WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

РЯЗАНОВА МАРИНА АНАТОЛЬЕВНА

Экспрессия генов 1A- и 2A-адренорецепторов у линий крыс, с наследственной индуцированной стрессом артериальной гипертонией (НИСАГ) и  с генетической кататонией (ГК)

03.03.01  ФИЗИОЛОГИЯ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Новосибирск 2012

Работа выполнена в лаборатории эволюционной генетики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института цитологии и генетики СО РАН и лаборатории патофизиологии Федерального государственного бюджетного учреждения «НИИ физиологии» СО РАМН,

г. Новосибирск.

Научный руководитель: профессор, доктор биологических наук

  Аркадий Львович Маркель 

  ИЦиГ СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

  Гилинский Михаил Абрамович

  ФГБУ «НИИ  физиологии» СО РАМН,

  г. Новосибирск 

 

  профессор, доктор биологических наук

  Колосова Наталия Гориславовна

  ИЦиГ СО РАН, г. Новосибирск 

Ведущая организация:  ГБОУ ВПО «Сибирский государственный

  медицинский университет»,  г. Томск

Защита диссертации состоится  __________________ 2012 года в ____часов на заседании диссертационного совета  Д 001.014.01 при ФГБУ «НИИ физиологии» СО РАМН, ул. Академика Тимакова, 4, Новосибирск,  630117.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ  физиологии»  СО РАМН

Автореферат разослан «____»______________2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук И.И. Бузуева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение генетико-физиологических механизмов гипертонической болезни представляет актуальнейшую проблему теоретической и практической медицины и биологии. Это связано с двумя обстоятельствами: во-первых, с чрезвычайной распространенностью данного заболевания среди населения особенно индустриально развитых стран; во-вторых, с тяжестью вызываемых осложнений.

На сегодняшний день животные модели  широко используются для исследования генетико-физиологических механизмов гипертонической болезни. В Институте цитологии и генетики СО РАН получены уникальные линии крыс – со стресс чувствительной артериальной гипертонией (линия  НИСАГ) (Маркель, 1986а; 1992), а также линия крыс ГК с генетической кататонией и с умеренно выраженной (пограничной) артериальной гипертонией (Барыкина и др., 1983; Kolpakov et al., 1983; 1996).

В отличие от других селекционных моделей гипертонии, у которых  имеется либо спонтанное повышение артериального давления (без видимого влияния средовых факторов), как у крыс линии (SHR), или при воздействии высокосолевой диеты, как у линий крыс SBH (Sabra hypertensive) и DS (Dahl salt-sensitive), у крыс линии НИСАГ гипертензивный статус наиболее полно реализуется в условиях мягкого эмоционального стресса. Крысы линии НИСАГ характеризуются рядом морфофизиологических показателей, характерных для развития этой патологии (Маркель и др., 1992; Максимов и др., 1999; Бузуева и др., 2000; Хворостова и др., 2001; 2003; Антонов и др., 2000; 2010; Markel et al., 1999; Amstislavsky et al., 2006). Ранее было показано, что в ряде структур мозга, участвующих в регуляции артериального давления, уровень норадреналина, дофамина, и скорость их метаболизма изменены (Гордиенко и др., 1990; 1993). В исследованиях по специфичному связыванию лигандов показано, что у крыс линии НИСАГ изменено число адренорецепторов в мозге по сравнению с исходной популяцией Вистар (Шишкина и др., 1991). Кроме того, показана увеличенная реактивность артерий к норадреналину (Балакирева и др., 1998). Предполагается, что возникновение или  поддержание гипертензивного статуса и сопутствующих функциональных эндокринных изменений у крыс линии НИСАГ может быть обусловлено изменением функционирования симпатоадреналовой системы, тесно связанной с регуляцией стресс-ответа и артериального давления.

Линия крыс ГК с пограничной гипертензией селекционирована по склонности к кататоническому застыванию, которое возникает под влиянием испуга. Такой вид кататонической реакции характерен для больных с некоторыми видами психопатологии (Колпаков, 1987). На сегодняшний день, получена инбредная линия крыс ГК, у которых отмечены поведенческие и биохимические особенности характерные для больных шизофренией и депрессией (Колпаков и др., 2004), и имеющих умеренно повышенное артериальное давление (Барыкина и др., 1983). Поэтому крыс ГК можно рассматривать также как линию с пограничной формой гипертензии. Следует подчеркнуть, что повышение артериального давления у крыс линии ГК явилось побочным эффектом селекции на пассивно-оборонительную реакцию застывания. В связи с тем, что крысы  линии ГК  всегда рассматривались с точки зрения отклонений в поведении, то специальных исследований механизмов становления гипертензивного статуса у этих крыс ранее не проводилось.

Активации симпатоадреналовой системы (САС) придаётся важное значение в патогенезе артериальной гипертонии. Своё участие в регуляции артериального давления САС осуществляет через воздействие норадреналина (НА) и адреналина (А) на специфические мембранные адренергические рецепторы. Предполагается, что изменение в адренорецепторном звене может участвовать в патогенезе артериальной гипертонии. Настоящая работа посвящена изучению экспрессии генов 1А- (1А-АР) и 2А-адренорецепторов (2А-АР), как наиболее важных для регуляции артериального давления (АД). 1А-АР – постсинаптические рецепторы, опосредуют эффекты НА (Piascik et al., 2001). Их активация вызывает сужение сосудов и увеличение периферического сосудистого сопротивления, повышая АД (Piascik et al., 1990; 2001; Docherty 2010). 2А-АР – главные пресинаптические ауторецепторы, ингибирующие высвобождение НА, препятствуя тем самым его эффектам (Altman et al., 1999; Hein et al., 1999; Phillip et al., 2002; Bucheler et al., 2002). Центральные 2А-АР опосредуют долговременное гипотензивное действие 2-АР-агонистов, например, клофелина (Macmillan et al., 1996; Phillip et al., 2002). Таким образом, 1А- и 2А-адренорецепторы принимают непосредственное участие в регуляции АД, однако их влияние на АД по сути противоположно.

Существует гипотеза о двухфазном развитии эссенциальной гипертонии. Первая фаза обусловлена гиперактивностью САС, предположительно связанной с изменениями регуляции на центральном уровне. Вторая фаза связана с развитием морфофункциональных изменений, смещающих гипертонию в сторону соле-зависимой и почечно-зависимой форм, в развитии которых периферические механизмы, в частности почка, играют более значительную роль (Johnson et al., 2005). Поэтому представляется особенно важным исследовать экспрессию адренорецепторов в центральной нервной системе и периферических органах, участвующих в регуляции АД, у крыс в разные возрастные периоды – во время начального становления гипертензивного статуса (1,5 месяца) и при его стабилизации (7 месяцев), когда механизмы поддержания АД могут быть различными. Кроме того, важно сопоставить результаты исследования двух разных гипертензивных линий крыс, что позволит более четко документировать представление о физиологических механизмах, лежащих в основе разных форм артериальной гипертонии. 

Цель работы: Выявление связи транскрипционной активности генов 1А- и 2А-адренорецепторов с повышением артериального давления при двух формах артериальной гипертонии – стресс-зависимой (крысы линии НИСАГ) и пограничной (крысы линии ГК), в двух возрастных группах – в периоде становления и после стабилизации гипертензивного статуса.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

  1. Исследовать величины АД в покое и после стресса у крыс линий НИСАГ, ГК и WAG (контрольная линия) двух возрастных групп – 1,5 и 7 мес.
  2. Изучить транскрипционную активность гена, кодирующего 1А- адренорецепторы в отделах мозга, ткани миокарда, почки, надпочечника и легких, у крыс линий НИСАГ, ГК и WAG (контрольная линия) двух возрастных групп – 1,5 и 7 мес.
  3. Изучить транскрипционную активность гена, кодирующего 2А- адренорецепторы в отделах мозга, ткани миокарда, почки, надпочечника и легких, у крыс линий НИСАГ, ГК и WAG (контрольная линия)  двух возрастных групп – 1,5 и 7 мес.
  4. Выявить корреляционные связи между уровнем АД и транскрипционной активностью генов 1А-АР и 2А-АР в структурах мозга и периферических органах у крыс линий НИСАГ, ГК и WAG (контрольная линия) двух возрастных групп – 1,5 и 7 мес.

Научная новизна работы. В работе впервые:

  • Исследована транскрипционная активность генов, кодирующих 1А- и 2А-адренорецепторы, в структурах мозга и в тканях органов крыс линий НИСАГ и ГК в молодом возрасте и при сформированной артериальной  гипертензии с использованием современного метода молекулярной биологии – полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени.
  • У крыс линии НИСАГ в 1,5-месячном возрасте обнаружено повышенное содержание мРНК альфа1А-АР в лобной коре. У крыс исследованных линий в возрасте 1,5 месяцев выявлена физиологическая корреляция между значением соотношения мРНК альфа1А-АР/альфа2А-АР в гипоталамусе с повышением артериального давления при стрессе.
  • На основании увеличения экспрессии 1А-АР и снижения экспрессии 2А-АР в ткани почки, а также корреляционной зависимости этих изменений с повышением артериального давления делается заключение о связи изменений адренорецепторного звена почки общей для крыс линий НИСАГ и ГК, имеющих разные формы гипертонии со становлением гипертензивного состояния.
  • Показано снижение экспрессии 1А- и повышение экспрессии 2А-адренорецепторов в отделах мозга 7-месячных крыс линии ГК, что указывает на снижение функциональной активности норадренергической системы мозга. Этого не наблюдается у крыс НИСАГ. Показана отрицательная связь значения коэффициента мРНК 1А-АР/ мРНК 2А-АР в продолговатом мозге с длительностью реакции каталептического застывания крыс ГК в полуторамесячном возрасте.
  • Обнаружены однонаправленные изменения экспрессии гена 1А-адренорецептора в лёгких у крыс линии НИСАГ и ГК, что указывает на  сходство симпатической регуляции сосудов малого круга кровообращения у крыс сравниваемых гипертензивных линий.
  • Выявлен пониженный уровень мРНК гена 1А-адренорецептора в надпочечниках крыс линии ГК, свидетельствующий о понижении симпатической стимуляции железы.

Теоретическая и научно-практическая ценность работы. Данная работа расширяет имеющиеся представления о возможных механизмах участия СНС в становлении различных форм артериальной гипертонии у крыс линий НИСАГ (стресс зависимая форма) и ГК (пограничная форма) для которой, наряду с гипертонией, также характерно развитие кататонического синдрома. Полученные данные представляют как теоретическую, так и практическую ценность. В частности, они могут быть использованы в фармакологии для выбора стратегии создания и использования антигипертензивных препаратов, воздействующих на адренорецепторы. Кроме того, результаты работы могут быть использованы в учебном процессе (в курсе лекций по физиологии и патофизиологии).

Положения, выносимые на защиту

  1. Для стресс чувствительной гипертонии, моделью которой являются крысы линии НИСАГ, характерной особенностью является повышение экспрессии гена 1А-адренорецептора в лобной коре в возрасте 1,5 месяцев - периоде становления гипертензивного статуса.
  2. Для  крыс со стресс чувствительной гипертонией (линия НИСАГ) и крыс с пограничной гипертонией (линия ГК) характерны сходные изменения экспрессии генов адренорецепторов в ткани почки в сторону преобладания экспрессии гена 1А-адренорецептора в обеих возрастных группах. Превышение экспрессии гена 1А-АР относительно экспрессии гена 2А-АР в ткани почки ассоциировано с повышением  базального артериального давления у крыс обеих гипертензивных линий. Снижение экспрессии гена 2А-адренорецептора в ткани почки связано со стресс-зависимым повышением артериального давления.
  3. Общей закономерностью для 1,5-месячных крыс независимо от их линейной принадлежности является ассоциация вызванного стрессом повышения артериального давления с преобладанием в гипоталамусе экспрессии гена 1А-адренорецептора над экспрессией гена 2А-адренорецептора.
  4. Снижение экспрессии гена 1А-адренорецептора в среднем и продолговатом мозге и повышение экспрессии гена 2А-адренорецептора в лобной коре у 7-месячных крыс линии ГК не ассоциированы с повышением артериального  давления, а связаны с особенностями их поведения – склонностью к кататоническим реакциям.

Апробация результатов. Материалы диссертации обсуждены на VI Сибирском физиологическом съезде (г. Барнаул, 2008),  на конференциях «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга», (Санкт-Петербург, 2008) и «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (г. Новосибирск, 2009), конференции «Медицинская геномика и протеомика» (г. Новосибирск, 2009), конференции «Фундаментальные науки – медицине» (г. Новосибирск, 2010), на XXI съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (г. Калуга, 2010). Также полученные результаты были представлены и обсуждены на отчетной сессии Института цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 научных статей в рецензируемых отечественных изданиях и 1 статья в зарубежном журнале. Кроме того, опубликовано 6 тезисов в сборниках трудов конференций.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из списка сокращений, введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 129 страницах печатного текста, содержит 18 рисунков и 8 таблиц. Библиографический указатель литературы включает 274 источника, из них 46 отечественных и 228 зарубежных.

Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам лаборатории эволюционной генетики и коллегам в ИЦиГ СО РАН – Ю.Э. Гербеку, Г.М. Дымшицу, Федосеевой Л.А. и сотрудникам лаборатории патофизиологии ИФ СО РАМН – Г.С. Якобсону, М.Д.Шмерлингу, И.И. Бузуевой и Е.Е. Филюшиной за поддержку, сотрудничество и ценные рекомендации. Отдельно хочется выразить признательность Т.А. Алёхиной и научному руководителю проф. А.Л. Маркелю.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные. Работа выполнена на 1,5- и 7-месячных, интактных крысах-самцах трёх инбредных линий –  НИСАГ, ГК и WAG (Wistar Albino Glaxo), последнюю использовали в качестве нормотензивного контроля. Животных содержали в стандартных условиях вивария Института цитологии и генетики СО РАН по несколько особей в клетке, со свободным доступом к воде и корму. Биологический материал – ткани миокарда, лёгких, почки, надпочечника, лобную кору, гипоталамус, средний мозг, продолговатый мозг у крыс после мгновенной декапитации быстро выделяли и помещали в жидкий азот, а затем на -700С до выделения РНК.

Измерение артериального давления  у крыс производили непрямым методом (tail cuff method), используя аппаратуру BioPack (USA) и Mingograph 32 (Швеция). Базальное АД измеряли у крыс под лёгким эфирным наркозом для избегания влияния на АД психологического стресса, связанного с процедурой измерения.  Иммобилизационный стресс  создавали путём помещения крыс в узкие проволочные сетки-цилиндры, размеры которых соответствовали размерам животных, чтобы они не могли в них развернуться. Длительность стресса составляла 30 минут, после чего измеряли уровень АД.

       Тест на кататоническое застывание. Показывает наличие или отсутствие кататонического застывания и его продолжительность. Животное приподнимали палочкой-тестером за передние лапы в углу клетки спиной к стенке. Палочку убирали и регистрировали время сохранения приданной неподвижной вертикальной позы. Положительной проба считалась тогда, когда кататоническая поза при первой или второй попытках удерживалась не менее 10 с.

Выделение  суммарной РНК. Суммарную РНК 1,5 мес. крыс выделяли по методике, описанной Chattopadhyay et al. (1993), с некоторыми изменениями. Небольшую часть ткани органа или  целую мозговую структуру от отдельного животного гомогенизировали в смеси 0,5% SDS (5 объемов/г ткани) и фенола, насыщенного водой (10 объёмов/г ткани) в течение 10-15 мин. Далее добавляли 1/8 суммарного объема 2М NaAc (pH 4.2) и тщательно перемешивали и держали при комнатной температуре в течение 5 мин. Затем гомогенат переносили в чистую пробирку свободную от РНКаз, содержащую (2 объёма/г ткани) хлороформ, осторожно перемешивали, затем центрифугировали 15 мин при 14000g. Cупернатант отбирали и дважды экстрагировали смесью насыщенного водой фенола и хлороформа (в соотношении 0,5 объёма фенола : 0,5 объёма хлороформа : 1 объём раствора РНК). Центрифугировали в центрифуге "Еppendorf" в течение 5 мин при 14000g. Водную фазу отбирали в новую пробирку. Затем 1 объем хлороформа смешивали с 1 объёмом раствора РНК, центрифугировали в тех же условиях. Верхнюю водную фазу отбирали в новую пробирку. РНК осаждали 2,5-3 объёмами 96 % этанола, перемешивали и ставили для дальнейшего осаждения и хранения при -20 0С. РНК из тканей 7 мес. крыс выделяли Три-реагентом («Molecular research center», USA) согласно рекомендациям производителя.

       Получение кДНК. Для удаления геномной ДНК из образцов использовали ДНКазу фирмы «Promega» (США) согласно рекомендациям производителя. Реакцию обратной транскрипции проводили в объеме 50 мкл, для чего к 7 мкл водного раствора содержащего 3 мкг  обработанной ДНКазой РНК добавляли 0,25 нмоль праймера N9, всё встряхивали, затем добавляли реакционную смесь. Она состояла из 5 мкл буфера F2, 5 мкл 4мМ dNTP, 25мкл 40% трегалозы, 1 мкл BSA (10мг/мл) и 5мкл (60 ед.акт) обратной транскриптазы (реактивы производства «Вектор-Бэст»). Реакцию проводили в следующем температурном режиме: 370С – 1 час, 420С – 30 мин, 500С – 10 мин, 750С -5 мин. В дальнейшем, для каждого образца кДНК делали проверочную постановку ПЦР в реальном времени с праймерами на ген домашнего хозяйства RPL30 для контроля обратной транскрипции. Кроме того, проводили ПЦР с РНК для проверки на присутствие геномной ДНК в образцах.

ПЦР в реальном времени. Полуколичественную оценку экспрессии мРНК генов альфа1А- и альфа2А-адренорецепторов  проводили по отношению к экспрессии мРНК  гена «домашнего хозяйства» RPL30 как внутреннего контроля полимеразной цепной реакции.  В работе использовали амплификаторы iCycler iQ5 и iCycler iQ4 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, США). Реакционная смесь объемом 20 мкл содержала 2 мкл буфера F2 (10-ти кратный) для  ПЦР, 1 мкл 0,2 мM dNTPs, 1 мкл SYBR Green I в разведении 1 : 20000, по 150 нМ прямого и обратного праймеров и 1 е.а. hot-Start полимеразы («Вектор-Бест», Новосибирск). Реакцию проводили в следующих условиях: предварительный прогрев при 940С – 1 мин; после этого следовали 45 циклов:  денатурация при 940С – 15 сек, отжиг – 20 сек (Тотж –см. Таблица.1.), элонгация при 720С – 20 сек, сбор данных по флуоресценции  (Трег – см. Таблица. 1.) – 10 сек. После окончания ПЦР снимали кривые плавления для контроля специфичности реакции. Из полученных образцов кДНК для каждого органа делали «усреднённый» раствор кДНК объединяющий образцы животных всех линий. Его использовали для построения калибровочных кривых, по которым определяли относительный уровень кДНК для целевых генов и гена сравнения  в образцах.

Таблица 1. Характеристика праймеров, используемых в ПЦР.

ген

последовательность праймеров

Тотж.,оС

       Трег., оС

длина продукта п.н.

Rpl30

F-5`-ATGGTGGCTGCAAAGAAGAC-3` R-5`-CAAAGCTGGACAGTTGTTGG-3`

64

83

165

1A-AР

F-5`-TGCCATCTTTGAGATCCTG-3` R-5`-GGTAGCTCACACCAATGTA-3

64

87

143

2A-AР

F-5`-TATGGGCTACTGGTACTTT-3` R-5`-CCCACACAGTGACAATGAT-3`

63

90

191

Праймеры, используемые для определения адренорецепторов, были подобраны автором с использованием онлайн олигоанализатора с сайта: www.eu.idtdna.com. Праймеры на ген домашнего хозяйства подобраны Федосеевой Л.А (Федосеева и др., 2009). Все праймеры были проверены в базе данных Blast (Basic Local Alignment Search Tool)  на специфичность.

Статистическая обработка данных. Статистический анализ данных производили с использованием однофакторного дисперсионного анализа  (ANOVA) и post-hoc сравнений с использованием LSD-критерия Фишера, а также корреляционного анализа по критериям Пирсона и Спирмена, и критерия Стьюдента для малых выборок, пакет программ  «Stastistica 6». В каждой экспериментальной группе было 6-10 животных. Результаты представлены как  M±m.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Артериальное давление у молодых крыс линий ГК и НИСАГ, в начале формирования гипертензивного статуса, повышено как в покое, так и после получасового рестрикционного стресса по сравнению с нормотензивной линией WAG  (Рис.1.). У взрослых крыс наблюдаются подобные изменения. При этом у крыс линии НИСАГ с возрастом значения АД  увеличиваются. Это может быть связано с разными механизмами, вовлечёнными в патогенез АГ в данных возрастных группах. При этом АД у крыс линии ГК имеет промежуточное значение между контролем и крысами НИСАГ и с возрастом значительно не меняется, что указывает на отличия в патогенезе АГ у крыс ГК и НИСАГ.

Рис.1. Значения систолического

артериального давления

у крыс линий НИСАГ, ГК

и  WAG двух возрастных

групп.

* - отличия от WAG (p<0,05);

** - (p<0,01);*** - (p<0,001);

# -  от НИСАГ (p<0,01);

## - (p<0,001)

Количество мРНК гена 1А- и 2А-адренорецепторов в структурах мозга  крыс линий НИСАГ и ГК. Исследование  экспрессии генов 1А-  и 2А-адренорецепторов в структурах мозга крыс линии НИСАГ выявило достоверные различия по содержанию мРНК гена 1A-AР в лобной коре 1,5 месячных крыс. Для этой структуры показано достоверное влияние фактора генотипа (F2,15=5,8, p<0,01) на экспрессию гена 1А-АР. Post-hoc анализ выявил повышенное содержание мРНК этого гена в лобной коре крыс НИСАГ как по сравнению с контролем – крысами WAG (p<0,01), так и  по сравнению с другой исследуемой группой –  крысами ГК (p<0,01) (Рис. 2). У 7 месячных крыс линии НИСАГ подобных  изменений не отмечено. Известно, что рецепторы 1 типа – постсинаптические и являются проводниками эффектов норадреналина, увеличивая процесс возбуждения в ЦНС (Piascik et al., 2001). Поэтому  увеличенная экспрессия гена 1А-АР в лобной коре, может быть связана с повышением центральных стимулирующих влияний норадреналина и с установлением гипертензивного статуса у молодых крыс НИСАГ. Так как известно, что при стрессе в лобной коре - где происходит оценка стимула как стрессорного или нейтрального, повышается выделение НА (Finalay et al., 1995),  то увеличенная экспрессия гена 1А-АР также может быть ассоциирована с повышенной чувствительностью крыс НИСАГ к стрессу.

       

Рис. 3. Содержание мРНК гена 1А-адренорецептора в среднем и  продолговатом мозге крыс в возрасте 7  месяцев.

# - отличия от НИСАГ (p<0,05); + -  (p<0,01);  ** - отличия от WAG (p<0,01).

       У крыс линии ГК обнаружены различия в экспрессии адренорецепторов только в возрасте 7 месяцев. Выявлена связь генотипа с экспрессией гена 1А-АР в среднем (F2,14=5,4,p<0,05) и продолговатом (F2,14=6,7, p<0,01) мозге. Показано снижение количества мРНК гена 1А-АР в среднем мозге крыс линии ГК как по сравнению с контролем (p<0,01), так и по сравнению с линией крыс НИСАГ (p<0,01). (Рис.3.). Сходные изменения в экспрессии мРНК гена 1А-АР у 7-месячных крыс ГК обнаружены в продолговатом мозге (Рис.3.). 

Рис. 4. Содержание мРНК гена 2А-адренорецептора в лобной коре 7 мес. крыс линии WAG, НИСАГ и ГК.

+ - отличия от НИСАГ (p<0,01)

** - отличия от WAG (p<0,01)

       

       Показана связь генотипа с уровнем мРНК 2А-АР в лобной коре (F2,13=9,3, p<0,01) в 7 месяцев. Содержание мРНК 2А-АР в лобной коре у крыс линии ГК  было повышено (p<0,01) (Рис.4.). Таким образом, в таких важных для регуляции АД структурах как продолговатый и средний мозг предполагаемого увеличения экспрессии гена 1А-АР и снижения экспрессии гена 2А-АР у гипертензивных  крыс обнаружено не было. Подобные изменения ассоциированы с АГ и наблюдаются у крыс линии SHR (Reja et al.,2002). Напротив, у крыс ГК в 7-месячном возрасте было выявлено снижение количества мРНК гена 1А-АР в среднем и продолговатом мозге и повышение количества мРНК гена 2А-АР в лобной коре. Кроме того, значение коэффициента мРНК 1А-АР/ мРНК 2А-АР у крыс линии ГК было достоверно изменено в лобной коре (p<0,05) и продолговатом мозге (p<0,05) в сторону преобладания мРНК 2А-АР. Считают, что баланс соотношения этих адренорецепторов играет важную роль в поддержании оптимального уровня симпатической активности, а преобладание 1А-АР  связано с её повышением  и с АГ (Reja et al.,2002). Поэтому выявленные изменения в экспрессии генов АР в стволе мозга и лобной коре у крыс линии ГК, по-видимому, связаны не с повышением АД, а скорее с их поведенческими особенностями. В пользу этого свидетельствуют литературные данные, показывающие, что блокада 1-адренорецепторов вызывает уменьшение моторной активности вплоть до каталепсии у мышей (Stone et al.,1999b; 2003a; 2003b), а стимуляция 2А-АР оказывает угнетающее действие на двигательную активность (Шишкина и др., 2003; Robinson et al., 2000).

       Корреляционный анализ показал наличие положительной не зависящей от генотипа связи между уровнем АД при стрессе и значением мРНК 1А-АР/ мРНК 2А-АР в гипоталамусе 1,5 мес. крыс (Пирсон r=0,56, p<0,05;  Спирмен r=0,61, p<0,05).  Выявленная корреляция показывает физиологическую зависимость реактивности АД к стрессу от количественного соотношения мРНК генов АР у молодых крыс. Это соответствует ранее полученным данным, показывающим положительную связь количества 1-АР и АД при стрессе у гибридов крыс линии НИСАГ и крыс Вистар. Наряду с этим следует отметить наличие достоверного увеличения мРНК 1-АР в лобной коре у молодых крыс НИСАГ, что отличает их от крыс ГК и WAG.

Поскольку селекция крыс линии ГК велась не на повышение АД, а на предрасположение к реакции кататонического застывания, была исследована связь выявленных изменений экспрессии генов АР в мозге с проявлением тормозных реакций. При сравнении генотипов исследованных линий крыс обнаружена  отрицательная корреляция коэффициента (мРНК 1А-АР/ мРНК 2А-АР) в продолговатом мозге с временем застывания у 1,5 месячных крыс (Пирсон r=-0,65, p<0,05; Спирмен r=-0,68, p<0,05). Это подтверждает наше представление о связи изменений экспрессии АР в мозге крыс линии ГК с их поведенческими особенностями.

Количество мРНК гена 1А- и 2А -адренорецепторов в тканях органов у крыс линий НИСАГ и ГК. Исследование периферических органов выявило изменения в экспрессии генов АР в почках – органах регулирующих водно-солевой гомеостаз и играющих важную роль в регуляции АД (Рис.5.).

Рис.5. Количество мРНК гена 1А- (а)  и 2А-адренорецепторов (б) в ткани

  почки крыс линии НИСАГ, ГК и WAG двух возрастных групп.

*  - отличия от WAG (p<0,05);*** - (p<0,001);# - (p=0,06).

 

Количество мРНК 1А-АР было повышенным в почках 7-месячных крыс НИСАГ на уровне тенденции (F2,12=3,5, p=0,05). Сходные, но статистически не значимые изменения наблюдаются и у молодых крыс (Рис.5. а). Кроме того, показано влияние генотипа на уровень 2А-АР-мРНК в ткани почки 1,5-месячных крыс (F2,14=8,49, p<0,001). Выявлено снижение количества мРНК гена 2А-АР в почке  крыс линии ГК (p<0,05) и ещё большее снижение у крыс линии НИСАГ (p<0,001) в 1,5 месячном возрасте. У взрослых крыс имеются  подобные, но статистически не достоверные изменения в экспрессии гена 2А-АР (Рис.5. б). Такое разнонаправленное изменение экспрессии двух подтипов -АР в ткани почки приобретает особое значение, так как тому и другому сдвигу и тем более их сочетанию должно сопутствовать усиление симпатических влияний на почку у генетически гипертензивных крыс, что может приводить к снижению почечного кровотока и к активации ренин-ангиотензиновой системы и, в конечном итоге, к повышению АД.

Кроме того, значение коэффициента (мРНК 1А-АР/ мРНК 2А-АР) в ткани почки у линии крыс ГК и ещё более значительно у крыс НИСАГ в обеих возрастных группах превышало величину этого коэффициента у нормотензивных крыс (фактор влияния генотипа F2,14=13,p<0,001 и F2,12=5,9,p<0,01 соответственно) (Рис.6.). Это красноречиво свидетельствует в пользу усиления симпатической стимуляции почки, особенно у крыс НИСАГ. Кроме того, известно, что эти подтипы АР непосредственно участвуют в регуляции водно-солевого гомеостаза. Так, показано, что агонисты 2-АР могут увеличивать скорость образования мочи через возрастание осмолярного и водного клиренса (Stanton et al., 1987; Intengan et al., 1996).

  Рис.6. Значение  коэффициента

  мРНК 1А-АР / мРНК 2А-АР

  в ткани почки крыс линии

  НИСАГ, ГК и WAG двух

  возрастных групп.

* - отличия от WAG (p<0,05);

** - (p<0,01);*** - (p<0,001);

+ - отличия от НИСАГ (p<0,05).

Фармакологические исследования показали, что стимуляция гуанфацином 2А-АР почки повышает осмотический клиренс, а ингибиция этого рецептора селективным антагонистом RX-82002 уменьшает его (Intengan et al., 1997b). Кроме того, установлено, что изменения функции 2А-АР почки связаны с гипертонией у генетически гипертензивных крыс SHR. Так, показана неспособность 2А-АР к стимуляции выделения осмотически  активных веществ у крыс SHR (Intengan et al., 1997a), а у чувствительных к соли крыс Sabra выявлено отсутствие 2А-АР-подтипа в мембранах коры почки, тогда как у  устойчивых к соли крыс Sabra эти рецепторы присутствовали (Le Jossec et al., 1995). Кроме того известно, что уменьшение выделения натрия при нервной стимуляции почки связано с участием 1-АР (Osborbn et al., 1983; Smyth et al., 1986) и именно 1А-АР подтип имеет важное функциональное значение в задержке воды и натрия почками у крыс Вистар и крыс с гипертонией, склонных к инсульту (Stroke-prone) (Sattar et al., 1995). Поэтому выявленные нами координированные изменения в экспрессии -АР обоих подтипов могут приводить к увеличению АД у крыс линий НИСАГ и ГК, также непосредственно вызывая задержку осмотически активных веществ и воды в организме.

Исследование надпочечников – как важного звена симпатоадреналовой системы не показало различий по количеству мРНК 1А-АР у крыс НИСАГ, но выявило снижение экспрессии гена 1А-АР у молодых крыс линии ГК (F2,11=4,4;p<0,05; post-hoc p<0,01), что указывает на пониженную норадренергическую стимуляцию (Рис.7.).

 

  Рис.7. Количество мРНК гена

  1А-АР в надпочечниках крыс

  линии НИСАГ, ГК  и WAG двух

  возрастных групп.

**- отличия от WAG (p<0,01).

Выявлено снижение экспрессии гена 1А-АР в ткани лёгких крыс линий ГК (F2,14=13,9;p<0,001; post-hoc  p<0,001) и НИСАГ в 1,5 месяца (p<0,01). Подобные изменения показаны и для взрослых крыс линии ГК (F2,13=4,7;p<0,05; post-hoc  p<0,01) (Рис.8.). По-видимому, такие однонаправленные изменения в экспрессии гена 1A-AР у двух исследуемых линий могут быть компенсаторными в условиях повышенной симпатической стимуляции. Скорее всего, речь идёт о тех рецепторах, которые локализованы в гладких мышцах сосудистой системы легких. Есть факты показывающие снижение количества 1-АР в лёгких при увеличенной симпатической стимуляции (Faber et al., 2006).

Рис.8. Количество мРНК гена

  1А-АР в лёгких крыс

  линии НИСАГ, ГК и WAG двух

  возрастных групп.

  **- отличия от WAG (p<0,01);

  ***- (p<0,001).

Корреляционный анализ выявил ассоциацию между соотношением мРНК 1А-АР/ мРНК 2А-АР в почке и уровнем АД в покое у 7-месячных крыс (Пирсон r=0,86, p<0,05;  Спирмен r=0,76, p<0,05).  Чем больше преобладает экспрессия гена 1А-АР над 2А-АР и больше симпатическое влияние на почку, тем больше значение  базального АД. Кроме того, обнаружена отрицательная связь между значением АД после стресса и мРНК 2А-АР как у 7-месячных (Пирсон r=-0,78, p<0,05; Спирмен r=-0,85,p<0,05), так и 1,5 месячных крыс (Пирсон r=-0,79, p<0,05; Спирмен r=-0,85,p<0,05), ИА также у всех исследованных крыс независимо от возраста (Пирсон r=-0,75; p<0,05;  Спирмен r=-0,83,p<0,05), показывая, что почечные 2А-АР значимы также в повышении реакции АД на стресс. Обнаруженные связи доказывают важность изменений на уровне экспрессии генов -АР почек в развитии АГ и важность баланса соотношения 1А- и 2А-адренорецепторов для регуляции АД.

Обобщая полученный материал (Табл. 2.), можно отметить, что повышение экспрессии гена 1А-адренорецепотра можно было наблюдать у крыс линии НИСАГ только в лобной коре в возрасте 1,5 мес. Причем, это сочеталось со снижением экспрессии другого типа адренорецепторов 2А-АР и достоверным изменением соотношения экспрессии генов адренорецепторов в сторону преобладания 1А-АР в ткани почки. Такое положение может приводить к усилению адренергических влияний в головном мозге и в почке у молодых крыс НИСАГ в периоде становления АГ.

Таблица 2. Общая картина наблюдаемых изменений экспрессии генов адренорецепторов у крыс линий НИСАГ и ГК по сравнению с крысами WAG.

1,5 месяца

7 месяцев

1А-AР

2А-AР

1А-AР

2А-AР

лобная кора

надпо-чечник

легкие

почка

средний мозг

продол-говатый мозг

легкие

лобная кора

НИСАГ



ГК



мРНК 1А-АР/ мРНК 2А-АР

1,5 мес.

мРНК 1А-АР/ мРНК 2А-АР

7 мес.

почка

лобная кора

продолговатый мозг

почка

НИСАГ

ГК

У молодых крыс НИСАГ рецепторные механизмы повышения адренергических влияний  в головном мозге происходят за счет усиления стимулирующего адренергического рецепторного поля, а в почке за счет ослабления ингибирующих  влияний. У взрослых крыс с установившейся гипертонией изменения в адренорецепторном звене обнаружены только в периферических органах – почках.  Как показал корреляционный анализ, эти изменения в Полученные результаты укладываются в гипотезу  о двухфазном формировании АГ, когда на первом этапе задействованы центральные механизмы, а затем периферические (почечные) механизмы играют более значимую роль. Изменения в экспрессии адренорецепторов в тканях 1,5-  и 7-месячных крыс линии ГК свидетельствуют в пользу сходного механизма формирования АГ в этих возрастных группах и важного участия только почечного звена. Важными представляются результаты, показывающие общие для двух линий НИСАГ и ГК изменения в адренорецепторном звене почки. Выявление таких изменений  у  разных линий крыс, полученных при использовании разных селекционных стратегий и имеющих различную степень гипертонии,  указывает на важность почечного звена в развитии гипертензивных состояний,  в том числе и стресс зависимых.

ВЫВОДЫ

  1. Крысы линий НИСАГ и ГК имеют повышенное АД уже в полуторамесячном возрасте. У крыс линии НИСАГ, в отличие от крыс линии ГК, происходит дальнейшее значительное повышение АД по мере взросления.
  2. В раннем возрасте развитие гипертензии у крыс НИСАГ ассоциировано с относительным преобладанием экспрессии альфа1А-АР как в лобной коре, так и в ткани почки, а у крыс ГК – только в ткани почки.
  3. Для всей совокупности 1,5 месячных экспериментальных животных независимо от линейной принадлежности выявлена положительная корреляция соотношения мРНК альфа1А-АР/альфа2А-АР в гипоталамусе с артериальным давлением при стрессе, указывающая на общее значение  изменений экспрессии генов адренорецепторов гипоталамуса в регуляции ответа АД на стресс. 
  4. Положительная связь коэффициента мРНК1А/мРНК2А в ткани почки с артериальным давлением в покое  у 7-месячных крыс и отрицательная связь количества мРНК2А-адренорецептора и артериального давления при стрессе подтверждают роль адренорецепторов почки в  патогенезе обоих типов артериальной гипертонии.
  5. Снижение экспрессии гена 1А-адренорецептора в среднем и продолговатом мозге и повышение экспрессии гена 2А-адренорецептора в лобной коре у 7-месячных крыс линии ГК не могут рассматриваться в качестве механизма гипертензии и связаны с поведенческими особенностями крыс ГК. Относительное преобладание мРНК альфа2А-АР над альфа1А-АР в продолговатом мозге 1,5-месячных крыс ГК положительно коррелирует с выраженностью кататонической реакции.
  6. Гипертензивный статус у крыс линий НИСАГ и ГК связан с уровнем экспрессии генов альфа1А- и альфа2- адренорецепторов. У исследованных линий крыс изменения экспрессии адренорецепторов по сравнению с контролем имеют общие черты в почках, но различны в мозге.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Алёхина Т.А., Рязанова М.А., Уколова Т.Н., Сахаров Д.Г., Чугуй В.Ф., Прокудина О.И. Нейрогормональные сдвиги про формировании латентного торможения у крыс с предрасположением каталепсии // Нейрохимия, 2008, Т. 25, №3, С.1-6.
  2. Клочков Д.В., Алёхина Т.А., Уколова Т.Н., Рязанова М.А. Влияние постоянного освещения на проявление кататонических реакций у самок крыс линии ГК // Бюлл.эксп.биол.мед., 2008, Т.7, С.26-29.
  3. Барыкина Н.Н., Чугуй В.Ф., Алехина Т.А., Рязанова М.А., Уколова Т.Н., Сахаров Д.Г., Колпаков В.Г. Обучение крыс,  предрасположенных к кататоническим состояниям, в водном тесте Морриса // Журн. высш. нерв. деятельности, 2009, Т.59, №6, С.728-735.
  4. Алёхина Т.А., Уколова Т.Н., Кузнецова Н.В., Пальчикова Н.А., Рязанова М.А., Клочков Д.В. Влияние имипрамина на реакции нервной возбудимости  крыс линии  ГК // Бюлл.эксп.биол.мед., 2009, Т.147, №6, С.663-666.
  5. Федосеева Л.А., Рязанова М.А., Дымшиц Г.М., Маркель А.Л. Характеристика экспрессии генов рениновой системы в миокарде гипертензивных крыс линии НИСАГ // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2009, Т.147, № 10, С.430-434.
  6. Федосеева Л.А., Рязанова М.А., Антонов Е.В., Дымшиц Г.М., Маркель А.Л. Экспрессия генов рениновой системы почки и сердца  у гипертензивных крыс линии НИСАГ // Биомедицинская химия, 2011, Т.57, № 4, С.410-419.
  7. Markel A.L., Achkasov A.F., Alekhina T.A., Prokudina O.I., Ryazanova M.A., Ukolova T.N., Efimov V.M., Boldyreva E.V., Boldyrev V.V. Effects of the alpha- and gamma-polymorphs of glycine on the behavior of catalepsy prone rats // Pharmacol. Biochem. Behav., 2011,V. 98, P. 234–240.
  8. Рязанова М. А. Экспрессия генов альфа1А- и альфа2А-адренорецепторов в миокарде и ткани почки у гипертензивных крыс линии НИСАГ (ISIAH).// Бюллетень  СО РАМН, 2012, Т.32, № 1, С.43-47.
  9. Рязанова, М.А., Алёхина Т.А., Уколова Т. Н., Прокудина О.И., Барыкина Н.Н. Адаптационные механизмы нейрогормональных реакций у крыс с предрасположением к каталепсии (ГК) при разных видах стресса // Тез. докладов VI Сибирского физиологического съезда. Барнаул, 2008.Т.2. С. 58.
  10. Рязанова, М.А., Алёхина Т.А., Уколова Т. Н., Сахаров Д.Г., Прокудина О.И. Нейрогормональные сдвиги при формировании латентного торможения у крыс с предрасположением к каталепсии // Тез. докладов конференции «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга». Санкт-Петербург, 2008. С. 115-116.
  11. Маркель А.Л., Рязанова М.А., Федосеева Л.А., Редина О.Е., Смоленская С.Э.,  Пыльник Т.О., Алехина Т.А., Иванова Л.Н. Особенности функции катехоламиновой нейромедиаторной системы мозга у гипертензивных крыс линии НИСАГ // Тез. докладов конференции «Медицинская геномика и протеомика», Новосибирск, 2009. С. 89.
  12. Рязанова, М.А., Уколова Т. Н., Алёхина Т.А. Уровень мРНК альфа1А-адренорецептора и коррекция глицином поведенческих характеристик у крыс линии ГК // Тез. докладов «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов». Новосибирск, 2009. С. 224-225.
  13. Рязанова М.А., Маркель А.Л. Экспрессия генов адренорецепторов в тканях крыс линии НИСАГ и  ГК // Тез. докладов XXI Съезд физиологического общества имени И.П. Павлова. Калуга, 2010. С. 529.
  14. Маркель А.Л, Федосеева Л.А., Антонов Е.В., Рязанова М.А., Пыльник Т.О., Смоленская С.Э., Редина О.Е., Иванова Л.Н. Характеристика функций симпатоадреналовой системы в генетической модели стресс чувствительной артериальной гипертонии // Тез. докладов конференции «Фундаментальные науки – медицине». Новосибирск, 2010. С.43.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.