WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ТРОФИМОВА Ирина Леонидовна

ФЕНОМЕН ИЗБИРАТЕЛЬНОЙ ОКРАСКИ ФЛУОРОХРОМОМ АКРИДИНОВЫМ ОРАНЖЕВЫМ ГЕТЕРОХРОМАТИНОВЫХ РАЙОНОВ МЕТАФАЗНЫХ ХРОМОСОМ ЧЕЛОВЕКА

Специальность: 03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург – 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им.Д.О.Отта» Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук и на кафедре генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета

Научный консультант: доктор биологических наук, доцент Кузнецова Татьяна Владимировна, ФГБУ «НИИ акушерства и гинекологии им.Д.О.Отта» СЗО РАМН, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, доцент Козикова Лариса Васильевна, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной цитогенетики ГНУ ВНИИ генетики и разведения с.х. животных РАСХН, СанктПетербург кандидат биологических наук Медведева Анна Владимировна, научный сотрудник лаборатории нейрогенетики института физиологии им. И.П. Павлова РАН, Санкт-Петербург

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение " Научно-исследовательский институт медицинской генетики" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, Томск

Защита состоится «____» ________________ 2012 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 212.232.12 при Санкт-петербургском государственном университете по адресу: 199034 СанктПетербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан «____» ____________ 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 212.232.доктор биологических наук Мамон Людмила Андреевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Организация и функциональная значимость таких специализированных участков хромосом как гетерохроматиновые районы (ГХР) привлекают особое внимание цитогенетиков человека с конца 1950-х гг., когда было обнаружено явление хромосомного полиморфизма. Особенно значительные и вариабельные по размерам блоки гетерохроматина (ГХ) локализованы в прицентромерных районах хромосом 1, 9 и 16, а также в дистальном отделе длинного плеча Y-хромосомы. Методами дифференциальной окраски (CBG, DA/DAPI, MG/QFH) был установлен гетероморфизм гомологичных районов прицентромерного ГХ (ПЦГХ) и для других хромосом (акроцентрические хромосомы, хромосомы 3 и 4). ГХР 1qh, 9qh, 16qh и Yqh издавна отводится особая роль в нарушениях репродукции у человека (см.

Прокофьева-Бельговская, 1986; Назаренко, 1993; Баранов, Кузнецова, 2007; Ворсанова и др., 2010), однако биологический смысл С- и Q-гетероморфизма ГХР и механизмы участия этих районов в нормальном и патологическом эмбриогенезе человека остаются предметом дискуссий.

В настоящее время традиционные представления о молекулярной организации и функциональной инертности ПЦГХ подверглись существенному пересмотру. В составе ПЦГХ млекопитающих и человека, кроме различных по протяженности и нуклеотидному составу сатДНК обнаружено высокое содержание ретротранспозонов, которые, по-видимому, принимают участие в репрограммировании генома и регулируют экспрессию многих генов на начальных стадиях эмбриогенеза (Peaston et.al., 2004; Tomilin, 2008; Eymery et.al., 2009).

Показана транскрипция сатДНК ПЦГХ у разных организмов (Rizzi et.al., 2004; Jolly et.al., 2004, 2006; Enukashvily et.al., 2007; Jehan et.al., 2007; Probst, Almouzni, 2011). Предполагается, что образующиеся РНК-транскрипты принимают участие в моделировании структуры хроматина в ответ на стресс (Rizzi et.al., 2004; Jolly et.al., 2004), участвуют в регуляции клеточного цикла (Lu, Gilbert, 2007) и клеточной дифференцировки (Eymery et.al., 2009; 2010). Полученные за последние годы сведения позволили сформулировать гипотезу, согласно которой программа индивидуального развития закодирована в специфических последовательностях ДНК в ПЦГХ, нарушения транскрипции которых могут пагубно отражаться на функциях генома, проявляться в виде синдромов, приводить к остановке развития и даже гибели эмбриона на ранних стадиях (Parris, 2009; 2010). Однако данных о транскрипции ПЦГХ в эмбриогенезе человека пока не получено.

Поиск причин нарушений и остановки эмбрионального развития у человека проводится, в основном, при спонтанных абортах и реже при других клинических формах патологии беременности – неразвивающейся беременности и анэмбрионии, при которых развитие хориона продолжается в течение нескольких недель после гибели эмбриона. Доминирующим фактором в ранней внутриутробной гибели признан хромосомный дисбаланс (Лебедев и др., 2006; Баранов, Кузнецова, 2007), при этом летальные для эмбриона доимплантационных стадий хромосомные аномалии могут быть совместимы с развитием и дифференцировкой экстраэмбриональных тканей после имплантации (Лебедев, 2006). Поэтому исследования структурно-функциональных особенностей ГХР хромосом в эмбриональных и экстраэмбриональных тканях, развитие которых происходит по разным программам, вызывают особый интерес.

К настоящему времени показано, что ГХР хромосом в цитотрофобласте (ЦТБ) хориона по сравнению с клетками эмбриональных органов деконденсированы и гипометилированы, а также рано реплицируются (Perez et.al., 1991; Назаренко, Карагеоргий, 1995; Баранов, Кузнецова, 2007). В свете современных представлений о функциях ГХ особую актуальность приобретают исследования процессов пролиферации и дифференцировки клеток трофобласта, нарушения которых также могут сопровождаться гибелью эмбриона при имплантации и плацентации.

Учитывая, что сведения о параметрах клеточного цикла и митотической активности клеток ЦТБ хориона от эмбрионов при нормальной беременности и спонтанных абортусов скудны и противоречивы (Брусиловский, 1976; Terzoli et.al., 1985; Zahed et.al., 1988; Барцева, 1989; Kennerknehct et.al., 1992), представлялось целесообразным исследовать особенности пролиферации клеток ЦТБ при неразвивающейся беременности. При выполнении этой задачи на краткосрочных органных культурах ворсин хориона с помощью метода «меченых митозов» мы обратили внимание на необычный спектр и избирательность окраски флуорохромом акридиновым оранжевым (АО) полиморфных ГХР хромосом. Аналогичная флуоресценция районов ПЦГХ была также обнаружена на препаратах из нативных и культивированных в отсутствии БДУ образцов хориона, не подвергавшихся каким-либо деконденсирующим или денатурирующим предобработкам, как при неразвивающейся, так и нормальной физиологической беременности. Известно, что для АО характерна метахромазия, обусловленная взаимодействием флуорохрома с нуклеиновыми кислотами, белками и другими биополимерами.

Так, двуцепочечные нуклеиновые кислоты АО окрашивает в зеленый цвет, а одноцепочечные – в красный (Зеленин, 1967; Zelenin, 1999; Луппа, 1980). При рН выше 7.0 краситель способен образовывать комплексы с белками и флуоресцировать в красной области спектра (Зеленин, 1967; Zelenin, 1999).

Исходя из особенностей взаимодействия флуорохрома с нуклеопротеиновым составом хромосом, целью исследования явилось изучение причин обнаруженной нами избирательной окраски АО ГХР хромосом человека.

Конкретные задачи включали:

1) Анализ влияния различных условий приготовления и окрашивания препаратов на характер флуоресценции АО в районах 1qh, 9qh и 16qh в клетках ЦТБ, эмбриональных органов и ФГА-стимулированных лимфоцитов человека.

2) Выяснение распространенности феномена избирательной окраски ПЦГХ с помощью АО на препаратах из различных типов клеток человека и мыши.

3) Изучение особенностей флуоресценции АО в ГХР хромосом 1, 9, 16 в ЦТБ и в эмбриональных клетках после обработок эндонуклеазами и протеолитическими ферментами.

4) Определение транскрипционной активности сатДНК3 хромосомы 1 (HS3-1 - human satellite of chromosome 1) в эмбриональных и экстраэмбриональных клетках на разных стадиях эмбрионального развития человека.

5) Исследование локализации HS3-1 в ядрах клеток эмбриональных и экстраэмбриональных тканей человека.

Научная новизна. Впервые обнаружен феномен и изучена природа хромосом-специфичной избирательной окраски флуорохромом АО районов ПЦГХ хромосом человека. Установлено, что этот феномен характерен для ГХР хромосом спонтанно делящихся клеток человека и мыши.

Впервые проведено комплексное исследование метафазных хромосом человека с помощью РНКазы А, РНКазы Н, ДНКазы I и ДНК-лигазы Т4, результаты которого свидетельствуют в пользу наличия разрывов в ДНК ГХР хромосом 1, 9, 16 в ЦТБ хориона и эмбриональных клетках, а также одноцепочечных нуклеиновых кислот и дуплексов РНК-ДНК в клетках ЦТБ.

Впервые исследована локализация HS3-1 в интерфазных ядрах эмбриональных и экстраэмбриональных клеток человека. Показано, что в клетках хориона раннего срока 4-недель беременности (н.б.) HS3-1 располагается ближе к центру ядра и граничит с хромоцентрами, тогда как, начиная с 5-6 н.б., в клетках зрелой плаценты, а также в клетках собственно эмбриональных тканей (печень, почка, позвоночник), HS3-1 расположен ближе к периферии ядра и входит в состав хромоцентров.

Впервые обнаружены полиаденилированные транскрипты HS3-1 в эмбриональных органах и в хорионе на сроке 7-9 н.б Показано, что транскрипция HS3-1 в разных тканях происходит либо со смысловой, либо с антисмысловой цепи ДНК, но не с обеих цепей одновременно. На более поздних сроках транскрипты HS3-1 не обнаружены ни в эмбриональных, ни в экстраэмбриональных тканях.

Показано, что в условиях in vitro в течение 24-96 ч клетки ЦТБ хориона проходят не более двух последовательных клеточных делений.

Получены данные, свидетельствующие о недорепликации ГХР, а также подтверждена асинхронная репликация ГХР хромосом 1, 9, 16 в ЦТБ хориона.

Теоретическая и практическая значимость результатов. Результаты работы вносят вклад в понимание структуры и функциональной роли ГХ в эмбриогенезе человека. При анализе транскрипции и репликации сатДНК в хорионе и плаценте следует учитывать особенности митотической активности, а также лимит последовательных клеточных делений клеток ЦТБ в условиях in vitro. Установленный факт недорепликации ДНК в ГХР расширяет представления о механизмах пролиферации, дифференцировки и апоптоза клеток ЦТБ хориона в период активного органогенеза. Феномен метахроматической окраски флуорохромом АО указывает на своеобразную организацию ГХР метафазных хромосом в бластных клетках и акцентирует внимание на необходимости детальных исследований ПЦГХ в разных типах клеток.

Полученные данные свидетельствуют, что органная культура образцов хориона в течение 24-96 ч в сочетании с методом дифференциальной окраски RBA, предполагающем использование БДУ, может повысить результативность и разрешающую способность цитогенетической диагностики при анализе причин неразвивающейся беременности.

Результаты могут быть использованы в курсах лекций по организации интерфазного ядра, структуре хромосом, цитогенетике и биологии развития человека для студентов кафедр генетики и селекции, цитологии и гистологии, эмбриологии биолого-почвенного факультета СПбГУ. Избирательная окраска АО ГХР хромосом 1, 9, 16 благодаря воспроизводимости, простоте, скорости и экономичности может быть рекомендована в качестве экспресс-метода для анализа полиморфных ГХР хромосом человека в цитогенетической пренатальной диагностике и в онкогематологии.

Положения, выносимые на защиту:

1) В условиях краткосрочной органной культуры клетки ЦТБ хориона при физиологической и неразвивающейся беременности проходят, как правило, не более двух последовательных клеточных цикла. Репликация районов 1qh, 9qh, 16qh в ЦТБ хориона происходит асинхронно. Недорепликация ГХР является характерным свойством клеток ЦТБ.

2) Специфическая избирательная окраска флуорохромом АО полиморфных блоков 1qh, 9qh, 16qh на необработанных препаратах из хориона свидетельствует о цитохимических и конформационных особенностях организации ГХР хромосом в клетках ЦТБ.

3) В эмбриональных клетках и в клетках плаценты HS3-1 располагается в хромоцентрах и ближе к периферии ядерной оболочки. В клетках хориона на сроке 4-5 н.б. HS3-1 занимает более центральное положение в ядре и граничит с хромоцентрами.

4) Транскрипция HS3-1 происходит в клетках хориона и эмбриональных органов до 9 н.б.

Личный вклад автора. Основная часть экспериментальной работы выполнена автором самостоятельно. Часть исследования, связанная с изучением локализации и транскрипции HS31 выполнена совместно с сотрудниками лаборатории молекулярной генетики ИЭМ СЗО РАМН (Санкт-Петербург) и лаборатории морфологии клетки ИНЦ РАН (Санкт-Петербург), статистическая обработка экспериментальных данных проводилась при участии к.б.н.

Мыльникова С.В., что отражено в совместных публикациях.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на V съезде ВОГИС (Москва, 2009); конференции с международным участием Modern Microscopy Techniques in Biology and Medicine (г. Санкт-Петербург, 2009); конгрессах Европейского общества генетики человека (Вена, 2009; Гётеборг, 2010; Амстердам, 2011; Нюренберг, 2012); VII конференции Европейского цитогенетического общества (Стокгольм, 2009); Международной конференции общества IFPA «Плацента человека» (Аделаида, 2009); XVI Всероссийском симпозиуме “Структура и функции клеточного ядра” (Санкт-Петербург, 2010); VI съезда Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010); IX научной конференции «Генетика человека и патология: Актуальные проблемы современной цитогенетики» (Томск, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 21 работа, в том числе 5 статей в журналах перечня ВАК, 2 статьи в сборниках, 14 тезисов отечественных и международных конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 108 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Данные проиллюстрированы 7 таблицами и 20 рисунками. Библиографический указатель включает 2источников, из них 43 опубликованы в отечественной печати.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалом для исследования послужили образцы ворсинчатого хориона и эмбриональных органов (от 86 и 28 эмбрионов соответственно), полученные после прерывания беременности по медицинским или социальным показаниям в срок 5-12 н.б.; 13 образцов плацент в срок 36-н.б.; 2 образца пуповинной крови (20 и 22 н.б.) и 30 образцов периферической крови взрослых индивидов; 5 образцов костного мозга; 2 образца амниоцитов; биоптат яичка от пациента с бесплодием; мезенхимальные и эмбриональные стволовые клетки (3 и 1 образец соответственно); образцы костного мозга и семенников от 1-го взрослого самца мыши.

Методы исследования.

Приготовление препаратов метафазных хромосом из хориона (плаценты) и эмбриональных органов прямым и полупрямым методами проводили согласно стандартным протоколам (Баранов, Кузнецова, 2007) и с модификациями на этапах гипотонической обработки, фиксации, получения и нанесения клеточной суспензии из ворсин хориона или кусочка эмбрионального органа на препарат (Кузнецова и др., 2012).

Приготовление препаратов хромосом из костного мозга и семенников мыши проводили, как описано (Dyban, Baranov, 1987). В качестве гипотонического раствора использовали 0.55% KCl и 0.9% цитрат натрия.

Приготовление препаратов метафазных хромосом из лимфоцитов периферической и пуповинной крови проводили по стандартной методике (Кузнецова и др., 1999).

Препараты хромосом из других тканей. Препараты из пунктата костного мозга от пациентов, страдающих лейкозом, любезно предоставлены И.С.Мартынкевич, НИИ гематологии и трансфузиологии; пунктата яичка от пациента с бесплодием - И.Д. Федоровой, НИИАГ им. Д.О.

Отта; из образцов культивированных клеток амниотической жидкости - Ю.А.Логиновой, клиника Ава-Петер; из клеточных линий мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (4, 6 и 205 пассажи) - А.В.Воскресенской, НИИАГ им. Д.О. Отта и Г.Р.Акопян, Институт наследственной патологии НАМН Украины; препараты из культуры эмбриональных стволовых клеток - Н.Б.Рубцовым и Т.В.Карамышевой, ИЦиГ СО РАН. Препараты были приготовлены согласно стандартным протоколам.

Для анализа кариотипа использовали метод дифференциальной окраски хромосом QFH/AcD (Кузнецова и др., 1999).

Окраска АО. Препараты окрашивали раствором АО (0.1%; 0.01% или 0.001%), приготовленным на натрий-фосфатном буфере (рН 5.0 или 7.0) или цитратно-фосфатном буферном растворе Мак-Ильвейна (рН 5.5 или 7.0) (Кузнецова и др., 2012); и на ацетатном буферном растворе рН 4.2 (Сайфитдинова, 2008). Препарат заключали под покровное стекло в соответствующий буферный раствор.

Метод «меченных» митозов. Образцы хориона и эмбриональных органов инкубировали в течение 24, 48, 72, 96 ч с однократным введением БДУ в конечной концентрации 15 мкг/мл при постановке органной культуры. Препараты готовили согласно стандартному протоколу (Кузнецова и др., 1999) и окрашивали 0.01% АО.

Иммуноцитохимическое определение сегментов хромосом, включивших БДУ, проводили, как описано в монографии В.С Баранова и Т.В. Кузнецовой (2007).

Митотический индекс (МИ) рассчитывали согласно формуле: МИ = (количество митозов/10000 ядер)100%.

Обработка препаратов хромосом эндонуклеазами и протеолитическими ферментами.

Обработку препаратов метафазных хромосом РНКазой-А (DNAse free), РНКазой-Н (DNAse free), ДНКазой I, последовательную обработку РНКазой-А и ДНКазой I, ДНК-лигазой Т4, протеиназой К, 0.01% пепсином и 0.01% трипсином проводили, как описано (Трофимова и др., 2012). В качестве контроля использовали препараты после обработки соответствующими буферными растворами.

Приготовление препаратов интерфазных ядер для 3D-FISH анализа проводили, как описано (Вайссертрейгер и др., 2007).

2-D FISH и 3-D FISH проводили согласно стандартным протоколам (Баранов, Кузнецова, 2007;

Solovei et.al., 2002) и инструкции фирмы-производителя ДНК-зонда CEP1 (Abbot Molecular, USA).

Анализ препаратов проводили на универсальных микроскопах ЕС ЛЮМАМ-РПО11 (ЛОМО) и LEICA DM LS, оснащенных блоками светофильтров для флуорохромов Hoechst 33258, АО, FITC, DAPI и PI. Для получения видеоизображения использовали программное обеспечение Leica DFC Twain и Adobe Photoshop 7.0. Анализ локализации HS3-1 в ядрах проводили с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа «LSM 510 META» (Carl Zeiss, Германия). Получение, обработку, пространственную реконструкцию изображений и измерение расстояния между флуоресцентными сигналами в ядре осуществляли с помощью программного обеспечения "LSM 510" (Heidelberg, Germany).

Выделение РНК, обратная транскрипция и ПЦР. Тотальную РНК выделяли из эмбриональных и экстраэмбриональных тканей с использованием Trizole™ (Sigma Aldrich).

Реакцию обратной транскрипции и ПЦР проводили, как описано (Кузнецова и др., 2012).

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы «In Start Graph Pad Prism» и формул (Гланц, 1999).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Особенности репликации прицентромерного гетерохроматина хромосом 1, 9, 16 в клетках хориона человека Анализ репликации хромосом в клетках ЦТБ проводили на образцах хориона при физиологически нормальной беременности (группа ФБ, N=6) и при остановке развития плода (группа НБ, N= 8). «Меченные» митозы регистрировали с помощью окраски АО, при которой участок хромосомы, включивший БДУ, флуоресцирует в красной области спектра, не включивший – в желто-зеленой.

Для 450 метафазных пластинок в группе НБ и 277 в группе ФБ на всех препаратах, независимо от времени инкубирования образца с БДУ, была обнаружена красная флуоресценция ГХР хромосом 1, 9, 16 и желто-зеленая вдоль плеч всех хромосом. Аналогичная окраска ГХР, характерная для хромосом после одного раунда репликации в присутствии БДУ, наблюдалась также на всех контрольных препаратах, то есть инкубированных в среде, не содержащей БДУ, или приготовленных ускоренным прямым методом (без инкубации) (рис.1а).

В некоторых метафазных пластинках в красном спектре флуоресцировали также прицентромерные ГХР, спутники акроцентрических хромосом и район Yqh (рис.1а). Так как указанные районы четко визуализировались не во всех образцах, а с мужским кариотипом оказалась только их часть, в дальнейшей работе основное внимание мы уделяли окраске ГХР хромосом 1, 9 и 16.

На остальных метафазах наблюдалась дифференциальная окраска сестринских хроматид и сестринские хроматидные обмены (СХО). При этом в 11-ти метафазах из 106 в группе НБ и из 133 в группе ФБ красная флуоресценция ГХР регистрировалась совместно с СХО (рис.1б).

Таким образом, очевидно, что красная флуоресценция АО не связана с включением БДУ, а обусловлена иными причинами.

С помощью детекции БДУ специфическими антителами (АТ-БДУ) проанализировано 143 и 37 метафазных пластинок (группа ФБ, N=4 и НБ, N=3, соответственно). Независимо от времени инкубирования с БДУ в большинстве метафазных пластинок сигнал АТ-БДУ был равномерно распределен вдоль плеч хромосом, но отсутствовал в ГХР одного или обоих гомологов хромосом 1, 9 и 16 (рис. 2). Это можно объяснить как асинхронным вступлением клеток ЦТБ в деление, так и асинхронной репликацией ГХР, показанной ранее с помощью импульсного введения БДУ (Баранов, Кузнецова, 2007). Отсутствие сигнала, возможно, обусловлено недоступностью хроматина в ГХР для АТ-БДУ (Moran et.al., 1985; Buck et.al., 2008). Однако более вероятной представляется недорепликация ГХР в клетках ЦТБ хориона, которая может индуцировать вступление клетки либо в апоптоз, либо в следующий цикл без завершения предыдущего. Эндоредупликация рассматривается как механизм полиплоидизации трофобласта (Zybina et.al., 2004), а метафазные пластинки с диплохромосомами регулярно отмечаются на препаратах из хориона (Баранов, Кузнецова, 2007). Апоптоз и дифференцировка, как и деление клеток ЦТБ происходят на протяжении всей беременности (Huppertz, Herrler, 2005), однако выраженность этих процессов может быть различной в зависимости от разных факторов (срока развития, патологии беременности, особенностей кариотипа и др.).

Рис. 1. Кариограмма (а) и метафазная пластинка (б) из ЦТБ хориона. Окраска 0.01% АО. На кариограмме (а) представлены хромосомы из метафазной пластинки на препарате, приготовленном из хориона ускоренным прямым методом. Дифференциальная окраска ГХР (показано стрелками) и сестринских хроматид после двух раундов репликации в присутствии БДУ (б).

Рис. 2. Метафазная пластинка из ЦТБ хориона, иммунофлуоресцентная детекция АТ к БДУ после его включения в течение всей S-фазы. Отсутствие сигнала антител к БДУ во всех ГХР хромосом 1, 9 и 16.

Анализ митотической активности клеток ЦТБ в группах ФБ и НБ проводили с помощью оценки МИ и регистрации метафаз, прошедших два последовательных раунда репликации в присутствии БДУ. Результаты суммированы в таблице и на рис.3.

Полученные данные свидетельствуют о внутри- и межиндивидуальной вариабельности митотической активности клеток ЦТБ, которая, вероятно, обусловлена различной интенсивностью роста и рамификации ворсин (Koulecher et al.,1985). Возможно, поэтому, а также в силу малочисленности и гетерогенности выборок, значимого влияния особенностей кариотипа, срока развития, условий и продолжительности инкубирования образца на МИ выявить не удалось. Только для двух образцов в группе ФБ отмечено влияние БДУ на деление клеток (табл.), а для группы НБ - тенденция к снижению митотического индекса клеток ЦТБ в нативных ворсинах (табл.) и доли клеток, прошедших 2 клеточных цикла (рис.3), что, возможно, указывает на их сниженный пролиферативный потенциал. Однако способность к пролиферации таких клеток повышается в условиях in vitro (табл., рис. 3). При увеличении времени инкубировании образцов с БДУ до 96 ч (ФБ, N=2; НБ, N=1; 272 и метафазные пластинки соответственно, данные не показаны), нами не было зарегистрировано метафаз с хромосомами, прошедшими три последовательных раунда репликации.

Полученные результаты согласуются с немногочисленными данными литературы (Zahed Рис. 3. Доля клеток 2-й генерации в ЦТБ et.al., 1988; Kennerknehct et.al., 1992) и, вероятно, хориона в группах НБ и ФБ.

свидетельствуют о «лимите деления», т.е.

ограниченном числе циклов, которое проходит клетка ЦТБ в органной культуре.

Следует отметить, что в первичных культурах клетки трофобласта также быстро утрачивают способность к делению, вступают в апоптоз или дифференцируются (Genbacev, Miller, 2000). Возможно, что в органной культуре, как и in vivo, часть клеток ЦТБ после выхода из цикла вступают в состояние пролиферативного покоя, особенно характерное для стволовых клеток, в том числе и клеток ЦТБ, которые на протяжении всей беременности обладают способностью к самоподдержанию и дифференцировке в функционально специализированные клетки (Genbacev, Miller, 2000; Bischof, Irminger-Finger, 2005).

Таблица. Митотический индекс (в %) на препаратах из образцов хориона при физиологической и неразвивающейся беременности.

Срок Без Коэф. Коэф.

№ образца, Инкубация без БДУ, ч Инкубация с БДУ, ч (н.б.) инкуби- регрес- Стьюкариотип рования сии дента 24 48 72 24 48 Образцы ЦТБ группы НБ 1) 46,ХУ 4/5 0,06 0,59 0,37 0,41 0,49 0,06 0,18 0,00198 3,42) 92,ХХУУ 5/6 0,29 0,17 0,44 0,48 0,27 0,42 0,21 0,01725 0,583) 46,ХХ 7 0,25 0,49 0,16 0,05 0,50 0,41 0,50 0,5223 1,84) 47,ХУ,+15 7/8 0,28 0,79 1,04 0,51 0,62 0,77 0,79 0,8455 0,315) 47,ХХ,+9 7/8 0,20 0,21 0,29 0,19 0,27 0,39 0,23 0,1056 3,76) 46,ХХ 8/9 0,19 0,66 0,59 0,25 0,61 0,79 0,23 0,01750 0,547) 69,ХХХ 8/9 0,30 0,77 0,41 0,19 0,49 0,23 0,26 0,1761 1,28) 47,ХХ,+9 8/9 0,02 0,06 0,18 0,12 0,11 0,08 0,22 0,7708 0,270,19±0,04 0,47±0,10 0,44 ±0,10 0,28±0,06 0,42± 0,06 0,39±0,10 0,32±0,Среднее ± ошибка среднего Образцы ЦТБ группы ФБ 1) 46,ХУ 5/6 0,35 0,41 0,35 0,43 0,22 0,25 0,38 0,4045 2,72) 46,ХХ 6 0,50 0,6 0,57 0,53 0,62 0,56 0,39 0,2634 0,883) 46,ХХ 6/7 0,35 0,5 0,43 0,51 0,4 0,4 0,42 0,8243 3,34) 46,ХУ 7 0,38 0,45 0,59 0,52 0,41 0,5 0,4 0,1327 3,55) 46,ХХ 9 0,18 0,32 0,37 0,23 0,29 0,33 0,17 0,0003 4,914 * 6) 46,ХУ 9/10 0,21 0,37 0,26 0,27 0,23 0,13 0,19 0,2286 6,286 * Среднее± 0,33±0,05 0,44±0,04 0,43±0,05 0,42±0,05 0,36±0,06 0,36±0,07 0,33±0,ошибка среднего Примечание: * отмечены статистически значимые различия (P< 0,05) Тканеспецифичные особенности окраски флуорохромом акридиновым оранжевым районов прицентромерного гетерохроматина метафазных хромосом.

После окраски АО необработанных препаратов из ЦТБ (рис.1а) и эмбриональных органов (рис.4а) мы регулярно регистрировали красную флуоресценцию ГХР метафазных хромосом 1, 9, 16, во многих пластинках – ГХР хромосом 13, 14, 15, 21, 22 и Y. На препаратах из ФГА-стимулированных лимфоцитов, как и ожидалось, была зарегистрирована равномерная желто-зеленая флуоресценция вдоль плеч всех хромосом (рис.5а).

Хорошо известно, что С- или R-рисунки дифференциальной окраски с помощью АО можно получить только после солевой, щелочной и/или термической предобработки препаратов, а в их отсутствии АО окрашивает хромосомы относительно равномерно в желтозеленый цвет (de la Chapelle et.al., 1971, 1973; Bobrow, Madan, 1973; Wyandt et.al., 1974; Benyush, Tupitsyna, 1975; Verma, Babu, 1975; Lin et.al., 1980; Захаров и др., 1982). Специфичность окрашивания зависит также от партии и концентрации красителя, состава и рН буферного раствора (Зеленин, 1967; Zelenin, 1999), способа нанесения фиксированных клеток на препарат и срока его хранения (de la Chapelle et.al., 1971, 1973; Wyandt et.al., 1974). Мы провели анализ окраски хромосом на препаратах из хориона, эмбриональных органов и лимфоцитов, свежеприготовленных и хранившихся до одного месяца, используя при этом разные концентрации, буферные растворы и партии АО, а также модифицируя методики приготовления препаратов. Было проанализировано 307 метафаз из ЦТБ, 116- эмбриональных органов и 358 - лимфоцитов периферической крови. Результаты экспериментов показали, что особенности окраски ГХР не зависят от условий приготовления (условий in vitro, состава гипотонического раствора, мацерации образца в 60% уксусной кислоте, способа нанесения фиксированного материала на стекло), окрашивания (концентрации и партии красителя, рН и состава буферного раствора) и срока хранения препаратов. При всех условиях на препаратах из ЦТБ и эмбриональных органов наблюдалась красная флуоресценция ГХР хромосом 1, 9, 16 и желтозеленая вдоль плеч хромосом (рис.4а-в), а хромосомы всего набора на препаратах из ФГАстимулированных лимфоцитов равномерно окрашивались в желто-зеленый цвет (рис.4г).

Рис.4. Метафазные пластинки из клеток роговицы эмбрионального глаза (а), ЦТБ хориона (б-в), ФГА-стимулированных лимфоцитов периферической крови (г). Прямые методы с мацерацией в 60% уксусной кислоте (а-б), клеточная суспензия, без мацерации в 60% уксусной кислоте (в).

Гипотоническая обработка - цитрат натрия (а, в, г), хлористый калий (б). Окраска 0.01% АО натрий-фосфатный буфер, рН 7.0.

Как и на препаратах из лимфоцитов периферической крови (рис.5а) избирательного окрашивания ГХР хромосом не наблюдалась на необработанных препаратах метафазных хромосом из лимфоцитов пуповинной крови (рис.5б), амниоцитов (рис.5в) и мезенхимальных стволовых клеток (рис.5г). При этом красная флуоресценция блоков ПЦГХ была хорошо воспроизводима на хромосомах из ЦТБ плаценты (рис.6а), эмбриональных стволовых клеток (рис.6б), клеток костного мозга (рис.6в) и семенника человека (рис.6г), а также клеток костного мозга (рис.6д) и семенника мыши (рис.6е).

Рис. 5. Метафазные пластинки, из ФГА-стимулированных лимфоцитов периферической (а) и пуповинной (б) крови; культур мезенхимальных стволовых клеток (в); амниоцитов (г). Окраска 0.01% АО.

Избирательная окраска АО прицентромерных ГХР хромосом мыши на необработанных препаратах из тимуса, селезенки и семенников мыши, приготовленных прямым методом, упоминалась ранее лишь в одном исследовании (Stockert, Lisanti, 1972). Феномен избирательной окраски ПЦГХ хромосом человека на препаратах, приготовленных прямым методом и не подвергнутых каким-либо специальным предобработкам при приготовлении и перед окрашиванием АО, обнаружен нами впервые. Очевидно, что причиной феномена является структурно-функциональная организация ГХР хромосом в спонтанно делящихся митотических и мейотических клетках.

Рис. 6. Митотические (а-в, д) и мейотические (г, е) хромосомы человека (а-г) и мыщи (д,е): из ЦТБ плаценты (а); эмбриональных стволовых клеток (б);

костного мозга (в) и сперматоцита человека (г);

костного мозга (д) и сперматоцита мыши (е). Окраска 0.01% АО.

Цитохимические особенности районов прицентромерного гетерохроматина метафазных хромосом из клеток цитотрофобласта хориона и эмбриональных органов, выявляемые с помощью флуорохрома акридинового оранжевого.

Для проверки предположения о наличии однонитевых РНК и ДНК, одноцепочечных разрывов, а также особенностей белкового состава ГХР хромосом 1, 9 и 16, был проведен анализ окрашивания АО метафазных хромосом после предобработок препаратов in situ с помощью эндонуклеаз и протеаз. Всего было проанализировано 464 метафазные пластинки из ЦТБ хориона и 163 - из эмбриональных органов.

После обработки трипсином, пепсином и протеиназой К изменений в окраске ГХР хромосом из ЦТБ (рис.7Iб-г) и эмбриональных органов (рис.7IIб-г) не обнаружено. После обработки препаратов ДНК-лигазой Т4 наблюдалось снижение интенсивности красной флуоресценции ГХР хромосом из ЦТБ и эмбриональных клеток (рис.6з). Обработки РНКазой А, РНКазой Н и последовательная обработка РНКазой А и ДНКазой I приводили к аналогичным изменениям окраски, особенно заметными в районе 1qh, только на хромосомах из ЦТБ (рис.7дж, 7Iи).

Известно, что РНКаза А гидролизует одноцепочечные РНК, в то время как РНК-аза Н удаляет РНК только из дуплексов ДНК-РНК (Rychlik et.al.,2010). Кроме этого, в красной области спектра флуоресцируют участки хроматина с фрагментированной ДНК (Evenson et.al., 1984). Опираясь на полученные результаты, можно предположить, что в районе 1qh в клетках ЦТБ имеются одноцепочечные РНК и РНК-ДНК дуплексы, что косвенно подтверждается результатами окрашивания препаратов после предобработок ДНК-лигазой Т4, "восстанавливающей" разрывы фосфодиэфирных связей в двуцепочечной ДНК, РНК или ДНК/РНК гибридах (Knopf, 1977). Результаты окрашивания препаратов после обработки ДНКлигазой свидетельствуют, что одноцепочечные разрывы, по-видимому, вносят бльший вклад в особенности флуоресценции ГХР на метафазных хромосомах из клеток эмбриональных органов по сравнению с таковыми из клеток ЦТБ хориона.

Рис.7. Окраска 0.01% АО хромосом 1, 9, 16 из ЦТБ хориона (I) и эмбриональных органов (II).

Контрольный препарат (а); после предобработки трипсином (б); пепсином (в); протеиназой К (г);

РНКазой А (д); РНКазой Н (е); ДНКазой I (ж); ДНК - лигазой Т4 (з); совместной предобработки РНКазой А и ДНКазой I на препарате из ЦТБ (и).

Наличие РНК в центромерных и прицентромерных районах хромосом человека показано и другими исследователями (Pierpont, Yunis, 1977; Probst, Almouzni, 2008; Mahieu-Williame et.al., 2010). Происхождение РНК может быть различно: одиночные рибонуклеотиды в двуцепочечной ДНК как следствие «ошибок включения» во время репликации; остатки фрагментов Оказаки, не полностью удаленных из вновь синтезированной цепи; а также РНК-транскрипты, ассоциированные с ДНК (Rychlik et.al., 2010).

В наших экспериментах предобработка ДНКазой I, гидролизующей одно- и двуцепочечные ДНК, не влияла на спектр флуоресценции, тогда как последовательная обработка РНКазой А и ДНКазой I приводила к заметному снижению красной флуоресценции в районах 9qh и 16qh и ее отсутствию в районе 1qh во всех метафазных пластинках из ЦТБ.

Однако, косвенные данные о наличии однонитевой ДНК в ГХР хромосом 1, 9 и 16 в хорионе, но не эмбриональных органах, были получены ранее с помощью ник-трансляции in situ, опосредованной ДНКазой I (Баранов, Кузнецова, 2007).

Следует допустить, что специфическое окрашивание районов ПЦГХ может быть обусловлено и другими причинами. Так, красная флуоресценция характерна для комплекса АО с кислотными группами белков (Зеленин, 1967; Zelenin, 1999). Показано, что ассоциированные с ГХР метафазных хромосом 1, 9, 16 белковые комплексы факторов HSF-1, участвующие в транскрипции сатДНК, устойчивы к обработкам протеиназой К и пепсином и чувствительны к нуклеазам (Jolly et.al., 2002). Возможно, такие белковые комплексы вместе с РНК вносят вклад в красную флуоресценцию районов ПЦГХ в исследованных нами клетках.

Обнаруженная нами красная флуоресценция АО в районах ПЦГХ, вероятно, обусловлена не только химическим составом (одноцепочечными нуклеиновыми кислотами, гистоновыми и негистоновыми белками), но и аномальной упаковкой и деконденсацией хроматина (Бенюш, Тупицына, 1975; Захаров и др., 1982; Evenson et.al., 1984; Zelenin, 1999). В свою очередь, степень компактизации ГХР может быть связана с уровнем метилирования ДНК (Назаренко, Карагеоргий, 1995). Однако флуоресцирующие в красном спектре блоки гетерохроматина в хорионе, в сперматогониях и сперматоцитах I порядка деконденсированы и гипометилированы (Perez et.al., 1991; Назаренко, Карагеоргий, 1995; Kokalj-Vokac et.al., 1998; Пендина и др., 2001;

Баранов, Кузнецова, 2007), но они окрашиваются точно так же в плаценте и эмбриональных тканях, где - конденсированы и метилированы (Назаренко, Карагеоргий, 1995; Баранов, Кузнецова, 2007). Напротив, гипометилированные и деконденсированные ГХР в амниоцитах (Fernandez et.al., 1996) не дифференцируются при окраске АО, так же как и в лимфоцитах, где они конденсированы и гиперметилированы (Баранов, Кузнецова, 2007). Следовательно, компактизация и степень метилирования ДНК ПЦГХ не могут быть причинами обнаруженной флуоресценции при окраске АО.

Очевидно, что для выяснения природы феномена красной флуоресценции АО в ГХР хромосом в спонтанно делящихся клетках требуются дальнейшие исследования. Вместе с тем, полученные нами данные указывают на необычную организацию района 1qh в ЦТБ хориона.

Следует отметить, что особая структура, демонстрирующая одновременно свойства гетеро- и эухроматина (отсутствие типичных для гетерохроматина эпигенетических маркеров и различная степень компактизации хроматиновых фибрилл) показана только для района 9qh в клетках с транскрипционной активностью сатДНК3 хромосомы 9 (Jolly et al., 2004; Rizzi et al., 2004).

Локализация и транскрипционная активность HS3-1 в эмбриональных и экстраэмбриональных тканях.

Интересным представлялось проверить, связано ли выявленное нами значительное снижение интенсивности флуоресценции АО в районе 1qh на препаратах метафазных хромосом хориона после обработок РНКазами, с транскрипционной активностью сатДНК 2 и 3, входящих в его состав. Транскрипция сатДНК 3 хромосомы 1 (HS3-1) была показана ранее (Вайсертрейгер и др., 2007). Нами был проведен анализ транскрипции HS3-1 в 6 образцах хориона и эмбриональных органов от 6 абортусов сроком 7-13 н.б. Транскрипты HS3-1 были обнаружены в хорионе абортусов только в срок 7 н.б. У 7-нед. эмбриона транскрипты выявлены в продолговатом мозге, но не в почках. При этом транскрипты в почках зарегистрированы в срок 9 н.б. У 9-нед. эмбрионов транскрипты также были выявлены в легком, продолговатом мозге, надпочечнике, сердце и кишечнике. В образцах тканей после 11 н.б. транскрипты выявлены не были (продолговатый мозг, надпочечник, печень) (рис. 8).

Обнаружено несколько вариантов транскриптов HS3-1, наиболее частые из них – длиной около 250 и 600 пар нуклеотидов. Короткие транскрипты 100 п.н. обнаружены в сердце. Все выявленные транскрипты были полиаденилированы. Во всех тканях, кроме почек и сердца транскрипция происходила со «смысловой» нити. В почках и сердце транскрипты считывались с антисмысловой цепи ДНК.

Обнаруженная нами транскрипция HS3-1, вероятнее всего стадиоспецифична и связана с пролиферативной активностью клеток, так как транскрипты прицентромерных сателлитов обычно обнаруживаются в интенсивно делящихся клетках (Lu, Gilbert, 2007). Возможно, она также связана с процессами клеточной дифференцировки. Причины транскрипции с разных цепей ДНК не совсем ясны. Однако показано, что инактивация цепь-специфичной транскрипции ПЦГХ на стадии двух клеток приводит к гибели эмбриона мыши (Probst, Almouzni, 2011).

Рис.8. Электрофореграмма продуктов ОТ-ПЦР HS3-1 в эмбриональных и экстраэмбриональных тканях.

Стрелками отмечены зоны расположения кДНК транскриптов.

GAPDH использован в качестве контроля амплификации.

По-видимому, выявленные нами транскрипты HS3-1 не принимают прямого участия в процессе интерференции РНК, так как для этого необходима транскрипция в обоих направлениях одновременно (Ugarkovic, 2005). Вероятно, в эмбриональных клетках процесс гетерохроматинизации осуществляется в основном за счет эпигенетических модификаций, а транскрипты ПЦГХ влияют на связывание с хроматином ферментов, осуществляющих метилирование ДНК и модификации гистонов, косвенно участвуя, таким образом, в поддержании структуры ГХ. В хорионе, для которого характерны деметилирование и деконденсация ГХР хромосом, по-видимому, активируются иные механизмы формирования и поддержания структуры ГХ.

Учитывая транскрипционную активность HS3-1, представлялось интересным исследовать пространственную организацию районов 1qh в интерфазном ядре. При локализации HS3-1 мы оценивали положение FISH-сигнала (ДНК-зонд к району 1q12) по отношению к границе ядра и относительно хромоцентра на оптических срезах (рис.9а, б). Согласно полученным результатам, в срок 8-10 н.б. в ядрах эмбриональных клеток сателлит HS3-1, как правило, занимает периферическое положение (рис.10а) и расположен в хромоцентрах (рис.9а и 10б). Однако, 36,9% FISH-сигналов, соответствующих HS3-1, в ядрах клеток почки оказались не в хромоцентрах (рис. 10б), что, по-видимому, связано с его деконденсацией в этих клетках.

Рис.9. FISH с зондом CEP 1 (HS3-1, красный) на интерфазных ядрах клеток эмбриональной печени (а) и ЦТБ хориона 4-5 н.б. (б). Стрелкой показан декомпактизованный сигнал. Масштабные линейки - 10 мкм.

В хорионе наблюдалось стадио-специфичное расположение сателлита в ядре. Следует отметить, что в ядрах клеток хориона абортусов 4-5 н.б. один из FISH-сигналов визуально занимал больший объем ядра по сравнению с другими образцами, поэтому был морфологически охарактеризован как декомпактизованый. Кроме того, FISH-сигналы были локализованы преимущественно во внутренней части ядра и на границе, но не внутри хромоцентров (рис.9б).

Аналогичные характеристики этого сателлита были отмечены при малигнизации клеток, их старении и дифференцировке (Enukashvily et.al., 2007), а также в ядрах лимфоцитов больных синдромом ICF (Dupont et.al., 2011), ГХР хромосом 1, 9, 16 которых имеют схожие характеристики (деконденсация, гипометилирование) с таковыми в клетках хориона. В ядрах клеток хориона абортусов 5-6 и 10-11 н.б. FISH-сигналы занимали преимущественно периферическое положение и входили в состав хромоцентров (рис.10в, г). В плаценте HS3-также был выявлен в составе хромоцентров на периферии ядра, что согласуется с данными других авторов (Weierich et.al., 2003; Enukashvily et.al., 2007).

Рис. 10. Локализация HS3-1 в ядрах клеток эмбриональных органов (а, б), хориона и плаценты (в, г) по отношению к оболочке ядра (а, в) и хромоцентрам (б, г). N – число сигналов.

Известно, что локализация хромосомного сегмента в ядре, время репликации и транскрипционная активность генов, входящих в его состав, а также эпигенетический статус хроматина находятся в тесной взаимосвязи (Dhar et al., 1989; Woodfine et.al., 2003; Mendez et.al., 2009). Однако остается неясным, является ли размещение транскрибирующегося HS3-1 в центре ядра следствием или причиной его «необычного» структурно-функционального статуса в клетках ЦТБ 4-5 н.б. (ранняя репликация, гипометилирование и деконденсация), а также, почему при сохранении транскрипционной активности и статуса сателлита, происходит его перемещение к периферии ядра уже в срок 5-6 н.б. Очевидно, что тканеспецифичные особенности локализации сателлита в ядре требуют дальнейших исследований.

ВЫВОДЫ 1) Клетки цитотрофобласта хориона при физиологической и неразвивающейся беременности проходят не более двух последовательных клеточных цикла.

2) Репликация полиморфных блоков 1qh, 9qh, 16qh в цитотрофобласте хориона происходит асинхронно.

3) Избирательная окраска флуорохромом АО полиморфных гетерохроматиновых блоков 1qh, 9qh, 16qh специфична для клеток из тканей с естественной митотической активностью (хориона, плаценты, эмбриональных органов, костного мозга).

4) В районах прицентромерного гетерохроматина хромосомы 1 в клетках цитотрофобласта хориона присутствуют одноцепочечные нуклеиновые кислоты, а также дуплексы РНК-ДНК.

5) В гетерохроматиновых районах 1qh, 9qh, 16qh хромосом из эмбриональных клеток и клеток цитотрофобласта хориона имеются одноцепочечные разрывы ДНК.

6) В интерфазных ядрах клеток хориона 4-5 недель беременности HS3-1 локализован ближе к центральной части ядра и не входит в состав хромоцентров. В ядрах клеток хориона 5-6 и 10-11 недель беременности, а также плаценты и эмбриональных органов HS3-1 локализован ближе к периферической области ядра и входит в состав хромоцентров.

7) В клетках хориона обнаружены полиаденилированные транскрипты HS3-1 до 7, а в клетках эмбриональных органов – до 9 недели беременности. Транскрипция HS3-1 происходит либо со смысловой, либо с антисмысловой цепи ДНК.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ В изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Трофимова И.Л., Ляпунова М.С., Жолнерович Е.В., Кузнецова Т.В., Баранов В.С.

Особенности окраски гетерохроматиновых районов хромосом хориона человека акридиновым оранжевым // Цитология.- 2010. – Т. 52.- № 8.- с.685-686.

2. Кузнецова Т.В., Трофимова И.Л., Ляпунова М.С., Евдокименко Е.В., Баранов В.С.

Феномен избирательной окраски полиморфных гетерохроматиновых блоков хромосом в спонтанно делящихся клетках с помощью флуорохрома акридинового оранжевого // Генетика. - 2012. – Т. 48.- № 4. - с. 451-456. (Kuznetzova T.V., Trofimova I.L., Lyapunova M.S., Evdokimenko E.V., Baranov V.S. Phenomenon of selective staining of pericentomeric heterochromatin regions in chromosomes from spontaneously dividing cells by acridine orange flurochrome // Genetika. - 2012. – Vol. 48.- № 4. - p. 369-375).

3. Трофимова И.Л., Ляпунова М.С., Евдокименко Е.В., Кузнецова Т.В. Влияние различных предобработок на окраску прицентромерного гетерохроматина хромосом 1, 9, флуорохромом акридиновым оранжевым // Мед.генетика.- 2012.-Т.11.- № 4 (118).- с. 50-54.

4. Трофимова И.Л., Евдокименко Е.В., Кузнецова Т.В. Особенности митотической активности клеток цитотрофобласта хориона у эмбрионов первого триместра беременности // Журнал акушерства и женских болезней.- 2012.- Т. LX I.- выпуск 3.- с. 115122.

5. Кузнецова Т.В., Енукашвили Н.И., Трофимова И.Л., Горбунова А., Вашукова Е.С., Баранов В.С. Локализация и транскрипция прицентромерного гетерохроматина хромосомы в эмбриональных и экстраэмбриональных тканях человека // Мед.генетика.- 2012.-Т.11.- № 4 (118).- с.19-24.

В сборниках работ:

1. Трофимова И.Л., Жолнерович Е.В., Мыльников С.В., Кузнецова Т.В. Сравнительный анализ пролиферативного статуса цитотрофобласта ворсинчатого хориона при физиологической и неразвивающейся беременности // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике / Под ред. А.Б. Масленникова. Вып.13.- Новосибирск:

Альфа Виста. – 2009.- с. 259-264.

2. Трофимова И.Л., Соловьев К.В., Федорова Е. М., Васильев В.Б., Паткин Е.Л., Кузнецова Т.В. Особенности пространственного расположения районов конститутивного гетерохроматина в интерфазном ядре эмбриональных и экстраэмбриональных тканей человека // Генетика человека и патология / Под редакцией В.П. Пузырева. Вып. 9.- Томск:

Печатная мануфактура. - 2011.- с.88- 91.

Тезисы конференций:

1. Trofimova I.L., Kuznetzova T.V., Baranov V.S. Constitutive heterochromatin traits as revealed by Acridine Orange in human embryos // Chromosome Res.-2009. - V17.- Suppl.– p.235-236.

2. Kuznetzova T.V., Trofimova I.L., Martynkevich I.S., Baranov V.S. Human Constitutive Heterochromatin: a New Intrigue // Chromosome Res.-2009.- V17.- Suppl.– p.236-237.

3. Trofimova I.L., Mylnikov S.V.Kuznetzova T.V. Сell cycle studies of human cytotrophoblast cells in missed abortion // Europ. J. Hum. Genetics- 2009.- V17.-Suppl.2. – p.153-154.

4. Трофимова И.Л., Мыльников С.В., Кузнецова Т.В. Сравнительный анализ клеточного цикла цитотрофобласта хориона при неразвивающейся и прогрессирующей беременности // V съезд ВОГиС.- 2009.-Ч.2.-с.267.

5. Trofimova I.L., Kuznetzova T.V. Features of constitutive heterochromatin regions extraembryonic and embryonic tissue in human embryos // Placenta -2009.-V.30.-Issue 9.-A.22.

6. Trofimova I.L., Lyapunova M.S., Zolnerovich E.V., Kuznetzova T.V. Functional status of constitutive heterochromatin in embryonic and extraembrionic human’s tissues // Modern Microscopy Techniques in Biology and Medicine -2009.- p.29-30.

7. Lyapunova M.S., Trofimova I.L., Zolnerovich E.V., Kuznetzova T.V. Functional characteristics of heterochromatic regions of human chromosomes in the embryogenesis // Modern Microscopy Techniques in Biology and Medicine -2009.- p.18-19.

8. Zolnerovich E.V., Trofimova I.L., Lyapunova M.S., Kuznetzova T.V. Proliferative activity of human chorionic villi cytotrophoblast // Modern Microscopy Techniques in Biology and Medicine -2009.- p.34.

9. Трофимова И.Л., Ляпунова М.С., Жолнерович Е.В., Кузнецова Т.В. Особенности конститутивного гетерохроматина в цитотрофобласте хориона и эмбриональных тканях человека //Медицинская генетика: Материалы VI съезда Российского общества медицинских генетиков, Ростов-на-Дону.- 2010.-с.181.

10. Trofimova I.L., Lyapunova M.S., Zolnerovich E.V., Kuznetzova T.V., Baranov V.S. Some cytochemical peculiarities of constitutive heterochromatin in cytotrophoblast chromosomes from human chorionic villi // Europ. J. Hum. Genetics - 2010.- V18.-Suppl.1. – p.111.

11. Lyapunova M.S., Trofimova I.L., Zolnerovich E.V., Kuznetzova T.V. Cytochemical characteristics of constitutive heterochromatin regions from cytotrophoblast from human chorionic villi // Europ. J. Hum. Genetics - 2010.- V18.-Suppl.1. – p.112.

12. Kuznetzova T.V., Trofimova I.L., Lyapunova M.S., Zolnerovich E.V., Baranov V.S. A simple and rapid method for heterochromatin regions selective staining on direct chromosomal preparations from tissues with spontaneous mitotic activity // Europ. J. Hum. Genetics - 2010.- V18.- Suppl.1. – p.127.

13. Trofimova I.L., Lyapunova M.S., Zolnerovich E.V., Kuznetzova T.V. Peculiarities of replication of 1qh, 9qh, 16qh and Yqh regions of human chromosome from chorionic villi and embryonic tissues // Europ. J. Hum. Genetics - 2011.- V19.- Suppl.2. – p.156.

14. Trofimova I.L., Solovyov K.V., Fedorova E.M., Vasilyev V.B., Kuznetzova T.V. 3D position of constitutive heterochromatin regions within the nucleus of chorionic villi and embryonic tissues // Europ. J. Hum. Genetics - 2012.- V.20. - Suppl.1 – p.110.

Список сокращений АО – акридиновый оранжевый н.б. – недель беременности АТ-БДУ – антитела к БДУ ПЦГХ – прицентромерный гетерохроматин БДУ – бромдезоксиуридин СатДНК – сателлитная ДНК ГХ – гетерохроматин СХО – сестринские хроматидные обмены ГХР - гетерохроматиновые районы ФБ – физиологическая беременность МИ – митотический индекс ЦТБ – цитотрофобласт НБ – неразвивающаяся беременность HS3-1 - cателлит 3 хромосомы







© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.