3 (таблица). Также было проведено двойное иммуногистохимическое окрашивание для выявления экспрессии С-kit и десмина.

6. Эксперимент с чистой культурой звёздчатых клеток печени4

Звёздчатые клетки выделяли из печени крыс самцов весом 300-400 г, которые находились под нембуталовым наркозом (0,01 мл/100 г веса). Фракция синусоидных клеток была получена методом коллагеназо-проназной обработки печени (Knook et al., 1982; Alpini et al., 1994). Популяцию звёздчатых клеток печени получали в градиенте плотности найкоденса (Nycodenz, Nyegaard and Company AS, Oslo, Norway) (Gressner, Schafer, 1989) и помещали в 24-луночные планшеты (0,25х10 клеток/мл). На дне лунок находились покровные стекла. Жизнеспособность клеток составляла 90% при окрашивании с трепановым синим. Клетки культивировали в среде ДМЕМ, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, антибиотики и противогрибковые препараты. Планшеты находились во влажной среде СО2 инкубатора (5% СО2) при 37 С. Первую замену среды проводили через день, а затем каждые два дня. Клетки наблюдали в фазово-контрастном микроскопе. В первый день культивирования около 90% клеток содержали в своей цитоплазме капельки жира, что характерно для звёздчатых клеток печени. В момент замены культуральной среды часть покровных стёкол фиксировали в ацетоне для проведения иммуноцитохимических реакций. Культивирование клеток проводили до образования плотного единого монослоя. В ходе культивирования звёздчатых клеток печени крысы проводили гистохимическое выявление активности гамма-глутамилтранспептидазы (γ-ГТП) (Rutenberg et al., 1968).

В настоящей работе были использованы коммерческие моноклональные антитела (DAKO, Denmark; Novocastra, United Kingdom; Abcam, United Kingdom; Boehringer, Mannheim, Germany; Sanbio, Netherlands) к белкам, являющимся маркёрами различных клеточных типов печени (десмин, α-ГМА, цитокератины 7 и 19 и др.), стволовых и прогениторных клеток (CD34, CD117 (C-kit), CD133, Bcl-2 и др.), апоптоза (Bcl-rambo), а также антитела к ядерному антигену пролиферирующих клеток (Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA), позволяющие изучать пролиферативные процессы. Полный перечень использованных антител приведен в таблице. Для окрашивания были использованы: 1) непрямой иммунопероксидазный метод; 2) стрептавидин-биотиновый метод; 3) метод меченых иммунных комплексов; 4) метод меченых полимеров и их комбинации. В работе использованы вторичные антитела и визуализационные системы фирм DAKO (Denmark), Novocastra (United Kingdom). Для контроля специфичности иммуноцито- и гистохимических реакций производили замену первичных антител неиммунной сывороткой животного – донора первичных антител.

При окрашивании парафиновых срезов печени человека и крысы с антителами к большинству изучаемых антигенов была использована предварительная демаскировка антигенов методом HIAR (Нeat-Induced Antigen Retrieval) (Shi et al., 1991). В ходе изучения межклеточных взаимодействий между холангиоцитами и гладкомышечными клетками кровеносных сосудов было проведено двойное иммуногистохимическое окрашивание криостатных срезов плодов крысы на -ГМА и холангиолярные цитокератины. Двойное окрашивание парафиновых срезов печени эмбрионов и плодов человека было проведено в сочетаниях: СК18/десмин, СК19/десмин, ESA/десмин, HSA/десмин, Bcl-2/десмин, C-met/десмин, C-kit/десмин, CD34/десмин, СК18/CD34, СК19/CD34, HSA/CD34, ESA/CD34 и др. В процессе работы были оптимизированы методы двойного иммуногистохимического окрашивания. Микропрепараты после окрашивания фотографировали с помощью микроскопов Leica DMLS (аналоговая фотокамера Leica MPS32) и Leica DM1000 (цифровая фотокамера DFC290). 

Морфометрическими методами определяли число пролиферирующих холангиоцитов в процессе регенерации печени крысы, которое выражали в процентах от общего числа просчитанных клеток этого типа. Было исследовано не менее трёх срезов печени каждого животного. Подсчёт пролиферирующих холангиоцитов вели во всех перипортальных полях зрения. Статистический анализ результатов морфометрических исследований проводили с помощью табличного процессора MS Exel. Для оценки достоверности различий использовали t-критерий Стьюдента.

Результаты исследования и их обсуждение

       Проведённое в соответствии с поставленными задачами изучение фенотипов эпителиальных и мезенхимных клеток в области закладки печени в процессе эмбрионального развития человека позволило установить, что взаимодействие клеток мезенхимы вентральной брыжейки и поперечной перегородки (виментин+/десмин+/СК18+/СК19+/Bcl-2+/C-kit+) с эпителиальными клетками печёночного дивертикула, выселяющими из эпителия двенадцатиперстной кишки, продолжается до конца 7-й – начала 8-й НГ. В процессе выселения из кишки эпителиальные клетки меняют свой фенотип, утрачивая способность экспрессировать ЕМА, характерный для кишечного эпителия. Очевидно, что именно в период вторичной печёночной индукции влияние сигналов из мезенхимы на миграцию и дифференцировку эпителиальных клеток печени является самым важным, поэтому этот период является критическим этапом мезенхимально-эпителиальных взаимодействий. Более того, клетки мезенхимы вентральной брыжейки и поперечной перегородки не только оказывают индуктивные влияния на дифференцирующийся эпителий печени, но и сами могут являться клеточным источником для генерации этих клеток, поскольку экспрессируют эпителиальные маркёры, характерные для гепатоцитов и холангиоцитов – СК18 и СК19. Экспрессия мезенхимными клетками маркёров стволовых клеток Bcl-2, CD133 и C-kit также подтверждает их стволовые потенции. Таким образом, как минимум часть популяции мезенхимных клеток вентральной брыжейки и поперечной перегородки можно рассматривать как источник развития её основных эпителиальных клеток – гепатоцитов.

       Еще одним фенотипическим признаком мезенхимных клеток, окружающих печень, является экспрессия десмина. Поскольку десмин – признанный маркёр звёздчатых клеток печени, в частности, у грызунов (Yokoi et al., 1984), то можно предположить, что описанные десмин-позитивные мезенхимные клетки могут дифференцироваться не только в гепатобласты, но и в звёздчатые клетки печени.

Изучение фенотипа синусоидных клеток печени подтвердило наше предположение и позволило установить ряд новых фактов. Во-первых, можно утверждать, что синусоидные клетки, и, в частности, звёздчатые клетки, появляются в печени человека на 4-й неделе гестации, а не на 11-12-й неделе, как предполагалось ранее (Geerts, 2004). Во-вторых, впервые достоверно показано, что звёздчатые клетки печени человека экспрессируют десмин –  маркёр этих клеток у грызунов (Yokoi et al., 1984) – с момента их появления и до конца 14-й недели гестации, что позволяет рассматривать его у человека как фенотипический маркёр только незрелых звёздчатых клеток.

Большинство синусоидных клеток печени в эмбриональном периоде имело фенотип, соответствующий описанному нами выше фенотипу мезенхимных клеток (виментин+/десмин+/СК18+/СК19+/Bcl-2+/C-kit+). Поскольку десмин – маркёр только одного клеточного типа  в печени, а именно – звёздчатых клеток, становится очевидным, что источником развития последних являются десмин-позитивные клетки мезенхимы вентральной брыжейки и поперечной перегородки, что подтверждает предположения, сделанные ранее другими учёными (Rubbia-Brandt et al., 1997).

В ходе исследования нами был установлен ещё один тип клеток, экспрессирующий фенотип, сходный с фенотипом мезенхимных клеток и звёздчатых клеток печени, – мезотелиальные и субмезотелиальные клетки, которые, по мнению ряда авторов, являются источником развития звёздчатых клеток печени (Loo, Wu, 2008) и могут иметь отношение к мезенхимально-эпителиальным взаимодействиям и дифференцировке гепатобластов в процессе развития печени (Loo, Wu, 2008; Asahina et al., 2009). Установленное нами сходство фенотипических характеристик мезотелиальных/субмезотелиальных и звёздчатых клеток печени свидетельствует о связи между данными популяциями клеток и, таким образом, подтверждает предположения, высказанные ранее другими авторами.

Поскольку большинство мезенхимных клеток поперечной перегородки и вентральной брыжейки в период их взаимодействия с эпителием передней кишки составляют десмин-позитивные клетки (будущие звёздчатые клетки печени), именно этот клеточный тип и его клеточные предшественники представляют собой  важнейший фактор микроокружения, обеспечивающий гепатоцитарную дифференцировку эпителиальных клеток кишки. Высокая плотность десмин-позитивных звёздчатых клеток и их расположение в тесном контакте с дифференцирующимися гепатоцитами ранее были отмечены в пренатальной печени крысы (Vassy et al., 1993; Kiassov et al., 1995; Киясов и др., 1997). Важность межклеточных контактов между звёздчатыми клетками печени и эпителиальными клетками-предшественницами была подтверждена и in vitro (Nagai et al., 2002). Именно звёздчатые клетки печени вырабатывают многие важнейшие факторы, необходимые для такой дифференцировки, – фактор роста фибробластов, морфогенетический белок кости BMP, фактор роста гепатоцитов HGF (Gohda et al., 1986; Gohda et al., 1988; Weidner et al., 1991; Jung et al., 1999; Rossi et al., 2001; Sekhon et al., 2004) и другие факторы (Friedman, 2008). Они синтезируют фактор стволовых клеток (Fujio et al., 1994), рецептор к которому (C-kit) мы выявили на гепатобластах, что не только подтверждает значение данного сигнального пути для пролиферации и дифференцировки последних, но и участие в нём звёздчатых клеток печени. Таким образом, становится очевидным, что основным мезенхимным клеточным типом, оказывающим индуктивные влияния на дифференцировку эпителиальных клеток печени, сначала являются десмин-позитивные клетки поперечной перегородки, а затем их потомки – звёздчатые клетки печени.

Фенотип эпителиальных клеток закладки желчного пузыря с момента своего появления полностью соответствовал фенотипу эпителия передней кишки – СК18+/СК19+/ESA+/EMA+, что подтверждает его развитие путём инвагинации эпителия передней кишки. Что касается дифференцировки  гепатобластов, то с момента своего появления (3,5 НГ) они экспрессировали  СК18, СК19 и ESA, но, как уже было отмечено выше, при выселении из кишечного эпителия, прекращали экспрессировать ЕМА. Возможно, это связано с потерей полярности у выселяющихся клеток. В последующем, уже у зрелых гепатоцитов, на билиарном полюсе вновь появляется ЕМА. Экспрессия СК18 сохраняется в гепатобластах и гепатоцитах человека на всех этапах онтогенеза, то есть этот цитокератин является линейным маркёром данных клеток и поэтому не может быть использован для установления степени их дифференцированности. Экспрессия же гепатобластами СК19 и ЕSA оказалась транзиторной, она была характерна только для гепатобластов и отсутствовала в зрелых гепатоцитах. Наличие единичных СК19+ гепатоцитов в печени человека в первые месяцы жизни указывает на незрелость фенотипа этих клеток и, следовательно, на незавершённость морфогенеза печени к рождению. СК19+ или ESA+ паренхиматозные клетки были выявлены нами также в печени больных хроническими гепатитами, что указывает либо на изменение фенотипа зрелых гепатоцитов или, что более вероятно, на появление новых, не до конца дифференцированных, клеток из стволовых клеток в процессе репаративной регенерации.

Дифференцирующиеся гепатобласты человека, помимо маркёров эпителиальных клеток, экспрессируют целый ряд неэпителиальных маркёров, отсутствующих в эпителии передней кишки. Одним из них оказался десмин (4-5 НГ). Этот факт в сочетании с одновременной экспрессией мезенхимными и синусоидными клетками печени СК18 и СК19, по нашему мнению, указывает на родство этих клеточных популяций и возможность их развития из одного общего предшественника либо на развитие гепатобластов из десмин-позитивных звёздчатых клеток печени. Впервые такое предположение было высказано тогда, когда похожие результаты были получены при изучении пренатальной печени крысы (Киясов и др., 1997). Ещё одним общим маркёром для звёздчатых клеток и фетальных гепатобластов мыши и крысы является сосудистая молекула клеточной адгезии VCAM-1 (Kubota et al., 2007). Возможность мезенхимально-эпителиальной трансдифференцировки звёздчатых клеток, выделенных из печени взрослых крыс (Li et al., 2003; Sicklick et al., 2006; Jelnes et al., 2007), и экспрессия ими ряда маркёров стволовых клеток, таких как Thy-1 (Hoppo et al., 2004; Derzso  et al., 2007), CD133, Oct4 (Kordes et al., 2007), также подтверждают нашу гипотезу. Более того, мы установили, что звёздчатые клетки в онтогенезе печени человека экспрессируют еще один маркёр стволовых клеток – анти-апоптозный белок Bcl-2, а их мезенхимные клетки-предшественницы – C-kit, который появляется в звёздчатых клетках при регенерации печени крысы. Пространство Диссе, в котором располагаются звёздчатые клетки печени, может составлять микроокружение для последних, выполняя роль «ниши» стволовых клеток (Sawitza et al., 2009). Совокупность полученных нами данных в сочетании с результатами других авторов позволяет, таким образом, рассматривать звёздчатые клетки печени как региональные стволовые клетки печени, и сегодня правомерно говорить как минимум о двух возможных источниках развития гепатоцитов. Это, во-первых, энтодермальный эпителий передней кишки, а во-вторых – десмин-позитивные мезодермальные клетки поперечной перегородки и вентральной брыжейки желудка и их потомки – звёздчатые клетки печени.

Кроме десмина гепатобласты человека также экспрессируют маркёры стволовых клеток C-kit (4-8 НГ) и C-met – рецептор к фактору роста гепатоцитов (4-16 НГ). В регенерирующей печени больных хроническими гепатитами, а также крыс после ЧГ и химического повреждения НС были обнаружены как единичные, так и сгруппированные C-kit-позитивные гепатоциты, а экспрессия С-met отмечена в печени человека в мелких клетках воспалительного инфильтрата и в единичных гепатоцитах (в этих же зонах выявлены ESA+ клетки схожей морфологии). Экспрессия C-kit в гепатобластах в пренатальном онтогенезе и гепатоцитах при репаративной регенерации указывает в первую очередь на их высокую чувствительность к фактору стволовых клеток, а также на низкий уровень их дифференцированности и возможную принадлежность к категории прогениторных клеток. Таким образом, полученные нами результаты подтверждают теорию о том, что гепатоциты – это коммитированные унипотентные стволовые клетки, в норме покоящиеся, но способные к активации и продукции одного вида клеток. Наличие же клеток, экспрессирующих С-met, может указывать на вероятность дифференцировки гепатоцитов не только из эпителия, но и из клеток мезенхимы. Возможность подобной трансформации была показана in vitro (Tsarfaty et al., 1994), когда мезенхимные клетки, экспрессирующие С-met, образовывали трубчатые структуры, то есть становились эпителиальными. В экспериментах возможность образования гепатоцитов из клеток мезодермы во взрослом организме неоднократно была подтверждена другими исследователями (Petersen et al., 1999; Theise et al., 2000; Alison et al., 2000; Grompe, 2009). Полученные нами данные косвенно подтверждают такую возможность и у человека, причём как в онтогенезе, так и при репаративной регенерации. Об этом свидетельствует появление при регенерации одновременно с Cmet+ клетками ESA-позитивных клеток схожей морфологии, поскольку ESA может экспрессироваться эпителиальными клетками не только энтодермального, но и мезодермального генеза (Latza et al., 1990).

Первые гепатобласты, экспрессирующие специфический антиген гепатоцитов HSA, появляются на периферии печени человека после окончания 4-й НГ, а около крупных сосудов – на 6-й НГ. Далее число HSA+ гепатоцитов около сосудов значительно возрастает, а с конца 7-й НГ и далее в течение всей жизни все гепатоциты экспрессируют HSA. Дифференцировка билиарного полюса гепатоцитов начинается на сроке 4,5-5 НГ: первые CD66a+ гепатоциты появляются около крупных сосудов, и здесь их число максимально. В дальнейшем экспрессия этого антигена нарастает, и большинство желчных капилляров имеет просвет. После 12-ти НГ практически все гепатобласты формируют желчные капилляры и CD66a-позитивны. Экспрессия CD66a более интенсивна в перипортальных зонах по сравнению с перицентральными. Таким образом, маркёрами, указывающими на завершение дифференцировки гепатобластов в гепатоциты, являются СК18, HSA и CD66a – они появляются в гепатобластах c начала их дифференцировки (4-4,5 НГ), их экспрессия нарастает параллельно с дифференцированностью клеток и сохраняется в зрелых гепатоцитах на всех сроках индивидуального развития, т.е. присутствие этих маркёров характеризует фенотип зрелых гепатоцитов. Появление этих белков в гепатоцитах регенерирующей печени может быть использовано как показатель достижения ими полной морфологической дифференцировки и функциональной зрелости в ходе регенераторного процесса. Гепатобласты же транзиторно экспрессируют маркёры, указывающие на незрелость их фенотипа, – десмин, C-met, C-kit, ESA, СК19. Их экспрессия уменьшается и прекращается по мере дифференцировки клеток. Таким образом, признаком дифференцированного состояния гепатоцитов кроме интенсивной экспрессии HSA и CD66a можно считать также отсутствие экспрессии десмина, C-met, C-kit, ESA и CK19.

Если рассматривать вопрос о бипотентности гепатобластов, то результаты наших исследований показали разнородность популяции гепатобластов с самых ранних этапов развития печени человека. Уже на сроке 4 НГ в  ней можно выделить как минимум две субпопуляции эпителиальных клеток, отличающиеся размерами, формой и интенсивностью экспрессии СК19 и СК18. Поскольку СК19 является маркёром в первую очередь клеток внутрипечёночных желчных протоков, логично предположить, что мелкие вытянутые клетки, наиболее интенсивно экспрессирующие этот цитокератин, могут быть названы предшественницами будущих холангиоцитов – холангиобластами. Термин же «гепатобласты», по-видимому, целесообразно использовать только для описания клеток-предшественниц гепатоцитов. Тот факт, что через 1-2 недели (5,5-6 НГ) часть описанных клеток (холангиобластов) группируется вдоль линий, соединяющих кровеносные сосуды, также подтверждает наше предположение – очевидно, они «выстраиваются» вдоль оси будущего ацинуса. Интересно, что холангиобласты сохраняются в паренхиме печени как минимум до конца 15-й НГ, по-видимому являясь источником дифференцировки холангиоцитов для формирующихся протоковых пластинок и внутрипечёночных желчных протоков.

Самым ранним сроком пренатального развития человека, когда можно визуализировать структуры, напоминающие протоковую пластинку, является 6-я НГ, а не 8-я, как было описано ранее (Blankenberg et al., 1991). Именно в это время впервые можно видеть усиление градиента экспрессии ESA, СК18 и СК19 в гепатобластах по направлению ко всем сосудам печени. После 7-8-й НГ формировалась истинная протоковая пластинка, клетки которой имели веретенообразную форму и меньшие, чем гепатобласты размеры, тогда как ранее их описывали как уплощенные кубические эпителиальные клетки (Van Eyken et al., 1988; Blankenberg et al., 1991). Протоковая пластинка быстро становилась двухслойной. С середины 12-й НГ и далее в течение всего пренатального развития клетки протоковой пластинки выселялись и мигрировали вдоль кровеносных сосудов. При этом были хорошо видны канальцы Геринга, клетки которых также интенсивно экспрессировали СК18, СК19, ESA. Выявленная миграция клеток по ходу кровеносных сосудов свидетельствует о том, что одним из механизмов развития внутрипечёночных желчных протоков является их прорастание вглубь долек. В это время в области ворот печени впервые можно видеть желчные протоки, имеющие сформированный просвет и окружённые мезенхимой портальных трактов. Ещё через 2 недели сформированные желчные протоки с просветом появлялись внутри железы в образующихся портальных трактах. Обращает на себя внимание тот факт, что вокруг мелких ветвей воротной вены в это время ещё не было сформированных портальных трактов, однако выявлялась высокая интенсивность экспрессии ESA, СК18 и СК19 в прилежащих клетках и тонкая прослойка мезенхимных клеток вокруг сосуда.

Динамика экспрессии ЕМА и СК7 имела существенные отличия от закономерностей появления и экспрессии других эпителиальных маркёров. Эти антигены впервые появлялись у человека только в момент формирования собственно желчных протоков сначала в воротах печени (на 11,5 и 12 НГ соответственно), затем внутри железы и практически отсутствовали в протоковой пластинке. Нам удалось показать, что экспрессия СК7 начинается на 8 недель раньше, чем это было описано ранее (Van Eyken et al., 1988), что указывает на завершение в целом формирования системы внутрипечёночных желчных протоков к концу I триместра гестации. Большинство холангиоцитов становится позитивным по ЕМА уже на 14-й НГ, тогда как по СК7 – только к моменту рождения. Во второй половине гестации в печени человека видны бифуркации растущих желчных протоков в области портальных трактов, при этом также происходит ветвление кровеносных сосудов. Подобная картина ветвления внутрипечёночных желчных протоков и кровеносных сосудов была выявлена нами и при регенерации печени человека (хронические гепатиты) и крысы (ЧГ, повреждение НС). По-видимому, такое ветвление сосудов является одним из основных механизмов формирования трубчатых структур печени не только у плодов человека, но и при образовании новых портальных трактов в регенерирующей печени человека и крысы. Формирование желчных протоков продолжается в печени человека и после рождения, на что указывает присутствие в ней в первые месяцы жизни как одиночных и сгруппированных клеток, экспрессирующих СК19 и СК7, так и образующихся из них мелких протоков и их ветвлений. Экспрессии HSA и CD66a в клетках  протоковой пластинки, формирующихся внутрипечёночных желчных протоках и канальцев Геринга у человека не отмечено, однако они транзиторно экспрессировали C-kit на 7-7,5 НГ с последующим быстрым снижением экспрессии по мере дифференцировки клеток.

Результаты проведённых исследований свидетельствуют о том, что мы вплотную подошли к тому моменту, когда новые факты не могут быть объяснены в рамках традиционных теорий. Если ранее многие учёные рассматривали протоковую пластинку как слой гепатобластов, дифференцирующихся в холангиоциты и формирующих желчные протоки (Van Eyken et al., 1988), то сегодня появились факты, которые противоречат такой трактовке. Фенотипы гепатобластов и холангиобластов действительно оказались весьма похожи, однако каждый клеточный тип экспрессирует также «свои» маркёры, которые отсутствуют в противоположной клеточной популяции. Для гепатобластов – это десмин, C-met, HSA, CD66a, для холангиобластов – ЕМА и СК7. Фенотипические отличия гепатобластов и холангиоцитов на ранних стадиях развития печени были установлены и другими авторами (Dudas et al., 2004; Shiojiri et al., 2004). Клетки, изолированные из фетальной печени крысы на 12-14-й дни гестации и трансплантированные во взрослую печень, были способны генерировать и гепатоциты, и холангиоциты, тогда как из клеток, изолированных на 18-й день гестации, могли образовываться только гепатоциты (Sandhu et al., 2001). Таким образом, у крысы дифференцировка бипотентного эпителиального предшественника и разделение его потомков на две линии происходит до 18-го дня гестации, а у человека, по нашим данным, – не позднее 5-6 НГ. В дальнейшем, именно холангиобласты (а не гепатобласты) формируют протоковую пластинку и желчные протоки. Повышение градиента экспрессии изначально наблюдается около всех сосудов печени – как приносящих, так и выносящих. Однако клетки, интенсивно экспрессирующие СК18 и СК19, были расположены не только вблизи кровеносных сосудов, но и в паренхиме печени, и они появлялись там на 2-3 недели раньше, чем протоковая пластинка. По нашему мнению, на сроке 4-5 НГ происходит разделение путей дифференцировки клеток гепатоцитарного и холангиолярного рядов, изначально развивающихся из общего кишечного эпителиального предшественника. То есть протоковая пластинка состоит не из гепатобластов, а из незрелых холангиоцитов – холангиобластов, отличающихся от гепатобластов формой, размерами и фенотипом, которые сначала мигрируют вдоль стенки кровеносного сосуда (экспрессируя СК19, СК18, ESA, C-kit), а затем, когда их число в данном конкретном месте достигает необходимого уровня, формируют трубчатые структуры и экспрессируют только СК18, СК19, СК7 и ЕМА, причём СК7 и ЕМА появляются уже в достаточно дифференцированных клетках.

Таким образом, гепатоциты и холангиоциты, с одной стороны, могут происходить из общей кишечной эпителиальной клетки-предшественницы, и очевидно, что из этого источника развивается большинство клеток обеих популяций. С другой стороны, гепатоциты могут иметь альтернативный клеточный источник развития – мезенхимные десмин-позитивные (очевидно, звёздчатые) клетки, тогда как для холангиоцитов существование дополнительного источника развития пока ничем не подтверждается. При этом результаты проведённого исследования показали, что в ходе пренатального развития человека клетки протоковой пластинки окружены десмин-позитивными звёздчатыми клетками печени. Возможно, что клетки более зрелых протоков также находятся в тесном контакте со звёздчатыми клетками, однако сроки появления первых протоков совпадают с моментом прекращения экспрессии десмина в звёздчатых клетках печени человека, что не позволяет проследить данные взаимодействия. Аналогичные взаимоотношения между звёздчатыми клетками и клетками формирующихся внутрипечёночных желчных протоков были выявлены ранее в печени крысы (Киясов и др., 1997). Таким образом, десмин-позитивные звёздчатые клетки печени формируют микроокружение для клеток развивающихся внутрипечёночных желчных протоков и у крысы, и у человека, и, очевидно, оказывают влияние на процесс дифференцировки последних. Механизмами такого влияния могут быть прямые межклеточные контакты между десмин-позитивными звёздчатыми клетками и эпителием протоков, значение которых было показано в экспериментах in vitro (Petersen et al., 2001), а также продуцируемые звёздчатыми клетками печени и имеющие важное значение для морфогенеза протоков разнообразные ростовые факторы – HGF,  трансформирующие факторы роста TGF-α, TGF-β и др. (Schirmacher et al., 1992; Tan et al., 1995; Terada et al., 1997; Asahina et al., 2002; Lemaigre, 2003), а также белки межклеточного вещества (Doljanski, Roulet, 1934; Maher et al., 1988; Shah, Gerber, 1990; Ramadori et al., 1991; Desmet, 1992; Madri, Basson, 1992; Terada, Nakanuma, 1994; Friedman, 2008). Предположение же о том, что микроокружение формирующихся протоков может быть образовано миофибробластами, происходящими из звёздчатых клеток печени (Libbrecht et al., 2002), не нашло своего подтверждения, поскольку маркёр миофибробластов -ГМА ни на одном из сроков гестации у человека не был обнаружен вблизи протоков. Этот контрактильный белок всегда присутствовал только в ГМК вен и артерий. Аналогичные результаты были получены нами и при изучении пренатального развития кровеносных сосудов и желчных протоков у крысы.

Существует гипотеза, рассматривающая в качестве основных механизмов перестройки протоковой пластинки пролиферацию образующих её клеток и последующее удаление «лишних» клеток апоптозом (Fabris et al., 2000; Clotman et al., 2002; Roskams, Desmet, 2008). Оказалось, однако, что в развивающейся печени человека на всех сроках гистогенеза пролиферирующие клетки практически не встречаются в протоковой пластинке. Только во второй половине гестации в формирующихся желчных протоках, особенно мелких, можно было видеть единичные PCNA-позитивные клетки. Следовательно, пролиферативный процесс не играет значительной роли в формировании протоковой пластинки и её удвоении у человека, что подтверждает данные, полученные другой группой учёных (Fabris et al., 2000; Clotman et al., 2002). По-видимому, основной механизм формирования протоковой пластинки – дифференцировка холангиобластов, а не пролиферация клеток, которая становится более активной тогда, когда протоки уже более или менее сформированы. Однако при повреждении печени различной природы неизменно отмечается усиленная пролиферация многих клеток печени, в том числе и  холангиоцитов. Пролиферацию этих клеток мы обнаружили и в печени больных хроническими гепатитами, и в печени крыс, регенерирующей после ЧГ или повреждения НС (около 35% пролиферирующих клеток через 2-3 суток после повреждения). Другими словами, по-видимому, во взрослом организме именно этот механизм обеспечивает восстановление клеток протоков после повреждения печени. Очевидно, что именно пролиферация холангиоцитов приводит к появлению единичных и сгруппированных СК19+/СК7(-) веретенообразных клеток, обнаруженных нами в регенерирующей печени и человека, и крысы. Они соответствуют по размеру и форме холангиобластам фетальной печени, и, так же как и они, имеют незрелый фенотип, на что указывает отсутствие в них СК7. Образовавшиеся холангиоциты формируют группы, что приводит затем к образованию новых протоков путём миграции клеток и ветвления имеющихся протоков.

Механизмы апоптоза также не играют значительной роли в перестройке протоковой пластинки: ни клетки протоковой пластинки, ни клетки внутрипечёночных желчных протоков в развивающейся печени человека не экспрессировали ни индуктор апоптоза Bcl-rambo, ни анти-апоптозный белок Bcl-2, хотя оба маркёра присутствовали в других клетках железы. Уменьшение экспрессии Bcl-2 в процессе пренатального развития рассматривается рядом авторов как доказательство удаления «лишних» клеток протоковой пластинки апоптозом (Roskams, Desmet, 2008). Наши же результаты скорее подтверждают данные Серджи с коллегами о низком уровне апоптоза в клетках протоковой пластинки (Sergi et al., 2000). 

Поскольку было установлено, что и в процессе пренатального развития печени человека, и при регенерации печени человека и крысы образование новых внутрипечёночных желчных протоков происходило путём их ветвления, и этот процесс был связан с ветвлением кровеносных сосудов, было сделано предположение, что и в пренатальном гистогенезе печени человека развитие системы желчных протоков неразрывно связано с развитием портальных сосудов. Однако оставалось непонятным, как происходит развитие сосудистой, в первую очередь артериальной, системы печени, и что является первичным – развитие протоков или прорастание сосудов. В связи с этим мы исследовали процесс формирования сосудов печени в пренатальном онтогенезе человека в сопоставлении с формированием внутрипечёночной билиарной системы.

Первые CD34-позитивные клетки (гемангиобласты) были обнаружены на сроке 3,5 НГ во внезародышевой части желточного мешка, дорзальной и вентральной аортах и в зародышевой мезодерме, то есть желточный мешок является не только первым кроветворным органом, но и служит некой ключевой точкой, от которой начинается формирование сердечно-сосудистой системы эмбриона. К концу 4-й НГ все эндотелиальные клетки аорты также экспрессировали CD34. Далее CD34-позитивные клетки появлялись в вителиновых и пупочных венах, венозном протоке, нижней полой вене и синусоидах печени, а затем (4,5-7 НГ) – в клубочках мезонефроса, среди мезодермальных клеток, окружающих нервную трубку, кишку, лёгкие. При этом в почках и нервной системе были видны тяжи CD34+ клеток, идущие от аорты или артерий к органам, которые на 7-й НГ экспрессировали также Bcl-2. Таким образом, во многих органах формирование сосудов начинается с васкулогенеза, и первые капиллярные сети появляются в печени и почках. Только в некоторых случаях (почка, нервная трубка) одновременно можно видеть прорастание эндотелиоцитов от аорты или других артерий вглубь органов (ангиогенез). В основном же система магистральных внутриэмбриональных сосудов формируется за счёт последовательной смены васкулогенеза ангиогенезом, после которого начинается артериогенез, и на этой стадии вокруг эндотелиальных клеток появляются миогенные клетки. Гладкомышечные клетки в стенке сосудов сначала появляются в пупочной вене около плаценты и в области желудочков сердца и аорты (4-я НГ), которые таким образом являются вне- и внутриэмбриональными центрами, от которых начинается дифференцировка гладкомышечных клеток (ГМК) кровеносных сосудов. При этом в ГМК сначала начинается экспрессия десмина, затем – -ГМА, и затем – кальпонина. По-видимому, только функционально активная клетка экспрессирует все три белка. После установления экспрессии этих миогенных белков в пупочной вене, аорте, подвздошных и пупочных артериях (4-5 НГ) начинается приобретение дефинитивного фенотипа ГМК в других крупных ветвях аорты.

Развитие сосудов внутри печени имело схожие закономерности. На стадии печёночного дивертикула в печени человека не удавалось увидеть какие-либо полости, напоминающие сосуды – в это время она представляла собой плотную массу клеток. После окончания 4-й НГ в печени уже можно видеть мелкие полости, выстланные CD34+ эндотелиальными клетками – будущие синусоидные капилляры. Наряду с синусоидами в это время на краю печени можно видеть одну большую полость – приносящую вителиновую вену. Уже на этих сроках эндотелиальные клетки в печени экспрессируют не только виментин, но и эндотелиальные маркёры CD34 и CD31, экспрессия которых резко снижается к окончанию эмбрионального периода развития. После 8-й НГ лишь единичные эндотелиоциты около кровеносных сосудов продолжают экспрессировать CD34. Таким образом, эндотелиальные клетки являются одной из наиболее рано дифференцирующихся клеточных популяций в печени человека.

На начальных этапах развития печени человека единственным сосудом, содержащим в своей стенке ГМК, экспрессирующие десмин и -ГМА, была вителиновая вена. Чуть позднее в единичных клетках этой вены появлялся кальпонин. На 6-й НГ в печени уже можно видеть выстланные эндотелием полости разного размера, но более крупные, чем синусоидные капилляры. В стенке некоторых из этих полостей присутствуют единичные ГМК, экспрессирующие -ГМА, а затем и кальпонин. К концу 6-й НГ в печени довольно много таких сосудов, при этом в стенке приносящих (будущих воротных) вен экспрессия -ГМА намного более выражена, чем в выносящих (будущих центральных) венах. Такая же закономерность отмечена и для эндотелиального маркёра CD34: его экспрессия также более выражена в приносящих внутрипечёночных сосудах. Контуры таких сосудов имеют округлую форму и ровный край, тогда как сосуды, у которых лишь единичные клетки экспрессируют -ГМА и CD34, имеют, как правило, вытянутую форму и неровный, «изрезанный» край. Эти выносящие сосуды обычно расположены ближе к периферии печени и, по-видимому, представляют собой формирующиеся центральные вены. Таким образом, именно на этом этапе (7-8 НГ) можно впервые наблюдать дифференциацию внутрипечёночных вен на приносящие и выносящие. Исходя из существующей теории формирования сосудистой системы печени (Collardeau-Frachon, Scoazec, 2008), эти сосуды появляются в результате сложной перестройки пупочных и вителиновых вен, что приводит к образованию афферентной венозной портальной системы.

В дальнейшем именно вокруг приносящих CD34+/-ГМА+ сосудов концентрируются СК19+++ холангиобласты, формирующие протоковую пластинку. При этом нельзя не вспомнить, что усиление градиента экспрессии цитокератинов и ряда других эпителиальных маркёров на более ранних сроках было отмечено около всех сосудов, а также на периферии печени, где сосудов ещё не было. Формирование же истинной протоковой пластинки из имеющих характерную морфологию мелких веретенообразных клеток происходило уже только вокруг афферентных сосудов. Очевидно, что именно дифференцировка ветвей воротной вены является определяющим фактором для образования протоковой пластинки. Весьма вероятно, что триггером в данном процессе служит повышение концентрации кислорода в печени после формирования афферентной воротной системы. Известно также, что  билиарная дифференцировка индуцируется в фетальной печени перипортальным градиентом активина/TGF-, выраженность которого контролируется ингибирующим влиянием ядерного фактора гепатоцитов HNF6 и Onecut factor OC-2 (Clotman et al., 2005), а сигналом к активации самого HNF6 служит сигнал из портальной мезенхимы (Crosnier et al., 2000; Nijjar et al., 2001; Loomes et al., 2002; Flynn et al., 2004; Tanimizu, Miyajima, 2004). Постепенно все внутрипечёночные ветви воротной вены окружаются кольцом мезенхимы, которая после 8-й НГ визуализируется достаточно чётко и должна стать основой для формирования портальных трактов, в которую позднее будут врастать ветви печёночной артерии (Collardeau-Frachon, Scoazec, 2008).

На сроке 5,5-6,5 НГ можно видеть отходящий от аорты чревный ствол, растущий в направлении поджелудочной железы и печени, клетки стенок которого экспрессируют один из маркёров стволовых клеток Bcl-2. В это же время можно видеть первые CD34+ клетки в мезенхиме, окружающей желчный пузырь, а затем и пузырную артерию. Данные факты подтверждают предположение о том, что печёночная артерия изначально развивается как артерия для желчного пузыря (Desmet, 1992). По-видимому, развитие сосудов печени и желчного пузыря происходит путём ангиогенеза (прорастание артерий в орган) и васкулогенеза (образование сосудов из эндотелиальных клеток-предшественниц в самом органе). Немного позднее (8,5 НГ) в самой печени появляются сосуды, в стенках которых присутствуют клетки, экспрессирующие, так же как и клетки стенок чревного ствола, Bcl-2 вплоть до 14-й НГ. Поскольку в эмбриогенезе сосудистой системы экспрессия Bcl-2 была отмечена только в стенке артерий, по всей видимости, в данном случае мы наблюдаем первые признаки прорастания в печень ветвей собственной печёночной артерии. Нельзя исключить, что стимулировать этот рост могут факторы, вырабатываемые холангиобластами, в частности, транскрипционные факторы HNF-6 и HNF-1β (Clotman et al., 2002, 2003; Coffinier et al., 2002), и сигнальные пути Jagged-1/Notch (Xue et al., 1999;  McCright et al., 2002; Nijjar et al., 2002; Flynn et al., 2004; Kodama et al., 2004), имеющие важное значение для развития как протоков, так и артерий.

К 8-й НГ в стенках крупных сосудов печени появляется второй слой -ГМА+ гладкомышечных клеток и усиливается экспрессия кальпонина. Именно в эти сроки активно начинаются процессы ремоделирования протоковой пластинки (её удвоение и формирование просвета, миграция клеток в мезенхиму будущего портального тракта и в паренхиму печени), что позволяет связать этот факт с появлением в печени новых афферентных сосудов – ветвей печёночных артерий. У плода по воротной вене течёт главным образом артериальная кровь, поступающая из пупочной вены, а по печёночной артерии – смешанная кровь со значительной долей венозной крови. Возможно, именно возникающее при прорастании артерии изменение состава поступающей в печень крови имеет решающее значение для завершения формирования внутрипечёночного билиарного дерева. Кроме того, ветви воротной вены ещё до прорастания артерии окружены капиллярами, эндотелий которых позитивно окрашивается с антителами к CD34, чего не наблюдается вокруг центральных вен. К 13-14-й НГ внутри печени можно дифференцировать портальные тракты, содержащие внутрипечёночные желчные протоки, артериальные и венозные сосуды. К этому времени капилляры становятся более крупными и располагаются главным образом внутри портального тракта вокруг его сосудов среди клеток мезенхимы. Таким образом, можно сделать вывод, что определяющим в формировании системы желчных протоков все-таки является наличие афферентных кровеносных сосудов, на первом этапе (образование протоковой пластинки) – портальных вен (7-8 НГ), а затем (ремоделирование протоковой пластинки и образование протоков) – капиллярной сети и печёночных артерий (8-9 НГ и позднее). В пользу такого вывода свидетельствует и тот факт, что на протяжении всего пренатального развития эпителий желчного пузыря и образующиеся желчные протоки окружены мелкими кровеносными сосудами, по-видимому, мелкими артериолами и капиллярами, эндотелий которых экспрессирует CD34. Таким образом, прорастание артериальных ветвей предшествует формированию желчных протоков, что подтверждает гипотезу о том, что именно артерии индуцируют объединение периферических трубочек билиарных клеток в процессе ремоделирования протоковой пластинки (Terada, Nakamura, 1993).

При рассмотрении проблемы формирования сосудистой системы печени возникает ещё один вопрос, связанный с выполнением печенью в пренатальном периоде кроветворной функции. Многие вопросы печёночного этапа гемопоэза,  в частности, пути и сроки появления в печени разных типов клеток крови, популяции клеток, составляющих микроокружение кроветворных островков, изучены крайне недостаточно. На самом раннем изученном нами сроке (3,5 НГ) большинство клеток крови находилось в желточном мешке, просвете дорзальной и вентральной аорт. Часть этих клеток, имеющих по сравнению с другими относительно большие размеры и объём цитоплазмы, экспрессировала десмин и CD34. Позднее клетки такой морфологии мы наблюдали в сосудах печени и островках кроветворения, и они экспрессировали десмин и С-met. Мы предполагаем, что такие клетки могут представлять субпопуляцию кроветворных клеток, способных дифференцироваться в гепатоциты. Появление в них десмина, а затем C-met, вероятно указывает путь такой дифференцировки, поскольку одной из особенностей C-met является его появление в мезенхимных клетках, дифференцирующихся в эпителий (Tsarfaty et al., 1994). Кроме того, данный факт косвенно подтверждает возможность развития самих звёздчатых клеток из кроветворных стволовых клеток, которая была установлена ранее на мышах (Baba et al., 2004).

Первые единичные CD34-позитивные гемангиобласты появляются в паренхиме печени человека на самых ранних этапах её развития (4,5 НГ), и далее их число постепенно увеличивается. ЕМА+ клетки эритроидного и лимфоцитарного рядов (Delsol et al., 1988; Brugger et al., 1999), по нашим данным, появляются в печени на 5-6 НГ до начала печёночного кроветворения, возможно в результате дифференцировки CD34+ клеток. Начиная с 8-й НГ, ЕМА+ клетки образуют кластеры, максимально концентрируясь около сосудов и на периферии печени, а также в островках кроветворения и в просвете сосудов печени. Во второй половине гестации их число постепенно уменьшается, у новорождённых они присутствуют только в кроветворных островках. CD31+ клетки-предшественницы мегакариоцитов впервые появляются в паренхиме печени на сроке 4 НГ, а с середины 6-й НГ уже можно видеть CD31+ мегакариоциты, с 8-й НГ они появляются в островках кроветворения. Далее число CD31-позитивных мегакариоцитов нарастает, и их максимальное количество отмечено в период с 8-й по 20-ю НГ. По-видимому, заселение гемангиобластов и других клеток-предшественниц происходит из  желточного мешка по вителиновым венам, и до начала кроветворения они главным образом служат клетками-предшественницами эндотелиальных клеток печени, которые инициируют формирование внутриорганного сосудистого русла, а также формируют популяцию клеток-предшественниц кроветворения, которые дадут начало кроветворным островкам на 8-й НГ (Гумерова и др., 2004; Kiyasova, Gumerova, 2004). С этого момента клетки кроветворных островков начинают активно экспрессировать Bcl-rambo, что подтверждает апоптоз «лишних» кроветворных клеток (Kataoka et al., 2001), которые затем удаляются звёздчатыми макрофагами, появляющимися в островках с началом кроветворения. В отличие от других клеток крови, макрофаги появляются сначала не в печени, а в мезенхиме вентральной брыжейки на 5,5-й НГ, что свидетельствуют о том, что именно эти мезенхимные клетки являются источником развития макрофагов печени. Через неделю (6 НГ) макрофаги появляются в синусоидах печени, число их нарастает, после 8-й НГ они присутствуют в кроветворных островках, а с 13-й НГ – в соединительной ткани портальных трактов.

По результатам нашего исследования, у человека основными клетками, образующими микроокружение кроветворных клеток в островках с 8-й по 14-ю НГ, являются десмин-позитивные звёздчатые клетки, расположенные внутри и вокруг  островков. Весьма вероятно, что они и дальше продолжают выполнять эту функцию, однако проследить их локализацию в печени человека на более поздних стадиях, к сожалению, не представляется возможным из-за прекращения в них экспрессии десмина. Механизмами влияния звёздчатых клеток на кроветворение могут быть синтез необходимых для нормального кроветворения эритропоэтина (Maxwell et al., 1994; Eckardt, 1996), нейротрофина (Passino et al., 2007), ретиноидов (Tocci et al., 1996), экспрессия сосудистой молекулы клеточной адгезии VCAM-1 (Kubota et al., 2007), ключевой для поддержания адгезии гемопоэтических прогениторов к стромальным клеткам костного мозга (Miyake et al., 1991), и фактора стромальных клеток SDF-1α – потенциального хемоаттрактанта для кроветворных стволовых клеток, стимулирующего их миграцию к месту гемопоэза за счёт взаимодействия со специфическим рецептором CXR4 (Wright et al., 2002). Таким образом, звёздчатые клетки печени являются клетками «ниши» не только для эпителиальных клеток печени, но и для кроветворных клеток в период печёночного этапа кроветворения.

В процессе изучения пренатального развития и регенерации печени мы не раз сталкивались с экспрессией разнообразных маркёров стволовых клеток различными клетками печени и её окружения. Однако остается открытым вопрос, какие из этих клеток в наибольшей степени проявляют фенотипические признаки стволовых клеток. Результаты исследования позволили установить, что маркёры стволовых клеток печени в процессе пренатального онтогенеза печени человека экспрессируют: 1) клетки мезенхимы, окружающей печень: Bcl-2 на 4-8 НГ, CD133 и C-kit на 5-6 НГ; 2) мезотелиальные клетки капсулы печени: Bcl-2 на 5-7-й НГ; 3) звёздчатые клетки печени: Bcl-2 с 4-й до 14-й НГ, далее в течение всего пренатального периода и у новорожденных Bcl-2-позитивные клетки присутствуют в синусоидах печени; 4) синусоидные клетки: C-kit на 6-7 НГ и CD133 с 4-й по 8-ю НГ; 5) гепатобласты: C-met с 4-й по 8-ю НГ и C-kit с 4-й НГ, после 8-й НГ интенсивность экспрессии C-kit снижается, но сохраняется до периода новорожденности; 6) клетки протоковой пластинки: C-kit с 7-й НГ и далее в течение всего пренатального периода; 7) эндотелиальные клетки сосудов печени: Bcl-2 с 7-й по 14-ю НГ, а с 4-й НГ и в течение всего пренатального периода – CD34, после 8-й НГ экспрессия CD34 сохраняется только в эндотелиоцитах перипортальных областей печени; 8) клетки стенки сосудов печени: Bcl-2 с 7-й по 14-ю НГ; 9) кроветворные стволовые клетки в просвете сосудов (с 4-й НГ) и позднее в островках кроветворения – CD34 и C-met. В регенерирующей печени больных хроническими гепатитами С-kit экспрессировали как гепатоциты, так и синусоидные клетки. Мелкие клетки в области перипортального воспаления экспрессировали С-met. В печени крысы в ходе регенерации после повреждения НС или ЧГ С-kit экспрессировали гепатоциты и звёздчатые клетки печени. Таким образом, наиболее устойчивая экспрессия маркёров стволовых клеток выявлена в развивающейся печени человека в синусоидных клетках (главным образом в звёздчатых клетках печени), в гепатобластах/гепатоцитах и клетках протоковой пластинки. Очевидно, что именно эти клеточные типы обладают свойствами прогениторных клеток в наибольшей степени. Изучение же экспрессии этих маркёров в регенерирующей печени человека и крысы ограничивает этот ряд клеток до двух клеточных популяций. Это – гепатобласты/гепатоциты и звёздчатые клетки печени. Интересно, что эти две клеточные популяции находятся друг с другом в весьма своеобразных и очень тесных взаимоотношениях. С одной стороны, каждая из них проявляет свойства стволовых клеток. С другой стороны, пространство Диссе (в образовании которого участвуют гепатоциты) является «нишей» стволовых клеток, в которой находятся звёздчатые клетки печени, а сами звёздчатые клетки, в свою очередь, являются клетками микроокружения дифференцирующихся гепатобластов. Наличие общих маркёров и  переходных с гепатобластами форм клеток, экспрессия маркёров стволовых клеток, расположение в «нише» стволовых клеток указывают на исключительную роль звёздчатых клеток в развитии и регенерации печени. Именно этот клеточный тип может со всем основанием претендовать на роль региональной стволовой клетки печени. Для проверки этой гипотезы мы провели эксперимент по культивированию чистой популяции звёздчатых клеток.

Свежевыделенные и помещённые в культуру клетки имели типичную морфологию звёздчатых клеток – отростчатые клетки, содержащие в цитоплазме капли жира и экспрессирующие виментин и десмин. Культивируемым клеткам не создавали искусственное микроокружение и не добавляли в среду ростовые факторы, рассчитывая на то, что они, обладая синтетическими способностями, будут создавать себе микроокружение сами. К концу первой недели они окрашивались с антителами против коллагенов I, III и IV типов и ламинина. В течение первой недели культивирования возрастала плотность клеток и интенсивность окраски с антителами к десмину. В цитоплазме части клеток, лежащих в удалении от основной клеточной массы, появлялись стресс-волокна, и начиналась экспрессия -ГМА, постепенно количество таких клеток увеличивалось. Мы не пересевали клетки в момент слияния, и к концу второй недели добились образования монослоя и ретракции цитоплазматических отростков. Уже на этом сроке были обнаружены отдельные кластеры клеток, в которых присутствовал специфический фермент гепатоцитов -глутамилтранспептидаза (-ГТП). Процесс упаковки монослоя сопровождался репрессией десмина и исчезновением миофибробластов. Через три недели культивирования, когда монослой морфологически был похож на монослой эпителиальных клеток, клетки обрабатывали трипсином и пересаживали на новые покровные стекла.

Пересаженные клетки после изменения микроокружения в течение первых суток вновь приобретали типичную морфологию звёздчатых клеток печени. Часть этих клеток была двухъядерной, что могло быть следствием их деления, но нельзя исключить, что какие-то из них в момент пересева были полиплоидными. В течение первой недели культивирования пересаженные клетки начинали экспрессировать десмин, а в их цитоплазме в течение первых двух недель начинался синтез макромолекул межклеточного матрикса. По мере увеличения плотности клеток происходила ретракция отростков и образование плотного пласта, напоминающего пласт эпителия. На 9-е сутки, несмотря на то, что уже начинал образовываться монослой, в цитоплазме лишь единичных клеток выявлялась -ГТП, однако к концу третьей недели она присутствовала практически во всех клетках культуры. Более того, к концу третьей недели культивирования часть клеток экспрессировала -ФП, а в цитоплазме более крупных клеток, напоминающих по своей морфологии гепатоциты, появлялись СК8 и СК18.

Таким образом, полученные нами данные позволили установить, что звёздчатые клетки печени крысы могут совершать мезенхимально-эпителиальную трансформацию и экспрессировать гепатоцитарные маркёры – -ГТП, СК8 и СК18, -ФП. Последние годы появляется все больше фактов, подтверждающих такую возможность. Так, с началом печёночного этапа гемопоэза высокая плотность звёздчатых клеток имеет место как в печени в целом, так в области очагов кроветворения, причём эти клетки в очагах кроветворения имеют эпителиально-мезенхимальный фенотип (Kiassov et al., 1995; Chagraoui et al., 2003). В звёздчатых клетках печени человека была обнаружена одновременная экспрессия одного из маркёров кроветворных стволовых клеток СD34 (Suskind,  Muench, 2004) и эпителиальных маркёров СК18, СК19 и Е-кадгерина (Lim, Lee , 2002; Lim et al., 2002). Позднее была показана возможность образования гепатоцитов из мезенхимных клеток in vitro и in vivo (Alison et al., 2004; Lee te al., 2004; Seo et al., 2005). На основании результатов нашего исследования динамики фенотипов клеточных популяций в пренатальном онтогенезе и при репаративной регенерации, мы считаем, что дифференцировка мезенхимных клеток имеет следующее направление: десмин-позитивные клетки мезенхимы поперечной перегородки и вентральной брыжейки дают начало звёздчатым клеткам печени, которые, в свою очередь, формируют в эмбриогенезе региональный стволовой резерв для восстановления пула гепатоцитов. Помимо этого, десмин-позитивные звёздчатые клетки печени в пренатальном онтогенезе являются важнейшим фактором микроокружения для развивающихся гепатоцитов, холангиоцитов и кроветворных клеток. Обладая своеобразной двойственностью (стволовые клетки – клетки микроокружения), по всей вероятности,  звёздчатые клетки печени могут выполнять одну из этих программ в зависимости от потребностей органа в тот или иной момент времени, или же популяция этих клеток является функционально неоднородной. Таким образом, не вызывает сомнений, что звёздчатые клетки печени играют очень важную роль в развитии и регенерации этого органа. Установленные в настоящем исследовании факты позволяют рассматривать именно этот клеточный тип в качестве наиболее вероятного претендента на роль стволовой клетки печени человека и крысы.

Выводы

  1. У человека в ходе первичной печёночной индукции процесс обособления эпителиальных клеток зачатка печени от кишки сопровождается изменением их фенотипа – прекращением экспрессии ЕМА. В период вторичной печёночной индукции, основные события которой у человека происходят с 4-й по 8-ю НГ, мезенхимные клетки поперечной перегородки и вентральной брыжейки желудка, окружающие выселившиеся эпителиальные клетки, имеют фенотип виментин+/десмин+/СК18/СК19+, отличный от фенотипа мезенхимных клеток других локализаций (виментин+/десмин(-)/СК18(-)/СК19(-)). Мезенхимные и эпителиальные клетки, участвующие во вторичной печёночной индукции, имеют ряд общих фенотипических признаков – в их цитоплазме или на плазматической мембране присутствуют десмин, СК18, СК 19 и C-kit.
  2. У человека из мезенхимных клеток поперечной перегородки и вентральной брыжейки желудка образуются два типа синусоидных клеток – звёздчатые клетки печени и звёздчатые макрофаги печени:

А) Звёздчатые клетки печени появляются в развивающейся печени на 4-й НГ и фенотипически не отличаются от основной массы окружающих её мезенхимных клеток: в цитоплазме звёздчатых клеток выявляются десмин, СК18, СК19 и Bcl-2. Десмин не является постоянным фенотипическим маркёром звёздчатых клеток печени человека и выявляется в них только до 14й НГ включительно.

Б) Звёздчатые макрофаги печени, в которых присутствует макрофагальный антиген, обнаружены в синусоидах печени начиная с 7-й недели развития, а первые клетки, позитивные по макрофагальному антигену, появляются среди клеток мезенхимы на неделю раньше.

  1. На сроке 4-6 НГ в десмин-позитивных звёздчатых клетках печени человека присутствуют маркёры гепатобластов СК18 и СК19, и одновременно в клетках с морфологией гепатобластов появляется десмин, что свидетельствует о возможности мезенхимально-эпителиальной трансдифференцировки десмин-позитивных звёздчатых клеток печени in vivo. Такая же трансдифференцировка происходит in vitro – в чистой культуре в звёздчатых клетках печени крысы при установлении межклеточных контактов и образовании монослоя появляются маркёры, специфические для гепатобластов и гепатоцитов – СК8, СК18, СК19, –ФП и -ГТП.
  2. В процессе репаративной регенерации печени крысы и человека звёздчатые клетки печени, наряду с гепатоцитами, проявляют фенотипические признаки прогениторных клеток, экспрессируя C-kit. Устойчивая экспрессия маркёров стволовых клеток также  характерна для обоих указанных клеточных типов в пренатальном онтогенезе человека: гепатобласты экспрессируют C-kit, C-met, CD133 (4-8 НГ), а звёздчатые клетки печени – Bcl-2 (4-14 НГ). 
  3. В пренатальной печени человека десмин-позитивные мезенхимные клетки и звёздчатые клетки печени окружают дифференцирующиеся гепатобласты и холангиобласты, а также кроветворные клетки в период печёночного этапа гемопоэза.
  4. В печени человека с 5-й НГ можно выделить две популяции эпителиальных клеток, отличающихся формой, размерами и фенотипом: крупные округлые гепатобласты (ESA+/СК18+/СК19+/C-kit+/десмин+/C-met+/CD66a+/HSA+) и мелкие вытянутые холангиобласты (ESA+/СК18+/СК19+++/C-kit+/ЕМА+/СК7+). Большинство гепатоцитов приобретают окончательный фенотип (СК18+/CD66a+/HSA+) к 15-16 НГ, а холангиоцитов – к 13-14 НГ (ESA+/СК18+/СК19+++/ЕМА+++/СК7+++), в момент появления в печени  первых сформированных желчных протоков.
  5. В пренатальном онтогенезе человека формирование и ремоделирование протоковой пластинки, из клеток которой формируются внутрипечёночные желчные протоки, происходит путём дифференцировки холангиобластов в холангиоциты без существенного участия процессов пролиферации и апоптоза, однако в процессе восстановления протоков после повреждения печени у человека и крысы в пролиферации участвует до одной трети холангиоцитов. Формирование внутрипечёночных желчных протоков в пренатальном онтогенезе печени человека и их восстановление при репаративной регенерации печени человека и крысы осуществляется за счёт прорастания и ветвления протоков совместно с артериальными сосудами. 
  6. Эндотелиальные клетки, экспрессирующие специфические для эндотелия маркеры CD34 и CD31, появляются в развивающейся печени на сроке 4 НГ. Экспрессия CD34 и CD31 прекращается в большинстве эндотелиоцитов к концу  8-й НГ, и они приобретают фенотип CD34(-)/CD31(-), характерный для этих клеток в зрелой печени человека.
  7. Дифференциация венозных сосудов печени начинается на 6-7 НГ: ветви воротной вены имеют ровные контуры, выстланные СD34+ эндотелиоцитами и развитую мышечную оболочку, для центральных вен характерны «изрезанный» контур, CD34± эндотелиоциты и единичные ГМК в мышечной оболочке. Становление афферентных кровеносных сосудов предшествует и определяет формирование системы внутрипечёночных желчных протоков: после дифференциации ветвей воротной вены (6-7 НГ) образуется протоковая пластинка, а прорастание ветвей печёночной артерии (8-9 НГ) предшествует её ремоделированию и формированию протоков.

практические рекомендации

  1. В морфологической диагностике опухолей печени и при изучении процессов дифференцировки гепатоцитов человека рекомендуется применять в качестве маркёров гепатобластов десмин, ESA, CK18, CK19, C-met, C-kit, гепатоцитов – СК18, СD66a, HSA, учитывая тот факт, что СК18 одинаково интенсивно экспрессируется в клетках разной степени дифференцированности.
  2. В морфологической диагностике опухолей печени и при изучении процессов дифференцировки клеток внутрипечёночных желчных протоков человека рекомендуется применять в качестве маркёров холангиобластов ESA, CK18, CK19, C-kit, холангиоцитов – CK19, ЕМА, СК7.
  3. Ввести в стандарт морфологической диагностики хронических заболеваний печени человека иммуногистохимическое выявление экспрессии: 1) C-met и Ckit – для определения факта активации стволового компартмента; 2) CD34 и CD31 – для выявления фенотипа эндотелиальных клеток синусоидов печени и их возможной капилляризации.
  4. При изучении пренатального развития сосудистой системы человека целесообразно применять иммуногистохимическое выявление десмина, -ГМА и кальпонина как маркёров, отражающих степень дифференцированности гладкомышечных клеток сосудистой стенки.
  5. При выполнении иммуногистохимического окрашивания образца ткани моноклональными антителами к двум различным антигенам после выявления активности ферментной метки в первом окрашивании применять кипячение в цитратном буфере в течение 15 минут для разрушения и удаления всех нанесённых на срезы иммуноглобулинов с целью минимизации неспецифического связывания антител во время второго окрашивания.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Билалов М.М. Экспрессия цитокератинов №7 и №19 в пре- и постнатальном онтогенезе печени крыс / М.М. Билалов, А.А. Гумерова // Сборник докладов итоговой научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых учёных, посвящённой 40-летию КГМА. – Кемерово, 1996. – С.100-102.
  2. Гумерова А.А. Улучшенный метод одновременного иммуногистохимического выявления двух белков промежуточных филаментов цитоскелета / А.А. Гумерова, М.М. Билалов, А.П. Киясов // Тезисы II Республиканской конференции молодых учёных и специалистов. – Казань, 1997. – С. 47.
  3. Киясов А.П. Использование иммуногистохимических методов для прогнозирования исходов хронических гепатитов / А.П. Киясов, Л.С. Фатхеева, А.А. Гумерова [и др.] // Тезисы докладов II Российской научно-практической конференции с международным участием «Гепатиты В, С, D и G – проблемы диагностики, лечения и профилактики». – Москва, 1997. – С. 94.
  4. Гумерова А.А. Индуцированная пролиферация отдельных клеточных типов печени, поджелудочной и щитовидной желез / А.А. Гумерова, М.А. Титова, А.П. Киясов // Материалы научной конференции, посвящённой 190-летию кафедры анатомии человека КГМУ и 100-летию со дня рождения чл.-корр. АН СССР, проф. Н.Г. Колосова «Влияние антропогенных факторов на структурное состояние органов, тканей и клеток организма человека и животных: проблемы экологии в медицине». – Казань, 1997. – С. 37-38.
  5. Киясов А.П. Экспрессия десмина клетками Ито эмбриональной печени человека / А.П. Киясов, А.А. Гумерова // Тезисы докладов III Республиканской научно-технической конференции молодых учёных и специалистов. – Казань, 1997. – С. 41.
  6. Гумерова А.А. Нитрат свинца стимулирует пролиферацию и апоптоз клеток Ито в печени крысы / А.А. Гумерова, А.П. Киясов, А.Р. Минсафина // Тезисы докладов III Республиканской научно-технической конференции молодых учёных и специалистов. – Казань, 1997. – С. 83.
  7. Гумерова А.А. Пролиферация клеток Ито печени не является триггером их трансформации в миофибробласты / А.А. Гумерова, А.П. Киясов // Тезисы докладов 3-го съезда физиологов Сибири и Дальнего Востока. – Новосибирск, 1997. – С. 54.
  8. Киясов А.П. Экспрессия цитокератинов в пре- и постнатальном онтогенезе / А.П. Киясов, А.А. Гумерова, М.М. Билалов // Онтогенез. 1997. Т. 28, № 5. С. 389-393.
  9. Гумерова А.А. Иммуногистохимическое выявление пролиферирующих клеток Ито в печени крыс / А.А. Гумерова, А.П. Киясов // Материалы научной конференции, посвящённой 35-летию ЦНИЛ КГМУ «Современные методы исследования в клинике и эксперименте». – Казань, 1997. – Ч. I. – С. 35-36.
  10. Гумерова А.А. Альфа-гладкомышечный актин – фенотипический маркёр активированных клеток Ито печени человека / А.А. Гумерова, А.С. Созинов, Л.С. Фатхеева [и др.] // Материалы конференции молодых учёных России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», посвящённой 240-летию ММА им. И.М. Сеченова. – Москва, 1998. – С. 94.
  11. Киясов А.П. Реэкспрессия цитокератина-19 в первичной культуре гепатоцитов человека / А.П. Киясов, А.А. Гумерова, С.В. Петров [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1998. Т. 126, № 7. С. 118-120.
  12. Kiassov A., Gumerova A. The influence of lead nitrate on intrahepatic bile duct cells in rat liver / А. Kiassov, А. Gumerova // Abstracts of International symposium «Progress in basic, applied and diagnostic histochemistry». – Bratislava, 1998. – P. 37.
  13. Gumerova A. The expression of cholangiolar cytokeratins in cholestatic liver / А. Gumerova, А. Minsafina, А. Sozinov [et al.] // Abstracts of International symposium «Progress in basic, applied and diagnostic histochemistry». – Bratislava, 1998. – P. 38.
  14. Nizamov R. Phenotype of cells in organ culture liver of rat embryons / R. Nizamov, A. Kiassov, A. Gumerova [et al.] // Abstracts of International symposium «Progress in basic, applied and diagnostic histochemistry». – Bratislava, 1998. – P. 40.
  15. Киясов А.П. Перисинусоидальные клетки Ито в эмбриональном гистогенезе и регенерации печени человека / А.П. Киясов, А.А. Гумерова, А.С. Созинов //  Материалы 4-й Российской конференции «Гепатология сегодня». – Москва, 1999. – РЖГГК. – 1999. – Т. 9, № 1. – С. 109.
  16. Киясов А.П. Гистогенез и дифференцировка внутрипечёночных желчных протоков / А.П. Киясов, А.А. Гумерова, А.Р. Минсафина [и др.] // Материалы IV съезда ВРНОАГЭ. – Ижевск, 1999. – Российские морфологические ведомости. – 1999. – № 1-2, раздел 2. – С. 81.
  17. Гумерова А.А. «Прямой митоген» нитрат свинца вызывает усиление перекисного окисления липидов и активацию клеток Ито в печени крыс / А.А. Гумерова, И.Х. Валеева, А.П. Киясов // Онтогенез. 1999. Т. 30, № 4. С. 289-295.
  18. Abdulchakov S. Perisinusoidal cell proliferation and activation in liver regeneration /  S. Abdulchakov, A. Gumerova, A. Kiassov [et al.] // Abstracts of XI International Congress of liver Disease «Liver Cirrhosis and its Development». – Basel, 1999. – P. 1.
  19. Gumerova A. Desmin and α–Smooth-Muscle-Actin in normal and damaged human liver / A. Gumerova, A. Kiassov, A. Sozinov [et al.] // Abstracts of XI International Congress of liver Disease «Liver Cirrhosis and its Development». – Basel, 1999. – P. 16.
  20. Созинов А.С. Иммуногистохимические критерии дифференциальной диагностики хронических заболеваний печени / А.С. Созинов, Л.С. Фатхеева, А.А. Гумерова [и др.] // Тезисы докладов III Российской научно-практической конференции с международным участием «Гепатиты В, С, D и G – проблемы диагностики, лечения и профилактики». – Москва, 1999. – С. 213.
  21. Валеева И.Х. О механизме пролиферации гепатоцитов, индуцированной нитратом свинца / И.Х. Валеева, А.А. Гумерова, А.П. Киясов // Казанский медицинский журнал. 2000. Т. LXXXI, № 3. С. 195-197.
  22. Gumerova A. Immunohistochemical investigations in diagnostic and forecasting of chronic hepatitis / A. Gumerova, A. Kiassov, A. Sozinov [et al.] // Abstracts of XI International Congress of Histochemistry and Cytochemistry «Understanding Biocomplexity: The Post-Genome Challenge». – York, 2000. – P. 83.
  23. Константинова И.С. Роль клеток Ито в постнатальном периоде онтогенеза /  И.С. Константинова, А.А. Гумерова // Материалы научно-производственной конференции по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии. – Казань, 2001. – Ч. 1. – С. 151.
  24. Бурыкин И.М. Экспрессия десмина и гладкомышечного актина в ходе онтогенеза сердца и скелетной мышцы / И.М. Бурыкин, А.А. Гумерова, В.А. Киясова // Тезисы докладов IV научно-практической Республиканской конференции молодых учёных и специалистов Республики Татарстан. – Казань, 2001. – С.7.
  25. Киясов А.П. Патогистологическая диагностика хронических вирусных гепатитов / А.П. Киясов, А.С. Созинов, А.А. Гумерова [и др.] // Методические рекомендации № 2001/124 МЗ РФ. – КГМУ. – Казань, 2001. –  16 с.
  26. Киясов А.П. Мезенхимо-эпителиальные взаимодействия в печени / А.П. Киясов, А.А. Гумерова, Р.С. Низамов // Тезисы докладов XVIII Съезда физиологического общества им. И.П. Павлова. – Казань, 2001. – С. 353.
  27. Gumerova A. Cell sources of liver development / A. Gumerova, A. Kiassov, V. Kiassova // Abstracts of 37th Annual Meeting of the EASL. – Madrid, 2002. – J. of Hepatol. – V. 36. – P. 269.
  28. Киясов А.П. Клетки Ито в онтогенезе и регенерации печени / А.П. Киясов, А.А.  Гумерова // Цитология. 2002. №4. С. 342-349.
  29. Анохин В.А. Вирусные гепатиты в структуре перинатальных инфекций / В.А. Анохин, А.А. Гумерова // Российский педиатрический журнал. 2002. № 2. С. 32-34.
  30. Низамов Р.С. Одновременное выявление клеток, экспрессирующих десмин и А-актин из гладких мышц в органотипической культуре печени эмбрионов крыс / Р.С. Низамов, А.П. Киясов, А.А. Гумерова // Вятский медицинский вестник. – 2002. – № 1. – С. 62.
  31. Киясов А.П. Клеточные источники соединительной ткани в печени и почках при хронических заболеваниях / А.П. Киясов, А.А. Гумерова, А.С. Хайруллов // Тезисы докладов VI конгресса международной ассоциации морфологов. – Уфа, 2002. – Морфология. –  2002. – № 2-3. – С. 44.
  32. Киясов А.П. Закономерности активации клеток Ито / А.П. Киясов, А.А. Гумерова // Тезисы докладов VI конгресса международной ассоциации морфологов. – Уфа, 2002. – Морфология. – 2002. – № 2-3. – С. 71.
  33. Киясов А.П. Морфологические и иммуногистохимические критерии оценки этиологии, степени активности и стадии развития хронических вирусных гепатитов В и С / А.П. Киясов, А.С. Созинов, А.А. Гумерова [и др.] // Вестник Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И. Мечникова. 2002. № 1-2. С. 157-160.
  34. Киясов А.П. Пренатальный гистогенез, аномалии развития и внутриутробное инфицирование печени человека. Изучение пренатального гистогенеза печени человека / А.П. Киясов, А.А. Гумерова, С.Р. Абдулхаков // Отчеты Фонда НИОКР РТ, конкурсы проектов 1998/99 г. / Казань: Физтехпресс, 2002. – С. 137-138.
  35. Гумерова А.А. Анализ повреждения внутрипечёночных желчных протоков у больных хроническими вирусными гепатитами и первичным билиарным циррозом / А.А. Гумерова, Л.С. Фатхеева, А.П. Киясов [и др.] // Материалы 8-й Российской конференции «Гепатология сегодня». – Москва, 2003. – РЖГГК. – 2003. – № 1. – С. 42.
  36. Cheremina N.A. Expression of A-Smooth Muscle Actin in Chronic Lead Nitrate Liver Injury / N.A. Cheremina, A.A. Gumerova, A.P. Kiassov // Abstracts of International Congress «XII Falk Liver Week». – Freiburg, 2003. – P. 61.
  37. Созинов А.С. Альтерация печени при экспериментальном дисбиозе у крыс / А.С. Созинов, С.Р. Абдулхаков, А.А. Гумерова [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2003. Т. 136, № 7. С. 23-26.
  38. Киясов А.П., Гумерова А.А. Пренатальный гистогенез, аномалии развития и внутриутробное инфицирование печени человека. Изучение межклеточных взаимодействий на ранних этапах онтогенеза человека при внутриутробном инфицировании / А.П. Киясов, А.А. Гумерова // Отчеты Фонда НИОКР РТ, конкурсы проектов 2001 г. – Казань: «Фэн» АН РТ, 2003. – С. 279-280.
  39. Патент 2227298 Российская Федерация. Способ полуколичественной оценки изменений в биоптатах печени при хронических вирусных гепатитах / А.С. Созинов, А.П. Киясов, А.А. Гумерова [и др.]; заявитель и патентообладатель Казан. гос. мед. ун-т. – № 2002116906/15; заявл. 24.06.02; опубл. 20.04.2004, Бюл. № 11.
  40. Фатхеева Л.С. Диагностическая значимость некоторых клинических, биохимических и морфологических показателей при хронических вирусных гепатитах В и С и первичном билиарном циррозе / Л.С. Фатхеева, А.С. Созинов, А.А. Гумерова [и др.] // Казанский медицинский журнал. 2004. Т. LXXXV, № 1. С. 20-23.
  41. Фатхеева Л.С. Особенности активации миофибробластов при хронических вирусных гепатитах / Л.С. Фатхеева, А.А. Гумерова, А.П. Киясов [и др.] // Материалы 9-й Российской конференции «Гепатология сегодня». – Москва, 2004. – РЖГГК. – 2004. – № 1. – С. 28.
  42. Fatcheeva L. Miofibroblasts activation at chronic viral hepatitis / L. Fatcheeva, A. Gumerova, A. Kiassov [et al.] // Abstracts of International symposium “Gastroenterology week». – Freiburg, 2004. – Part III. – P. 131.
  43. Киясова В.А. Экспрессия СD34 и СD31 в эмбриональной печени человека / В.А. Киясова, А.А. Гумерова, А.П. Киясов // Тезисы V общероссийского съезда анатомов, гистологов и эмбриологов. – Казань, 2004. – Морфологические ведомости. – 2004. – № 1-2. – С. 29.
  44. Киясова В.А. Развитие сосудов во внутренних органах эмбрионов человека / В.А. Киясова, П.Н. Резвяков, А.А. Гумерова [и др.] // Тезисы V общероссийского съезда анатомов, гистологов и эмбриологов. – Казань, 2004. – Морфологические ведомости. – 2004. – № 1-2. – С. 49.
  45. Kiyasova V.A. Peculiarities in prenatal development of future endothelial and blood cells’ progenitors / V.A. Kiyasova, A.A. Gumerova // Proceedings of 16th international congress of the IFAA. – Kyoto, 2004. – P. 224.
  46. Kiyasova V.A. CD34 expression in prenatal human development / V.A. Kiyasova, A.A. Gumerova // Abstracts of ICHC. – San Diego, 2004. – P10-13.
  47. Созинов А.С. Информативность некоторых клинических, лабораторных и морфологических методов исследования для дифференциальной диагностики хронических вирусных гепатитов В и С / А.С. Созинов, Л.С. Фатхеева, А.А. Гумерова [и др.] // Нижегородский медицинский журнал. Здравоохранение ПФО. – 2005. – № 2. – С. 146-149.
  48. Киясов А.П. Мезенхимально-эпителиальная трансформация клеток Ито in vitro / А.П. Киясов, А.А. Гумерова, М.А. Титова // Клеточные  технологии в биологии и медицине. 2006. № 3. С. 150-154.
  49. Киясов А.П. Овальные клетки предполагаемые стволовые клетки печени или гепатобласты? / А.П. Киясов, А.А. Гумерова, М.А. Титова // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2006. № 4. С. 55-59.
  50. Gumerova A. C-met–positive mesenchymal cells are possible source of hepatocytes during human liver development and regeneration / A. Gumerova, A. Kiassov, M. Titova [et al.] // Abstracts of International symposium XIII Falk Liver Week. – Freiburg, 2006. – P. 72.
  51. Gazizov I.M. Development of intrahepatic bile ducts by detection of cytokeratin 7 / I.M. Gazizov, A.P. Kiassov, A.A. Gumerova [et al.] // Abstracts of International symposium XIII Falk Liver Week. – Freiburg, 2006. – P. 58.
  52. Калигин М.С. Экспрессия мышечных маркеров в тканях сердца плодов человека / М.С. Калигин, А.А. Гумерова, М.А. Титова [и др.] // Всероссийская научная конференция с международным участием, посвящённая 10-летию медицинского факультета и кафедры анатомии и гистологии человека БелГУ. – Белгород, 2006. – С. 68.
  53. Гумерова А.А. Экспрессия маркеров различных типов клеток печени на ранних этапах пренатального развития человека / А.А. Гумерова, М.А. Титова, А.П. Киясов // Цитология. 2007. № 2. С. 133-141.
  54. Kiassov A.P. Stem cells potencies of persinusoidal Ito cells / A.P. Kiassov, A.A. Gumerova, S.R. Abdulkhakov [et al.] // Материалы Британско-Российского совещания в сотрудничестве с Европейской комиссией «Стволовые клетки: законодательство, исследования и инновации. Международные перспективы сотрудничества». – Москва, 2007.
  55. Абдулхаков С.Р. Экспрессия С-kit в печени при хроническом вирусном гепатите С / С.Р. Абдулхаков, Т.С. Сметанникова, А.А. Гумерова // Материалы научно-практической конференции «Современные аспекты гистогенеза и вопросы преподавания гистологии в ВУЗе», посвящённой 100-летию со дня рождения профессора Л.И. Фалина. – Санкт-Петербург, 2007. – Морфология. – № 3. – С. 53.
  56. Газизов И.М. Изучение реакции внутрипечёночных желчных протоков на частичную гепатэктомию / И.М. Газизов, М.С. Калигин, А.А. Гумерова [и др.] // Материалы научно-практической конференции «Современные аспекты гистогенеза и вопросы преподавания гистологии в ВУЗе», посвящённой 100-летию со дня рождения профессора Л.И. Фалина. – Санкт-Петербург, 2007. – Морфология. – № 3. – С. 63.
  57. Газизов И.М. Изучение экспрессии C-kit после частичной гепатэктомии у крыс / И.М. Газизов, М.С. Калигин, А.А. Гумерова [и др.] // Материалы научно-практической конференции «Современные аспекты гистогенеза и вопросы преподавания гистологии в ВУЗе», посвящённой 100-летию со дня рождения профессора Л.И. Фалина. – Санкт-Петербург, 2007. – Морфология. – № 3. – С. 63.
  58. Зарипова Д.Н. Экспрессия билиарного гликопротеина CD66 в пренатальном гистогенезе печени человека / Д.Н. Зарипова, А.А. Гумерова, И.М. Газизов [и др.] // Материалы научно-практической конференции «Современные аспекты гистогенеза и вопросы преподавания гистологии в ВУЗе», посвящённой 100-летию со дня рождения профессора Л.И. Фалина. - Санкт-Петербург, 2007. – Морфология. – № 3. – С. 70-71.
  59. Abdulkchakov S. Hepatic stellate cells and liver regeneration in chronic viral hepatitis C / S. Abdulkchakov, N. Cheremina, A. Gumerova [et al.] // Abstracts of International symposium II Falk Gastro-Cоnference. – Dresden, 2007. – Part III. – P. 11. 
  60. Gazizov I.M. Expression of C-kit in liver after partial hepatectomy in rats / I.M. Gazizov, A. Gumerova, M.S. Kaligin [et al.] // Abstracts of International symposium II Falk Gastro-Cоnference. – Dresden, 2007. – Part III. – P. 14. 
  61. Gazizov I.M. Perisinusoidal cells after partial hepatectomy in rats / I.M. Gazizov, A.A. Gumerova, M.S. Kaligin [et al.] // Abstracts of International symposium II Falk Gastro-Cоnference. – Dresden, 2007. – Part III. – P. 15. 
  62. Gumerova A. Stem cell properties of hepatic stellate cells / A. Gumerova, A. Kiassov, S. Abdulkchakov [et al.] // Abstracts of International symposium II Falk Gastro-Cоnference. – Dresden, 2007. – Part III. – P. 20. 
  63. Гумерова А.А. Участие клеток Ито в гистогенезе и регенерации печени / А.А. Гумерова, А.П. Киясов, М.С. Калигин [и др.] // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2007. № 4. С. 39-46.
  64. Газизов И.М. Экспрессия рецептора фактора стволовых клеток C-kit в регенерирующей печени после частичной гепатэктомии / И.М. Газизов, А.А. Гумерова, М.С. Калигин [и др.] // Морфологические ведомости. 2008. № 1-2. С. 23-27.
  65. Калигин М.С. Экспрессия рецептора фактора стволовых клеток (C-kit) в ходе развития внутренних органов человека / М.С. Калигин, А.А. Гумерова, М.А. Титова [и др.] // Морфологические ведомости. 2008. № 1-2. С. 63-66.
  66. Gumerova A. The role of myofibroblasts in intrahepatic bile ducts changes during chronic viral hepatitis and primary biliary cirrhosis / A. Gumerova, L. Fatkheeva, S. Abdulkhakov [et al.] // Abstracts of International symposium III Falk Gastro-Cоnference. – Mainz, 2008. – Part III. – P. 52.
  67. Ilmaz T. Activation of stem cells compartment during liver regeneration in chronic viral hepatitis В and C / T. Ilmaz, D. Andreeva, A. Gumerova [et al.] // Abstracts of International symposium III Falk Gastro-Cоnference. – Mainz, 2008. – Part III. – P. 115.
  68. Gazizov I.M. Perisinusoidal cells expressing stem cell properties after partial hepatectomy in rats / I.M. Gazizov, M.S. Kaligin, A.A. Gumerova [et al.] // Abstracts of International symposium III Falk Gastro-Cоnference. – Mainz, 2008. – Part III. – P. 35.
  69. Киясов А.П. Трансплантация аутогенных гемопоэтических стволовых клеток больным хроническими гепатитами / А.П. Киясов, А.Х. Одинцова, А.А. Гумерова [и др.] // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2008. № 1. С. 70-75.
  70. Abdulkhakov S.R. The role of haematopoietic stem cells and hepatic stellate cells in liver regeneration in chronic viral hepatitis / S.R. Abdulkhakov, N.A. Cheremina, A.A. Gumerova [et al.] // Abstracts of 16th UEGW. – Vienna, 2008. – Gut. – V. 57 (S. II). – A157 (P0258).
  71. Abdulkhakov S.R. C-kit expression in liver in chronic viral hepatitis C / S.R. Abdulkhakov, T.S. Yilmaz, A.A. Gumerova [et al.] // Abstracts of 16th UEGW. – Vienna, 2008. – Gut. – V. 57 (S. II). – A157 (P0259).
  72. Gumerova A. Hepatic stellate cells can be liver stem cells and source of hepatocytes’ regeneration / A. Gumerova, A. Kiassov, M. Titova [et al.] // Abstracts of 44th annual meeting of the EASL. – Copenhagen, 2009. – J. of Hepatol. – V.50 (S.1). – P. S307.
  73. Abdulkhakov S. Cellular reactions of hepatic stellate cells and hematopoietic stem cells in viral hepatitis C / S. Abdulkhakov, T. Yilmaz, A. Gumerova [et al.] // Abstracts of EASL monothematic conference «Portal hypertension: advances in knowledge, evaluation and management». – Budapest, 2009. – P. 65.
  74. Калигин М.С. C-kit-позитивные клетки печени человека в ходе органогенеза / М.С. Калигин, Д.И. Андреева, А.А. Гумерова [и др.] // Материалы 14-й Российской конференции «Гепатология сегодня». – Москва, 2009. – РЖГГК. – Т. 19, № 1. – С. 25.
  75. Газизов И.М. Активация стволового компартмента в печени крыс после частичной гепатэктомии и трансплантации клеток пуповинной крови человека / И.М. Газизов, Д.И. Андреева, А.А. Гумерова [и др.] // Сборник тезисов Всероссийской школы-конференции «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования». – Москва, 2009. – С. 16.
  76. Бурганова Г.Р. Экспрессия рецептора к фактору стволовых клеток C-kit при хронических вирусных гепатитах В и С / Г.Р. Бурганова, С.Р. Абдулхаков, А.А. Гумерова [и др.] // Материалы 10-го юбилейного съезда научного общества гастроэнтерологов России. – Москва, 2010. – С. 63-64.
  77. Gumerova A. Hepatocytes and hepatic stellate cells have properties of stem/progenitor cells during prenatal development and liver regeneration / A. Gumerova, A. Kiassov, M. Kaligin [et al.] // Abstracts of 45th annual meeting of EASL. – Vienna, 2010. – J. of Hepatol. – V. 52 (S.1). – P. S364.
  78. Гумерова А.А. Гепатоциты и перисинусоидальные клетки печени обладают свойствами стволовых/прогениторных клеток в ходе пренатального развития и репаративной регенерации печени / А.А. Гумерова, А.П. Киясов, М.С. Калигин [и др.] // Сборник тезисов IV Всероссийского симпозиума с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии». – Санкт-Петербург, 2010. – С. 59-60.
  79. Гумерова А.А. Могут ли перисинусоидальные клетки быть региональными стволовыми (прогениторными) клетками печени? / А.А. Гумерова, А.П. Киясов // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2010. № 1. С. 33-40.
  80. Гумерова А.А. Перспективы использования различных популяций стволовых/прогениторных клеток в клеточной терапии заболеваний печени / А.А. Гумерова, А.К. Шафигуллина, С.Р. Абдулхаков [и др.] // Материалы III Международного симпозиума «Актуальные вопросы клеточных технологий». Москва, 2010. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. Т. V, № 3. С. 25.
  81. Gumerova A. Perspectives of different populations of stem/progenitor cells in treatment of alcoholic hepatitis / A. Gumerova, S. Abdulkhakov, A. Shafigullina [et al.] // Abstracts of IV Falk Gastro Conference. – Freiburg, 2010. – P. 66.
  82. Gumerova A. Lead nitrate induces toxic liver damage and stem cell activation in rat liver // A. Gumerova, M. Kaligin, I. Gazizov [et al.] // Abstracts of IV Falk Gastro Conference. – Freiburg, 2010. – P. 47.
  83. Гумерова А.А. Звёздчатые клетки печени стимулируют дифференцировку мезенхимных стволовых клеток костного мозга крысы в гепатоциты in vitro / А.А. Гумерова, А.К. Шафигуллина, А.А. Трондин [и др.] // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2011. Т. 6, № 4. С. 72-81.
  84. Gumerova A. The cell sources and differentiation of intrahepatic bile ducts during human liver development / A. Gumerova, A. Kiassov, M. Titova [et al.] // Abstracts of 46th annual meeting of the EASL. – Berlin, 2011. – J. of Hepatol. – V. 54 (S.1). – P. S278-S279.
  85. Шафигуллина А.К. Трансплантированные звёздчатые клетки печени восстанавливают популяцию гепатоцитов без риска развития фиброза печени / А.К. Шафигуллина, А.А. Гумерова, А.А. Трондин [и др.] // Сборник трудов II Международной научно-практической конференции «Достижения, инновационные направления, перспективы развития и проблемы современной медицинской науки, генетики и биотехнологий». – Екатеринбург, 2011. – С. 240-241.
  86. Гумерова А.А. Гепатоцитарная дифференцировка звёздчатых клеток печени in vitro / А.А. Гумерова, А.К. Шафигуллина, А.А. Трондин [и др.] // Сборник трудов международной Интернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии». – Казань, 2011. – С. 214-218.

Список сокращений

-ГМА – альфа-гладкомышечный актин

-ФП – альфа-фетопротеин

-ГТП – гамма-глутамилтранспептидаза

ГМК – гладкомышечная клетка

НГ – неделя гестации

НС – нитрат свинца

ЧГ – частичная гепатэктомия

BMP – Bone Morphogenetic Protein, морфогенетический белок кости

CK – Cytokeratin, цитокератин

EMA – Epithelial Membrane Antigen, эпителиальный мембранный антиген

ESA – Epithelial Specific Antigen, эпителиальный специфичный антиген

HGF – Hepatocyte Growth Factor, фактор роста гепатоцитов

HNF – Hepatocyte Nuclear Factor, ядерный фактор гепатоцитов

HSA – Hepatocyte Specific Antigen, специфический антиген гепатоцитов

PCNA – Proliferating Cell Nuclear Antigen, ядерный антиген  пролиферирующих клеток

SDF (SDGF) – Stromal Derived Growth Factor, фактор стромальных клеток

TGF – Transforming Growth Factor, трансформирующий фактор роста

VCAM – Vascular Cell Adhesion Molecule, сосудистая молекула клеточной адгезии


1 Забор биоптатов печени выполнен врачом отделения гастроэнтерологии РКБ МЗ РТ Л.С. Фатхеевой.

2 Данный фрагмент работы выполнен совместно с ассистентом кафедры нормальной анатомии КГМУ к.м.н.  И.М. Газизовым. 

3 Иммуногистохимическое окрашивание с антителами к C-kit выполнено совместно с ассистентом кафедры нормальной анатомии КГМУ к.м.н. Калигиным М.С.

4 Данный фрагмент рабты выполнен совместно со старшим научным сотрудником ЦНИЛ КГМУ к.б.н.  Низамовым Р.С.







© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.