WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

На правах рукописи

Карп Ольга Эдвиновна

ГЕНОТОКСИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ДОЛГОЖИВУЩИХ РАДИКАЛОВ БЕЛКА, ИНДУЦИРОВАННЫХ РЕНТГЕНОВСКИМ ИЗЛУЧЕНИЕМ

03.01.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино – 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук и в Пущинском государственном естественно-научном институте Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Брусков Вадим Иванович кандидат биологических наук Гудков Сергей Владимирович

Официальные оппоненты:

Новоселова Елена Григорьевна - доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биофизики клетки РАН, главный научный сотрудник лаборатории механизмов рецепции Безлепкин Владимир Георгиевич - кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, заведующий лабораторией радиационной молекулярной биологии

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Филиал института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится «18» октября 2012 г. в 15 ч. 30 мин. на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002.038.01 при Федеральном государственном бюджетном Учреждении науки Институте биофизики клетки Российской академии наук по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3.

Автореферат разослан «______» _______________ 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Смолихина Татьяна Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Воздействие ионизирующего излучения на живые организмы может происходить как за счет прямого действия – возбуждения и ионизации макромолекул, так и путем косвенного действия – образующихся в результате радиолиза воды высокореакционных свободных радикалов [Кудряшов, 2004]. Преобладающая часть повреждений биополимеров в клетке, индуцированных ионизирующей радиацией, образуется в результате окислительного стресса. Окислительный стресс – это нарушение в биологической системе баланса между прооксидантами и возможностью их нейтрализации в системе антиоксидантной защиты [Halliwell, Gutteridge, 1982]. При воздействии ионизирующего излучения окислительный стресс обусловлен образованием активных форм кислорода (АФК) в результате радиолиза воды [Ward, 1988]. Поскольку АФК, за исключением перекиси водорода, являются короткоживущими продуктами, то этот процесс происходит непосредственно во время облучения.

Для нейтрализации избыточного количества АФК в клетках имеется многофункциональная система антиоксидантной защиты в виде разнообразных перехватчиков радикальных продуктов радиолиза воды, а также ферментных систем нейтрализации радикалов. Увеличение внутриклеточной концентрации АФК свыше возможности их нейтрализации системой антиоксидантной защиты клетки вызывает окислительный стресс, приводящий к повреждениям биологических молекул и необходимости их элиминации или репарации. Возникает необходимость активизации различных защитных и адаптационных клеточных механизмов для преодоления повреждающих последствий окислительного стресса.

Определенное количество АФК постоянно образуется в клетке в результате нормальных аэробных биохимических реакций и необходимо для осуществления редокс-регуляции различных клеточных функций.

Существенная роль в сигнально-регуляторных клеточных процессах принадлежит перекиси водорода – долгоживущей формы АФК [Stone, Yang, 2006; Forman, Maiorino, Ursini, 2010].

В настоящее время установлено, что при воздействии высоких доз ионизирующей радиации на биологические объекты мишенями являются вода и белки. Белки являются более чувствительной мишенью, чем ДНК и липиды для реакции с гидроксильным радикалом (ОН•) – наиболее реакционноспособной АФК [Du, Gebicki, 2004]. Это обусловлено тем, что среди биополимеров содержание белкового компонента в клетке является наибольшим и составляет около 15% ее общей массы и 70% сухой массы [Gracanin et al., 2011] и они содержат ряд высокореакционных групп [Shtarkman et al., 2008].

При повреждении белков ионизирующей радиацией в присутствии кислорода возникает ряд окисленных продуктов, время полужизни которых может составлять несколько часов и более [Stadtman, 1993]. Среди них важную роль занимают гидропероксиды белков и аминокислот [Rahmanto et al., 2010].

Первичное окисление белков и свободных аминокислот с образованием их пероксидов может вызывать ряд цепных реакций, что в конечном итоге приводит к повреждению других биомолекул, включая ДНК и белки [Rahmanto et al., 2010]. Предполагается, что окисление белков свободными радикалами участвует в процессе клеточного старения и инициирует ряд болезней человека [Hawkins, Davies, 2001].

Под влиянием ионизирующей радиации, наряду с короткоживущими продуктами радиолиза воды, в клетках млекопитающих образуются долгоживущие радикалы, преимущественно локализованные на белках [Kumagai et al., 2002]. С помощью метода ЭПР установлено, что при воздействии высоких доз ионизирующей радиации (кГр) в клетках и в растворах различных белков образуются долгоживущие радикалы белков (ДЖРБ) [Koyama et al., 1998, Kumagai et al., 2002], время полужизни которых достигает 20 ч [Miyazaki et al., 2002]. В настоящее время возникновение ДЖРБ показано для многих белков под влиянием ионизирующего излучения и ряда других воздействий. ДЖРБ образуются под воздействием гамма, рентгеновского, ультрафиолетового излучений, пероксинитрита и продуктов разложения перекиси водорода иммобилизованной пероксидазой [Гудков и др., 2007]. Под влиянием ДЖРБ в ДНК in vitro происходит образование 8оксогуанина (8-оксо-7,8-дигидро-8-оксогуанина) – биомаркера повреждений ДНК, вызываемых АФК [Luxford et al., 1999, 2000; Furukawa et al., 2005;

Midorikawa, 2005; Гудков и др., 2007]. Установлено, что ДЖРБ in vivo вызывают мутации и приводят к трансформации клеток [Koyama et al., 1998].

В небольших количествах ДЖРБ образуются в клетках животных и растений при их нормальной жизнедеятельности [Miyazaki et al., 2002].

Было показано, что аминокислоты, так же, как и белки, способны к образованию долгоживущих радикалов в результате воздействия ионизирующего излучения [Блюменфельд, Калмансон, 1958; Гудков и др., 2010].

В связи с этим актуальным является исследование возможности индукции пролонгированного окислительного стресса долгоживущими радикалами белка (ДЖРБ) после облучения, их роли в окислительном повреждении ДНК и генотоксического действия в клетках млекопитающих.

Цель и основные задачи исследования. Цель данной работы заключалась в исследовании генотоксического потенциала ДЖРБ, индуцированных рентгеновским излучением.. В соответствии с целью были поставлены основные задачи:

1. Выявить образование ДЖРБ in vitro при воздействии ионизирующего излучения в дозе 10 Гр и определить время их полужизни.

2. Исследовать генерацию активных форм кислорода под влиянием ДЖРБ как механизм индукции пролонгированного окислительного стресса после воздействия ионизирующего излучения.

3. Определить способность ДЖРБ вызывать окислительные повреждения ДНК in vitro и in vivo.

4. Установить возможность нейтрализации окислительного стресса, обусловленного ДЖРБ, некоторыми природными антиоксидантами после облучения.

Научная новизна. Впервые установлено образование АФК (1О2, НО2•, Н2О2 и ОН•) в водных растворах под действием ДЖРБ, индуцированных рентгеновским излучением, а также исследован физико-химический механизм этого процесса. Образование АФК под влиянием ДЖРБ является причиной повреждений ДНК в модельных системах in vitro и длительного протекания окислительного стресса после воздействия ионизирующей радиации в организме млекопитающих, приводящего к повреждениям ДНК в клетках их красного костного мозга.

Впервые показана способность ДЖРБ, индуцированных рентгеновским излучением, вызывать окислительные повреждения в ДНК in vivo при их внутривенном, внутрибрюшинном и пероральном введении. Установлено, что потребление грызунами некоторых природных антиоксидантов после облучения позволяет значительно снизить окислительные повреждения ДНК, обусловленные ДЖРБ, в клетках их красного костного мозга.

Научно-практическая ценность. Разработана методика регистрации ДЖРБ с применением хемилюминесценции белковых растворов, индуцированной рентгеновским излучением. Показан распад ДЖРБ, индуцированных ионизирующим излучением, и потеря их генотоксических свойств через сутки после облучения. Установлена возможность эффективной нейтрализации окислительного стресса и генотоксического действия, обусловленного ДЖРБ природными антиоксидантами – инозином (рибоксином), метионином и триптофаном.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 1112, 14-15-й конференциях молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2007-2008, 2010-2011), на конференции «Биомедицинская инженерия» (Пущино, 2007), на VIII Международном симпозиуме «Биологические механизмы старения» (Харьков, 2008), на Конгрессе «Медико-биологические проблемы токсикологии и радиологии» (СанктПетербург, 2008, 2011), на конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Белоруссия, Минск, 2008), на VIII конференции молодых ученых, специалистов и студентов, посвященной Дню космонавтики (Москва, 2009), на IX Международном симпозиуме «Биологические механизмы старения» (Украина, Харьков, 2010), на III Всероссийском конгрессе «Симбиоз-Россия 2010» (Нижний Новгород, 2010), на VIII Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2010), на VI Съезде по радиационным исследованиям (Москва, 2010), на VII Международной Крымской конференции «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии» (Украина, Судак, 2011), на конференции «Радиация и Чернобыль: Наука и практика». (Белоруссия, Гомель, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 29 работ, из них 7 статей в рецензируемых журналах, 4 - из списка ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы (главы), методической части, полученных результатов и их обсуждения (главы), заключения, выводов, списка цитируемой литературы (204 источника).

Работа иллюстрирована 13 рисунками и содержит 8 таблиц.

Список принятых сокращений. АФК – активные формы кислорода;

ДЖРБ – долгоживущие радикалы белка; 8-OG – 8-оксогуанин (8-оксо-7,8дигидро-8-оксогуанин); OH – гидроксильный радикал; О2 - – супероксиданион радикал; О2 – синглетный кислород; Guo – гуанозин; Ino – инозин;

ПХЭ – полихроматофильные эритроциты; МЯ – микроядра; ЭПР – электронный парамагнитный резонанс; БСА – бычий сывороточный альбумин;

КСА – крысиный сывороточный альбумин.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Получение крысиного сывороточного альбумина Крысиный альбумин был получен методом гель-фильтрации крысиной сыворотки на сефадексе G-100. В качестве свидетеля был использован БСА.

Собранная фракция альбумина была лиофильно высушена, после чего сухой белок был растворен в изотоническом растворе NaCl. Раствор альбумина вводился животным в хвостовую вену в объеме 1 мл из расчета 1 мг/г живого веса. Концентрация альбумина определялась по методу Лоури [Lowry et al., 1951].

Обезвоживание творога Для скармливания мышам использовали полностью обезжиренный пищевой творог, содержащий 18% белка, который дополнительно обезвоживали. Избыток влаги удаляли с помощью фильтровальной бумаги и высушивали потоком теплого воздуха в течение 6 ч. В результате такой сушки содержание белка в используемом твороге составляло 45%, а мыши им охотно питались.

Облучение Облучение проводили на рентгеновской терапевтической установке РУТ-15 (15 мA, 200 кВ) (МосРентген, Россия) при мощности дозы 1 Гр/мин (фокусное расстояние 0,375 м). При облучении ДНК in vitro использовалась мощность 4 Гр/мин (фокусное расстояние 0,195 м) [Гудков и др., 2009].

Тотальное облучение животных проводили в специальной клетке, препятствуя их перемещению.

Животные В экспериментах были использованы самцы аутбредных мышей Kv:

SHK в возрасте от пяти до шести недель и весом 18 22 г, а также самцы крыс линии Вистар массой 140 ± 15 г и возрастом 5 недель (питомник Крюково, Российская академия медицинских наук). Животные содержались в виварии при температуре 23 ± 3°С и получали стандартную диету со свободным доступом к гранулированному коммерческому корму для мышей (Арно, Москва) и водопроводной воде.

Хемилюминесценция белковых растворов Исследование долгоживущих радикалов белка (ДЖРБ) осуществляли методом измерения хемилюминесценции растворов белков, индуцированной рентгеновским излучением с использованием высокочувствительного хемилюминометра Биотокс-7АМ (Экон, Москва). Измерения проводили в темноте, при комнатной температуре, в пластиковых полипропиленовых флаконах для жидкостного сцинтилляционного счета объемом 20 мл (Beckman, США). Использование больших по сравнению со стандартными (0,мл) объемов позволило повысить чувствительность почти в 200 раз. После воздействия рентгеновского излучения все образцы выдерживали в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин. Контролями служили исследуемые белки, не подвергавшиеся воздействию рентгеновского излучения, необлученные и облученные в дозах 10, 20 Гр среды для растворения данных соединений.

Иммуноферментный анализ (ИФА) Для количественного определения 8-оксогуанина в ДНК использовали неконкурентный иммуноферментный анализ с использованием моноклональных антител, специфичных к 8-оксогуанину. Использовали метод иммобилизации ДНК [Hirayama, Tamaoka, Horikoshi, 1996].

Облученные образцы ДНК (800 мкг/мл) денатурировали кипячением на водяной бане 6 мин и охлаждали во льду 20 мин. Аликвоты (40 мкл) наносили на дно лунок 96-луночных планшет Costar. ДНК иммобилизовали с помощью простой процедуры адсорбции при высушивании в течение 1,5 ч при 80 С.

Блокировали неспецифические места адсорбции, используя на каждую лунку планшета 300 мкл блокирующего раствора, содержащего 1% казеина в 0,15 М Трис-HCl буфере, рН 8,5, и 0,15 М NaCl. После этого планшеты инкубировали при 30оС в течение 2 ч на планшетном шейкере ST-3 (Elmi, Латвия).

Образование комплекса антиген-антитело с антителами (50 мкл/лунку), специфичными к 8-оксогуанину (в разведении 1:1000), проводили в блокирующем растворе путем инкубации в течение 2 ч при 37 С. Дважды промывали (300 мкл/лунка) раствором 50 мМ Трис-HCl буфер, рН 8,5, и 0,М NaCl на шейкере. Затем формировали комплекс с конъюгатом (антимышиным иммуноглобулином, меченным пероксидазой хрена (1:1000) в блокирующем растворе (50 мкл/лунка), инкубируя 2 ч при 37 С. Промывали лунки 1 раз с добавлением 1% Тритон Х-100 и 2 раза аналогично тому, как описано выше. Далее добавляли хромогенный субстрат – 18,2 мМ ABTS и перекись водорода (2.6 мМ) в 0,05 М цитратном буфере, рН 4.0 (1мкл/лунку). По достижении окрашивания, реакцию останавливали добавлением равного объема 1,5 мМ NaN3 в 0,1 М цитратном буфере, рН 4,0.

Оптическую плотность образцов измеряли на планшетном фотометре (Titertek Multiscan, Финляндия) при =405 нм.

Микроядерный тест Цитогенетические повреждения клеток красного костного мозга крыс и мышей определяли по образованию полихроматофильных эритроцитов (ПХЭ), содержащих микроядра (МЯ). Мышей умерщвляли методом цервикальной дислокации через 28 ч после воздействия (рентгеновское излучение, введение крысиного сывороточного альбумина, потребление творога), поскольку максимальный выход ПХЭ с МЯ наблюдается примерно через сутки [Gudkov et al., 2009]. Гистологические препараты готовили по стандартной методике с некоторыми модификациями [Asadullina et al., 2010]. При подсчете ПХЭ, содержащих МЯ, использовали световой микроскоп “МикМед-2”(ЛОМО, Спб) с иммерсионным объективом при увеличении х1000.

Определение перекиси водорода Для количеcтвенного опpеделения перекиси водорода иcпользовали выcокочувcтвительный метод уcиленной xемилюминеcценции в cиcтеме люминол–p-йодофенол–пеpокcидаза [Bruskov et al., 2002; Gudkov et al., 2006].

В качеcтве xемилюминометpа иcпользовали жидкоcтный cцинтилляционный cчетчик «Бета-1» (МедАппаратура, Укpаина) для измеpения -излучения, pаботающий в pежиме cчета одиночныx фотонов (без cxемы cовпадений).

Чувcтвительноcть метода позволяла опpеделять Н2О2 в концентpации менее нМ. Cодеpжание Н2О2 pаccчитывали, иcпользуя калибpовочные гpафики завиcимоcти интенcивноcти xемилюминеcценции от извеcтной концентpации пеpекиcи водоpода в pаcтвоpе. Иcxодную концентpацию Н2О2, иcпользуемую для калибpовки, опpеделяли cпектpофотометpичеcки пpи длине волны 240 нм c иcпользованием коэффициента моляpного поглощения 43,6 М–1.cм–1.

Определение концентрации гидроксильных радикалов Для количественного определения концентрации гидроксильных радикалов в растворе использовали специфичный для ОН-радикалов флуоресцентный зонд – кумарин-3-карбоновую кислоту [Manevich, Held, Biaglow, 1997]. Интенсивность флуоресценции измеряли на спектрофлуориметре Cary Eclipse (Varian, Австралия) с ex = 400 нм, em = 4нм. Калибровку производили с помощью коммерческой 7-ОН-кумарин-3карбоновой кислоты.

Определение концентрации растворенного кислорода Бидистиллированную воду дополнительно насыщали аргоном или кислородом путем барботирования в течение 15 мин. Сухие облученные навески БСА растворяли в концентрации 1 г/л в обогащенной этими газами воде. Концентрацию кислорода в растворе измеряли на приборе Oxygraph-2K (Оroboros, Австрия) и на приборе Эксперт-001 (Эконикс, Москва).

Статистический анализ Все данные представлены как средние значения и их стандартные ошибки. При проверке статистической достоверности различий между группами сравнения использовали t-критерий Стъюдента.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Образование долгоживущих радикалов белка Методом индуцированной рентгеновским излучением хемилюминесценции белка исследовано влияние различных доз рентгеновского излучения на образование долгоживущих радикалов.

Установлено, что интенсивность хемилюминесценции растворов бычьего сывороточного альбумина (БСА), овальбумина и казеина линейно зависит от поглощенной дозы рентгеновского излучения в интервале 5-50 Гр.

Для определения времени полужизни ДЖРБ исследовано изменение интенсивности хемилюминесценции раствора облученного БСА, овальбумина и гидролизата казеина в дозе 10 Гр от времени после воздействия рентгеновского излучения. Результаты представлены на рис.1.

Рис.1. Изменение во времени интенсивности 4люминесценции растворов гидролизат казеина бычьего сывороточного овальбумин альбумина (1 г/л), БСА овальбумина (10 г/л) и 3гидролизата казеина (1 г/л), облученных рентгеновскими лучами в 2дозе 10 Гр.

Данные представлены, как среднее значение ± 1стандартная ошибка среднего значения для трех независимых экспериментов. Фоновые значения люминесценции 0 1 2 3 4 5 вычтены из полученных ремя после облучения, ч результатов Время полужизни радикалов овальбумина и казеина, установленное данным методом при дозе 10 Гр, составляет около 5.5 ч и 2.5 ч соответственно.

2. Образование АФК в водной среде под влиянием долгоживущих радикалов бычьего сывороточного альбумина В ряде исследований показано, что наиболее вероятный механизм индуцированного ДЖРБ повреждения других биологических молекул, включая ДНК [Гудков и др., 2010; Гудков и др., 2010а; Luxford et al., 2000;

Furukawa et al., 2005], может быть обусловлен радикал-индуцированным процессом, происходящим после радиационного воздействия [Davies et al., 1995]. В данной работе была исследована способность индуцированных рентгеновским излучением ДЖРБ БСА генерировать АФК в водном растворе.

Сухие навески БСА облучали в дозах 10-50 Гр, растворяли в 20 мМ ТрисHCl Интенсивность люминесценции, имп/мин буфере (рН 8,5) до конечной концентрации 1 г/л и определяли продукцию Н2О2 методом усиленной хемилюминесценции в системе люминол-4йодфенол-пероксидаза хрена [Bruskov et al., 2002; Bruskov et al., 2012]. Такая постановка опыта позволила избавиться от перекиси водорода, образующейся в водных растворах при радиолизе воды, и регистрировать только перекись водорода, образующуюся под влиянием ДЖРБ.

Установлена генерация перекиси водорода в водных растворах под действием ДЖРБ. Показана зависимость образования перекиси водорода под влиянием облученного БСА (1 г/л) при различных временах после облучения (рис. 2). Способность к генерации Н2О2 в растворе уменьшается примерно в два раза через 2,5-3 часа с зависимостью, близкой к экспоненциальной.

Рис.2. Образование перекиси водорода, индуцированное 10 Гр долгоживущими радикалами БСА, 20 Гр образующимися при рентгеновском 30 Гр облучении in vitro в дозах 10 - 50 Гр, 50 Гр через различные промежутки времени. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего значения для трех независимых экспериментов.

Фоновые концентрации перекиси водорода вычтены из полученных результатов 0 1 2 Время после облучения, ч Для выяснения механизма образования перекиси водорода в растворе облученного БСА было исследовано влияние различных факторов на этот процесс. Установлен кислородный эффект – влияние концентрации растворенного кислорода на продукцию перекиси водорода, индуцированную ДЖРБ (табл. 1). Генерация перекиси водорода под влиянием облученного БСА через 15 мин после облучения в дополнительно насыщенной кислородом воде на 30% выше, чем в контроле, и на 50% ниже при насыщении аргоном (табл.1).

С помощью супероксиддисмутазы (СОД) показано участие супероксиданионрадикалов в образовании перекиси водорода в воде при воздействии ДЖРБ.

СОД увеличивает концентрацию Н2О2 в результате дополнительной дисмутации этих радикалов на 30%. Добавление тирона, являющегося спиновой ловушкой радикалов, уменьшает концентрацию перекиси водорода в растворе на 90%. Была исследована возможная роль синглетного кислорода в процессе генерации Н2О2, индуцированной ДЖРБ. Добавление азида натрия, избирательного тушителя О2, на 30% уменьшает генерацию перекиси водорода под действием ДЖРБ. Добавление гуанозина – перехватчика [H O ], нM синглетного кислорода, уменьшает генерацию перекиси водорода под воздействием ДЖРБ на 70%. Под влиянием 25% D2O, которое увеличивает время жизни 1О2 в растворе, в 1,5 раза увеличивается концентрация Н2О2. Эти данные доказывают участие синглетного кислорода в процессе образования Н2О2.

Таблица 1. Влияние различных условий на образование Н2О2 в водных растворах под воздействием БСА, предварительно облученного в дозе 10 Гр. Приведены средние значения трех независимых экспериментов и их стандартные ошибки. Фоновые концентрации перекиси водорода вычтены из полученных результатов * – Статистически достоверное отличие относительно контрольных образцов (р < 0.05).

** – К – относительное изменение величин концентрации Н2О2 к контролю.

*** – Перед воздействием ионизирующего излучения вода в течение 15 мин была насыщена газом при помощи барботировния **** – Азид натрия при данной концентрации не оказывает значительного ингибирующего действия на активность пероксидазы Воздействие [O2], мкМ [Н2О2],нМ К** Контроль 270 5,1 ± 0,4 1,270 6,8 ± 0,4* 1,СОД (10-3 ед./мл) Тирон (100 нМ) 270 0,7 ± 0,4* 0,Барботирование Ar (15 мин)*** 130 2,4 ± 0,1* 0,Барботирование О2 (15 мин)*** 475 6,6 ± 0,2* 1,D2O (25%) 270 7,5 ± 0,5* 1,Азид натрия (100 мкM)**** 270 3,6 ± 0,3* 0,Гуанозин (1 мM) 270 1,4 ± 0,2 0,Полученные результаты можно обобщить с помощью следующей схемы последовательных реакций образования Н2О2 под действием ДЖРБ.

–NH–RС H–CO– –NH–RС –CO– + Н (1) Н + 1О2 НО2 (2) НО2 + НО2 Н2О2 + 1О2 (3) В результате воздействия рентгеновского излучения на белковую молекулу происходит отщепление радикала водорода от -углеродных атомов полипептидной цепи (реакция 1). Образование -углеродного радикала в БСА показано методом ЭПР [Davies et al., 1995]. Радикал водорода, реагируя с растворенным в воде кислородом в синглетном состоянии [Bruskov et al., 2002], продуцирует гидроперекисный радикал (реакция 2). Дальнейшая дисмутация этих радикалов приводит к образованию Н2О2 (реакция 3). Следует отметить, что в реакции спонтанной дисмутации гидроперекисных радикалов возникает кислород в электронно-возбужденном синглетном состоянии, а его удаление должно способствовать более интенсивному протеканию реакции образования Н2О2. Наряду с этим, существует еще один возможный путь образования Н2О2 [Stadtman, 1993]:

–NH–RС –CO– + О2 –NH–RС OO –CO– (4) –NH–RС OO –CO– –N=RС –CO– + НО2 (5) НО2 + НО2 Н2О2 + 1О2 (3) Реакция -углеродного радикала с кислородом приведет к формированию алкилпероксильного радикала (реакция 4). Быстрая внутримолекулярная элиминация пероксильных радикалов при -углеродном атоме приводит к генерации гидроперекисного радикала в растворе (реакция 5) [Hawkins, Davies, 2001]. Образование Н2О2 в этом случае также будет продуктом дисмутации этих радикалов (реакция 3).

Была исследована возможность образования гидроксильных радикалов в растворе под влиянием облученного БСА. Гидроксильные радикалы определяли с помощью высокоспецифичного фуоресцентного зонда кумарин3-карбоновой кислоты (ККК) [Гудков и др., 2012]. Схема проведения опытов была аналогична схеме определения перекиси водорода. В течение пострадиационного периода наблюдается экспоненциальное уменьшение способности облученного БСА к генерации гидроксильных радикалов, так же, как и к генерации перекиси водорода. Образование гидроксильных радикалов в воде при действии ДЖРБ, вероятно, происходит за счет распада образовавшейся перекиси водорода в присутствии восстановителя. Известно, что сывороточные альбумины связывают ионы металлов переменной валентности (железо, медь), которые играют роль восстановителя перекиси водорода, вызывая ее распад до гидроксильных радикалов и гидроксиланионов [Roche et al., 2008].

Полученные данные свидетельствуют о том, что ДЖРБ могут длительное время осуществлять генерацию АФК – перекиси водорода и гидроксильных радикалов. Этот процесс может быть причиной длительного протекания окислительного стресса после воздействия исследованных доз ионизирующей радиации и повреждений ДНК в клетке и модельных системах in vitro.

3. Образование 8-оксогуанина в ДНК in vitro под действием долгоживущих радикалов бычьего сывороточного альбумина Можно полагать, что АФК, индуцированные ДЖРБ, продлевают окислительный стресс и являются причиной окислительного повреждения других биологических молекул, включая ДНК. Методом иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител исследовано образование 8-оксогуанина – биомаркера окислительных повреждений ДНК – в растворе ДНК под действием облученного БСА in vitro. На рис.3 показана дозовая зависимость образования 8-оксогуанина в ДНК под действием рентгеновского излучения или долгоживущих радикалов БСА.

0 10 Доза, Гр Рис.3. Зависимость образования 8-оксогуанина (8-OГ) в ДНК под действием ионизирующей радиации или молекул БСА (1 г/л), подвергнутых воздействию ионизирующей радиации.

Фоновые значения вычтены из полученных результатов. Данные представлены как средние значения и их стандартные ошибки для трех независимых экспериментов.

– ДНК (10 и 20 Гр), проинкубированная в течение 2,5 ч с раствором БСА (0 Гр); – ДНК (0 Гр), проинкубированная в течение 2,5 ч с раствором БСА (10 и 20 Гр);

– ДНК (0 Гр), проинкубированная в течение 2,5 ч с буфером для растворения БСА (0 Гр), облученным в дозах 10 и 20 Гр Инкубация ДНК с облученным в дозах 10 или 20 Гр раствором БСА в течение 2,5 ч в присутствии иммобилизованной каталазы приводит к образованию в ДНК 8-оксогуанина. Доля повреждений, опосредованная облученным белком, по сравнению с тотальным облучением ДНК в той же дозе, является значительной, и составляет 35 %. При увеличении (свыше 2,часов) времени инкубации ДНК с облученным белком дополнительного образования 8-оксогуанина не наблюдалось. Полученный результат показывает высокую эффективность повреждения ДНК, опосредованную облученным белком. Инкубация ДНК с облученным в дозах 10 или 20 Гр буфером для растворения БСА в течение 2,5 ч не приводит к образованию в ДНК 8-оксогуанина. Кросс-реакций первичных антител с молекулами БСА не наблюдалось. Аналогичные результаты были получены и для облученных рентгеновским излучением растворов овальбумина.

Некоторые низкомолекулярные биоантиоксиданты способны элиминировать ДЖРБ. Установлено, что эффективным перехватчиком ДЖРБ является витамин С [Koyama et al., 1998; Kumagai et al., 2002; Luxford et al., 1999]. Эпигаллокатехингаллат, компонент зеленого чая, при добавлении после воздействия ионизирующего излучения элиминирует белковые радикалы и уменьшает частоту мутаций в облученных клетках [Kumagai et al., 2002].

Показано, что галловая [Kumagai et al., 2003] и мочевая [Pietraforte, Minetti, 1997] кислоты также нейтрализуют ДЖРБ.

Количество молекул 8-OG на 10 G ДНК Ранее установлено, что пуриновые рибонуклеозиды – гуанозин и инозин – являются природными биоантиоксидантами и радиопротекторами, и увеличивают выживаемость животных при введении их после воздействия ионизирующей радиации [Гудков и др., 2008]. Поэтому нами была исследована возможность элиминации окислительных повреждений ДНК долгоживущими радикалами БСА с помощью ряда природных антиоксидантов. Были использованы гуанозин, инозин, L-аминокислоты – метионин и триптофан, а также витамин С в концентрации 1 мМ. Полученные результаты представлены на рис.4.

* * * * * * 1 2 3 4 5 6 Рис.4. Образование 8-оксогуанина в ДНК под действием долгоживущих радикалов облученного в дозе 10 Гр БСА (1 г/л) и влияние некоторых антиоксидантов (1 мМ) на этот процесс. Фоновые значения вычтены из полученных результатов. Данные представлены как средние значения и их стандартные ошибки для трех независимых экспериментов.

1 – ДНК, облученная в дозе 10 Гр; 2 – БСА, облученный в дозе 10 Гр;

3 – БСА, облученный в дозе 10 Гр с добавлением Guo, 4 – Ino, 5 - Met L, 6 - Trp L; 7 - vit. C * – Статистически достоверное отличие относительно контрольных образцов -группа 2- (р < 0,05) Было показано, что с помощью этих антиоксидантов можно существенно уменьшить повреждающий эффект долгоживущих радикалов БСА. Данные вещества снижали уровень окисленного гуанина в ДНК, образующегося под воздействием долгоживущих радикалов БСА, гуанозин – на 56%, инозин – на 93 %, метионин – на 80 %, триптофан – на 67 % и витамин С – на 50 %.

Количество молекул 8-OG на 10 G ДНК 4. Образование полихроматофильных эритроцитов с микроядрами в клетках красного костного мозга животных под влиянием долгоживущих радикалов белка Методом микроядерного теста исследована способность ДЖРБ, индуцированных рентгеновским излучением, вызывать пролонгированный окислительный стресс и приводить к окислительным повреждениям в ДНК in vivo.

Изучено влияние облученного крысиного сывороточного альбумина (КСА) при внутривенном введении его самцам крыс Вистар на образование микроядер (МЯ) в полихроматофильных эритроцитах (ПХЭ) костного мозга.

Опытной группе из четырех животных внутривенно был введен растворенный в 0,9%-ом растворе NaCl крысиный сывороточный альбумин в дозе 1 мкг/г, облученный в дозе 100 Гр через 15 мин после облучения. Контрольные группы состояли из четырех-пяти особей каждая: 1) интактные животные, которым внутривенно был введен 0,9% NaCl; 2) животные, которым был введен 0,9% NaCl, облученный в дозе 100 Гр; 3) животные, которым был введен раствор КСА в 0,9% NaCl, облученный в дозе 100 Гр и выдержанный 24 ч после облучения; 4) животные, тотально облученные в дозе 1 Гр. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2. Образование микроядер (МЯ) в полихроматофильных эритроцитах (ПХЭ) костного мозга крыс при внутривенном введении КСА, облученного в дозе 100 Гр. Данные представлены как средние значения и их стандартные ошибки.

1 – введение 0,9% NaCl без облучения; 2 – введение 0,9% NaCl, облученного в дозе 100 Гр;

3 – введение КСА через 24 ч после облучения в дозе 100 Гр;

4 – введение КСА, облученного в дозе 100 Гр, сразу после облучения;

5 – крысы, тотально облученные в дозе 1 Гр.

* - статистически достоверное отличие от группы 1 (p < 0,05) № Воздействие Число Число Число ПХЭ с МЯ, % животных ПХЭ ПХЭ с МЯ 1 0 Гр 4 13851 65 0,47 ± 0,2 NaCl 0,9% 100 Гр 4 16187 128 0,79 ± 0,02** 3 КСА 100 Гр (24 ч) 4 10961 71 0,64 ± 0,4 КСА 100 Гр 4 9706 127 1,26 ± 0,18** 5 1 Гр 5 13927 305 2,19 ± 0,12** Процент ПХЭ, содержащих МЯ, в группе животных, которым внутривенно вводили КСА, облученный в дозе 100 Гр, был в 2,7 раза больше, чем у контрольных животных.

Для оценки генотоксического влияния продуктов, образующихся при радиолизе раствора NaCl, крысам вводили изотонический раствор NaCl, облученный в дозе 100 Гр. Установлено, что около 40% генотоксического эффекта раствора КСА обусловлено эффектом облученного раствора NaCl.

Введение белка через 24 ч после его облучения, когда, по нашим данным, происходит полный распад ДЖРБ, не показало достоверных отличий в содержании МЯ по сравнению с группой интактных животных.

Поскольку нами была показана линейная дозовая зависимость образования микроядер при тотальном рентгеновском облучении мышей (рис.

5), можно полагать о существовании линейной зависимости также и у крыс.

Таким образом, можно рассчитать, что внутривенное введение раствора альбумина, облученного в дозе 100 Гр, вызывает такое же количество цитогенетических повреждений, как тотальное разовое облучение в дозе около 0,3 Гр.

Рис.5. Зависимость количества микроядер (МЯ) в полихроматофильных эритроцитах (ПХЭ) красного костного мозга мышей от дозы рентгеновского излучения 0,0 0,5 1,0 1,Доза, Гр Было исследовано влияние скармливания облученного обезжиренного и обезвоженного творога самцам белых мышей Kv:SHK на формирование МЯ в ПХЭ их костного мозга. Мыши в течение 24 ч в качестве пищи получали творог, облученный рентгеновскими лучами в дозе 100 Гр. Были использованы следующие группы мышей: 1) получавшие необлученный творог; 2) получавшие творог, облученный в дозе 100 Гр и выдержанный в течение 24 ч для элиминации долгоживущих радикалов белка; 3) получавшие творог, облученный в дозе 100 Гр. Мыши потребляли в среднем 2,5 г творога на животное за 24 ч, т.е. около 0,1 г облученного белка на грамм живого веса.

Для питья использовали растворы природных антиоксидантов: инозина, Lметионина, L-триптофана и аскорбиновой кислоты в дистиллированной воде в концентрации 5 мМ. Полученные результаты представлены в таблице 3 и на рис. 6.

При потреблении мышами облученного в дозе 100 Гр творога в течение 24 ч происходит увеличение содержания МЯ в ПХЭ их костного мозга на 50% по сравнению с группой интактных животных. Эти результаты свидетельствует о способности ДЖРБ сохранять свой окислительный потенциал и при переваривании пищи [Карп и др., 2010]. При потреблении творога через 24 ч после его облучения, когда, по нашим данным, происходит полный распад ПХЭ с МЯ, % ДЖРБ, не выявлено достоверных отличий в количестве МЯ по сравнению с группой контрольных животных. Так как увеличение количества микроядер в клетках красного костного мозга линейно зависит от дозы рентгеновского излучения (рис.5), то потребление мышами облученного в дозе 100 Гр творога вызывает такое же количество цитогенетических повреждений, как тотальное разовое облучение в дозе около 0.1 Гр.

Таблица 3. Влияние скармливания обезжиренного и обезвоженного творога, облученного в дозе 100 Гр, на образование микроядер (МЯ) в полихроматофильных эритроцитах (ПХЭ) костного мозга мышей. 1 – контрольная группа – необлученные животные; 2 – контрольная группа – необлученные животные, в качестве корма использовали необлученный творог; 3 – в качестве корма использовали творог, облученный в дозе 100 Гр; 4 – использовали творог, облученный в дозе 100 Гр и выдержанный в течение 24 ч для распада ДЖРБ.

* – статистически достоверное отличие от группы 2 (p < 0.05) № Воздействие Число Число Число ПХЭ с МЯ, % животных ПХЭ ПХЭ с МЯ 1 0 Гр 7 12373 54 0,49 ± 0,2 белок 0 Гр 7 15342 73 0,50 ± 0,3 белок 100 Гр 11 26126 177 0,69 ± 0,04* 4 белок 100 Гр 24 ч 4 8231 43 0,51 ± 0,При одновременном приеме с питьевой водой природных антиоксидантов – 5 мM растворов инозина, L-триптофана и L-метионина – наблюдалось снижение количества микроядер в красном костном мозге мышей до исходных значений, статистически не отличающихся от группы интактных животных. При приеме раствора витамина С наблюдалось уменьшение прироста количества микроядер на 30% (рис. 6).

Рис.6. Влияние некоторых антиоксидантов при их 0,* совместном введении с облученным * обезжиренным творогом 0,(per os) на выход ПХЭ с МЯ в красном костном мозге мышей.

1 – контрольная группа, в 0,качестве корма использовали необлученный творог;

0,2 – в качестве корма использовали творог, облученный в дозе 100 Гр;

3-6 – в качестве корма 0,использовали творог, 1 2 3 4 5 облученный в дозе 100 Гр, и дополнительно в качестве питья – 5 мМ растворы антиоксидантов - Met L (3), Trp L; (4), Ino (5), витамин C (6).

* - статистически достоверное отличие от группы 1, (p < 0.05) ПХЭ с МЯ, % Основным белком, входящим в состав обезжиренного творога, является казеин, который в процессе пищеварения расщепляется до отдельных аминокислот. Результаты, полученные для облученного творога, позволили предполагать, что механизмом повреждающего действия ДЖРБ при пероральном введении может являться генотоксическое действие долгоживущих радикалов аминокислот.

В связи с этим было исследовано генотоксическое действие раствора гидролизата казеина, облученного в дозе 100 Гр, при введении его внутрибрюшинно аутбредным мышам Kv:SHK. Установлено, что при внутрибрюшинном введении мышам этого раствора происходит увеличение числа полихроматофильных эритроцитов, содержащих микроядра, в 1,3 раза по сравнению с контролем (таблица 4).

Таблица 4. Влияние гидролизата казеина, облученного в дозе 100 Гр, при внутрибрюшинном введении на образование микроядер в полихроматофильных эритроцитах красного костного мозга мышей.

1 – контроль, введение 0,9% NaCl без облучения; 2 – введение раствора гидролизата казеина (в 0,9 % NaCl, 0,2 мкг/г) без облучения; 3 – введение раствора гидролизата казеина, облученного в дозе 100 Гр; 4 – введение гидролизата казеина, облученного в сухом виде в дозе 100 Гр и затем растворенного для инъекции * – статистически достоверное отличие от контроля (0 Гр) (p < 0,05) № Воздействие N Число Число ПХЭ с МЯ, % ПХЭ ПХЭ с МЯ 1 Контроль (0 Гр) 5 11051 52 0,47 ± 0,2 Гидролизат казеина (0 Гр) 5 10139 36 0,35 ± 0,03* 3 Гидролизат казеина (100 Гр) 5 10665 62 0,58 ± 0,08* 4 Гидролизат казеина (100 Гр) 5 9437 60 0,67 ± 0,12* (сухой) Таким образом, установлено, что облученные белки и аминокислоты способны приводить к повреждению структуры ДНК in vivo, а также показана возможность нейтрализации генотоксических повреждений ДНК с помощью некоторых природных антиоксидантов.

ВЫВОДЫ 1. Показано образование долгоживущих радикалов бычьего сывороточного альбумина, овальбумина и гидролизата казеина при воздействии рентгеновского излучения в диапазоне доз от 5 до 50 Гр. Время полужизни этих радикалов составляет 3, 5,5 и 2,5 часов соответственно.

2. Показана способность индуцированных рентгеновским излучением долгоживущих радикалов белков вызывать окислительные повреждения ДНК in vitro с образованием в ней 8-оксогуанина.

3. Установлен физико-химический механизм повреждающего воздействия долгоживущих радикалов белков, заключающийся в их способности длительное время генерировать активные формы кислорода – перекись водорода и гидроксильные радикалы в водной среде.

4. Установлено, что долгоживущие радикалы белков и аминокислот, индуцированные рентгеновским излучением, способны вызывать образование цитогенетических повреждений в ДНК полихроматофильных эритроцитов красного костного мозга грызунов с образованием микроядер.

5. Использование природных антиоксидантов – Ino, Met L, Trp L – позволяет нейтрализовать последствия окислительного стресса, обусловленного долгоживущими радикалами белков, индуцированными воздействием ионизирующего излучения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах 1. Карп О.Э., Гудков С.В., Гармаш С.А., Штаркман И.Н., Черников А.В., Брусков В.И. Генотоксическое действие in vivo долгоживущих радикалов белка, индуцируемых рентгеновским облучением. // ДАН. 2010. Т. 434, № 3, с. 41242. Гудков С.В., Гармаш С.А., Штаркман И.Н., Черников А.В., Карп О.Э., Брусков В.И. Долгоживущие радикалы белка, индуцируемые рентгеновским облучением, являются источником активных форм кислорода в водной среде // ДАН. 2010. Т. 430, №1, c. 123-13. Гудков С.В., Гармаш С.А., Карп О.Э., Смирнова В.С., Черников А.В., Брусков В.И. Долгоживущие радикалы аминокислот, индуцируемые рентгеновским излучением, являются источником образования перекиси водорода в водной среде. // Биофизика. 2010а. Т. 55, № 4, с. 588-54. Гудков С.В., Карп О.Э., Гармаш С.А., Иванов В.Е., Черников А.В., Манохин А.А., Асташев М.Е., Ягужинский Л.С., Брусков В.И. Образование активных форм кислорода в воде под воздействием видимого и инфракрасного излучения в полосах поглощения молекулярного кислорода. // Биофизика.

2012. Т. 57, № 1, с. 5-5. Гудков С.В., Штаркман И.Н., Карп О.Э., Ассадулина Н.Р., Гармаш С.А., Черников А.В., Брусков В.И. Использование рибоксина (инозина) после рентгеновского облучения для защиты клеток крови мышей. // Нижегородский медицинский журнал. 2008. №4., с. 18-24.

6. Гудков С.В., Тихомиров А.А., Андриевский Г.В., Штаркман И.Н., Асадуллина Н.Р., Гармаш С.А., Карп О.Э., Недзвецкий В.С. ДНК-защитные и радиопротекторные эффекты гидратированного фуллерена С60. // Физика живого. 2009. №. 17, с.82-7. Bruskov V.I., Karp O.E., Garmash S.A., Shtarkman I.N., Chernikov A.V., Gudkov S.V. Prolongation of oxidative stress by long-lived reactive protein species induced by X-ray radiation and their genotoxic action. // Free Radical Research.

doi:10.3109/10715762.2012.7093Участие в научных конференциях и симпозиумах 8. «Биология наука XXI века». 11-я международная Пущинская школаконференция молодых ученых. Пущино. 29 октября – 2 ноября 2007 г. с. Асадуллина Н.Р., Карп О.Э., Гудков С.В., Штаркман И.Н., Брусков В.И.

Антиоксидантные свойства некоторых пуриновых соединений 9. Медицинская биоинженерия – 2007. Пущино. 10-12 декабря 2007 г. с. 14-15.

Гудков С.В., Штаркман И.Н., Гармаш С.А., Карп О.Э., Брусков В.И. Метод определения долгоживущих белковых радикалов, образующихся при воздействии рентгеновского излучения 10. Медицинская биоинженерия – 2007. Пущино. 10-12 декабря 2007 г. с. 24-26.

Карп О.Э., Штаркман И.Н., Гудков С.В., Гармаш С.А., Брусков В.И.

Опрделение 8-оксогуанина в ДНК с помощью иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител 11. VIII международный симпозиум «Биологические механизмы старения».

Харьков. Украина. 21-24 мая 2008 г. с. 23 Гудков С.В., Штаркман И.Н., Карп О.Э., Гармаш С.А., Брусков В.И. Долгоживущие радикалы белка как посредники окислительного стресса с генотоксическими последствиями 12. VIII международный симпозиум «Биологические механизмы старения».

Харьков. Украина. 21-24 мая 2008 г. с. 58 Гудков С.В., Штаркман И.Н., Карп О.Э., Черников А.В., Брусков В.И. Влияние аминокислот на образование активных форм кислорода при воздействии рентгеновского облучения и тепла 13. Медико-биологические проблемы токсикологии и радиологии. СанктПетербург. 29-30 мая 2008 г. с. 211. Гудков С.В., Асадуллина Н.Р., Карп О.Э., Гармаш С.А., Штаркман И.Н., В.И. Брусков. Антиоксидантные и радиозащитные свойства некоторых природных пуриновых соединений 14. Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем. Белоруссия. Минск. 25-27 июня 2008 г. с. 147-149. Штаркман И.Н., Гудков С.В., Гармаш С.А., Карп О.Э., Черников А.В., Брусков В.И.

Долгоживущие радикалы белков, индуцированные рентгеновским излучением, как источники образования активных форм кислорода 15. «Биология наука XXI века». 12-я международная Пущинская школаконференция молодых ученых. Пущино. 10 – 14 ноября 2008 г. с. 170. Гармаш С.А., Гудков С.В., Штаркман И.Н., Карп О.Э., Брусков В.И. Образующиеся при воздействии рентгеновского излучения долгоживущие радикалы белков способны генерировать перекись водорода и гидроксильные радикалы 16. «Биология наука XXI века». 12-я международная Пущинская школаконференция молодых ученых. Пущино. 10 – 14 ноября 2008 г. с. 190. Гудков С.В., Штаркман И.Н., Карп О.Э., Гармаш С.А., Брусков В.И. Образование долгоживущих радикалов белка и аминокислот под воздействием рентгеновского излучения и их генотоксическое действие 17. VIII Конференция молодых ученых специалистов и студентов посвященная дню космонавтики. Москва. 14 апреля 2009. с. 21-22 Карп О.Э., Штаркман И.Н., Гудков С.В., Брусков В.И. Долгоживущие радикалы белка способны повреждать ДНК in vitro и in vivo 18. «Биология наука XXI века» 14 Международная Пущинская школа конференция молодых ученых. Пущино. 19-23 апреля 2010. с. 135 Карп О.Э., Гудков С.В., Брусков В.И. Генотоксическое действие долгоживущих радикалов белка in vivo 19. IX международный симпозиум «Биологические механизмы старения».

Харьков. Украина. 26-29 мая 2010 г. с. 19. Гармаш С.А., Карп О.Э., Гудков С.В., Брусков В.И. Долгоживущие радикалы l-аминокислот как посредники в развитии окислительного стресса 20. III Всероссийский конгресс «Симбиоз-Россия 2010». Нижний Новгород. 24-мая 2010 г. с. 173. Карп О.Э., Смирнова В.С., Асадуллина Н.Р., Иванов В.Е., Гармаш С.А., Гудков С.В., Брусков В.И. Образование цитогенетических повреждений под действием долгоживущих радикалов белка 21. VIII Международная конференция «Биоантиоксидант» Москва. Россия. 4-октября 2010 г., с.111-112. Гармаш С.А., Карп О.Э., Гудков С.В., Брусков В.И.

Долгоживущие радикалы аминокислот как источник образования перекиси водорода в водной среде 22. VIII Международная конференция «Биоантиоксидант» Москва. Россия. 4-октября 2010 г., с.196-197. Карп О.Э., Гудков С.В., Брусков В.И. Повреждения днк in vivo под воздействием долгоживущих радикалов белка и их нейтрализация природными биоантиоксидантами 23. VI съезд по радиационным исследованиям. Москва. 25-28 октября 2010 г. т.1, с. 20. Гармаш С.А., Карп О.Э., Гудков С.В., Брусков В.И. Прооксидантные свойства долгоживущих радикалов L-аминокислот 24. VI съезд по радиационным исследованиям. Москва. 25-28 октября 2010 г. т.1, с. 31. Карп О.Э., Гудков С.В., Черников А.В., Смирнова В.С., Брусков В.И.

Генотоксические свойства долгоживущих радикалов белка, индуцированных рентгеновским излучением 25. «Биология наука XXI века» 15 Международная Пущинская школа конференция молодых ученых. Пущино. 18-22 апреля 2011. с. 124-125. Карп О.Э., Гудков С.В., Брусков В.И. Роль долгоживущих радикалов белка в продлении окислительного стресса in vivo при действии рентгеновского излучения 26. Медико-биологические проблемы токсикологии и радиологии. СанктПетербург. 19-20 мая 2011 г. с. 134. Карп О.Э., Гудков С.В., Черников А.В., Брусков В.И. Прооксидантные и генотоксические свойства долгоживущих радикалов белков, индуцированных неионизирующими и ионизирующими излучениями 27. VII Международная Крымская конференция «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии». Украина. Судак. 22-30 сентября 2011 г.

с.15. Брусков В.И., Гудков С.В., Карп О.Э., Черников А.В., Штаркман И.Н.

Продление окислительного стресса долгоживущими активными формами белка, индуцированными рентгеновским излучением, и их генотоксическое действие 28. Радиация и Чернобыль: Наука и практика. Беларусь. Гомель. 13-14 октября 2011 г. с.38-40. Гудков С.В., Гапеев А.Б., Бережнов А.В., Карп О.Э., Гармаш С.А., Брусков В.И. Сочетанное действие рентгеновского излучения и видимого/инфракрасного излучения в полосах поглощения молекулярного кислорода 29. «Биология наука XXI века» 16 Международная Пущинская школа конференция молодых ученых. Пущино. 16-21 апреля 2012. с. 315-316. Карп О.Э., Гудков СВ., Брусков В.И. Продление окислительного стресса долгоживущими активными формами белка, индуцированными рентгеновским излучением, и их генотоксическое действие






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.