WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

На правах рукописи

СИНЯКОВА НАДЕЖДА АЛЕКСАНДРОВНА

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА Il6ST И РОЛЬ БЕЛКА gp130 У МЫШЕЙ С НАСЛЕДСТВЕННОЙ КАТАЛЕПСИЕЙ

03.01.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 2012

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО РАН

Научный консультант:

д.б.н. Куликов Александр Викторович

Официальные оппоненты:

Морозова Ольга Владимировна, д.б.н.

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, с.н.с.

Шишкина Галина Трифоновна, д.б.н.

Феде Институт Цитологии и генетики СО РАН, в.н.с.

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики СО РАМН

Защита состоится « 15» ___июня________ 2012 г. в __11:30___ часов на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 на базе Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск, пр-кт, академика Лаврентьева,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН Автореферат разослан « ___ » ______________ 2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета к.х.н., доцент Коваль В. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Выявление молекулярных механизмов наследственных психических заболеваний и поиск путей их коррекции являются ключевой проблемой нейрогеномики поведения и молекулярной нейрофармакологии. Многие тяжелые нарушения нервной системы сопровождаются каталепсией (реакцией замирания) - состоянием длительной неподвижности с пластическим тонусом мускулатуры, неспособностью изменить приданную позу (Sanberg et al., 1988; Weder et al. 2008; Daniels 2009). В клинике каталепсия чаще всего проявляется при злокачественном экстрапирамидном синдроме, вызванном лечением пациентов блокаторами дофаминовых D2 рецепторов (нейролептиками) (Ahlenius and Hillegaart 1986; Klemm 1989; Wadenberg 1996; Caroff et al. 2000; Lee 2007; 2010; Paparrigopoulos et al. 2009; Porsolt et al. 2010). Выяснение молекулярногенетического механизма каталепсии является актуальной задачей молекулярной биологии и медицины.

Моделью патологической реакции замирания является щипковая каталепсия у мышей (Amir et al., 1981; Kulikov et al., 1993). Была установлена ассоциация предрасположенности щипковой каталепсии у мышей с «депрессивным» состоянием (Куликов, 2004; Базовкина и др., 2005; Kulikov, Popova, 2008) и со сниженным порогом судорожной активности нейронов гиппокампа (Лисачев и др., 2008). Щипковая каталепсия довольно редкое явление и не обнаружена у мышей большинства линий, таких как AKR/J, C57BL/6, DBA/2 и др. В то же время, она наблюдается у половины мышей линии CBA/LacJ (Куликов и др., 1989; Kulikov et al., 1993). Гипертрофированная предрасположенность к каталепсии у мышей CBA/LacJ была значительно усилена у мышей линии ASC (Antidepressant Sensitive Catalepsy), полученной длительной селекцией гибридов между CBA и некаталептической линией AKR/J (Kondaurova et al., 2006). Методами Quantative trait loci-анализа (QTL) (Куликов и др., 2003; Куликов, Базовкина, 2003) и длительной селекции (Kondaurova et al., 2006) главный ген каталепсии был локализован в дистальном фрагменте хромосомы 13. С помощью переноса дистальных фрагментов хромосомы 13 от каталептической линии CBA/LacJ в геном некаталептической линии AKR/J главный ген каталепсии был локализован во фрагменте 111.35 – 116.14 Мб хромосомы 13. Была создана конгенная линия AKR.CBA-D13Mit76, отличающаяся от AKR/J наличием CBA-фрагмента хромосомы 13 в геноме AKR/J и высокой предрасположенностью к каталепсии (Kulikov et al., 2008).

Среди генов, локализованных в данном фрагменте, наиболее вероятным геном кандидатом является ген Il6st, кодирующий белок gp130, осуществляющий трансдукцию сигнала от рецепторов цитокинов группы интерлейкина-6 (IL-6). Это чрезвычайно важная группа интерлейкинов (IL), включающая IL-6, IL-11, IL-27, leukaemia inhibitory factor (LIF), ciliary neurotropic factor (CNTF), онкостатин М, кардиотропин-1 и др. (Chesnokova and Melmed 2002; Fasnacht and Muller 2008;

Heinrich et al. 2003), играет ключевую роль в нейрогенезе, нейрональной дифференциации, иммунном ответе и воспалении (Naka et al. 2002). Ряд авторов предполагает участие IL-6 в механизме депрессии (Bluthe et al. 2000; Hayley et al.

2005; Leonard, Myint, 2009). На этом основании была сформулирована гипотеза, что причиной наследственной каталепсии у мышей CBA/LacJ могут быть мутации в гене Il6st или регуляторных областях гена, изменяющие его экспрессию или функцию белка gp130 (Kulikov et al., 2008).

Цель работы состояла в изучении структуры и экспрессии гена Il6st, а также функциональной активности белка gp130, а также в установлении их возможной ассоциации с наследственной каталепсией у лабораторных мышей, различающихся по предрасположенности к каталепсии.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Определить нуклеотидные последовательности экзонов гена Il6st мышей некаталептической линии AKR/J и каталептической линии CBA/LacJ.

2. Изучить уровни транскрипции гена Il6st в головном мозге у животных каталептических линий СBA/LacJ, AKR.CBA-D13Mit76, ASC и устойчивой к каталепсии линии AKR/J.

3. Исследовать уровень трансляции и долю гликозилированной формы белка gp130 в мозге у животных линий СBA/LacJ, AKR.CBA-D13Mit76, ASC и AKR/J.

4. Исследовать влияние липополисахарида (ЛПС) на поведение и экспрессию генов Il6st и его гена-мишени Gfap в головном мозге у мышей конгенных линий AKR/J и AKR.CBA-D13Mit76.

5. Исследовать влияние IL-6 на поведение у мышей конгенных линий AKR/J и AKR.CBA-D13Mit76.

6. Изучить влияние IL-6 ex vivo на экспрессию генов Il6st и Gfap в срезах гиппокампа мышей линий AKR/J и AKR.CBA-D13Mit76.

Научная новизна работы. В настоящей работе впервые:

1. Определены нуклеотидные последовательности кодирующей области гена Il6st у мышей линии AKR/J (номер доступа в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) – JQ085376) и CBA/LacJ (номер доступа в базе данных GenBank – JQ085377).

2. Выявлена зависимость экспрессии гена Il6st от структуры мозга у мышей линий AKR/J, CBA/LacJ, AKR.CBA-D13Mit76, ASC.

3. Обнаружено увеличение уровня мРНК гена Il6st у мышей линии AKR.CBAD13Mit76 в стриатуме по сравнению с линиями AKR/J, CBA/LacJ и ASC.

4. Выявлена зависимость уровня белка gp130 и степени его гликозилирования от структур мозга у мышей линий AKR/J, CBA/LacJ, AKR.CBA-D13Mit76, ASC.

5. Установлена положительная ассоциация CBA - фрагмента 111.35 – 116.14 Мб хромосомы 13 c чувствительностью к ЛПС у мышей.

6. Показано участие CBA-фрагмента 111.35 – 116.14 Мб хромосомы 13 в каталептогенном действии IL-6 у мышей.

Теоретическая и научно-практическая ценность работы. Основным вкладом данного исследования в изучение генетических и молекулярных механизмов нарушений поведения является экспериментальное доказательство ассоциации наследственной каталепсии с чувствительностью к ЛПС и IL-6. Другим важным положением, продемонстрированным в работе, является экспериментальное доказательство участия белка gp130 в механизме каталепсии мышей. Несмотря на то, что полученные экспериментальные результаты не подтвердили гипотезу о том, что наследственная каталепсия у мышей CBA/LacJ вызвана мутацией в гене Il6st, изменяющей его экспрессию или функцию белка gp130, проделанная работа позволила сократить первоначальный список генов-кандидатов, ассоциированных с наследственной каталепсией у мышей CBA/LacJ. Была показана научнопрактическая ценность конгенной линии AKR.CBA-D13Mit76 как модели для экспериментального изучения молекулярных механизмов действия ЛПС и IL-6.

Полученные результаты используются в курсе лекций «Молекулярные механизмы поведения» для студентов 4 курса факультета естественных наук НГУ.

Положения, выносимые на защиту:

1. Наследственная каталепсия у мышей линии CBA/LacJ не ассоциирована с изменениями в кодирующей части гена Il6st, а также с изменениями в экспрессии гена Il6st и функциональной активности gp130.

2. Конгенная линия мышей AKR.CBA-D13Mit76 обладает повышенным уровнем мРНК гена Il6st в стриатуме по сравнению с линиями AKR/J, CBA/LacJ и ASC.

3. Наибольший уровень мРНК гена Il6st для мышей линий AKR.CBAD13Mit76, AKR/J, CBA/LacJ и ASC обнаружен в среднем мозге и гипоталамусе.

Наибольший уровень обеих форм (гликозилированной и негликозилированной) белка gp130 наблюдался в среднем мозге у мышей этих линий.

4. Фрагмент 111.35 – 116.14 Мб хромосомы 13 влияет на чувствительность мышей к липополисахариду (ЛПС) и IL-6.

5. Стимуляция gp130 экзогенным IL-6 или эндогенным IL-6, секретированным в ответ на введение липополисахарида (ЛПС) вызывает каталептогенное действие у мышей.

Апробация результатов. Полученные результаты были представлены и обсуждены на XLVIII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2010), 5-ой международной конференции «Биологические основы чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2010), XXI съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, 2010), Первой всероссийской молодежной научной конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биологии» (Томск, 2010), 13ой ежегодной встрече интернационального общества поведческой и нейрональной генетики Genes, Brain and Behavior 2011 (Италия, Рим, 2011), 15ой Международной конференции по нейронаукам и биологической психиатрии «Стресс и поведение» (Санкт-Петербург, 2011) и VII съезде Казахского физиологического общества с международным участием «Современная физиология: от клеточно-молекулярной до интегративной – основа здоровья и долголетия» (Казахстан, Алматы, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них четыре статьи из списка журналов, рекомендованных ВАК, в отечественных (2) и международных (2) журналах, 4 тезиса на всероссийских и 3 на международных конференциях.

Соавторство и благодарности. Автор выражает глубокую признательность к.б.н. П.Д. Лисачеву (лаборатория биомедицинской информатики конструкторскотехнологического института вычислительной техники СО РАН) за приготовление и инкубацию срезов гиппокампа, к.б.н. Д.В. Базовкиной (лаборатория нейрогеномики поведения ИЦиГ СО РАН) за помощь в проведении тестов на каталепсию и секвенировании, к.б.н. М.А. Тихоновой (лаборатория нейрогеномики поведения ИЦиГ СО РАН) за помощь в обработке поведенческих тестов и к.б.н. Кондауровой Е.М (лаборатория нейрогеномики поведения ИЦиГ СО РАН) за совместную работу по Вестерн блоттингу.

Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы, список цитируемой литературы (301 наименований) и приложение. Работа изложена на страницах, содержит 29 рисунков, из которых 15 оригинальные, и 9 таблиц, из которых 4 оригинальные. В приложениях помещены 10 оригинальных таблиц, которые поясняют рисунки 14 – 29.

Материалы и методы Животные Эксперименты проводили на половозрелых самцах (3-4 мес., массой 28 ± 0.г) инбредных линий AKR/J (n = 181), CBA/LacJ (n = 64), ASC (n = 66) и AKR.CBAD13Mit76 (n = 211). Линия ASC (Antidepressant Sensitive Catalepsy) создана в лаборатории нейрогеномики поведения ИЦиГ СО РАН в результате длительной селекции бэккроссов CBA x (CBA x AKR) на каталепсию. Эта линия включает 75% генома CBA и 25% генома AKR и характеризуется чрезвычайно высокой предрасположенностью к каталепсии (Базовкина и др., 2005; Kondaurova et al., 2006;

Kulikov et al., 2008). Линия AKR.CBA-D13Mit76 была получена в лаборатории нейрогеномики поведения ИЦиГ СО РАН переносом фрагмента 111.35 – 116.Мб хромосомы 13 от линии CBA/LacJ в геном AKR/J с помощью последовательных возвратных скрещиваний на линию AKR/J. Линия AKR.CBAD13Mit76 обладает выраженной предрасположенностью к каталепсии на уровне CBA/LacJ (Kulikov et al., 2008). Животных отсаживали от матерей в возрасте 30 дней и содержали по 6 особей в клетках 40 х 25 х 15 см в стандартных условиях вивария.

За два дня до начала экспериментов животных изолировали в клетках того же размера, чтобы устранить влияние эффекта группы.

Введение препаратов Мышей линий AKR/J и AKR.CBA-D13Mit76 разделяли на выровненные по весу животных группы: контрольным группам вводили физиологический раствор, а экспериментальным группам - растворенный в физиологическом растворе ЛПС (E.

coli 055:B5, Sigma, USA; чистота препарата >97%) в дозах 50 или 200 мкг/кг или IL6 (Sigma, USA) в дозе 3 мкг/кг. Все препараты вводили внутрибрюшинно. Через 3 ч после введения ЛПС или через 1 ч после введения IL-6 изучали поведение мышей в тестах открытого поля и каталепсию. Затем через 4 ч после введения ЛПС животных декапитировали, быстро на холоду вынимали мозг, выделяли переднюю кору, гиппокамп, гипоталамус и средний мозг, замораживали их жидким азотом и хранили при -70оС до экстракции РНК.

Исследование поведения мышей Тест открытого поля проводили по стандартной методике (Kulikov et al., 2008). Горизонтальную двигательную активность измеряли автоматически как суммарное расстояние, пройденное животными, вертикальную - по числу стоек на задних лапках, а амбивалентное поведение – по числу актов умывания. Тревожность оценивали по времени пребывания (%) в центральной области арены.

Исследование выраженности каталепсии проводили по стандратной процедуре (Kulikov et al., 1993) и оценивали по среднему времени замирания в трех тестах.

Определение нуклеотидной последовательности гена Il6st Нуклеотидная последовательность кодирующей области гена Il6st была взята в базе данных Ensemble (http://www.ensemble.org). Праймеры подбирали, пользуясь программами Oligo (Molecular biology insights, inc, США), OligoAnalyzer (http://idtdna.com); проверяли праймеры на специфичность по базе данных Blast (http://www.blast.ncbi.nlm.nih.gov). Автоматическое определение нуклеотидных последовательностей полученных продуктов ПЦР проводили в центре коллективного пользования автоматического секвенирования ДНК ИХБФМ-ИЦиГ СО РАН. Секвенограммы анализировали при помощи программы CodonCode Aligner (СodonCode corporation, США).

Выделение РНК и ОТ-ПЦР Выделение общей РНК проводили при помощи гуанидин тиоционатного лизиса с последующей фенольной депротеинизацией и спиртовым осаждением (Chomczynski, Sacchi, 1987), полученную фракцию РНК обрабатывали ДНКазой, разводили обработанной диэтилпирокарбонатом водой РНК до концентрации 0.1мкг/мкл и проводили обратную транскрипцию с помощью вырожденного гексамерного олигодезоксирибонуклеотида.

Концентрацию примесей геномной ДНК в препаратах кДНК измеряли с помощью ПЦР с праймерами, специфичными для 5 и 6 экзонов гена триптофангидроксилазы 1 мыши, который не экспрессируется в головном мозге (Науменко, Куликов, 2006). Ни в одной из исследуемых проб концентрация геномной ДНК не превышала 80 копий на мкл.

Концентрацию мРНК генов определяли методом полуколичественной ОТПЦР с использованием известных количеств геномной ДНК мыши (линия C57BL/6J) в качестве внешнего стандарта и оценивали по числу копий кДНК на 1копий кДНК РНК полимеразы II, используемой в качестве внутреннего стандарта (Науменко, Куликов, 2006; Naumenko et al., 2008).

Вестерн блоттинг gp130.

Экстракты белка из структур мозга разделяли в 10% разделяющем и 4% концентрирующем ПААГ гелях и переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Hybond-ECL (Amersham, США). Белок gp130 выявляли с помощью первичных поликлональных антител кролика к gp130 мыши. Полосы с молекулярной массой ок.130 кДа относили к гликозилированной форме gp130, ок. 100 кДа – к негликозилированной, что соответствовало теоретически ожидаемым результатам (Taga et al., 1989). Экспрессию белка выражали в относительных единицах и нормировали на экспрессию тубулина, которая конститутивна в мозге (Bauer et al., 2009).

Сравнение действия IL-6 ex vivo на экспрессию генов в срезах гиппокампа Работа проводилась совместно с сотрудником лаборатории информационной биологии КТИ ВТ СО РАН П.Д. Лисачевым. Срезы гиппокампа (400 мкм) мышей AKR/J и AKR.CBA-D13Mit76 инкубировали в 100 мл искусственной спинномозговой жидкости с IL-6 (нг/мл) или без него (контроль) в течение 3 ч в СО2-инкубаторе при температуре 32оС. После инкубации срезы замораживали в азоте и хранили при -70оС до экстракции РНК.

Статистический анализ данных.

Данные представляли как средние ± ошибка средней и сравнивали при помощи одно-/двухфакторного дисперсионного анализа с последующим множественным сравнением по Фишеру. Уровень мРНК гена Il6st у нативных животных сравнивали при помощи дисперсионного анализа с множественными парными сравнениями.

Результаты Анализ нуклеотидных последовательностей кДНК гена Il6st у мышей AKR/J и CBA/LacJ.

Ген Il6st имеет 15 экзонов; кодирующей части гена соответствует кДНК размером 5207 п.н. Для изучения связи наследственной каталепсии с возможными изменениями в нуклеотидной последовательности кодирующей области гена Il6st проводили секвенирование кДНК этого гена у мышей родительских линий AKR/J и CBA/LacJ. Всего секвенировали по три образца кДНК для каждой линии, поскольку мыши этих линий являются инбредными. Полученные последовательности были депонированы в базу данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) с номерами доступа JQ085376 для AKR/J линии и JQ085377 для линии CBA/LacJ. Не было обнаружено отличий нуклеотидных последовательностей кДНК для этих линий.

Таким образом, различия в предрасположенности к каталепсии у родительских линий не были связаны с наличием мутации в кодирующей части гена Il6st. Однако функциональный полиморфизм мог быть вызван нуклеотидными заменами в интронах или регуляторных областях гена, расположенных в области, предшествующей 5’- концу, изменяя его экспрессию на транскрипционном или трансляционном уровнях.

Влияние фрагмента 111.35-116.14 Мб хромосомы 13 на экспрессию гена Il6st.

Было обнаружено влияние линии (p<0,05), структуры (p<0,001) и эффект их взаимодействия (p<0,05) на уровень мРНК гена Il6st. Выявлено достоверное увеличение экспрессии гена у мышей AKR.CBA-D13Mit76 в стриатуме по сравнению с остальными линиями мышей (p<0,001) (Рис.1). Кроме того, для каждой линии мышей минимальный уровень мРНК гена наблюдался в коре и гиппокампе.

Рис.1. Уровень транскрипции гена Il6st у мышей с различной предрасположенностью к каталепсии. ***p<0,001 по сравнению с AKR/J, CBA/LacJ и ASC.

Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии ассоциации между уровнем мРНК и наследственной каталепсией и делают маловероятным предположение о том, что мыши каталептических линий отличаются от AKR/J наличием функциональной мутации (мутаций) в промоторном районе гена Il6st, способной регулировать транскрипцию данного гена. В связи с этим, мы предположили возможное наличие мутации в некодирующей части гена (в интронах или 3’-фланкирующей области), изменяющей функциональную активность белка gp130.

Изучение соотношения гликозилированной и негликозилированной форм белка gp130 у мышей, различающихся по предрасположенности к каталепсии.

Было обнаружено, что содержание как негликозилированной (рис.2) (p<0,0для всех линий), так и гликозилированной (для линии AKR/J – p<0,001; для CBA/LacJ - p<0,01; для AKR.CBA-D13Mit76 - p<0,05; для ASC- p<0,01) (рис.3) форм белка достоверно выше в среднем мозге по сравнению с другими отделами мозга.

Кроме того, была выявлена зависимость процентного соотношения гликозилированных молекул от общего числа молекул gp130 от структуры мозга - снижение этого соотношения наблюдалось в стриатуме (для линии AKR/J – p<0,001;

для CBA/LacJ - p<0,05; для AKR.CBA-D13Mit76 - p<0,01; для ASC - p<0,01).

Не было обнаружено разницы между линиями по содержанию негликозилированной (для всех структур p>0,05), гликозилированной (для всех структур p>0,05) форм белка, а также по процентному количеству гликозилированного белка gp130 (для всех структур p>0,05).

Рис. 2. Относительное количество негликозилированной формы p100 в различных отделах мозга мышей линий AKR/J, CBA/LacJ, AKR.CBA-D13Mit76 и ASC.*** p<0,001 по сравнению с корой, гиппокампом, гипоталамусом и стриатумом.

Таким образом, мы показали, что предполагаемый функциональный полиморфизм не влияет на уровень трансляции гена Il6st и на важную пострансляционную модификацию – гликозилирование.

Следующим шагом было изучение функциональной активности белка gp130 в физиологическом эксперименте по изучению поведения мышей и экспрессии генов при его активации неспецифическим агентом – ЛПС и при непосредственной активации IL-6.

Рис. 3. Относительное количество гликозилированной формы gp130 в различных отделах мозга мышей линий AKR/J, CBA/LacJ, AKR.CBA-D13Mit76 и ASC. * p<0,05, **p<0,01,*** p<0,001 по сравнению с корой, гиппокампом, гипоталамусом и стриатумом.

Изучение влияния липополисахарида на поведение и экспрессию гена Il6st и его гена-мишени Gfap в мозге мышей конгенных линий AKR/J и AKR.CBA-D13Mit76.

В этом эксперименте для активации gp130 использовали неспецифический индуктор секреции IL-6 – липополисахарид (ЛПС) (50 и 200 мкг/кг).

В тесте на каталепсию время замирания у контрольных мышей конгенной линии было значительно выше, чем у контрольных мышей линии AKR/J (p<0,001).

Были выявлены эффекты ЛПС (p<0,006) и взаимодействия фрагмента и ЛПС (p<0,032). ЛПС (мкг/кг) не влиял на время неподвижности у мышей AKR/J, но значительно увеличивал его у мышей AKR.CBA-D13Mit76 (с 72 ± 7,2 с у контрольных животных до 110 ± 6,9 с у опытных животных, p<0,0005). Таким образом, непрямая активация gp130 эндогенным IL-6, обладает каталептогенным эффектом.

В тесте открытого поля, являющимся стандартным тестом на тревожность и двигательную активность, не было выявлено эффекта фрагмента 111.35-116.14 Мб хромосомы 13 на двигательную активность (p>0,05), время пребывания в центре (p>0,05), число стоек (p>0,05) и продолжительность груминга (p>0,05). Не обнаружено влияния ЛПС на время пребывания в центре (p<0,05). Однако был выявлен эффект препарата на двигательную активность (p>0,05), число стоек (p<0,01) и продолжительность груминга (p<0,01). Не обнаружено эффекта взаимодействия фрагмента хромосомы 13 мыши и ЛПС на двигательную активность (p>0,05), время пребывания в центре (p>0,05) и число вертикальных стоек (p>0,05). В то же время, обнаружено достоверное влияние взаимодействия на выраженность груминга (p<0,001) (рис.4).

При введении ЛПС большой дозы (200 мкг/кг) у мышей линии AKR/J наблюдалось достоверное снижение пройденного пути (p<0,02), числа стоек (p<0,02) и интенсивности груминга (p<0,03). В то же время, даже малая доза (мкг/мг) ЛПС вызывала снижение пройденного пути (p<0,03), числа стоек (p<0,02) и времени груминга (p<0,001) у конгенных мышей, но не у AKR/J. (Рис. 4). Очевидно, что большей чувствительностью к ЛПС обладают конгенные мыши, имеющие CBAаллель. гена Рис.4. Пройденный путь (A), число стоек (B), время пребывания в центре (С) и продолжительность груминга (D) в тесте открытого поля у мышей линий AKR/J и AKR.CBA-D13Mit76 при введении ЛПС (50, 200 мкг/кг). *p<0,05, **p<0,01, ## ***p<0,001 по сравнению с соответствующим контролем, p<0,01 по сравнению с контролем AKR/J.

Не обнаружено эффекта фрагмента 111.35-116.14 Мб хромосомы 13 (p>0,05), эффекта ЛПС (p>0,05) и взаимодействия эффектов фрагмента хромосомы и ЛПС (мкг/кг) (p>0,05) на экспрессию гена Il6st у животных AKR/J и AKR.CBA-D13Mit76.

Однако установлено влияние фрагмента на экспрессию гена глиального белка Gfap, являющегося геном-мишенью, активируемым IL-6, в коре (p<0,05) и среднем мозге (p<0,05). Экспрессия гена Gfap в этих структурах у животных AKR была выше, чем у мышей AKR.CBA-D13Mit76. В то же время фрагмент 111.35-116.14 Мб хромосомы 13 не влиял на экспрессию гена Gfap в гиппокампе (p>0,05). ЛПС (мг/кг) увеличивал экспрессию Gfap среднем мозге (p<0,04), но не в коре (p>0,05) и в гиппокампе (p>0,05). В среднем мозге ЛПС активировал экспрессию Gfap только у животных AKR.CBA-D13Mit76 (p<0.01), но не AKR/J (рис.5).

Несмотря на то, что активация gp130 вызывала поведенческие различия у мышей каталептической линии AKR.CBA-D13Mit76, она не приводила к достоверному изменению уровня мРНК гена Il6st, но влияла на уровень мРНК его гена-мишени Gfap в среднем мозге. Следующим этапом работы было выяснение различий на поведенческом, а также на транскрипционном уровне у мышей этих линий при активации gp130 экзогенным IL-6.

Рис.5. Влияние ЛПС (50 мкг/кг) на уровень транскрипции мРНК гена Gfap в различных отделах мозга у мышей линий AKR/J (1) и AKR.CBA-D13Mit76 (2).

#p<0,05 по сравнению с контролем AKR/J, **p<0,01 по сравнению с контролем AKR.CBA-D13Mit76.

Изучение влияния IL-6 на поведение мышей линий AKR/J и AKR.CBAD13Mit76.

Введение IL-6 (3 мкг/кг) не влияло на время замирания у мышей AKR/J (17,39±5,52 сек у контрольных животных против 24,82±7,59 сек у опытных, p>0,05), но увеличивало его у конгенных мышей (с 67,73±9,92 сек до введения препарата до 93,73±6,04 сек после введения, p<0,001). Таким образом, как и в случае с эндогенным, экзогенный IL-6 оказывает каталептогенное действие у мышей, имеющих CBA-аллель гена Il6st.

Было обнаружено влияние фрагмента 111.35-116.14 Мб хромосомы (p<0,05) и IL-6 (3 мкг/кг) (p<0,05) на двигательную активность в тесте открытого поля, но не был выявлен эффект их взаимодействия (p>0,05). Введение IL-6 не влияло на двигательную активность мышей AKR/J, но снижало двигательную активность мышей AKR.CBA-D13Mit76 (p<0,05) (Рис.6), что также согласуется с предыдущим опытом.

Рис.6. Пройденный путь в тесте открытого поля у мышей AKR/J и AKR.CBAD13Mit76 линий при введении IL-6 (3 мкг/кг, в/б). * p<0,05 по сравнению с контролем AKR.CBA-D13Mit76.

Влияние IL-6 на экспрессию генов Il6st и Gfap в срезах гиппокампа ex vivo.

Для того, чтобы оценить влияние IL-6 на экспрессию генов Il6st и Gfap, были исследованы срезы гиппокампа. При анализе экспрессии этих генов не было обнаружено ни эффекта линии (p>0,05), ни препарата (p>0,05), ни их совместного воздействия (p>0,05).

В опытах по фармакологической активации gp130 была выявлена разница в поведении мышей – активация gp130 как при помощи ЛПС, так и при помощи IL-6, увеличивала время каталептичекой неподвижности у животных AKR.CBAD13Mit76, но не у AKR/J, а также изменяла их двигательную активность. Однако мы не обнаружили различий экспрессии гена Il6st на транскрипционном уровне. Что касается его гена-мишени Gfap, его экспрессия изменялась только в среднем мозге при введении ЛПС конгенных мышей.

Обсуждение результатов Важной проблемой современной молекулярной генетики является изучение последовательности молекулярных событий, ведущей от гена к сложному физиологическому признаку. Особую актуальность эта проблема приобретает при изучении молекулярных механизмов нарушения поведения и психики.

Наследственная каталепсия у мышей, несомненно, является проявлением патологии функции мозга. Во-первых, это чрезвычайно редкий признак, обнаруженный пока у единственной линии мышей CBA/LacJ (Куликов и др., 1989; Куликов, 2004; Kulikov et al., 1993). Во-вторых, наследственная каталепсия у мышей ASC ассоциирована с депрессивно-подобным поведением (Bazovkina et al., 2005; Дубровина и др., 2008), со сниженным порогом судорожной активности нейронов гиппокампа (Лисачев и др., 2008) и супрессией специфического иммунитета (Альперина и др., 2008). Втретьих, каталепсия у мышей CBA/LacJ имеет простое наследование и, вероятнее всего, возникла в результате мутации в одном локусе (Kulikov et al., 1993).

Ранее было установлено, что главный ген, определяющий высокую предрасположенность к каталепсии, локализован между 111.35 и 116.14 Мб хромосомы 13 (Kulikov et al., 2008). В этом участке генома обнаружено 6 генов, продукты которых выполняют сигнальные функции в мозге, каждый из которых можно рассматривать как потенциальный ген-кандидат каталепсии. К сожалению, в настоящее время не существует универсального молекулярно-генетического метода для выбора гена каталепсии среди этого множества генов и, следовательно, выяснение участия каждого из этих генов в регуляции наследственной каталепсии у мышей требует собственного исследования.

При планировании экспреримента было предположено, что наиболее вероятным геном-кандидатом является ген Il6st, кодирующий белок gp130, так как он экспрессируется в клетках мозга, участвует в сигнальных процессах, выживании нейронов, нейрогенезе и воспалении. Не последнюю роль в выборе гена Il6st в качестве объекта данного исследования сыграла простота фармакологической активации gp130 с помощью ЛПС или IL-6. До начала этой работы не было никаких данных, указывающих на то, что данный ген может контролировать каталепсию, поэтому была сформулирована гипотеза, о том, что высокая предрасположенность к каталепсии может быть связана с мутацией в гене Il6st, изменяющей экспрессию его продукта – gp130 или его функциональную активность.

На первом этапе нами были определены нуклеотидные последовательности кДНК у мышей родительских линий – AKR/J и CBA/LacJ. Не было обнаружено никаких различий в кодирующей области у мышей этих линий, различающихся по проявлению каталепсии. Однако функциональный полиморфизм мог быть вызван мутацией в интронах или регуляторных областях гена, расположенных в области, предшествующей 5’- концу, изменяя его экспрессию на транскрипционном или трансляционном уровнях.

Для проверки предположения исследовали ассоциацию наследственной каталепсии с экспрессией гена Il6st на транскрипционном уровне в головном мозге мышей. Для этого определяли уровень мРНК гена Il6st в коре, гиппокампе, гипоталамусе, стриатуме и среднем мозге мышей каталептических линий с CBAаллелем гена CBA/LacJ, ASC и AKR.CBA-D13Mit76 и мышей некаталептичской линии AKR/J. Было обнаружено изменение уровня мРНК этого гена только в стриатуме у мышей конгенной линии AKR.CBA-D13Mit76 по сравнению с другими линиями, что свидетельствует об отсутствии ассоциации между предрасположенностью к каталепсии и уровнем транскрипции гена Il6st.

Полученные негативные результаты делают маловероятным предположение о том, что мыши каталептических линий отличаются от AKR/J наличием функциональной мутации в промоторном районе гена Il6st, способной регулировать экспрессию данного гена (Kondaurova et al., 2010).

Тогда мы предположили возможное наличие мутации в регуляторных частях гена, изменяющей количество и функциональную активность белка gp130. Однако у мышей AKR/J, CBA/LacJ, ASC и AKR.CBA-D13Mit76 не было обнаружено различий по концентрации белка gp130 и по процентному соотношению его гликозилированной формы в коре, гиппокампе, гипоталамусе, стриатуме и среднем мозге, что опровергало эту гипотезу.

Следующей была гипотеза о том, что мыши с различной предрасположенностью к каталепсии различаются фунциональной активностью белка gp130.

Прежде всего, нами было установлено, что малые дозы ЛПС (Kulikov et al., 2010) и IL-6 увеличивают время каталептического замирания у мышей линии AKR.CBA-D13Mit76. Этот каталептогенный эффект ЛПС и IL-6 был подтвержден нашими коллегами на мышах устойчивой к каталепсии линии С57BL/6 (Bazovkina et al., 2011). Следовательно, наши исследования и исследования наших коллег доказывают потенциальное участие белка gp130 в механизме каталепсии мышей.

В ходе исследования было установлено, что CBA-фрагмент 111.35 – 116.Мб хромосомы 13, перенесенный в геном AKR/J, увеличивал чувствительность мышей конгенной линии AKR.CBA-D13Mit76 к ЛПС по сравнению с AKR/J.

Действительно, ЛПС в дозе 50 мкг/кг достоверно увеличивал время каталепсии, и уменьшал выраженность двигательной активности (пройденный путь) и исследовательского поведения (вертикальные стойки) у мышей AKR.CBAD13Mit76, но не влиял на выраженность этих параметров поведения у мышей AKR/J (Синякова, Куликов, 2010; Kulikov et al., 2010). Снижение двигательной активности у мышей AKR.CBA-D13Mit76, но не у AKR/J, вызванное введением IL-6 (3 мкг/кг), подтверждает этот результат.

Поскольку из всех генов, входящих в генную сеть, опосредующую действие ЛПС и IL-6, мыши линии AKR/J и AKR.CBA-D13Mit76 различаются только по гену Il6st, полученные данные указывают на участие гена Il6st и белка gp130 в наблюдаемом увеличении чувствительности к ЛПС и IL-6 у мышей конгенной линии. Важно отметить, что высокая чувствительность к ЛПС и IL-6 у мышей AKR.CBA-D13Mit76 сопровождается высокой экспрессией гена Il6st в стриатуме – структуре, регулирующей двигательную активность.

Таким образом, результаты работы свидетельствуют об участии ЛПС и IL-6 в механизме каталепсии и о важной роли фрагмента 111.35 – 116.14 Мб хромосомы в регуляции чувствительности к ЛПС и IL-6. Однако мы не подтвердили гипотезу о том, что причиной каталепсии является мутация, изменяющая экспрессию гена Il6st или активность белка gp130 и, следовательно, имеются все основания для исключения гена Il6st из списка генов-кандидатов, определяющих высокую предрасположенность к каталепсии у мышей CBA/LacJ.

Выводы 1. Впервые определены нуклеотидные последовательности кодирующей области гена Il6st у мышей каталептической CBA/LacJ и некаталептической AKR/J линий, инбридинг которых поддерживается в институте цитологии и генетики СО РАН в течение 40 лет, и показана их абсолютная гомология у мышей CBA/LacJ и AKR/J линий.

2. Выявлена зависимость экспрессии гена Il6st от структуры мозга.

Минимальный уровень мРНК гена обнаружен в коре и гиппокампе, а максимальный – в среднем мозге и гипоталамусе Il6st у мышей линии AKR/J, CBA/LacJ, AKR.CBA-D13Mit76 и ASC.

3. Обнаружено увеличение уровня мРНК гена Il6st у мышей линии AKR.CBAD13Mit76 в стриатуме по сравнению с линиями AKR/J, CBA/LacJ и ASC.

4. Выявлена зависимость относительного количества белка gp130 и степени его гликозилирования от структуры мозга. Максимальный уровень негликозилированной, а также гликозилированной формы белка gp1наблюдается в среднем мозге у мышей линий AKR/J, CBA/LacJ, AKR.CBAD13Mit76 и ASC. Процент гликозилированных молекул белка минимален в стриатуме у мышей данных линий.

5. Ассоциации между предрасположенностью к наследственной каталепсии и уровнем, а также степенью гликозилирования белка gp130 в пяти структурах головного мозга мышей AKR/J, CBA/LacJ, ASC и AKR.CBA-D13Mit76 не обнаружено.

6. Мыши конгенной линии AKR.CBA-D13Mit76, отличающиеся от родительской линии AKR/J CBA-фрагментом 111.35 – 116.14 Мб хромосомы 13, характеризуются повышенной чувствительностью к липополисахариду по сравнению с животными AKR/J: введение липополисахарида в дозе 50 мкг/кг достоверно снижает двигательную и исследовательскую активности, интенсивность груминга и увеличивает экспрессию гена Gfap в среднем мозге мышей AKR.CBA-D13Mit76, но не AKR/J.

7. Активация белка gp130 экзогенным IL-6 (3 мкг/кг) не вызывает изменения экспрессии генов Il6st и Gfap в срезах гиппокампа мышей AKR/J и AKR.CBA-D13Mit76, однако экзогенный IL-6 усиливает каталепсию и снижает двигательную активность у мышей конгенной линии AKR.CBAD13Mit76, но не у AKR/J.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Куликов А. В., Науменко В. С., Цыбко А. С., Синякова Н. А., Базовкина Д.

В., Попова Н. К. Роль гликопротеида gp130 в регуляции серотониновой медиаторной системы головного мозга мышей // Молекуляр. биология. - 2010. - Т. 44. - С. 904-910.

2. Синякова Н. А., Куликов А. В. Участие белка gp130 в механизме действия бактериального липополисахарида на поведение и нервную систему мышей // Труды ТГУ. -2010. - С. 230-233.

3. Kulikov A. V., Sinyakova N. A., Naumenko V. S., Bazovkina D. V., Popova N.

K. Association of glycoprotein gp130 with hereditary catalepsy in mice // Genes Brain Behaiv. -2010. - V. 9.- P. 997-1003.

4. Kondaurova E. M., Naumenko V. S., Sinyakova N. A., Kulikov A. V. Map3K, IL6ST, GZMK, and HSPB3 genes coexpression network in the mechanism of freezing reaction in mice // J. Neurosci. Res. -2011. - V. 89. - P. 267-273.




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.