WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

Дмитриев Григорий Владимирович

ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ И ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ

ХОЛОДОВОЙ АДАПТАЦИИ ВИРУСА КРАСНУХИ

03.02.02 – вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении “Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова” Российской академии медицинских наук

Научные руководители:

доктор биологических наук        Борисова Татьяна Константиновна

кандидат биологических наук         Файзулоев Евгений Бахтиерович

Официальные оппоненты:

Урываев Леонид Викторович, член-корреспондент РАМН и РАЕН, доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ «НИИ вирусологии имени Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России, заместитель директора по научной работе,

Агафонов Александр Петрович, доктор биологических наук, ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», заместитель директора по научной работе.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П.Чумакова» Российской академии медицинских наук.

Защита диссертации состоится 20 декабря 2012 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН по адресу: 105064, г. Москва, Малый Казенный пер., д. 5а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН.

Автореферат разослан «___» ноября 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

кандидат биологических наук                                               И.В. Яковлева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Краснуха – острое вирусное заболевание, широко распространенное как у детей, так и у взрослых. Вакцинация является наиболее эффективным, экономичным и доступным средством борьбы с краснухой. В России вакцинация против краснухи введена в календарь прививок с 1998 г. Несмотря на все более широкое применение вакцины против краснухи, среди женщин детородного возраста сохраняется значительная неиммунная прослойка, что сохраняет угрозу появления случаев синдрома врожденной краснухи (СВК). В связи с этим проблема профилактики СВК в настоящее время является весьма актуальной. В настоящее время в Российской Федерации для иммунизации населения против краснухи используется вакцина зарубежного производства, созданная на основе штамма Wistar RA27/3 и впервые зарегистрированная в Европе в 1971 г. [ Plotkin S.A., 1976]. Для проведения широкомасштабной вакцинации в России и снижения издержек на закупку зарубежной вакцины требуется создание вакцины, основанной на отечественном вакцинном штамме.

       С учетом массовости и повторности прививок против этой инфекции важны надлежащее качество применяемых вакцин и их низкая реактогенность. Особое значение имеет контроль генетической стабильности вакцинных штаммов. Такой контроль необходим, так как в процессе производства вакцин возможно накопление в геноме вакцинного вируса мутаций, способных привести к снижению или потере иммуногенных свойств вследствие гиператтенуации, а также к реверсии аттенуированного вируса к дикому штамму. Согласно рекомендациям ВОЗ, в особенности, для живых аттенуированных вакцин, следует проводить контроль генетической стабильности, поиск генетических маркеров аттенуации и подтверждение их наличия в вакцинных штаммах [WHO, Technical Report Series No 941, 2007; WHO Technical Report, Series №. 924 2004].

Механизмы аттенуации вируса краснухи изучены не полностью, поэтому актуальным является изучение механизмов ослабления диких вариантов вируса, поиск ключевых мутаций, ведущих к аттенуации, а также выявление характерных фенотипических проявлений, которые могут служить маркерами аттенуации и использоваться наряду с секвенированием для контроля генетической стабильности вакцинных штаммов.

Цели и задачи исследования

Целью настоящего исследования являлось выявление фенотипических и генетических детерминант аттенуации вируса краснухи на примере штамма С-77.

Для реализации поставленной цели требовалось решение следующих задач:

  • биологическая характеристика дикого и ослабленного вариантов штамма С-77 вируса краснухи и выявление фенотипических детерминант его аттенуации;
  • подбор праймеров для секвенирования генома вируса краснухи и оптимизация условий проведения ПЦР;
  • определение генотипа штамма С-77 вируса краснухи;
  • полноразмерное секвенирование генома дикого и холодоадаптированного (wt и ca) вариантов штамма С-77 вируса краснухи;
  • сравнительный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей wt и ca  вариантов штамма С-77 вируса краснухи и поиск вероятных генетических маркеров его аттенуации.

Научная новизна работы

Впервые в России осуществлен анализ геномов дикого и холодоадаптированного вариантов (ca и wt варианты) вируса краснухи. Было проведено сравнение последовательностей геномов ca  и wt вариантов штамма С-77, а также других известных последовательностей геномов вируса краснухи. На основании этого сравнения были установлены вероятные генетические маркеры аттенуации, согласующиеся с современными представлениями о механизмах аттенуации вируса краснухи. В частности, была обнаружена аминокислотная замена в позиции 1042 домена, кодирующего протеазу, которая играет ключевую роль в приобретении холодоадаптированного фенотипа ca  варианта штамма С-77. С использованием современных вирусологических, иммунохимических и молекулярно-биологических методов установлены фенотипические маркеры аттенуации холодоадаптированного варианта штамма С-77 вируса краснухи.

Практическая значимость работы

       Отработанные методические приемы выявления генетических и фенотипических маркеров аттенуации вируса краснухи, выявленные генетические и фенотипические маркеры аттенуации штамма С-77 могут быть использованы в научных исследованиях, а также для контроля вакцинных штаммов на производстве, разработки и характеристики новых вакцинных штаммов вируса краснухи.

Полученные в работе данные о механизмах аттенуации вируса краснухи могут быть использованы при разработке вакцинных препаратов.

Вариант штамма С-77 на 39 пассаже обладает биологическими маркерами аттенуации: пониженной иммуногенностью на кроликах по сравнению с диким вариантом и холодоадаптированным фенотипом, что позволяет рассматривать его в качестве кандидата для разработки на его основе отечественной вакцины.

Положения, выносимые на защиту

  1. Варианты штамма С-77 вируса краснухи на 39 и 46 пассажах обладают холодоадаптированным фенотипом, то есть способны к эффективной репродукции при пониженной температуре.
  2. Сa и wt варианты штамма С-77 обладают фенотипическими различиями, выражающимися в сниженной иммуногенности на кроликах и более интенсивной репродукцией холодоадаптированного варианта штамма С-77 при пониженной температуре по сравнению с диким вариантом.
  3. В процессе холодовой адаптации штамма С-77 в геноме вируса произошло 13 нуклеотидных замен, 6 из которых вели к замене аминокислот. Часть из них уникальна и, возможно, определяет фенотипические отличия дикого и холодоадаптированного штамма.
  4. Большая часть аминокислотных замен локализована в области, кодирующей неструктурные белки, в частности, протеазу и представляют особый интерес, так как мутации в этом регионе, по данным литературы, приводят к возникновению холодоадаптированного фенотипа и связаны с аттенуацией вируса краснухи. Замена Tyr на Cys в позиции 1042 ОРС НСБ области, кодирующей протеазу, играет ключевую роль в приобретении холодоадаптированного фенотипа ca варианта штамма С-77.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы представлены на Всероссийском ежегодном конгрессе «Инфекционные болезни у детей: диагностика, лечение и профилактика» (Санкт-Петербург, 2010 г.), конференции молодых ученых «НИИВС им И.И. Мечникова» РАМН (Москва, 2011 г.), 11-ом международном конгрессе «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии» (Москва, 2011 г.).

Апробация диссертации состоялась 07.06.2012 г. на научной конференции отдела вирусологии им. О.Г. Анджапаридзе ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН.

       Публикации результатов исследования

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 6 глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 136 источника, из которых 11 отечественных и 125 зарубежный. Работа выполнена на 123 страницах машинописного текста и иллюстрирована 10 таблицами и 23 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Вирусный материал

В работе был использован отечественный штамм вируса краснухи С-77, выделенный Р.Г. Десятсковой из носового смыва больного манифестной формой краснухи в 2001 г. (wt). Также в работе использовались два холодоадаптированных (ca ) варианта штамма С-77 на 39 и 46 пассаже. Для их получения дикий вариант длительно культивировался в культуре клеток Vero: 34 пассажа при температуре 35С и 4 и 11 пассажей при 33С соответственно.

Клеточные линии

Перевиваемые культуры клеток почки кролика (линия RK-13) и африканской зеленой мартышки (линия Vero) были получены из Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург). Перевиваемые клеточные линии RK-13 и Vero культивировали в питательных средах RPMI 1640 (Gibco, США) или MEM (Gibco) в присутствии 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (Hy Clone, США), 1мМ глутамина (Gibco) и 50 мкг/мл гентамицина (Gibco) в T175 см2 матрасах, (Greiner Bio-one, Германия) при +37°С и 5%СО2.

Тест на иммуногенность

Антигенные свойства вариантов штамма С-77 (wt, ca39, ca46 вариантов) и штамма Wistar RA27/3 изучали с использованием иммунологического маркерного теста на кроликах. Для постановки теста использовали самок кроликов породы «шиншилла» весом 2,5-3 кг. Каждый штамм испытывался на двух животных. Вируссодержащую жидкость (ВСЖ) вводили по 1,0 мл внутривенно. Титр вируса составлял 3 lgТЦД50/мл. Сыворотки крови исследовали в реакции нейтрализации и ИФА.

Реакция нейтрализации

Реакцию нейтрализации проводили с использованием реакции ЦПД в культуре клеток RK-13. Готовили разведения иммунной сыворотки и добавляли равный объем ВСЖ с титром вируса 3 lgТЦД50/мл. Учитывали предельное разведение сыворотки, при котором не наблюдается ЦПД вируса.

       Определение IgG антител к вирусу краснухи методом иммуноферментного анализа (ИФА)

Определение IgG антител кролика к вирусу краснухи проводили с помощью набора «Векто-Рубелла – IgG» «Вектор-Бест» (Россия) по протоколу, рекомендованному фирмой-производителем.

Сыворотки разводили 1:100, связавшиеся антитела выявляли при инкубации с конъюгатом козьих антикроличьих IgG антител «Sigma Aldrich» (США) с пероксидазой хрена. Результаты учитывали на приборе Anthos Zenith 3100 «Anthos Labtec Instruments GmbH» (Австрия).

Выделение вирусной РНК

Вирусную РНК из исследуемых и контрольных образцов выделяли с помощью наборов реагентов «ZR Viral RNA Kit» (Zymo Research, США) или «Viral RNA Mini Kit» (Qiagen, Германия) в соответствии с рекомендациями производителей. Выделение РНК проводили из 100 мкл ВСЖ, элюцию – в 60 мкл безнуклеазной воды. Образцы РНК хранили при -70°С до постановки реакции ОТ и ПЦР.

Реакция обратной транскрипции

При постановке реакции обратной транскрипции (ОТ) 2 мкл праймера (5 пмоль/мкл) смешивали с 5 мкл вирусной РНК и прогревали смесь при 65C в течение 5 минут. кДНК получали в 30 мкл реакционной смеси, содержащей помимо праймера и РНК, буфер для ОТ, 0.5 мМ дНТФ, 2.5 мМ MgCl2, 4 ед. ингибитора рибонуклеаз, 50 ед. ревертазы вируса лейкоза Молони «RevertAid H Minus M-MuLV» (Fermentas, Литва) (табл. 2). Смесь инкубировали в течение 30 минут при 42°C. Фермент инактивировали нагреванием при 95°C в течение 5 минут.

Полимеразная цепная реакция

ПЦР проводили в амплификаторе «Циклотемп» (Россия). Реакцию проводили с использованием набора реактивов для проведения ПЦР-РВ (Буфер Б) (Синтол, Россия) или, при амплификации GC-богатых фрагментов, набора «TaKaRa LA with GC buffer» (Takara, Япония) в объеме 25 мкл для аналитических целей и 50-100 мкл для препаративных целей по протоколу, рекомендованному фирмой-производителем.

Филогенетический анализ и компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей

Нуклеотидные последовательности штаммов вируса краснухи были получены из электронной базы данных GenBank (NCBI). Анализ нуклеотидных последовательностей, множественное выравнивание геномов вирусов для выявления консервативных последовательностей, подбор праймеров и зонда для ОТ, ПЦР-РВ и секвенирования, генотипирование штамма вируса краснухи С-77 проводили с помощью компьютерных программ Omiga 2.0 («Oxford Molecular Ltd.», США) и Vector NTI Advance 9.0 («InforMax Inc.», США), FinchTV 1.4 (США), Unipro UGENE 1.7.0 (Россия).

Количественное определение вируса

Количественное определение ВК методом ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени проводили по методике, разработанной Забиякой Ю.И. с соавторами [Забияка Ю.И., 2010].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Анализ температурной чувствительности штаммов вируса краснухи

В процессе аттенуации вакцинные штаммы вируса краснухи приобретают ряд фенотипических отличий от диких штаммов. Одним из важнейших фенотипических маркеров аттенуации является наличие ca -фенотипа, т.е. способность эффективно репродуцироваться при пониженной температуре. Аттенуацию всех вакцинных штаммов вируса краснухи проводили при пониженной температуре, в результате чего все они приобрели ca -фенотип [Ohtawara M., 1985]. В данной работе был проведен анализ интенсивности репродукции дикого и холодоадаптированного вариантов штамма С-77, а также вакцинного штамма Wistar RA27/3 в качестве штамма сравнения, при различных температурных режимах с использованием метода количественного определения вируса на основе ПЦР-РВ. Для получения образцов вируссодержащей жидкости культуру клеток Vero заражали вирусом краснухи с множественностью заражения 0.01 инфекционная единица на клетку. Сбор вирусного материала проводили на 3-6 сутки после заражения.

Было установлено, что на пятый день культивирования при 39С титр ca46, ca39 вариантов штамма С-77 и штамма Wistar RA27/3 был меньше на 2.6, 2.2 и 1.1 lgТЦД50/мл соответственно, чем при температуре культивирования 33С (p<0.01), в то время как у wt варианта не наблюдалось достоверной разницы в титрах вируса при температуре культивирования 33С и 39С на пятый день (рисунок 1).

Небольшая разница в титре варианта са46 при температуре культивирования 33С и 39С была более выражена, чем у варианта ca39 (p<0.01), что может быть обусловлено лучшей адаптацией варианта ca46 к пониженной температуре культивирования, т.к. вариант ca39 культивировался при 33С 4 пассажа, а вариант ca46 – 11.

Таким образом, была установлена достоверная разница в интенсивности репродукции са39 и ca46 вариантов штамма С-77 при температурах культивирования 33С и 39С, при отсутствии достоверной разницы для wt варианта (рис. 1), что подтверждает наличие у ca вариантов вируса биологического маркера аттенуации – холодоадаптированного фенотипа. Данный маркер аттенуации может быть использован для дифференцирования ослабленных и диких штаммов вируса краснухи, а также для контроля стабильности вакцинных штаммов при производстве вакцин против краснухи.

Рис. 1. Накопление wt, ca39, ca46 вариантов штамма С-77 и штамма Wistar RA27/3 вируса краснухи в культуральной жидкости на пятый день культивирования при температуре 33С и 39С. Данные представлены в виде средних значений трех независимых экспериментов

Изучение wt и ca  вариантов штамма С-77 в иммунологическом маркерном тесте

Одним из фенотипических маркеров аттенуации вируса краснухи является пониженная иммуногенность на кроликах по сравнению с диким штаммом [Linnemann C.C., 1974]. Для выявления иммунологического маркера аттенуации штамма С-77 вируса краснухи было проведено сравнение антигенных свойств wt, ca39 вариантов штамма С-77, а также вакцинного штамма Wistar RA27/3 при внутривенной иммунизации кроликов.

Применение ИФА позволило выявить развитие сероконверсии вирус-специфических IgG-антител в ответ на введение вируса краснухи. Общий уровень IgG антител был определен перед первичной иммунизацией, а также через три, пять и девять недель после иммунизации (рис. 2). Уже через одну неделю после первичной иммунизации в сыворотке кроликов выявлялись вирусспецифические IgG-антитела к вирусу краснухи. Было выявлено, что наибольшей антигенностью обладают ca39 и wt варианты штамма С-77, у которых наблюдался высокий уровень антител, начиная с третьей недели после иммунизации, в то время как у штамма Wistar RA27/3 уровень антител был значительно ниже (рис. 2).

Рис. 2. Уровень IgG антител при первичной иммунизации кроликов wt, ca39 вариантами штамма С-77 и штаммом RA27/3, установленный методом ИФА. Титр вируса, использованный для иммунизации, – 3 lgТЦД50/мл, разведение сывороток 1:100.

В этих же сыворотках был определен титр вируснейтрализующих антител в реакции нейтрализации. Уже на первой неделе после первичной иммунизации наблюдался рост титра антител к wt варианту штамма C-77, который достигал максимальных значений 1:32 на 3-9 неделях. Титр антител к ca39 варианту штамма С-77, а также к штамму RA27/3 был значительно ниже, что согласуется с классическим испытанием Линнеманна на иммуногенность ослабленных штаммов. Максимальный титр ca39 варианта на пятой неделе составил 1:8, штамма Wistar RA27/3 – 1:4 на третьей неделе. На девятой неделе титр вируснейтрализующих антител к вакцинному штамму Wistar RA27/3 и са39 падал до 1:2, тогда как титр антител к дикому варианту штамма С-77 оставался на высоком уровне (рис. 3). Полученные данные свидетельствуют о существенных иммунологических различиях между диким и холодоадаптированными вариантами штамма С-77. Уровень протективных антител к холодоадаптированным штаммам краснухи был достоверно ниже. Наблюдалась достоверная разница в титре антител к ca39 варианту и штамму RA27/3, что говорит о более высокой антигенности штамма С-77 для кроликов. Таким образом, с помощью иммунологического маркерного теста у ослабленного и холодоадаптиарованного варианта штамма С-77 выявлен иммунологический маркер аттенуации. Наряду с холодоадаптированным фенотипом данный маркер аттенуации может быть использован на производстве для контроля стабильности вакцинных штаммов.

Рис. 3. Титр вируснейтрализующих антител у кроликов при первичной иммунизации wt, ca39 вариантами штамма С-77 и штаммом RA27/3. Титр вируса, использованный для иммунизации, – 3 lgТЦД50/мл.

Определение и сравнительный анализ нуклеотидной последовательности генома дикого и аттенуированного вариантов ВК (штамм С-77)

С целью выявления вероятных генетических детерминант холодовой адаптации было проведено полное секвенирование генома wt и ca39 вариантов штамма С-77 вируса краснухи. При секвенировании геномов wt и ca  вариантов штамма С-77 были определены все кодирующие последовательности, важные для оценки роли конформационных изменений вирусных белков.

Несмотря на существование только одного серотипа вируса краснухи и высокую консервативность генома, генотипирование выделенных штаммов является важной задачей эпидемиологии. Генотипирование штаммов вируса краснухи, выделенных у пациентов, служит для оценки эффективности элиминации краснухи, а также оценки реальных источников инфекции [WHO Expert Committee on Biological Standardization Technical Report Series No 941 2007]. С целью генотипирования штамма вируса краснухи С-77 был проведен филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей, кодирующих ген Е1 размером 1442 нуклеотида (8256-9698) wt варианта вируса, в результате которого штамм вируса краснухи С-77 был отнесен к генотипу 1h. Параллельно, в качестве контроля, проводили секвенирование участка генома Е1 вакцинного штамма RA27/3: полученная нами последовательность на 100% совпала с уже известной (код в GenBank - FJ211588).

С целью выявления вероятных генетических детерминант холодовой адаптации было проведено сравнение геномов wt и ca39 вариантов штамма С-77 вируса краснухи. При сравнении геномов ca  и wt вариантов штамма С-77 обнаружено 13 нуклеотидных замен, 6 из которых приводили к замене аминокислоты. Во фрагменте, кодирующем открытую рамку считывания неструктурных белков (ОРС НСБ), было обнаружено 8 нуклеотидных замен, 4 из которых ведут к замене аминокислоты. Во фрагменте, кодирующем открытую рамку считывания структурных белков (ОРС СБ), было обнаружено 5 нуклеотидных замен, 2 из которых ведут к замене аминокислоты (табл. 1).

       

Таблица 1

Нуклеотидные и аминокислотные замены ca  варианта штамма С-77

Фрагмент

Мутации в нуклеотидной последовательности

Аминокислотные замены

Позиция

wt

ca39

Уникальность*

Позиция

wt

ca

ОРС НСБ

P150

164

ACC

TCC

Нет

21

Thr

Ser

328

AGC

AGT

Да

-

-

-

2320

AGC

AGT

Нет

-

-

-

3165

TAC

TGC

Да **

1042

Tyr

Cys

3357

AGT

ACT

Да

1106

Ser

Thr

P90

5360

CTC

TTC

Нет

1774

Leu

Phe

6064

TTC

TTT

Да**

-

-

-

6223

GTC

GTT

Нет

-

-

-

ОРС СБ

C

6588

CTC

TTC

Да

27

Leu

Phe

7392

GCC

GCT

Нет

-

-

-

Е2

7490

CAT

CAC

Нет

-

-

-

8199

GCC

ACC

Да

564

Ala

Thr

Е1

8957

GTC

GTT

Нет

-

-

-

* Проводилось сравнение с известными последовательностями диких штаммов вирусов краснухи, представленными в базе GenBank NCBI.

** Обнаружено совпадение только с одной последовательностью дикого штамма из базы данных GenBank.

Было проведено множественное выравнивание последовательностей ca39 и wt вариантов штамма С-77 с 97 последовательностями диких штаммов вируса краснухи из базы данных NCBI GenBank, из которых 24 полноразмерных геномных последовательностей, 44 последовательности, кодирующих ОРС СБ, 2 последовательности, кодирующие ОРС НСБ, 29 последовательностей, кодирующих протеазу. В результате было обнаружено, что четыре аминокислотные замены являются уникальными, т.е. в данных позициях у диких штаммов вируса краснухи не обнаруживалось такой же аминокислоты за исключением 1 штамма (табл. 1). Две из них локализуются в позициях 3165 и 3357 в ОРС НСБ и приводят к заменам аминокислот Tyr1042Cys и Ser1106Thr в протеазе. Две других локализуются в позициях 6588 и 8199 ОРС СБ и приводят к заменам аминокислот Leu27Phe в белке С и Ala567Thr в белке Е2.


Выявление и анализ мутаций, потенциально ответственных за холодовую адаптацию штамма С-77 вируса краснухи

В поиске общих закономерностей генетических изменений, возникающих в геноме вируса краснухи при холодовой адаптации, проведено сравнение аминокислотных замен штамма С-77 с соответствующими позициями известных полноразмерных последовательностей холодоадаптированных вакцинных штаммов вируса краснухи и их диких штаммов-предков, при их наличии (табл. 2). Сравнение проводили со следующими штаммами: Matsuba vaccine (GenBank AB588193), Matsuba GMK3 (GenBank AB588189), BRD-2 Vac (GenBank AY258323), BRD-1 (GenBank AY258322), Takahashi vaccine (GenBank AB222608), RVi/Matsue.JPN/68 GenBank AB003453.1), а также тремя вакцинными штаммами, для которых не сохранены дикие штаммы-предки, TCRB19 vaccine (GenBank AB588188) Cendehil (GenBank AF188704) и Wistar RA27/3 (GenBank FJ211588). Перечисленные вакцинные штаммы относятся к генотипу 1a, за исключением китайских штаммов BRD-1 и BRD-2, которые относятся к генотипу 2А.

В позиции 21 ОРС НСБ вакцинного штамма Wistar RA27/3, также как и у ca варианта штамма С-77, находится аминокислота Ser, тогда как у wt варианта – Thr. Наличие в этой же позиции аминокислоты Thr у других диких штаммов, вакцинных штаммов и их предков, а также отсутствие дикого штамма-предка у RА27/3 не позволяет судить о значимости этой замены для процесса аттенуации вируса краснухи (табл. 2).

У некоторых вакцинных штаммов в триплетах, соответствующих аминокислотным заменам штамма С-77, были выявлены замены нуклеотидов, не ведущие к замене аминокислот. Так, у вакцинного штамма BRD-2 в ОРС НСБ в домене, кодирующем протеазу, в позиции 3358 имеет место нуклеотидная замена цитозина на тимин (AGC-AGT), при этом замены аминокислоты не происходит. У ca  варианта штамма С-77 в этом же триплете выявлена замена гуанина на цитозин в позиции 3357 (AGT-ACT), сопровождающаяся заменой аминокислоты Ser1106Thr. Данная нуклеотидная замена является уникальной, т.е. ни у одного из диких штаммов вируса краснухи не обнаруживалось такого же нуклеотида в данной позиции. У вакцинного штамма Takahashi vaccine в ОРС НСБ в домене, кодирующем полимеразу, в позиции 5362 имеет место нуклеотидная замена цитозина на тимин (TTC-TTT), при этом замены аминокислоты также не происходит. У ca  варианта штамма С-77 в этом же триплете выявлена замена цитозина на тимин в позиции 5360 (CTC-TTC), сопровождающаяся заменой аминокислоты Leu1774Phe (табл. 2). В свою очередь в позиции 6223 у ca  варианта штамма С-77 была обнаружена нуклеотидная замена, не ведущая к замене аминокислоты; замена в той же позиции была обнаружена в вакцинном штамме BRD-2.

В позиции 1042 ОРС неструктурных белков штамма С-77 выявлена аминокислотная замена Tyr на Cys. В результате сравнительного анализа в этой же позиции имеет место замена Tyr на His в японских штаммах Matsuba и Takahashi vaccine. Также у двух вакцинных штаммов TCRB-19 и Cendehil, для которых не сохранились штаммы-предки, в этой позиции находятся аминокислоты Cys и His соответственно. Важно отметить, что у всех диких штаммов вируса краснухи, представленных в базе данных GenBank (NCBI), в этой позиции находится аминокислота Tyr за исключением одного штамма.

Таблица 2.

Сравнение аминокислотных замен ca  варианта штамма С-77, приобретенных в процессе холодовой адаптации с известными вакцинными штаммами вируса краснухи и их дикими штаммами-предками

Штамм (генотип)

 

ОРС НСБ

ОРС СБ

Метилтрансфераза

Протеаза

Полимераза

С

Е2

164

21

3165

1042

3357

1106

5360

1774

6588

27

8199

564

C-77 wt (1h)

ACC

Thr

TAC

Tyr

AGT

Ser

CTC

Leu

CTC

Leu

GCC

Ala

C-77 сa39(1h)

TCC

Ser

TGC

Cys

ACT

Thr

TTC

Phe

TTC

Phe

ACC

Thr

C-77 сa46(1h)

-

-

TGC

Cys

-

-

-

-

-

-

-

-

Matsuba wt (1A)

ACC

Thr

TAC

Tyr

AGT

Ser

TTC

Phe

CTC

Leu

GCC

Ala

Matsuba vac (1A)

ACC

Thr

CAC

His

AGT

Ser

TTC

Phe

CTC

Leu

GCC

Ala

BRD-1 wt (2A)

ACC

Thr

TAC

Tyr

AGC

Ser

TTC

Phe

CTC

Leu

GCC

Ala

BRD-2 vac (2A)

ACC

Thr

TAC

Tyr

AGT

Ser

TTC

Phe

CTC

Leu

GCC

Ala

KRT wt (1A)

ACC

Thr

TAT

Tyr

AGT

Ser

TTC

Phe

CTC

Leu

GCC

Ala

KRT vac (1A)

ACC

Thr

CAC

His

AGT

Ser

TTT

Phe

CTC

Leu

GCC

Ala

TO-336 wt (1A)

ACC

Thr

TAC

Tyr

AGT

Ser

TTC

Phe

CTC

Leu

GCC

Ala

TO-336 vac (1A)

ACC

Thr

TAC

Tyr

AGT

Ser

TTC

Phe

CTC

Leu

GCC

Ala

Matsuura wt (1A)

ACC

Thr

TAC

Tyr

AGT

Ser

TTC

Phe

CTC

Leu

GCC

Ala

Matsuura vac (1A)

ACC

Thr

TAC

Tyr

AGT

Ser

TTC

Phe

CTC

Leu

GCC

Ala

TCRB-19 vac (1A)

ACC

Thr

TGC

Cys

AGT

Ser

TTC

Phe

CTC

Leu

GCC

Ala

Cendehil vac (1A)

ACC

Thr

CAC

His

AGT

Ser

TTC

Phe

CTC

Leu

GCC

Ala

RA27/3 vac (1A)

TCC

Ser

TAC

Tyr

AGT

Ser

TTC

Phe

CTC

Leu

GCC

Ala

На белом фоне – аттенуированные/вакцинные штаммы вируса краснухи. Цветом выделены дикие штаммы вируса краснухи.  - Секвенирование не проводилось

Результаты исследований разных групп ученых сходятся в том, что мутации, локализованные в генах, кодирующих неструктурные белки, и, в частности, протеазу, которая участвует в протеолитическом процессинге неструктурных белков, ведут к появлению холодоадаптированного фенотипа [Noriyuki O.2011, Sakata M. 2009, Sakata M. 2011, Zhou Y.2009]. В нашем исследовании было выявлено 4 значимые мутации в области, кодирующей неструктурные белки, 2 из них в области, кодирующей протеазу. Двумя группами японских ученых в 2009-2011 гг. был выявлен ряд мутаций в этой области, ведущих к снижению репродукции вируса краснухи при повышенной температуре [Noriyuki O. 2011, Sakata M. 2009, Sakata M. 2011].

Особого внимания заслуживает замена Tyr на Cys в позиции 1042 в протеазном домене штамма C-77. Данная мутация локализуется в протеазном домене полипротеина p150 [Sakata M. 2009] и является уникальной, т.е. у диких штаммов вируса краснухи в этой позиции практически всегда имеет место аминокислота Tyr. Нами было проведено секвенирование фрагмента генома длиной 1364 нуклеотида, кодирующего протеазу, у ca46 варианта штамма C-77. В результате показано, что данная мутация сохранялась и в ca46 варианте штамма C-77.

В вакцинном штамме TCRB-19 в данной позиции также находится аминокислота Cys, а в штаммах Matsuba и Cendehil – Tyr и His соответственно. Замена Tyr на His в позиции 1042 в вакцинном штамме Takahashi vaccine сопровождалась появлением ts фенотипа, что было доказано методами обратной генетики [Sakata M. 2009]. При обратной замене гистидина на тирозин в позиции 1042 генома вакцинного штамма Takahashi vaccine наблюдался значительный рост интенсивности репродукции полученного штамма при 39°С, однако, при замене тирозина на гистидин в позиции 1042 в геноме дикого штамма-предка RVi/Matsue.JPN/68 наблюдалось лишь незначительное снижение репродукции вируса при 39°С, что свидетельствует о наличии дополнительных детерминант холодовой адаптации [Sakata M. 2011]. Японскими учеными было выявлено, что молекулярный клон дикого штамма RVi/Matsue.JPN/68 с заменой Y1042H и T1497I (домен хеликазы) обладал сопоставимыми показателями роста с вакцинным штаммом Takahashi vaccine при температуре культивирования 39°С. Интенсивность репродукции данного клона была существенно ниже, чем у дикого штамма RVi/Matsue.JPN/68 и у клона с единственной заменой Y1042H [Sakata M. 2011].

Помимо этого, нельзя исключать вклад в развитие холодоадаптированного фенотипа и других замен, в том числе и не ведущих к замене аминокислот [Sakata M. 2011]. Совокупность таких замен, возникших в процессе холодовой адаптации, может способствовать репликации вируса при пониженной температуре или приводить к снижению стабильности геномных структур при повышенной температуре и, как следствие, снижать эффективность репликации вируса. Также к снижению репродукции при повышенной температуре может приводить и совокупность как транс-, так и цис- действующих факторов. Было выявлено, что сниженная интенсивность репродукции при температуре культивирования 39°С вакцинного штамма Takahashi (KRT) обусловлена подавлением синтеза РНК. Интенсивность репликации РНК у молекулярного клона с обратной заменой H1042Y при 39°С была на прежнем уровне. В то же время у дикого штамма-предка с заменой Y1042H также наблюдалось ослабление репликации при 39°С в сравнении с исходным диким штаммом Takahashi rvi/Matsue.jpn/68 [Sakata M. 2011]. Изменения в интенсивности репликации РНК возникали только при наличии замены в позиции 1042.

У вируса краснухи нерасщепленный неструктурный полипротеин p200 необходим для синтеза комплементарной полноразмерной РНК отрицательной полярности, которая является матрицей для синтеза геномной РНК. В синтезе геномной РНК участвуют продукты процессинга полипротеина p200 – белки p150 и p90. Таким образом, регуляция этих двух этапов репликации генома вируса краснухи осуществляется с помощью процессинга НСБ [Liang Y 2001]. Замены в участке генома, кодирующего протеазу, обнаруженные нами в штамме С-77, а также выявленные у вакцинного штамма Takahashi KRT и TO-336 vaccine, могут вызывать снижение активности вирусной протеазы при повышенной температуре культивирования, а также снижать конформационную стабильность процессированных и непроцессированных НСБ, что в результате может приводить к снижению репликации вируса при повышенной температуре [Sakata M. 2011].

У других представителей семейства Тогавирусов, таких как вирус Синдбис и вирус леса Семлики, выявлены штаммы с термочувствительным фенотипом с одиночными мутациями в доменах протеазы и хеликазы [Lulla V., 2006].

Протеазный домен вируса краснухи содержит богатый цистеином участок связывания ионов Сa 2+ и Zn2+, которые необходимы для протеазной активности и репликации вируса [Zhou Y. 2009]. Кроме того, данный участок содержит домен связывания кальмодулина (кальций-связывающий белок), который также играет важную роль в протеазной активности и репликации вируса [Zhou Y. 2010]. Мутации в этом домене приводят к снижению его конформационной стабильности при высокой температуре [Zhou Y. 2010], что является возможной причиной приобретения термочувствительного фенотипа некоторых вакцинных штаммов вируса краснухи.

Приведенные выше данные позволяют с высокой степенью уверенности утверждать, что замена Tyr на Cys в позиции 1042 в протеазном домене штамма C-77 является не случайной и не следствием адаптации к культуре клеток Vero, а прямо связана с приобретенным холодоадаптированным фенотипом.

Таким образом, в результате сравнительного анализа полноразмерных геномов wt и ca39 вариантов штамма С-77 были выявлены вероятные генетические детерминанты аттенуации вируса краснухи. 5 из 13, выявленных нами нуклеотидных замен в позициях 2320, 6223, 7392, 7490 и 8957, приобретенных в процессе холодовой адаптации штамма С-77, по всей вероятности, являются случайными, так как не ведут к замене аминокислоты и не являются уникальными. Хотя полностью исключать их роль в приобретении холодоадаптированного фенотипа штаммом С-77 нельзя. Две нуклеотидные замены в позициях 328 и 6064 также не ведут к замене аминокислот, но являются уникальными и поэтому представляют больший интерес. Нуклеотидная замена в позиции 164, сопровождается заменой аминокислоты Thr21Ser. Данная нуклеотидная замена не является уникальной, но аминокислота Ser в этой позиции находится у вакцинного штамма Wistar RA27/3 и не встречается ни у одного штамма-предка других вакцинных штаммов. Одна нуклеотидная замена в позиции 5360 ведет к замене аминокислоты, но не является уникальной. Наибольший интерес представляют нуклеотидные замены в позициях 3165, 3357, 6588, 8199, так как они ведут к замене аминокислот, нехарактерных для диких штаммов вируса краснухи, что рассматривается нами как свидетельство их вероятной роли в приобретении холодоадаптированного фенотипа ca  варианта штамма С-77 или адаптации к новому хозяину (клеткам Vero). Замена аминокислоты Tyr на Cys в позиции 1042 ОРС НСБ, соответствующая нуклеотидной замене в позиции 3165, по всей вероятности, играет ключевую роль в приобретении холодоадаптированного фенотипа ca  варианта штамма С-77, что согласуется с последними данными литературы.

Выводы

  1. Показано, что варианты штамма С-77 (39 и 46 пассаж) обладают холодоадаптированным фенотипом.
  2. Установлены фенотипические различия дикого и ослабленного вариантов штамма С-77 вируса краснухи, выражающиеся в сниженной иммуногенности на кроликах и различной интенсивности репродукции при пониженной температуре.
  3. При сравнении геномов ca  и wt вариантов штамма С-77 обнаружено 13 нуклеотидных замен, 6 из которых приводили к замене аминокислот. 4 аминокислотные замены локализуются в области, кодирующей неструктурные белки, а 2 – в домене протеазы.
  4. Четыре аминокислотные замены являются уникальными, что позволяет судить об их важной роли в приобретении холодоадаптированного фенотипа ca  варианта штамма С-77 или адаптации к новому хозяину (культуре клеток Vero). 
  5. Замена аминокислоты Tyr на Cys в позиции 1042 ОРС НСБ области, кодирующей протеазу, соответствующая нуклеотидной замене в позиции 3165, играет ключевую роль в приобретении холодоадаптированного фенотипа ca  варианта штамма С-77.
  6. Вариант штамма С-77 на 39 пассаже по своим фенотипическим и генетическим характеристикам может рассматриваться в качестве кандидата для производства отечественной вакцины.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

  1. Дмитриев Г.В., Файзулоев Е.Б., Оксанич А.С., Десятскова Р.Г., Борисова Т.К., Зверев В.В. Лабораторная характеристика дикого и ослабленного вариантов штамма С-77 вируса краснухи (тезисы) // Журнал инфектологии. –2010. – Т.2. – №3. С. 77.
  2. Дмитриев Г.В., Забияка Ю.И., Файзулоев Е.Б., Борисова Т.К., и др. Характеристика дикого и ослабленного вариантов штамма C-77 вируса краснухи // Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней (сб. научных трудов) под редакцией проф. Шапошникова А.А. и проф. Ющенко Г.В. М.: ЗАО МП «ГИГИЕНА». – 2011. – №10 С. 222-226
  3. Дмитриев Г.В., Забияка Ю.И., Файзулоев Е.Б., Борисова Т.К., Десятскова Р.Г., Зверев В.В.. Выявление маркеров аттенуации отечественного холодоадаптированного штамма С-77 вируса краснухи // Эпидемиология и вакцинопрофилактика, – 2012.– № 1 (62).– С. 69-71.
  4. Дмитриев Г.В., Борисова Т.К., Файзулоев Е.Б., Зверев В.В. Модельная система для изучения механизмов формирования иммунного ответа на вирус краснухи // Российский аллергологический журнал.– 2011.– №4(1).– С 445-446.
  5. Дмитриев Г.В., Борисова Т.К., Файзулоев Е.Б., Забияка Ю.И., Десятскова Р.Г., В.В. Зверев. Изучение молекулярных механизмов аттенуации вируса краснухи на примере отечественного штамма С-77 // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология.– 2012.– №3.– С. 28-34.
  6. Y. Ammour, E. Faizuloev, T. Borisova, A. Nikonova, G. Dmitriev, S. Lobodanov, V. Zverev Q. Quantification of measles, mumps and rubella viruses using real-time quantitative TaqMan-based RT-PCR assay // Journal of Virological Methods. – doi:10.1016/j.jviromet.2012.09.011.





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.