WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

на правах рукописи

ХУСНУТДИНОВА АННА НАИЛЕВНА

Генетические подходы к изучению гидрогеназы HydSL пурпурной серной бактерии Thiocapsa roseopersicina.

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени

кандидата биологических наук

Пущино – 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте фундаментальных проблем биологии Российской академии наук

Научные руководители:  доктор биологических наук

Цыганков Анатолий Анатольевич,

кандидат биологических наук

Бутанаев Александр Михайлович

Официальные оппоненты:  Рукавцова Елена Борисовна,

доктор биологических наук,

Филиал федерального государственного бюджетного

учреждения науки Института биоорганической

химии им. академиков М.М. Шемякина и

Ю.А. Овчинникова Российской академии наук,

старший научный сотрудник

Кокшарова Ольга Алексеевна

доктор биологических наук, Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова,

ведущий научный сотрудник.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт биохимии и

физиологии микроорганизмов

им. Г.К. Скрябина Российской академии наук.

Защита состоится «20» декабря 2012 г. в 11:00 на заседании диссертационного совета Д.002.066.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте фундаментальных проблем биологии Российской академии наук по адресу: Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, д. 2, ИФПБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИФПБ РАН.

Автореферат разослан «14» ноября 2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Г.Н. Назарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Молекулярный водород занимает важное место в метаболизме бактерий и некоторых эукариотических микроорганизмов. H2 может использоваться как источник энергии при дыхании, как донор электронов при фотосинтезе и в процессе метаногенеза. При брожении H2 часто является конечным продуктом. Кроме того, выделение H2 может регулировать уровень восстановленности пула пиридиннуклеотидов при разных типах питания. Выделение водорода в процессе азотфиксации катализируется нитрогеназами, в остальных случаях поглощение и выделение водорода катализируется гидрогеназами. Несмотря на то, что H2 является простейшей молекулой, оказалось, что для каждого типа метаболизма бактерии синтезируют отдельную гидрогеназу, имеющую свои структурные гены и механизмы регуляции (Vignais et al., 2007). Поэтому бактерии, способные к росту за счет разных типов питания с участием H2, как правило, синтезируют несколько гидрогеназ.

Пурпурная серная бактерия Thiocapsa roseopersicina BBS способна расти в фотоавтотрофных и хемолитоавтотрофных условиях с использованием H2, фиксировать молекулярный азот и осуществлять брожение с выделением водорода (Кондратьева и др., 1981). Поэтому неудивительно, что T. roseopersicina синтезирует, по крайней мере, 4 различных гидрогеназы, выполняющих разные функции (Rakhely et al., 2004, 2007; Maroti et al., 2010).

Одной из первых гидрогеназ, выделенных из пурпурных бактерий, была HydSL-гидрогеназа T. roseopesicina (Гоготов и др., 1976). Оказалось, что это удивительно стабильный фермент, имеющий температурный оптимум около 80оС, способный к активации молекулы H2 в присутствии О2 (Morozov et al., 2006). По сравнению с платиной этот фермент более устойчив к воздействию таких каталитических ядов, как H2S и CO (Зорин и др., 1986). Единственной обнаруженной к настоящему времени функцией этого фермента является участие в восстановлении серы, в соответствии с уравнением: H2 + S0 = H2S (Laurinavichene et al., 2007).

В то же время мало известно не только о причинах термостабильности и устойчивости к кислороду HydSL гидрогеназы, но также о структуре и механизме её действия. Поскольку этот фермент является гетеродимерным Ni-Fe металлоферментом с несколькими кластерами, его сборка и созревание представляют сложный и неизученный процесс и, судя по всему, не все вспомогательные гены к настоящему моменту известны (Weyman et al., 2011). 

Показано, что HydSL гидрогеназа является перспективным ферментом для создания водородных электродов как в качестве сенсора, так и для использования в топливных элементах без благородных металлов (Karyakin et al., 2007).

Таким образом, разработка подходов к изучению и целенаправленной модификации свойств указанной гидрогеназы представляется необходимой как в научном, так и в практическом отношении.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы является разработка генетических подходов для изучения HydSL гидрогеназы пурпурной серной бактерии T. roseopersicina.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- разработка генетической системы для модификации HydSL-гидрогеназы T roseopersicina BBS как в геноме, так и на плазмиде, автономно реплицирующейся в данной бактерии;

- создание генетической основы для изучения синтеза HydSL-гидрогеназы при гетерологичной экспрессии структурных генов на плазмиде в клетках E. coli и роли вспомогательных генов в этом процессе;

- создание штамма T. roseopersicina, несущего в геноме модифицированную вставкой 6His-метки субъединицу HydS гидрогеназы HydSL, и изучение свойств полученного двухсубъединичного фермента;

- модификация штамма T. roseopersicina GB11, не несущего структурных генов HydSL-гидрогеназы, плазмидой с геном субъединицы HydL, модифицированным вставкой 6His-метки;

- конструирование и тестирование вырожденных праймеров для поиска структурных генов  HydSL-, HoxYH и HupSL-гидрогеназ в неизученных пурпурных бактериях.

       Научная новизна. Создана генетическая система модификации генов HydSL-гидрогеназы T. roseopersicina BBS, локализованных как в геноме, так и на поддерживающейся в клетках бактерий плазмиде. С использованием этой системы впервые получен трансгенный штамм T. roseopersicina, продуцирующий модифицированную HydSL-гидрогеназу с шестью остатками гистидина, расположенными на С-конце малой субъединицы. Показано, что модифицированный фермент обладает близкими к исходному ферменту гидрогеназной активностью и термостабильностью, сохраняя ту же локализацию и функцию в клетках. Путем введения в трансгенный штамм T. roseopersicina GB11 поддерживающейся плазмиды, несущей  hydL, впервые получен штамм T. roseopersicina, экспрессирующий только большую субъединицу HydSL-гидрогеназы, модифицированную полигистидиновой меткой с N-конца. Показана важная роль малой субъединицы в сборке активного центра и функционировании фермента.

       Практическая значимость. Впервые сконструированы и апробированы вырожденные праймеры для поиска структурных генов HupSL, HoxYH и HydSL гидрогеназ в неизученных пурпурных бактериях. Использование этих праймеров позволяет проводить скрининг и отбирать перспективные штаммы.

       Получены штаммы E. сoli, синтезирующие HydS и HydL субъединицы гидрогеназы HydSL T. roseopersicina BBS как раздельно, так и совместно в одной клетке. Разработанная система является удобной основой для дальнейшего изучения роли вспомогательных белков в синтезе гидрогеназы, поскольку гетерологично экспрессированные структурные гены практически не обладают гидрогеназной активностью.

       Апробация работы. Результаты работы были представлены на 8-й международной конференции «Гидрогеназы и выделение водорода» (Брекенридж, США, 2007), Молодёжной школе-конференции с международным участием «Возобновляемые источники энергии» (Москва, 2008), 13-м международном симпозиуме по фототрофным прокариотам (Монреаль, Канада, 2009), Симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, 2009), 14 международной школе-конференции молодых учёных «Биология – наука 21 века» (Пущино, 2010).

Работа была поддержана грантами РФФИ (06-04-49658, 08-08-12196, 11-04-01383), частично финансировалась из подпрограммы «Нанобиотехнология» программы РАН «Фундаментальные основы технологий наноструктур и наноматериалов».

       Структура и объем диссертации. Диссертация содержит 8 глав и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов, приложения и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 122 страницах, содержит 27 рисунков и 9 таблиц. Список литературы содержит 242 источника.

       Публикации по теме работы. В рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК РФ, опубликовано 4 статьи по материалам диссертации и 1 обзорная статья. Опубликовано 5 тезисов докладов на российских и международных конференциях.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для гетерологичной экспрессии использовался штамм E. сoli  BL21. В качестве промежуточного штамма для переклонирования генов использовали E. сoli DH5α. Выращивание проводили на жидких и агаризованных средах LB и М63. Для индукции экспрессии генов в среды добавляли ИПТГ (1 мМ). Для гомологичной экспрессии использовали штаммы T. roseopersicina BBS и GB-11. Выращивание пурпурных бактерий проводили анаэробно на жидкой и агаризованной среде Пфеннига. Пурпурные несерные бактерии выращивали на среде Ормеруда и PYS. Антибиотики добавляли в зависимости от используемых штаммов и плазмид. Плазмидную ДНК из клеток E. coli и геномную ДНК из пурпурных бактерий выделяли согласно методике (Маниатис и др., 1984). Для разделения и анализа ДНК и плазмид использовали горизонтальный электрофорез в 1-2% агарозном геле. Гель фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете при длине волны 254 нм. Для выделения из геля и очистки ПЦР-фрагментов и векторов использовали набор QIAquick Gel Extraction Kit, QIAGEN. Для составления праймеров использовали нуклеотидные последовательности, доступные в базе данных «GenBank» с использованием программ Oligo и Vector NTI. Для составления вырожденных праймеров использовали множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей структурных генов в программе MUSCLE. Определение нуклеотидной последовательности ДНК и синтез праймеров производилось фирмой «Евроген Ру», Москва. Для получения рекомбинантной ДНК использовали стандартные методы генетической инженерии: расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции, лигирование фрагментов ДНК, генетическая трансформация с помощью электропорации или конъюгации (Маниатис и др., 1984).

Определение концентрации белка проводили согласно методике Брэдфорд ( Bradford, 1976). Концентрацию бактериохлорофилла а измеряли спектрофотометрически в ацетон-метанольном экстракте (Ремизов и др., 2004).

Выделение телец включения проводили последовательной отмывкой осадка индуцированных культур E. сoli BL21 после разрушения ультразвуком в 50 mM Tris-Cl буфере с добавлением 50 mM NaCl и 0.5% Triton X-100, pH 8.0. Для анализа белковых продуктов использовали вертикальный денатурирующий электрофорез в 8-12% ПААГ. Для исследования телец включения применяли электронную микроскопию, а также атомно-эмиссионную спектрометрию.

Для выделения модифицированной гидрогеназы HydSL-6His использовали метало-аффинную хроматографию (Ni-NTA, Amersham), ионообменную хроматографию (DE-52, Whatman) и препаративный электрофорез. Локализацию нативной гидрогеназы в ПААГ определяли по восстановлению бензилвиологена в атмосфере Н2 в присутствии трифенилтетразолиум хлорида (1 мМ) (Гоготов и др., 1976). Активность гидрогеназы измеряли газохроматографически по выделению водорода из восстановленного дитионитом метилвиологена или спектрофотометрически по восстановлению метилвиологена в присутствии водорода.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Получены штаммы E. сoli BL21, синтезирующие HydS и HydL субъединицы гидрогеназы HydSL T. roseopersicina BBS как раздельно, так и совместно в одной клетке. Разработанная система является удобной основой для дальнейшего изучения роли вспомогательных белков в синтезе гидрогеназы.

В синтезе и созревании Ni-Fe гидрогеназ в клетке T. roseopersicina, помимо структурных, участвует значительное количество вспомогательных белков, полный набор которых к настоящему моменту еще не установлен (Maroti  et al., 2003). В разных бактериях вспомогательные белки биосинтеза гидрогеназ выполняют схожие функции и могут быть даже взаимозаменяемыми. Это не относится к специфичным эндопептидазам, участвующим на последних этапах сборки большой субъединицы гидрогеназы. К началу наших исследований успешная гетерологичная экспрессия Ni-Fe гидрогеназ была осуществлена лишь в близкородственных видах микроорганизмов (Friedrich et al., 2005). E. сoli способна к синтезу не менее четырёх собственных Ni-Fe гидрогеназ (Bock  et al., 2002) и имеет многие вспомогательные гены, гомологичные соответствующим генам T. roseopersicina. Это давало нам надежду на экспрессию генов HydSL и получение активной гидрогеназы T. roseopersicina в клетках E. сoli.

Для экспрессии генов гидрогеназы HydSL в качестве вектора использовали плазмиду pET22b, а в качестве штамма-хозяина – E coli BL21. Структурные гены малой и большой субъединиц гидрогеназы (hydS и hydL) были клонированы совместно с геном эндопепетидазы (hynD) в вектор pET22b. Таким образом, была создана конструкция pET22b-hydS-hydL-hynD. Гены малой и большой субъединиц были также клонированы в плазмидные векторы разных групп совместимости pET22b и p15KS. Таким образом были получены конструкции pET22b-hydS и p15KS-hydL, которыми по отдельности трансформировали штамм E. coli BL21, получая штаммы-продуценты большой, малой и обеих субъединиц гидрогеназы. Также E. coli BL21  последовательно трансформировали плазмидами pET22b-hydS и p15KS-hydL для получения штамма-продуцента обеих субъединиц, в котором структурные гены гидрогеназы находятся на разных совместимых плазмидах.

       При анализе продуктов экспрессии штамма-продуцента конструкции pET22b-hydS-hydL-hynD оказалось, что если три гена располагаются на одной плазмиде pET22b, то продукт каждого последующего гена присутствует в меньших количествах по сравнению с предыдущим. При этом происходила сверхэкспрессия только того гена, который стоял первым после промотора в конструкции для экспрессии. После разрушения штаммов-продуцентов ультразвуком с последующим центрифугированием продукты экспрессии преимущественно обнаруживались в осадке, что указывало на неправильную сборку белка. Анализ активности полученного штамма затрудняется наличием собственной гидрогеназной активности E. coli. Различия в уровне активности гидрогеназы у штаммов, выращенных с индукцией транскрипции генов hydL-hydS-hynD, или без нее, были статистически незначимы. Падение гидрогеназной активности (в целых клетках) после прогревания в течение 10 мин при 80С указывало на невысокую термостабильность гидрогеназ, в отличие от HydSL-гидрогеназы T. roseopersicina, которая в таких условиях сохраняет 100% исходной активности (Gogotov et al., 1978). Полученные данные не позволяют утверждать, что структурные белки HydSL гидрогеназы проявляли ферментативную активность.

При индукции генов hydS и hydL в трех вариантах продуцентов (pET22b-hydS, p15KS-hydL, pET22b-hydS + p15KS-hydL) происходило накопление продуктов их экспрессии, которые после разрушения клеток обнаруживались в осадке. После солюбилизации на электрофореграммах белковых экстрактов из клеток-продуцентов E. coli обнаруживаются малая и большая субъединицы гидрогеназы при их экспрессии как раздельно, так и совместно в одной клетке (рис. 1).

Таким образом, нами получена генетическая конструкция для повышенного синтеза обеих субъединиц в одной клетке. При этом практически весь синтезированный белок обнаруживался в осадке, что указывало на формирование телец включение (ТВ).

Рис. 1. Электрофореграмма белков, полученных при экспрессии в E. сoli

структурных генов малой HydS (2), большой HydL (4) и обеих (6) субъединиц термостабильной гидрогеназы HydSL из

T. roseopersicina. Белковые маркеры

(М); неиндуцированная культура (1, 3, 5) (Ширшикова и др., 2011).

Образование ТВ – агрегатов белков, находящихся в неактивном состоянии, нередко наблюдается при синтезе белков в гетерологичных системах под сильными промоторами вследствие их неправильной сборки (Villaverde et al., 2003). Формирование ТВ в трех вариантах продуцентов (pET22b-hydS, p15KS-hydL и pET22b-hydS + p15KS-hydL), полученных нами, было исследовано методом электронной микроскопии.

       На электронных микрофотографиях клеток E. coli видно, что контрольные клетки, в которых не было индукции синтеза субъединиц, имеют сходную морфологию и ультраструктурную организацию (рис. 2 а, в, д). В них нуклеоид распределён диффузно по центральной части цитоплазмы клеток и выявляется в виде просветленных зон с характерным гранулярно-сетчатым строением.

Нуклеоид в клетках продуцентов HydS и HydL (рис. 2 б, г) распределен дискретно в виде зон небольшой протяженности и отличается высокой степенью компактизации нитей ДНК, что обычно наблюдается у микроорганизмов при стрессовых условиях (Suzina et al., 2006). При этом клетки, в которых индуцировали продукцию HydS и HydL, заметно отличаются друг от друга. В цитоплазме клеток продуцента HydS (рис. 2 б) видны ТВ в виде обширных включений (до 0,8 мкм) овоидной формы, которые имеют низкую электронную плотность и явное сродство к мембране. ТВ продуцента HydL (рис. 2 г) более гомогенны, имеют значительно более высокую электронную плотность по сравнению с ТВ, присутствующими в продуценте HydS. Эти образования представлены скоплениями множественных мелких (0,1 мкм и менее) глобул неправильной формы, тесно примыкающих друг к другу и занимающих большую часть цитоплазмы клеток.

Рис. 2. Ультратонкий срез клеток E. coli BL21. Представлены варианты клеток без индукции (а, в, д) и с индукцией экспрессии (б, г, е) HydS (а, б), HydL (в, г) и двух субъединиц (д, е) гидрогеназы HydSL из T.  roseopersicina. Обозначения: Н – нуклеоид, Ц – цитоплазма, ТВ – тельца включения. Длина масштабной линейки – 0,5 мкм (Ширшикова и др., 2011).

В клетках третьего штамма, продуцирующего обе структурные субъединицы гидрогеназы HydSL (рис. 6 е), нуклеоид менее компактен по сравнению с первыми двумя вариантами. Он имеет много коротких толстых тяжей ДНК и занимает более обширную область цитоплазмы. Синтезирующиеся субъединицы гидрогеназы также образуют ТВ. На фотографии хорошо видны овоидные ТВ HydS, а темные скопления возле них, видимо, представляют собой ТВ HydL.        

Таким образом, по крайней мере, большая часть синтезированных в E. coli структурных белков HydSL гидрогеназы образует  тельца включения.

Различия в электронной плотности ТВ продуцентов малой (HydS) и большой (HydL) субъединиц могут свидетельствовать о различном содержании металлов в ТВ, т.е. о наличии железосерных кластеров (Fe-S) в малой субъединице или активного центра в большой субъединице. Это предположение было проверено методом атомно-эмиссионной спектрометрии. Хорошее совпадение расчетных и фактических данных было получено для молярного соотношения Ni/белок у продуцента обеих субъединиц (1.0 и 1.2 моль/моль, соответственно). Присутствие никеля в недостаточных количествах в тельцах включения субъединицы HydL, экспрессированной отдельно от малой субъединицы HydS, позволяет предположить, что для сборки активного центра необходимо участие обеих субъединиц, и, возможно, только в этом случае происходит включение металлов в структуры, подобные природному активному центру. Наши предположения подтверждают исследования, проведенные на HoxBC Ni-Fe гидрогеназе из Ralstonia eutropha, где экспрессия только большой субъединицы приводит лишь к частичной сборке активного центра гидрогеназы (Winter et al., 2005).

Таблица 1. Молярное соотношение металл/белок в тельцах включения, полученных из трех разных штаммов-продуцентов E. coli.

Продуцент

Fe/белок (моль/моль)

Ni/белок  (моль/моль)

расчет

эксперимент

расчет

эксперимент

HydS

10-12

0.7

0

0

HydL

1

1.1

1

0.03

HydSL

11-13

4.0

1

1.2

Таким образом, нами получена система, позволяющая синтезировать структурные субъединицы гидрогеназы HydSL по отдельности или вместе. Отсутствие гидрогеназной активности обусловлено, видимо, недостатком вспомогательных генов E. coli для синтеза полноценной гидрогеназы HydSL. Созданная система является основой для изучения синтеза гидрогеназы и роли различных вспомогательных генов, которые при необходимости можно экспрессировать с дополнительных плазмид.

Получен трансгенный штамм T. roseopersicina, продуцирующий модифицированную HydSL-гидрогеназу с шестью остатками гистидина с С-конца малой субъединицы, и отработана методика ее выделения. Показано, что модифицированный фермент сходен с нативным по активности, термостабильности, температурному оптимуму, энергии активации, локализован в мембранах и участвует в поглощении водорода в присутствии серы.

Для разработки системы генетической модификации HydSL-гидрогеназы и ее тестирования была модифицирована малая субъединица HydS введением в соответствующий ген с 3'-конца полигистидиновой (6His) метки. Такая 6His-метка может значительно облегчить выделение фермента и использоваться для дальнейшей ориентированной иммобилизации гидрогеназы. Для введения 6His-метки в последовательность гена hydS была создана конструкция, позволяющая интегрировать в hydSL-оперон T. roseopersicina последовательность метки и маркерный ген устойчивости к канамицину, необходимый для селекции (рис. 3).

Рис. 3. Схема гомологичной рекомбинации между опероном HydSL-гидрогеназы T roseopersicina и коньюгативной плазмидой pEX18Tc, несущей модифицированный ген hydS-6His. Прямыми линиями показаны участки генов, по которым происходит рекомбинация.

Конструкция pEX18Tc-hydS-6His-npt-isp1, собранная в E. coli, методом конъюгации была перенесена в T. roseopersicina. Полученные трансконъюганты были проанализированы методом ПЦР на наличие вставки кассеты маркерного гена в оперон. Секвенирование последовательности оперона hydSL T. roseopersicina подтвердило наличие вставки маркерного гена устойчивости к канамицину, последовательности 6His, наряду с отсутствием замен в структурном гене hydS.

Встраивание 6His-метки с С-конца малой субъединицы HydSL может повлиять на локализацию гидрогеназы в клетке, поскольку известно, что заякоривание гидрогеназ данного типа происходит при помощи малой субъединицы (Vignais et al., 2007). Для оценки локализации модифицированного фермента сравнивали гидрогеназную активность в клеточных фракциях, полученных при разрушении клеток родительского и модифицированного штаммов. В целых клетках T. roseopersicina выделение Н2 из восстановленного метилвиологена могут катализировать только мембрансвязанная HydSL и растворимые Hox-гидрогеназы. При разрушении клеток ультразвуком большая часть HydSL-гидрогеназы выходит в раствор, а в мембранах остаётся до 30% фермента, который и отвечает за гидрогеназную активность мембранной фракции. Активность растворимой фракции обусловлена как HydSL-, так и Hox-гидрогеназами. Как видно из рисунка 4, в штамме с HydSL-6His-гидрогеназой удельная активность фермента в мембранной фракции не ниже, чем в родительском штамме. Можно предполагать, что модификация гидрогеназы не препятствует связыванию этого фермента с мембранами. Термостабильность гидрогеназы также, по-видимому, сохранилась, так как изменения активности после прогревания в разных фракциях различаются незначительно у штамма с HydSL-6His и родительского штамма.

Рис. 4. Распределение гидрогеназной активности между  фракциями супернатанта и хроматофор T. roseopersicina BBS (wt) и T. roseopersicina HydSL-6His (mut). Прогревание фракций – 80°С, 20 мин.

Ранее было показано, что в целых клетках T. roseopersicina HydSL гидрогеназа участвует в темновом потреблении Н2 в присутствии запасной серы (S0), восстанавливая её до H2S (Laurinavichene et al., 2007). Cохранение физиологической функции косвенно может свидетельствовать об отсутствии влияния 6His-метки на донорно-акцепторные взаимодействия фермента.

Накопление сульфида в присутствии донора электронов H2 имеет место как для T. roseopersicina BBS, так и для T. roseopersicina HydSL-6His (рис. 5). В атмосфере Ar количество сульфида гораздо ниже и связано с использованием других субстратов, в частности запасных углеводов. Таким образом, мы полагаем, что модифицированная HydSL-гидрогеназа выполняет в клетках ту же функцию, что и нативная.

Рис. 5. Зависимость накопления сульфида (нмоль S2-/мг бактериохлорофилла а) T. roseopersicina BBS и T. roseopersicina HydSL-6His от времени инкубации.

Для очистки модифицированной гидрогеназы HydSL-6His была отработана следующая схема:

Аффинная ----> Гель-  ----> Заморозка  ---->  Ультра- ---->

хроматография фильтрация  -25°С фильтрация 

Ионообменная  ---> Препаративный  ----->  Электроэлюция

хроматография  электрофорез

       

Хорошо известно, что HydSL-гидрогеназа T. roseopersicina проявляет высокую устойчивость к денатурирующим факторам, в том числе к нагреванию (Гоготов и др., 1976). Для изучения термостабильности фермента HydSL-6His препараты гидрогеназы, полученные после ультрафильтрации, инкубировали 10 мин при исследуемой температуре в 50 мМ Tris-HСl буфере (рН 9.0), а затем измеряли ее каталитическую активность в реакции восстановления метилвиологена. Инактивации фермента не наблюдалась до 80С. Даже при 95С сохранялось до 60% начальной активности фермента (рис. 6, а). Потеря активности немодифицированной гидрогеназы HydSL также происходит при температуре выше 80С (данные Н.А. Зорина).

Для изучения влияния температуры на активность гидрогеназы HydSL-6His препарат фермента вносили в реакционную смесь с заданной температурой и измеряли активность фермента в реакции восстановления метилвиологена водородом. Температурный оптимум реакции находится в области 70–80С (рис. 6, б), как и у гидрогеназы HydSL, выделенной из родительского штамма T. roseopersicina BBS. Активность HydSL-6His гидрогеназы возрастала более чем в 10 раз при увеличении температуры от 30 до 80С, т.е. энергия активации лимитирующей стадии катализа гидрогеназной реакции окисления Н2 HydSL-6His гидрогеназой составляла 12.9 ккал/моль, что сравнимо с данными для HydSL гидрогеназы – 10.2 ккал/моль (данные Н.А. Зорина).

Активность полученного нами гомогенного фермента HydSL составляла 1.9 мкмоль H2/минмг белка, что сравнимо с активностью гидрогеназы из родительского штамма – 1.5 мкмоль H2/минмг белка при той же концентрации белка и площади поверхности жидкой фазы (Bagynka et al., 1984).

Гомогенный препарат гидрогеназы, так же как и препарат, выделенный из родительского штамма, имел молекулярную массу, близкую к расчётной: 64 кДа для большой и 37 кДа для малой субъединицы. Однако, судя по отсутствию повторного связывания с аффинной колонкой, он либо не содержал 6His-метки, либо этому препятствовали конформационные изменения, возникшие при очистке фермента.

Рис. 6. Зависимость гидрогеназной активности препарата гидрогеназы HydSL-6His от температуры при прогревания препарата в течение 10 мин (а) и от температуры проведения реакции окисления водорода (б).

Таким образом, уровень активности, стабильность при высоких температурах, температурный оптимум и энергия активации у модифицированной гидрогеназы были близки к таковым для исходного фермента, что указывает на то, что структура белка после введения 6His-метки не претерпела изменений, по крайней мере, в области активного центра и Fe-S кластеров.

       Трансгенный штамм T. roseopersicina GB11 модифицирован поддерживающейся плазмидой для экспрессии гена hydL большой субъединицы HydSL-гидрогеназы с полигистидиновой меткой с N-конца. Полученные гидрогеназные фракции не обладали активностью.

       Одним из важных вопросов, связанных с синтезом активной HydSL гидрогеназы, является выяснение роли малой субъединицы. Исходя из гомологичного моделирования, наличие малой субъединицы связывают со стабилизацией фермента дополнительными ионными парами (Szilagyi et al., 2002). Наряду с этим предполагается, что HydS субъединица может быть необходима для активности, так как она может содержать до трёх Fe-S кластеров, осуществляющих перенос электронов между активным центром и внешней поверхностью фермента. С другой стороны известно, что Fe-Fe гидрогеназы, не содержащие малой субъединицы и Fe-S кластеров, обладают наибольшей каталитической активностью (Frey, 2002). Вероятно, наличие дополнительных Fe-S кластеров замедляет скорость катализа. Возникает вопрос, необходима ли малая субъединица для активности Ni-Fe фермента. Для выяснения этого вопроса можно провести синтез большой субъединицы в штамме T. roseopersicina, не несущем структурных генов гидрогеназы, и определить ее гидрогеназную активность.

В данной работе использовался коньюгативный вектор широкого круга хозяев pMHE6CrtDKm, предназначенный для экспрессии генов в пурпурных бактериях под каротиноидным промотором CrtD, амплифицированным с использованием геномной ДНК бактерии T. roseopersicina  (Fodor et al., 2003). Ген hydL, кодирующий большую субъединицу гидрогеназы HydSL, модифицированную 6His-меткой с N-конца, был клонирован в вектор pMHE6CrtDKm. Для экспреcсии генетической конструкции был выбран штамм T. roseopersicina GB-11, не обладающий активностью HydSL-гидрогеназы (Maroti et al., 2003). Плазмида pMHE6CrtDKm-6His-hydL была перенесена конъюгацией в T. roseopersicina GB-11, а затем выделена из трансконъюгантного штамма. Наличие гена большой субъединицы подтверждено рестрикцией.

Для очистки большой субъединицы 6His-HydL применялась металл-аффинная хроматография на колонке с никелевой агарозой (Ni-NTA, 20 мл, Amersham), аналогично очистке 6His-HydSL-гидрогеназы, описанной выше. При элюции имидазолом получены белковые фракции, активность которых не превышала фоновую, обусловленную наличием других гидрогеназ. Нативный электрофорез также не выявил наличия белковых полос с гидрогеназной активностью. Следует отметить, что в тестах на гидрогеназную активность использовали метилвиологен молекулу с низкой молекулярной массой, взаимодействующую со всеми известными типами гидрогеназ, включая минимальную Fe-Fe гидрогеназу Chlamydomonas reinhardtii, не содержащую Fe-S кластеры (Roessler et al., 1984). Поэтому отсутствие малой субъединицы, эквивалентное отсутствию Fe-S кластеров, обеспечивающих обмен электронами между активным центром и внешней средой, не может являться причиной отсутствия гидрогеназной активности.

В наших экспериментах отсутствие гидрогеназной активности большой субъединицы может быть обусловлено несколькими причинами. Во-первых, большая субъединица, в отсутствие малой субъединицы, может быть более чувствительной к действию внешних факторов, например, кислороду, аналогично Fe-Fe-гидрогеназе. Во-вторых, малая субъединица может оказаться необходимой для созревания полноценного фермента, как отмечено для нитрогеназ (Rubio et al., 2005). По данным работ Barbel (Winter et al., 2005), можно предположить участие малой субъединицы гидрогеназы в сборке большой субъединицы. Это косвенно подтверждается нашими данными об отсутствии никеля в ТВ при экспрессии большой субъединицы и достаточном количестве Ni лишь в ТВ, полученных при совместной экспрессии обеих субъединиц в гетерологичной системе E. coli (табл. 1).

Таким образом, полученные данные указывают на то, что субъединица 6His-HydL сама по себе не обладает гидрогеназной активностью, что коррелирует с данными полученными на HoxBC-гидрогеназе Ralstonia eutropha (Winter et al., 2005).

Сконструированы и апробированы вырожденные праймеры для поиска структурных генов HupSL-, HoxYH- и HydSL-гидрогеназ в неизученных пурпурных бактериях.

Альтернативой гетерологичной экспрессии гидрогеназы HydSL в клетках E coli для получения большого количества стабильного и высокоактивного фермента является поиск новых микроорганизмов с высокой скоростью роста, обладающих гидрогеназной активностью. Стандартный метод поиска новых штаммов-продуцентов предполагает исследование гидрогеназной активности и свойств очищенной гидрогеназы. В этом случае скрининг множества потенциальных штаммов-продуцентов оказывается слишком трудоёмким в отличие от использования молекулярно-биологических подходов.

Для создания праймеров с целью поиска структурных генов HupSL-, HydSL- и HoxYH-гидрогеназ пурпурных бактерий был проведён анализ известных последовательностей генов, кодирующих субъединицы гидрогеназ, путем множественного выравнивания в программе MUSCLE. Для составления поисковых праймеров к структурным генам  hupSL были использованы нуклеотидные последовательности генов гидрогеназ пурпурных бактерий T. roseopersicina BBS, Rhodobacter capsulatus B10, Rhodobacter sphaeroides 2.4.1., Rhodopseudomonas palustris BisA53, Rubrivivax gelatinosus sp., Rhodospirillum rubrum ATCC11170. Для генов HoxYH- и HydSL-гидрогеназ T. roseopersicina BBS и Allochromatium vinosum DSM180 использовали попарное выравнивание последовательностей кодирующих их структурных генов.

Последовательности  поисковых праймеров: для hoxYH прямой 5'-CGA-CCA-GAC-GGG-CAT-AGT-GAT-AGT-GGA-A-3' и обратный 5'-ATG-AGC-ACA-CAA-CCC-AAG-ATT-ACG-GTC-G-3'; для hupSL: прямой 5'-GGT-CGA-ACA-GGC-CAG-GCA-GGG-ATC-GAA-3' и обратный 5'-CAG-GGG-ATC-ACG-CGG-CGC-AGC-TTC-3'; для hydSL: прямой 5'-ATA-CAG-GGA-TCG-AAG-GAA-TGG-ATG-GTC-C-3' и обратный 5'-CCG-TCG-GTC-ATC-TGG-CTG-TCG-TTC-3'.

В качестве контрольных штаммов использовали штаммы T. roseopersicina BBS, Rba. capsulatus B10, Rba. sphaeroides 17023 и RV. ПЦР проводили с геномной ДНК, реакцию оптимизировали для использования целых бактериальных колоний. Фактический размер ампликона (продукта амплификации) для hupSL-генов составлял ~2.8 т.п.о, для hoxYH-генов ~1.8 т.п.о., для hydSL-генов ~4.5 т.п.о. и совпадал с расчётным.

Вырожденные праймеры для генов HoxYH гидрогеназы были успешно апробированы на A. minutissimum sp., размер ампликона составил ~1.6 т.п.о. (рис. 8 а), что немного меньше расчётного размера для T. roseopersicina и A. vinosum (~1.8 т.п.о.). ПЦР фрагмент hoxYH генов гидрогеназы был очищен и секвенирован с 3'-конца. Степень идентичности секвенированного фрагмента с последовательностью hoxYH типового штамма A. vinosum DSM 180 составила 96%. Вырожденные праймеры для HydSL-гидрогеназы были успешно апробированы на A. minutissimum sp., размер ампликона составил ~4.5 т.п.о. (рис. 8 б).

  Рис. 8. Электрофореграмма

  продуктов ПЦР, полученных

  при скрининге hoxYH-генов (а)

  и hydSL-генов (б)

  1 – контроль T. roseopersicina BBS,

  2 – A.  minutissimum  sp., М  –

  контроль длины фрагментов ДНК.

С использованием созданных праймеров на наличие генов HupSL-гидрогеназ были апробированы штаммы лабораторной коллекции №7, 9, 13, 14, 15, 16, и 62 неидентифицированных пурпурных несерных бактерий, выделенных из литорали Южно-Китайского моря. Все штаммы, за исключением №7 и №13, имели размер ампликона ~2.8 т.п.о. (рис. 7). Таким образом, в лабораторной коллекции было выявлено два штамма, не обладающих генами водородпоглощающей HupSL-гидрогеназы. Отсутствие ПЦР-фрагмента размером ~2.8 т.п.о. коррелировало с отсутствием гидрогеназной водородпоглощающей активности штаммов и с повышенным накоплением Н2 в условиях азотфиксации (Khusnutdinova et al., 2012). Последнее свойство является ключевым для применения пурпурных несерных бактерий в двухстадийной системе очистки сточных вод, что считается перспективным направлением биотехнологических исследований (Tao et al., 2008). Один из двух Hup--штаммов (Rba. sphaeroides №7) мы в дальнейшем успешно использовали в двух-стадийной системе получения водорода (Laurinavichene et al., 2012).

Рис. 7. Электрофореграмма продуктов ПЦР, полученных при скрининге hupSL-генов музея пурпурных несерных бактерий. М – контроль длины фрагментов ДНК, K1 – ПЦР без матрицы, К2 – ПЦР Rba. capsulatus B10. Номера дорожек соответствуют номерам  штаммов.

Таким образом, нами отработана методика обнаружения генов HydSL-, HoxYH- и HupSL-гидрогеназ в неизученных  пурпурных бактериях, что позволяет производить быстрый скрининг коллекций для поиска перспективных штаммов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Гетерологичная экспрессия стабильных Ni-Fe гидрогеназ в быстрорастущем организме имеет двойное значение. С одной стороны, это значительно ускорило бы исследования структуры и функций фермента, разработку сенсоров и топливных элементов на её основе, а также инициировало создание молекулярных преобразователей энергии света в водород. При этом вопрос о механизме созревания гидрогеназы может решаться независимо. С другой стороны, если набор вспомогательных генов, имеющихся в штамме-реципиенте, окажется недостаточным для правильной сборки и созревания гидрогеназы, полученная гетерологичная система может явиться удобной основой для изучения роли вспомогательных генов в синтезе, сборке и созревании изучаемой гидрогеназы.

Нами получена система гетерологичного синтеза в E. coli гидрогеназы HydSL T. roseopersicina, не обладающей активностью. Судя по пониженному содержанию железа в экспрессированных структурных белках (табл. 1), железосерные кластеры были сформированы не полностью. Содержание никеля в экспрессированных белках, соответствовало теоретически возможному, что может указывать на частичное формирование активного центра.

Возможно, механизм созревания HydSL-гидрогеназы является нестандартным. Таким образом, имеющийся в E. coli набор вспомогательных генов биосинтеза собственных гидрогеназ не является достаточным для созревания активной HydSL-гидрогеназы. Более того, дополнение структурных генов hydSL всеми известными вспомогательными генами (hynD, hupK, hypC1C2 и hypDEF) не приводило к появлению активной гидрогеназы (Weyman et al., 2011). Синтез активной HydSL-гидрогеназы T. roseopersicina оказался возможен лишь при встраивании в E. coli еще и плазмиды, несущей полный оперон из 6 вспомогательных генов Alteromonas macleodii (Weiman et al., 2011). По-видимому, обнаружены ещё не все вспомогательные гены биосинтеза гидрогеназ T. roseopersicina, что является задачей будущих исследований.

Разработанная нами генетическая система (синтез структурных генов HydSL гидрогеназы по отдельности и в комбинации в разных штаммах) может использоваться для решения следующих вопросов:

- экспрессия каких вспомогательных генов необходима для правильной сборки структурных белков гидрогеназы? Для этого данную систему необходимо дополнить плазмидами с набором вспомогательных генов в разных комбинациях;

- какие вспомогательные гены биосинтеза гидрогеназ, имеющиеся у E. coli, необходимы для синтеза HydSL-гидрогеназы T. roseopersicina в гетерологичной системе. Эту сложную задачу можно решить, используя в качестве реципиента указанных плазмид и разработанных нами конструкций штамм E. coli, не несущий оперонов гидрогеназ 1, 2 и 3.

В данной работе была также создана генетическая система модификации HydSL-гидрогеназы и получен трансгенный штамм T. roseopersicina, продуцирующий модифицированную HydSL гидрогеназу с шестью остатками гистидина на С-конце малой субъединицы. Следует отметить, что гистидиновая метка является активным химическим соединением и было неясно, будет ли модифицированная гидрогеназа обладать активностью, встраиваться в мембрану и выполнять физиологические функции внутри клетки. Нами показано, что гидрогеназная активность трансгенного штамма близка к родительскому. Локализация модифицированного фермента внутри клетки не отличается от нативного. Более того, полученный фермент участвует в поглощении водорода в присутствии серы с образованием сероводорода. Отработана методика выделения гидрогеназы, модифицированной 6His-меткой. Показано, что выделенный фермент обладает той же активностью, термостабильностью и температурным оптимумом, что и нативный. Однако, в процессе выделения гистидиновая метка оказалась лабильной. Этот факт препятствует дальнейшему использованию гидрогеназы с меткой для создания и изучения гидрогеназных электродов с ориентированной иммобилизацией фермента.

Для снижения вероятности протеолиза свободный С-конец малой субъединицы следует укоротить, предварительно изучив влияние делеции на активность гидрогеназы. Наряду с этим можно использовать иные метки или иные стратегии ориентированной иммобилизации, например, точечные замены цистеинов, координирующих железо в Fe-S кластерах малой субъединицы на глицин для осуществления химической сшивки 1,6-гександитиоловым мостиком железосерных кластеров с поверхностью электрода (Lubner et al., 2009, 2010).

Следует отметить, что создание мутантов T. roseopersicina с заменами в геноме – достаточно трудоёмкий процесс. Альтернативным вариантом создания мутантов является экспрессия интересующих генов, находящихся на плазмиде. Нами показано, что данный подход может использоваться для введения в штамм T. roseopersicina GB11, не несущий структурных генов HydSL гидрогеназы, гена большой субъединицы, модифицированной 6His-меткой с N-конца. Обнаружено также, что синтез большой субъединицы не приводит к появлению гидрогеназной активности. Эти данные, наряду с пониженным количеством металлов в ТВ большой субъединицы без экспрессии малой в гетерологичной системе, указывают на важную роль малой субъединицы гидрогеназы в сборке активного центра и функционировании фермента.

Представленные выше результаты позволяют заключить, что создана генетическая система модификации HydSL-гидрогеназы T. roseopersicina BBS, локализованной как в геноме, так и на поддерживающейся  плазмиде.

Для поиска генов HoxYH-, HydSL- и HupSL-гидрогеназ в новых штаммах пурпурных бактерий в данной работе была создана система вырожденных праймеров. Создание вырожденных праймеров для поиска различных классов гидрогеназ имеет практическое значение как для обнаружения потенциальных продуцентов гидрогеназ, обладающих, например, термостабильностью или устойчивостью к О2 (HydSL гидрогеназы), так и для быстрой характеристики пурпурных бактерий на присутствие тех или иных гидрогеназ. Ранее созданные праймеры для выявления генов Ni-Fe гидрогеназ основывались на консервативных последовательностях, координирующих активный центр (Kim et al., 2007) и не были специфичны для разных классов гидрогеназ. При апробации созданных нами праймеров была показана их высокая специфичность, при помощи которой удавалось амплифицировать фрагменты различных структурных генов гидрогеназ в организме, содержащем как минимум 5 различных генов гидрогеназ (T. roseopersicina). Другим направлением применения hupSL поисковых праймеров является выявление пурпурных несерных бактерий, не содержащих Hup-гидрогеназ. Ранее для увеличения выхода Н2 в условиях азотфиксации у имеющихся штаммов удалялись гены водородпоглощающих гидрогеназ (Gokhan et al., 2008;  Kars et al., 2010). В отличие от этого быстрый скрининг на отсутствие таких гидрогеназ может значительно ускорить выявление штаммов, способных к активному выделению водорода. С применением hupSL поисковых праймеров были выявлены новые штаммы, не обладающие генами водородпоглощающей HupSL-гидрогеназы (Khusnutdinova et al., 2012) и показана перспективность применения штамма Rba. sphaeroides №7 в двухстадийной системе получения водорода (Laurinavichene et al., 2012).

ВЫВОДЫ

       1. Создана генетическая система модификации HydSL гидрогеназы T. roseopersicina BBS, локализованная как в геноме, так и на поддерживающейся плазмиде.

       2.        Получен трансгенный штамм T. roseopersicina, продуцирующий модифицированную HydSL-гидрогеназу с шестью остатками гистидина на С-конце малой субъединицы, и отработана методика ее выделения. Показано, что модифицированный фермент сходен с нативным по активности, термостабильности, температурному оптимуму и энергии активации, локализован в мембранах и участвует в поглощении водорода в присутствии серы.

       3.        Получены штаммы E. сoli BL21, синтезирующие HydS и HydL субъединицы гидрогеназы HydSL T. roseopersicina BBS как раздельно, так и совместно в одной клетке. Полученная система является удобной основой для дальнейшего изучения роли вспомогательных белков в синтезе гидрогеназы.

       4.        Трансгенный штамм T. roseopersicina GB11 модифицирован реплицирующейся плазмидой для экспрессии гена hydL большой субъединицы HydSL-гидрогеназы с полигистидиновой меткой на N-конце. Полученные гидрогеназные фракции не обладали активностью. Эти данные, наряду с пониженным количеством металлов в ТВ большой субъединицы без экспрессии малой в гетерологичной системе, указывают на возможное участие малой субъединицы гидрогеназы в сборке активного центра и функционировании фермента.

       5.        Впервые сконструированы и апробированы вырожденные праймеры для поиска структурных генов HupSL-, HoxYH- и HydSL-гидрогеназ в неизученных пурпурных бактериях.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

В изданиях, рекомендованных ВАК:

       1. Ширшикова Г.Н., Хуснутдинова А.Н., Постникова О.А., Патрушева Е.В., Бутанаев А.М., Цыганков А.А. (2009) Экспрессия структурных генов Ni-Fe гидрогеназы HydSL из Thiocapsa roseopersicina в клетках Escherichia coli. Доклады российской академии наук, 425,124-126.

       2. Ширшикова Г.Н., Хуснутдинова А.Н., Цыганков А.А., Бутанаев А.М. (2011) Термостабильная Ni-Fe гидрогеназа HydSL из Thiocapsa roseopersicina: некоторые подходы к изучению продукции фермента в гетерологичной системе Escherichia coli. Известия ТулГУ. Естественные науки, вып. 2, 363-375.

       3. Цыганков А.А., Хуснутдинова А.Н. (2010) Метаболизм водорода пурпурными бактериями и его возможная практическая значимость. Труды Института микробиологии им. Виноградского, вып 16, 290-327. ISBN 978-5-317-03436-8.

       4. Laurinavichene T.V., Belokopytov B.F., Laurinavichius K.S., Khusnutdinova A.N., Seibert M., Tsygankov A.A. (2012) Towards the integration of dark- and photo-fermentative waste treatment. Repeated batch sequential dark and photofermentation using starch as substrate. Int J Hydrogen Energy, 37 (10), 8800-8810.

       5. Khusnutdinova A.N., Ovchenkova E.P., Khristova A.P., Laurinavichene T.V., Shastik E. S., Liu J., Tsygankov A.A. (2012) New tolerant strains of purple nonsulfur bacteria for hydrogen production in a two-stage integrated system. Int J Hydrogen Energy, 37 (10), 8820-8827.

Тезисы конференций:

1. Batyrova H.A., Boutanaev A.M., Khusnutdinova A.N., Shirshikova G.N., Tsygankov A.A. New approaches in oriental immobilization of hydrogenases on the hydrogen electrodes. // The sixth All-Russian conference with international participation “Renewable source of energy”, 2008. Moscow, Russia.

2. Khusnutdinova A.N., Batyrova H.A., Patrusheva E.V., BoutanaevA.M., Tsygankov A.A. New approaches in oriented immobilization of hydrogenase on the hydrogen electrode. // Rusnanotech, Nanotechnology International Forum, 2008. Moscow, Russia.

3. Khusnutdinova A.N., Batyrova H.A., Shirshikova G.N., Postnikova O.A., Patrusheva E.V., Boutanaev A.M., Tsygankov A.A. Expression of HydSL hydrogenase from Thiocapsa roseopersicina in Escherichia coli. // 13th  international symposium on phototrophic prokaryotes, 2009. Montreal, Canada.

4. Laurinavichene T.V., Khusnutdinova A.N., Rakhely G., Kovacs K.L., Tsygankov A.A. Three hydrogenases in light and dark metabolism of the purple sulfur bacterium Thiocapsa roseopersicina. // International meeting “Photosynthesis in the post-genomic era: Structure and Function of Photosynthesis”, 2006. Pushchino, Russia.

5. Shirshikova G.N., Patrusheva E.V., Khusnutdinova A.N., Boutanaev A.M., Tsygankov A.A. Expression of HydSL hydrogenase from Thiocapsa roseopersicina in E. coli. The 8th International Hydrogenase Conference, 2007. Breckenridge, USA.




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.