WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

На правах рукописи

CАЙФЕТЯРОВА ЮЛИЯ ЮРЬЕВНА

ЭНДОКРИННАЯ ФУНКЦИЯ ДОФАМИНЕРГИЧЕСКИХ НЕЙРОНОВ ЦЕЛОСТНОГО МОЗГА В ОНТОГЕНЕЗЕ КРЫС

Специальность 03.03.01 – физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2012

Работа выполнена в лаборатории гормональных регуляций Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Научный консультант:

академик Угрюмов Михаил Вениаминович

Официальные оппоненты:

Манухин Борис Николаевич - доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, руководитель группы межклеточных взаимодействий Раевский Владимир Вячеславович - доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, руководитель лаборатории нейроонтогенеза

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт нормальной физиологии им. П.К. Анохина» РАМН

Защита диссертации состоится « 25 » апреля 2012 г. в 15 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.238.01 Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу:

119334, Москва, ул. Вавилова, д. 26.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.

Сайт: http://idbras.comcor.ru/; e-mail: idbras@bk.ru Автореферат разослан «___» марта 2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук ele0806@yandex.ru Е.Б. Абрамова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из наиболее актуальных задач современной физиологии является изучение механизмов нейроэндокринной регуляции, обеспечивающих поддержание постоянства внутренней среды и регуляцию важнейших функций взрослого и развивающегося организма. Исследования формирования нейроэндокринной регуляции развития и функционирования организма в онтогенезе имеют большое значение не только для фундаментальной медико-биологической науки, но и для клинической медицины, поскольку малейшие нарушения метаболизма физиологически активных веществ (ФАВ) нейроэндокринной системы на ранних стадиях развития могут приводить к развитию тяжелых врожденных заболеваний.

Нейроэндокринная система в онтогенезе регулирует развитие целостного организма (Угрюмов, 1999). ФАВ, вырабатывающиеся компонентами нейроэндокринной системы, выступают в роли индукторов развития, оказывая необратимое морфогенетическое влияние на развивающиеся клетки- и органымишени (Lauder, 1993; Ugrumov, 1997; Mirochnik et al., 2005).

Мозг является центральным и ключевым звеном нейроэндокринной системы. Долгое время считалось, что мозг включается в нейроэндокринную регуляцию только после окончательной дифференцировки нейронов и формирования нейротрансмиссии (Dlouha et al., 1982). Полученные в последнее время нами и другими исследователями данные, согласно которым нейроны мозга сразу же после их образования и задолго до формирования межнейрональных связей и гемато-энцефалического барьера (ГЭБ) начинают синтезировать и выделять ФАВ (Ugrumov et al., 1989; Borisova et al., 1991;

Ugrumov et al., 1994), позволяют пересмотреть традиционные представления о роли мозга в нейроэндокринной регуляции развития целостного организма. В связи с этим нами была выдвинута гипотеза, согласно которой, мозг в онтогенезе до формирования межнейрональных синаптических связей и ГЭБ, может рассматриваться как эндокринный орган, участвующий в регуляции развития и функционирования периферических органов и целостного организма.

Ранее при изучении развития моноамин- и пептидергических систем мозга нами были получены косвенные доказательства в пользу выдвинутой гипотезы. Так было показано, что ДА содержится в общей системе циркуляции плодов и новорожденных крыс в концентрации, достаточной для оказания эндокринного влияния на секрецию пролактина гипофизом взрослых крыс (Ben-Jonathan et al., 1980). После закрытия ГЭБ концентрация ДА в периферической крови резко падает (Лаврентьева и др., 2006), что исключает дальнейшее участие ДА мозгового происхождения в эндокринной регуляции.

Однако, прямых доказательств того, что ДА, синтезируясь в нейронах мозга, поступает в общую систему циркуляции в онтогенезе до формирования ГЭБ, получено не было.

Кроме того, до сих пор отсутствуют попытки оценить влияние ДА мозгового происхождения на периферические органы-мишени в период отсутствия ГЭБ, тогда как это является одним из важнейших критериев эндокринной функции мозга. Учитывая, что рецепторы к ДА обнаруживаются в разных органах в онтогенезе задолго до формирования ГЭБ (Felder et al., 1989), можно ожидать, что ДА мозгового происхождения, содержащийся в периферической крови, способен оказывать влияние на развитие и/или функциональную активность этих органов, что требует дальнейшей экспериментальной проверки.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей диссертационной работы – получить прямые доказательства эндокринной функции ДА-ергических нейронов целостного мозга в онтогенезе до формирования ГЭБ.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать экспериментальную модель фармакологического ингибирования синтеза ДА нейронами мозга в онтогенезе до формирования ГЭБ.

2. Оценить вклад мозга в формирование физиологически активной концентрации ДА в плазме крови после ингибирования его синтеза в нейронах мозга до формирования ГЭБ.

3. Получить доказательства того, что ДА мозгового происхождения, содержащийся в периферической крови до формирования ГЭБ, оказывает прямое эндокринное влияние на выделение пролактина из лактотрофов гипофиза в моделях in vivo и in vitro.

Научная новизна работы. Впервые разработана модель фармакологического ингибирования синтеза ДА избирательно в мозгу у крыс в раннем постнатальном периоде. Экспериментально подобрана доза ингибитора, существенно снижающая синтез ДА в мозгу и не влияющая на его синтез в периферических ДА-синтезирующих источниках.

Впервые получено прямое доказательство того, что до формирования ГЭБ ДА поступает из мозга в общую систему циркуляции, обеспечивая поддержание его физиологически активной концентрации в крови.

Впервые на моделях in vivo и in vitro показано, что ДА мозгового происхождения, содержащийся в периферической крови у неонатальных крыс до формирования ГЭБ, оказывает специфическое влияние на функциональную активность лактотрофов, ингибируя выделение пролактина из передней доли гипофиза.

Научная и практическая значимость работы. Получены убедительные доказательства в пользу гипотезы о том, что мозг до формирования ГЭБ функционирует как эндокринный орган, выделяя ФАВ в общую систему циркуляции, которые в дальнейшем участвуют в регуляции функциональной активности органов-мишеней, что принципиально меняют существующую концепцию формирования нейроэндокринной регуляции развития целостного организма.

Новый вариант концепции формирования нейроэндокринной регуляции в онтогенезе и ее роли в развитии целостного организма, а также основанные на этой концепции новые представления о патогенезе врожденных заболеваний, могут быть широко представлены в курсах и учебниках по физиологии и фундаментальной медицине для студентов университетов и медицинских институтов.

Работа вносит вклад не только в экспериментальную физиологию, но и в клиническую медицину, в частности перинатологию. Изучение молекулярноклеточных механизмов эндокринной регуляции развития периферических мишеней со стороны ФАВ мозгового происхождения позволит по-новому представить себе механизмы развития врожденных заболеваний репродуктивной и выделительной функций, нарушения функционирования сердечно-сосудистой системы и ряда других. Это, в свою очередь, приведет к изменению стратегии ранней диагностики и лечения врожденных заболеваний, существенно повысив их эффективность.

Вклад автора. Все эксперименты, описанные в диссертационной работе, были спланированы и выполнены автором. Анализ всех полученных данных был также проведен автором.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены и обсуждены:

- на конференциях: Конференция молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, Москва, 2008, 2009, 2010 гг.; Конференция, посвященная 90-летию со дня рождения академика Т.М.Турпаева, Москва, 2008; Конференция молодых ученых Института нормальной физиологии им.

П.К. Анохина РАМН, Москва, 2009; Международная междисциплинарная конференция «Современные проблемы системной регуляции физиологических функций», Сафага, 2010; Международная конференция «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам», Клязьма, 2010;

Международный симпозиум «Molecular Neurobiology Today and Tomorrow», Берлин, 2010; Научно-практическая конференция с международным участием "Нейрохимические подходы к исследованию функционирования мозга", Ростов, 2011.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих перечню ВАК – 1, статей в иностранных рецензируемых журналах – 1, тезисов и материалов конференций – 7.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 238 источников.

Работа изложена на 122 страницах машинописного текста, содержит рисунка, 4 таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Животные.

Исследование проведено на самцах крыс линии Вистар на третий день постнатального развития (П3). День рождения крысят считали 1-ым постнатальным днем (П1).

Эксперименты.

Разработка модели ингибирования синтеза дофамина в мозгу у крыс на П3.

Подкожное введение ингибитора синтеза дофамина.

Животным подкожно вводили -метил-пара-тирозин (MПТ) (Sigma, США) – ингибитор тирозингидроксилазы. В первой серии экспериментов животным однократно вводили 200, 100, 80 или 50 мкг MПT в 10 мкл 0.9 % NaCl, а в контроле – только 10 мкл 0.9 % NaCl. Сбор материала производили через 20 часов после инъекций. Во второй серии экспериментов опытным животным вводили 50 мкг MПT в 10 мкл 0.9 % NaCl. В контроле животным вводили 10 мкл 0.9 % NaCl. Сбор материала производили через 4 часа после введения ингибитора.

Стереотаксическое введение ингибитора синтеза дофамина в боковые желудочки мозга.

Животным под эфирным наркозом в боковой желудочек мозга однократно вводили 50 мкг MПT в 2 мкл 0.9 % NaCl по координатам: 1.2 мм латерально от брегмы, 2.0-2.5 мм вглубь мозга, через стеклянную микроканюлю (d = мкм), соединенную с гамильтоновским шприцем (Ugrumov and Mitskevich, 1980); в контроле крысам однократно вводили 2 мкл 0.9 % NaCl.

Полное или частичное выключение дофаминового ингибиторного контроля секреции пролактина у крыс на П3 (in vivo).

Крысам на П3 в боковой желудочек мозга вводили 50 мкг МПТ, контрольным животным вводили 0.9 % NaCl. У одних животных через 4 часа собирали кровь из сердца и выделяли переднюю долю гипофиза. Другим животным через 4 часа после внутрижелудочкового введения МПТ внутрибрюшинно вводили 0,75 мг/кг галоперидола – ингибитора рецепторов к ДА, а через 1,5 часа собирали кровь и выделяли переднюю долю гипофиза. Сбор материала у крыс проводили под пентобарбиталовым наркозом (40 мг/кг).

Инкубация гипофизов крыс на П3 и взрослых животных в Кребс–Рингер буфере (in vitro).

Влияние разных концентраций экзогенного дофамина на секрецию пролактина.

Крыс на П3 декапитировали, выделяли переднюю долю гипофиза, делили ее пополам и переносили в камеры, содержащие 300 мкл холодного Кребс-Рингер буфера (КРБ) следующего состава (мМ): NaCl – 120, KCl – 4.8, CaCl2 – 2.0, MgSO4 – 1.2, NaHCO3 – 25, D-глюкоза – 10.1, HEPES – 20, аскорбиновая кислота – 0.13 (Sigma, США). В каждую камеру помещали по 3 половинки гипофизов. После 45-минутной стабилизации в КРБ при температуре 37°С среду заменяли на 300 мкл свежей и проводили две 10минутные инкубации для оценки спонтанного выделения пролактина. Затем одни половинки гипофизов переносили на 5 минут в КРБ, содержащий ДА в концентрации 1,5 нг/мл или 0,4 нг/мл, в то время как другие половинки тех же самых гипофизов продолжали инкубировать в КРБ без ДА. Полученные образцы инкубационной среды хранили при –70°С до определения пролактина.

Контроль специфичности действия дофамина на секрецию пролактина через Д2-рецепторы.

Процедуры инкубации, сбора и хранения материала проводились аналогично описанным выше. Разница заключалась в том, что одни половинки гипофизов после предварительной 45-минутной стабилизации и двух 10-минутных инкубаций в КРБ на 5 минут переносили в КРБ, содержащий 1.5 нг/мл ДА, в то время как другие половинки этих же гипофизов переносили также на 5 минут в КРБ, содержащий 1.5 нг/мл ДА и 10-10 М галоперидола.

Инкубация гипофизов крыс на П3 в плазме крови, содержащей эндогенный дофамин.

У крыс под пентобарбиталовым наркозом (40 мг/кг) собирали кровь из сердца и выделяли переднюю долю гипофиза. В собранную кровь добавляли 0,13 мM аскорбиновой кислоты (для сохранности эндогенного ДА), и затем ее центрифугировали при 7000 об/мин. Полученную у животных плазму пулировали и до проведения инкубации хранили 1 час при температуре +4°С.

Гипофизы, после предварительной 45-минутной стабилизации, сначала инкубировали 20 минут при 37°С в КРБ, а затем одни половинки гипофизов в течение 30 минут инкубировали в плазме при 37°С, содержащей 10-10 М галоперидола, в то время как другие половинки тех же гипофизов инкубировали в такой же плазме, но без галоперидола. После этого образцы инкубационной плазмы и сами гипофизы замораживали и хранили при -70°С до определения в них пролактина. Кроме того, по окончании эксперимента образцы инкубационной плазмы отбирали для контроля сохранности эндогенного ДА с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и хранили при температуре -70°С.

Взятие и обработка материала.

После подкожных инъекций MПT у крыс под пентобарбиталовым наркозом (40 мг/кг) выделяли мозг (одно полушарие за исключением 2/мозжечка), орган Цукеркандля, надпочечники и собирали кровь из сердца;

после внутрижелудочковых инъекций MПT помимо вышеперечисленных образцов собирали почки. На пробу приходился материал от одного животного.

Для определения ДА методом ВЭЖХ кровь переносили в пробирку, содержащую 30 мкл 5% раствора этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (Sigma, США) и 10 мкл 10% раствора метабисульфита натрия (Sigma, США).

Затем отделяли плазму центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 минут и добавляли в нее 3,4-дигидроксибензиламин гидробромид (ДГБА) – внутренний стандарт (Sigma, США) в 0,1н HClO4. Далее плазму центрифугировали при 14000 об/мин 20 минут, переносили в эппендорф и хранили при -70о С до определения ДА. Перед определением ДА осаждали на оксиде алюминия, элюировали 0,2 н HClO4 и полученные образцы центрифугировали при 4000 об/мин. Выделенное полушарие мозга и периферические органы гомогенизировали в 10 объемах 0,1 н HClO4, содержащей ДГБА при помощи ультразвукового гомогенизатора (Labsonic M, Sartorius, Франция), центрифугировали при 14 000 об/мин в течение 20 минут и в полученном супернатанте определяли ДА.

Для определения пролактина в плазме крови у животных под пентобарбиталовым наркозом (40 мг/кг) брали кровь из сердца, после чего ее центрифугировали при температуре +4°С на скорости 7000 об/мин в течение 20 минут. В полученном супернатанте определяли содержание гормона.

Для определения пролактина в ткани гипофизов проводили предварительную экстракцию гормона. Для этого гипофизы гомогенизировали при помощи ультразвукового гомогенизатора в 0.05 M карбонат-бикарбонатном буфере (рН 10,0), после чего в течение часа проводили экстракцию пролактина. Затем образцы центрифугировали 30 минут при температуре +4 °С и скорости 5000 об/мин и отбирали полученный супернатант. После нейтрализации супернатанта с помощью 0,01н HCl, проводили измерение пролактина.

Высокоэффективная жидкостная хроматография с электрохимической детекцией.

Измерение ДА в осажденной плазме крови, в супернатантах ткани мозга и периферических органов проводили при помощи обратно–фазной ВЭЖХ с электрохимической детекцией (Amperometric detector LC-4B, Bioanalytical Systems, США) при потенциале 655 мВ. Пробы вводили в инжектор (Rheodyne 7125, США) с петлей объемом 20 мкл. Разделение производили на 10сантиметровой колонке с внутренним диаметром 4 мм и наполнителем С-18, 3,мкм (Dr.Maisch GmbH, Германия). Подвижной фазой служил 0.1 М цитратнофосфатный буфер, содержащий 0.3 мМ октансульфоната натрия (Sigma, США), 0.1 мМ ЭДТА (Sigma, США) и 8 % ацетонитрила (Sigma, США) (pH 3.2).

Скорость потока 1 мл/мин обеспечивалась насосом (Gilson 307, Франция). Пик ДА идентифицировали, ориентируясь на время его выхода в стандарте, содержание рассчитывали методом внутреннего стандарта, используя отношение площадей пиков в стандартной смеси и в образце, с помощью программы «Мультихром» (Россия).

Иммуноферментный анализ.

Измерение пролактина в ткани передней доли гипофиза, образцах плазмы и инкубационной среды проводили с помощью метода иммуноферментного анализа, c использованием коммерческих наборов (SPIbio-Rat Prolactin EIA Kit, Bertin Pharma, Франция).

Статистическая обработка результатов.

Статистический анализ полученных результатов проводили с помощью Fтеста для определения однородности выборки и t-теста Стьюдента для определения достоверности различий.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ I. Мозг до формирования гемато-энцефалического барьера в онтогенезе – важнейший источник дофамина в крови у крыс В данной работе на примере ДА изучали возможность поступления ФАВ из мозга в общую систему циркуляции в перинатальном периоде развития до формирования ГЭБ. Для проведения экспериментов были использованы животные на П3, у которых ГЭБ для ДА не сформирован. Для получения прямых доказательств поступления ДА из мозга в кровь нами была разработана принципиально новая модель фармакологического ингибирования синтеза ДА в мозгу. В качестве ингибитора синтеза ДА был выбран МПТ – конкурентный ингибитор ключевого фермента синтеза ДА – тирозингидроксилазы. На первом этапе данной работы проводился подбор максимальной дозы ингибитора, в которой при системном введении и поступлении в кровь он не влиял бы на синтез ДА в периферических органах и в мозгу. Подкожное введение MПT в дозах 200 и 100 мкг через 20 часов приводило к достоверному изменению концентрации ДА в мозгу, плазме и органе Цукеркандля (Рис.1 А, Б, Г).

Введение ингибитора в дозе 80 мкг вызывало достоверное снижение концентрации ДА в плазме (Рис.1 Б). Только введение MПT в дозе 50 мкг не оказывало влияния на концентрацию ДА в изучаемых органах и плазме крови (Рис.1 А, Б, В, Г). Учитывая, что через 20 часов мы можем наблюдать в организме компенсаторные процессы после воздействия МПТ, мы проверили результат введения дозы 50 мкг через 4 часа. Оказалось, что результаты, полученные при введении этой дозы не различались – через 20 часов и через часа концентрация ДА в периферических органах, мозгу и плазме не изменялась, что дало возможность использовать нам данную дозу и данное время в последующих экспериментах по стереотаксическому введению ингибитора. Хотя при подкожном введении доза 50 мкг и не оказывала влияния на концентрацию ДА в мозгу, мы предположили, что при непосредственном введении ее в мозг она оказала бы локальное ингибирующее действие на ДАпродуцирующие нейроны.

0.9% NaCl МПТ А Б 2 * * * * * 0 200 100 80 200 100 80 МПТ, мкг МПТ, мкг Г В 600 764 4* * 3311200 100 200 80 1 МПТ, мкг МПТ, мкг Рис. 1. Концентрация дофамина в мозгу (А), плазме крови (Б), надпочечниках (В) и органе Цукеркандля (Г) через 20 часов после подкожного введения 200, 100, 80 и 50 мкг МПТ; в контроле вводили 0.9% NaCl.

* Достоверные различия между контролем и опытом (p < 0.05).

Стереотаксическое введение 50 мкг МПТ в боковые желудочки мозга через часа привело к значительному снижению концентрации ДА в мозгу и плазме Дофамин,нг/г ткани Дофамин, нг/мл Дофамин, нг/г ткани Дофамин, нг/г ткани (Рис. 2), в то время как в периферических органах не происходило изменения концентрации ДА (Табл. 1).

0.9% NaCl; МПТ 32.21.* 1* 0.0 Рис. 2. Концентрация дофамина (ДА) в мозгу (слева) и плазме крови (справа) через 4 часа после внутрижелудочкового введения 50 мкг МПТ; в контроле вводили 0.9% NaCl.

* Достоверные различия между контролем и опытом (p < 0.05).

Табл.1. Концентрация дофамина (ДА) в надпочечниках, органе Цукеркандля и почках через 4 часа после внутрижелудочкового введения 50 мкг МПТ; в контроле вводили 0.9% NaCl.

Орган Надпочечники Орган Цукеркандля Почки Вводимое 0.9% NaCl MПT 0.9% NaCl MПT 0.9% NaCl MПT вещество 418.2±47.ДА, нг/г 354.4±37.2 623.2±64.5 657.3±59.2 22.2±3.4 18.3±2.Таким образом, на разработанной нами модели получено прямое доказательство поступления ДА из мозга в кровь в раннем постнатальном периоде развития у крыс до становления ГЭБ, при этом развивающийся мозг вносит существенный вклад в формирование физиологически активной концентрации ДА в общей системе циркуляции.

ДА, нг / г ткани ДА, нг / мл плазмы II. Регуляция секреции пролактина дофаминергическими нейронами развивающегося мозга Для оценки влияния ДА, поступающего из мозга в общую систему циркуляции, на периферические органы, в качестве мишени мы использовали лактотрофы гипофиза. Для того, чтобы оценить влияние ДА, поступающего из мозга в общую систему циркуляции, на секрецию пролактина передней долей гипофиза в экспериментах in vivo проводили частичное (на разработанной ранее модели введения МПТ в мозг) или полное (с помощью введения галоперидола) выключение дофаминового ингибиторного контроля секреции пролактина. Как после частичного, так и полного выключения дофаминового контроля происходило увеличение выделения пролактина гипофизом в кровь, в то время как в самом гипофизе концентрация пролактина снижалась только при полном выключении дофаминового контроля (Рис. 3).

0.9% NaCl МПТ * МПТ+галоперидол 0 Плазма Гипофиз Рис. 3. Концентрация пролактина (ПРЛ) в плазме (слева) и в гипофизе (справа) после полного (внутрижелудочковое введение МПТ и системное введение галоперидола) или частичного (внутрижелудочковое введение МПТ) ингибирования дофаминового контроля секреции ПРЛ у крыс на третий постнатальный день; в контроле в боковые желудочки мозга вводили 0.9% NaCl.

* Достоверные различия между контролем и опытом (p < 0.05).

Концентрация ПРЛ, нг/мл Концентрация ПРЛ, нг/мг Полученные в эксперименте in vivo данные свидетельствуют об ингибиторном влиянии ДА мозгового происхождения на выделение пролактина лактотрофами передней доли гипофиза у неонатальных крыс. Однако следует иметь в виду, что ДА мозгового происхождения до формирования ГЭБ может оказывать влияние на секрецию пролактина как через портальную систему циркуляции, так и через общий кровоток.

Для подтверждения нашей гипотезы о развивающемся мозге как об эндокринном органе принципиально важно было определить, обладает ли ДА именно в той концентрации, в которой он содержится в периферической крови у неонатальных крыс, ингибирующим влиянием на секрецию пролактина. Для ответа на данный вопрос были проведены эксперименты in vitro.

Нами показано, что концентрация ДА в плазме крови трехдневных животных составляет 1.9 нг/мл, причем она снижается до 0.4 нг/мл после частичного ингибирования синтеза ДА в мозгу с помощью МПТ. Поэтому для получения доказательства того, что ДА именно мозгового происхождения, содержащийся в периферической крови, может оказывать влияние на секрецию пролактина гипофиза, в экспериментах in vitro гипофизы трехдневных животных инкубировали в КРБ с разными концентрациями экзогенного ДА:

1.5 нг/мл - концентрация, которая создается в плазме в результате поступления ДА из мозга в кровь, и 0.4 нг/мл – концентрация, которая создается за счет выделения ДА из периферических ДА-синтезирующих органов и частично из мозга. Через 5 минут после начала инкубации передней доли гипофизов с ДА в концентрации 1.5 нг/мл происходит достоверное снижение выделения пролактина в инкубационную среду, в то время как инкубация с ДА в концентрации 0.4 нг/мл не влияет на выделение пролактина (Рис.4А).

Концентрация пролактина в ткани гипофизов не изменялась, поскольку при инкубации в КРБ выделяется небольшой процент от общего содержания этого гормона в ткани.

Для оценки специфичности действия ДА на секрецию пролактина, т.е. через рецепторы к ДА, использовали дополнительный контроль с введением в среду, наряду с ДА, ингибитора его рецепторов – галоперидола.

Как и ожидалось, введение галоперидола снимало ингибирующее влияние ДА на секрецию пролактина лактотрофами (Рис. 4А).

А Б КРБ Плазма 0.* А Б КРБ плазма без 0. галоперидола 0,4 нг/мл ДА * 1,5 нг/мл ДА плазма с * галоперидолом ДА + галоперидол 0.3 0 Рис. 4. Концентрация пролактина (ПРЛ) в среде после инкубации передней доли гипофиза крыс на третий постнатальный день:

(А) в Кребс–Рингер буфере (КРБ), содержащем экзогенный дофамин (ДА) в концентрации 1.5 или 0.4 нг/мл, либо 1.5 нг/мл ДА в присутствии 10-10 М галоперидола; в контроле половинки соответствующих гипофизов инкубировали в КРБ без ДА. * Достоверные различия между контролем и опытом (p < 0.05);

(Б) в плазме после инкубации гипофизов животных на П3 в присутствии 10-10М галоперидола или без него. * Достоверные различия между концентрацией ПРЛ в плазме с галоперидолом или без (p < 0.05).

Поскольку действие экзогенного ДА в искусственной среде (КРБ) может отличаться от действия эндогенного ДА в крови, т.к. в крови могут находиться другие химические сигналы, модифицирующие эффекты ДА, то следующий этап нашей работы был посвящен проверке действия эндогенного ДА, содержащегося в периферической крови крыс до становления ГЭБ, на выделение пролактина из гипофиза. Как и ожидалось, концентрация пролактина в плазме, содержащей эндогенный ДА и экзогенный галопериодол ПРЛ, нг/мг гипофиза/300 мкл среды ПРЛ, нг/мг гипофиза/300 мкл плазмы в концентрации 10-10 М, была значительно выше, чем в плазме, содержащей только эндогенный ДА (Рис. 4Б). При этом концентрация пролактина в ткани гипофизов не изменялась. Использование специального контроля показало, что концентрация эндогенного ДА в плазме не изменялась в течение всего периода инкубации гипофизов, сохраняясь примерно на уровне 2 нг/мл. Полученные результаты свидетельствуют о том, что эндогенный ДА, содержащийся в плазме периферической крови у неонатальных крыс до становления ГЭБ, способен ингибировать выделение пролактина из передней доли гипофиза.

Таким образом, в данной работе представлены доказательства того, что ДА, поступающий из мозга в общую систему циркуляции до формирования ГЭБ, регулирует функциональную активность лактотрофов передней доли гипофиза, и в частности, выделение пролактина.

ВЫВОДЫ 1. Впервые разработана экспериментальная модель ингибирования синтеза дофамина в мозгу у крыс в перинатальном периоде до формирования гемато-энцефалического барьера. Подобрана минимальная доза ингибитора, максимально снижающая уровень дофамина в мозгу и не влияющая на его синтез в периферических органах.

2. На разработанной модели показан существенный вклад развивающегося мозга в формирование физиологически активной концентрации дофамина в общей системе циркуляции до формирования гемато-энцефалического барьера, о чем свидетельствует значительное снижение концентрации дофамина в плазме крови после ингибирования его синтеза в мозгу.

3. На примере гипофиза как периферического органа-мишени для дофамина в экспериментах in vivo и in vitro получены доказательства того, что до формирования гемато-энцефалического барьера дофамин, поступающий из мозга в общую систему циркуляции, оказывает прямое эндокринное влияние на выделение пролактина из лактотрофов гипофиза.

4. Полученные данные подтверждают гипотезу о том, что мозг в онтогенезе до формирования гемато-энцефалического барьера играет роль эндокринного органа, секретируя в общую систему циркуляции физиологически активные вещества, и оказывает прямое эндокринное влияние на развитие и функционирование периферических органов-мишеней.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Сайфетярова Ю. Ю., Дегтярева Е.А., Сапронова А.Я., Угрюмов М. В.

Эндокринная функция дофаминергических нейронов мозга у крыс в перинатальном периоде // Нейрохимия. 2011. Т. 28(3). С.192-199.

2. Ugrumov M.V., Saifetyarova J.Y., Lavrentieva A.V., Sapronova A.Y.

Developing brain as an endocrine organ: secretion of dopamine // Mol. Cell.

Endocrinol. 2012. V. 348(1). P.78-86.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография ГЭБ – гемато-энцефалический барьер ДА – дофамин ДГБА – 3,4-дигидроксибензиламин гидробромид П – постнатальный день ФАВ – физиологически активные вещества ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.