WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


На правах рукописи

Галицкая Анна Алексеевна

ЭКОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКАЯ АДАПТАЦИЯ WOLFFIA ARRHIZA (L.) К АБИОТИЧЕСКИМ И БИОТИЧЕСКИМ ФАКТОРАМ СРЕДЫ

03.02.08 – экология (биология) 03.01.04 – биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов – 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН) Научные руководители: доктор биологических наук, с.н.с., заведующий лабораторией физиологии растительной клетки ИБФРМ РАН Соколов Олег Игоревич;

кандидат биологических наук, с.н.с. лаборатории физиологии растительной клетки ИБФРМ РАН Селиванов Николай Юрьевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор кафедры экологии, ботаники и охраны природы Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский государственный университет» Сачков Сергей Анатольевич;

доктор биологических наук, доцент, ведущий научный сотрудник лаборатории нанобиотехнологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН Богатырев Владимир Александрович

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук

Защита состоится « 30 » мая 2012 г. в 10-00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.243.13 при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского» по адресу:

410012, г. Саратов, ул. Астраханская, д. 83, e-mail: biosovet@sgu.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке имени В.А. Артисевич Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского» Автореферат разослан «____» ______________ 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета С.А. Невский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследований. Глобальная проблема нехватки пресной воды на Земле в значительной мере усиливается повсеместным антропогенным загрязнением окружающей среды. В связи с этим задача сохранения и очистки естественных и искусственных водоемов становится особенно актуальной. Важная роль в этих процессах принадлежит высшим водным растениям (ВВР) (Якубовский, Мережко, 1982; Зенова и др., 1995; Куриленко, Осмоловская, 2006; Huss, Wehr, 2004), а наиболее перспективные способы решения этой задачи базируются на использовании видов, имеющих высокий адаптационный потенциал. В ряде работ показано, что наряду с популяционными механизмами адаптационные способности отдельных организмов, реализуемые через коррекцию биохимических и физиологических процессов, играют важную роль в поддержании гомеостаза природных систем (Маляревская, 1985; Ратушняк, 2002; Абдуллина, 2006). Представители семейства рясковых, широко распространенные в пресных водоемах с невысокой скоростью течения, часто используются как биоиндикаторы, а также в целях биотестирования водоемов (Ломакин, Ульянова, 1993; Цаценко, Малюга, 1998). Показано, что они весьма перспективны при проведении работ по фиторемедиации (Krner et al., 1998;

Cheng et al., 2002; Mkandavir et al., 2004, Zhao et al., 2012). Однако особенности их адаптации к изменению условий окружающей среды, необходимые для разработки наиболее эффективных методов очистки или индикации качества воды, изучены недостаточно.

Цель и задачи исследования. Цель работы: выявление эколого-биохимических особенностей адаптации высшего водного растения вольфии бескорневой (Wolffia arrhiza (L., 1771) Hork. ex Wimmer) к действию абиотических и биотических факторов в различных условиях культивирования.

Для реализации поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Изучить физиолого-биохимические параметры экспериментальной популяции вольфии бескорневой (численность, продуктивность, содержание белка, углеводов, аминокислотный состав и др.) в условиях разной обеспеченности элементами минерального питания.

2. Исследовать устойчивость вольфии бескорневой к воздействию поллютантов различной природы на примере тяжелых металлов (ТМ), сложных неорганических соединений – люминофоров и антибиотиков.

3. Определить степень и характер сомаклональной вариабельности на уровне закрепленных фенотипов вольфии бескорневой при ксенобиотической нагрузке.

4. Исследовать динамику изменения рН среды в процессе культивирования растений.

5. Изучить возможность совместного культивирования вольфии бескорневой с фитоассоциированными бактериями, реализующими различные типы взаимодействия, на примере Azospirillum brasilense, Agrobacterium tumefaciens, Pseudomonas fluorescens.

Научная новизна. Определены параметры, характеризующие процесс адаптации растения W. arrhiza к изменению условий существования, в том числе к различной обеспеченности элементами минерального питания, соответствующей уровням трофности водоемов. Впервые показано образование стабильных фенотипически измененных клонов вольфии бескорневой в ответ на действие ксенобиотиков с различными механизмами действия. Разработан оригинальный метод их получения и культивирования. Впервые показан нелинейный характер изменения рН культуральной среды (кондиционирование среды) в процессе развития популяции вольфии бескорневой в нормальных условиях и при ксенобиотической нагрузке. Впервые показано изменение спектра внутриклеточных белков данного растения и экстраклеточных пептидов бактерий при их совместном культивировании.

Научно-практическая значимость. Разработан способ получения аксеничной культуры W. arrhiza, защищенный патентом РФ (RU 2 390 121 С1 МПК A01G 7/00).

Данная культура может быть использована для решения ряда биотехнологических задач, связанных с получением сверхпродуцентов ценных соединений (белков, полисахаридов, пигментов и других метаболитов), в том числе и для получения фенотипически измененных клонов вольфии с новыми, экологически значимыми свойствами. Полученные результаты могут быть использованы для разработки фиторемедиационных мероприятий путем создания эффективных растительнобактериальных ценозов. Результаты диссертационной работы используются при преподавании студентам общих и специализированных курсов по экотоксикологии на биологическом факультете Саратовского государственного университета им. Н.Г.

Чернышевского.

Апробация работы. Материалы исследований были представлены и обсуждены на: Всероссийской конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты функционирования водных экосистем» (Саратов, 2001); Международной конференции: «International Symposium on Biochemical Interactions of Microorganisms and Plants with Technogenic Environmental Pollutants» (Saratov, 2003); Всероссийской конференции «Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты» (Саратов, 2005); 3-й Региональной школе – конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Саратов, 2006); 7-м съезде Общества физиологов растений России «Физиология растений – фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» и Международной научной школе «Инновации в биологии для развития биоиндустрии сельскохозяйственной продукции» (Нижний Новгород, 2011).

Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании лаборатории физиологии растительной клетки ИБФРМ РАН, протокол № 2 от 06.03.2012 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 1 патент и 2 статьи в изданиях, рекомендованных Перечнем ВАК РФ.

Декларация личного участия. Автор принимал непосредственное участие в планировании и проведении экспериментальной части работы, которая проводилась в период с 2001 по 2011 год, самостоятельно осуществлял обработку полученных данных. Доля личного участия автора в подготовке и написании совместных публикаций составляет 50 – 70%.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Вольфия бескорневая при разных уровнях обеспеченности элементами минерального питания обладает высокой продуктивностью и устойчивостью к действию органических и минеральных поллютантов, что позволяет ей быстро адаптироваться к разным условиям трофности и загрязненности среды произрастания.

2. Вольфия бескорневая под действием ксенобиотиков проявляет сомаклональную вариабельность и формирует несколько закреплённых фенотипов и пережидающую форму, что является проявлением механизма адаптации и способствует выживанию популяции.

3. Экспериментальная популяция W. arrhiza при совместном культивировании с микроорганизмами A. brasilense, A. tumefaciens, P. fluorescens способна влиять на их рост и вызывать изменение белковых спектров как растения, так и бактерий.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 149 страницах машинописного текста, включает 24 рисунка и 2 таблицы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, четырех глав с изложением полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и библиографического списка, включающего 234 источника отечественных и зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. ХАРАКТЕРИСТИКА ОСНОВНЫХ АБИОТИЧЕСКИХ И БИОТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ, НЕГАТИВНО ВОЗДЕЙСТВУЮЩИХ НА ЭКОСИСТЕМЫ ПРЕСНЫХ ВОДОЁМОВ (Обзор литературы) На основании анализа литературы охарактеризовано воздействие на экосистемы пресноводных водоемов факторов, возникающих в результате хозяйственной деятельности человека (Шашуловский и др., 2005; Государственный доклад.., 2010;

Доклад об экологической ситуации.., 2011). Охарактеризованы статусы антропогенно измененных экосистем (Брагинский, 1998; Бреховских и др., 2008). Описаны основные виды поллютантов и их действие на гидроценозы (Папина, 2001;

Антропогенные модификации.., 2002; Остроумов, 2004; Воробьев, 2006; Маркина, 2009; Соколов и др., 2009). Особое внимание уделено рассмотрению вопроса адаптации к условиям загрязнения высших водных растений как одного из важных факторов стабильности водной экосистемы и ее способности к поддержанию гомеостаза (Кокин, 1982, Кузнецов, 2001; Шашуловская, 2009; Садчиков, 2011; Yin et al., 2002, Krner et al., 2003). Отдельный раздел посвящен описанию представителей семейства рясковых, широко распространенных в стоячих водоемах на территории средней полосы России.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Исследования проведены в период с 2001 по 2011 г. на базе лаборатории биохимии и лаборатории физиологии растительной клетки Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук. Объектом исследования является поверхностно плавающее растение (нейстонный гидрофит) вольфия бескорневая (Wolffia arrhiza (L., 1771) Hork. ex Wimmer). В работе использовали аквариумную культуру, идентификацию растений проводили по П.Ф. Маевскому (2006). Культивирование осуществляли при 24оС при искусственном освещении с интенсивностью 6000 люкс и 16-ти часовом фотопериоде. Для отражения факториальных особенностей экологии вольфии бескорневой проводили оценку численности, скорости роста, продуктивности экспериментальной популяции. Для оценки продуктивности в условиях различной трофической обеспеченности использовали стандартные минеральные среды с различным содержанием и соотношением питательных элементов (нитратный и аммонийный азот, фосфор):

минеральная среда Гамборга–Эвелега В-5 (Plant tissue.., 1996), среды Хогланда (Hoagland, Arnon, 1938; Cell culture.., 1991), Хатнера (Hutner, 1953), Мурасиге и Скуга (Краткий справочник.., 1973), а также дистиллированная вода (рН 7) и отстоянная водопроводная вода (ГОСТ 2874-82). Общую продуктивность оценивали по изменению сырой биомассы растений, биосинтетическую активность – по сухой биомассе и содержанию белков и углеводов. При определении сухой биомассы растения фиксировали в течение 15 мин при 105С, а затем высушивали при 70С в течение трех часов (Большой практикум.., 1978). Общее содержание белка определяли по О.Н. Lowry с соавт. (1951), с предварительной экстракцией 0,2% дезоксихолатом натрия и осаждением ТХУ; содержание белка выражали в мг/г сырой биомассы.

Содержание свободных и связанных аминокислот определяли на автоматическом аминокислотном анализаторе ААА 339 (Чехия) по методу S. Moore and W.H. Stein (1951). Определение пигментов после экстракции 80%-ным этанолом проводили спектрофотометрически (Волова и др., 1998). Содержание углеводов определяли без предварительного гидролиза по реакции с фенолом и серной кислотой (Dubois et al., 1956). Окрашивание поверхности растений рутениевым красным проводили по методу, предложенному в работе J. Hafrn с соавт. (2000).

Оценку устойчивости вольфии к действию поллютантов проводили в 24-х луночных планшетах для иммунохимических реакций, при этом инкубацию осуществляли в асептических условиях в течение 7–21 сут. Результаты оценивали визуально с использованием бинокулярной лупы по количеству зеленых и обесцвеченных растений и числу новых почек.

При исследовании взаимодействия с микроорганизмами были использованы следующие культуры: A. brasilense Sp245, A. tumefaciense В1219, P. fluorescens B1471, полученные из коллекции ИБФРМ РАН (г. Саратов). Культуры бактерий выращивали на рекомендованных для них микробиологических средах (Методы общей бактериологии.., 1984; Dobereiner, Day, 1976). Инкубирование проводили при 28С в течении 3, 5 и 7-и сут. Электрофоретический анализ белков в полиакриламидном геле проводили по U.K. Laemmli (1970) с последующей окраской азотнокислым серебром.

Эксперименты проводили не менее чем в 3-х биологических и 3-х аналитических повторностях. Полученные данные статистически обрабатывали в программе Microsoft Excel 2003. Достоверность результатов оценивали с использованием критерия Стьюдента (Р>0,95). На рисунках представлены средние арифметические значения отдельных экспериментов и их стандартные отклонения.

ГЛАВА 3. ДИНАМИКА ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ КУЛЬТУРЫ W. ARRHIZA ПРИ АДАПТАЦИИ К УСЛОВИЯМ СРЕДЫ Условия питания, как известно, во многом определяют продуктивность растений и их популяций. На первом этапе исследования проведен подбор среды для создания модельной системы с оптимальными для вольфии бескорневой условиями существования по параметру накопления биомассы растения. Эксперименты показали, что максимальное увеличение сырой биомассы вольфии за 7 сут культивирования отмечено при выращивании на среде Гамборга-Эвелега В-5, разбавленной водой в 5 раз от рекомендованной авторами концентрации (далее 1/среды В-5) и разбавленной в 2 раза среды Хогланда (1/2 среды Хогланда) (рис. 1 а).

160,а б 5,140,5,120,4,4,100,3,80,3,60,2,40,2,20,1,0,1,Водопроводная вода 1.4мМ мочевина 0 2 4 6 8 10 12 14 Время культивирования, сут.

1/5 среды Гамборга В5 1/10 среды Гамборга В1/5 среды Гамборга В-5 Водопроводная вода 1/2 среды Хогланда 1/5 среды Хатнера Рис. 1. Изменение прироста сырой биомассы вольфии бескорневой на различных средах: а – средний прирост сырой биомассы на средах с различными источниками азота (сут. культивирования); б – динамика увеличения биомассы в зависимости от трофической обеспеченности Это увеличение составляет соответственно 138 и 122% от первоначального значения.

Таким образом, среды Гамборга и Хогланда являются для исследуемых растений наиболее сбалансированными по содержанию нитратной и аммонийной форм азота, что обеспечивает наиболее высокую скорость накопления биомассы. Продуктивность на среде В-5 составляет 7,16±0,02 мг/см2/сут, а на среде Хогланда 6,24±0,мг/см2/сут. При подобранных нами разведениях эти среды содержат сравнимые количества азота в аммонийной форме (0,4 мМ NH4+ для 1/5 В-5 и 0,5 мМ NH4+ для 1/2 среды Хогланда), но заметно отличаются по содержанию нитратного азота (4,мМ NO3- для 1/5 В-5 и 7 мМ NO3- для 1/2 среды Хогланда). Снижение прироста сырой биомассы на среде Хатнера, содержащей 5 мМ NH4+ и 5 мМ NO3-, подтверждает, что для растений этого вида наиболее предпочтительными источниками азота являются нитраты; количество сырой биомассы в данном случае оказалось сравнимым с ростом на водопроводной воде. Широко используемая при культивировании отдельных тканей растений среда Мурасиге и Скуга, с содержанием аммонийного азота в десять раз превышающим таковое в средах Гамборга и Хогланда, оказалась полностью неприемлемой для вольфии. Данные питательные среды отличаются и соотношением азот/фосфор, который для среды Мурасиге и Скуга составляет - 45,7, для сред Гамборга В-5 – 24,3; Хогланда – 15; Хатнера – 2,17 (в относительных единицах). Этот показатель является одной из важных характеристик эвтрофности водоемов (Миловская, 2004), несмотря на то, что его значения колеблются в широких пределах, подтверждая, что между трофическими статусами нет четких границ (Брагинский, 1998). Следует отметить, что среда Хатнера близка по этому параметру к гиперэвтрофному водоему, среды Хогланда – к эвтрофному, Гамборга В-5 – к эвтрофному или мезотрофному, а Мурасиге и Скуга – к мезотрофному или олиготрофному водоему. Это позволяет с их помощью моделировать развитие популяции в водоемах с различной трофностью.

Таким образом, вольфия бескорневая, как и некоторые другие виды рясок, лучше развивается на обогащенных средах с относительно высоким содержанием нитратного азота и средним значением соотношения азот/фосфор (в нашем случае в Сырая биомасса, г Увеличение сырой биомассы,% пределах от 15 до 24). Это хорошо согласуется с данными литературы о том, что рясковые являются индикаторами мезо- и эвтрофных водоемов (Биологический контроль.., 2010). При культивировании на оптимальной среде популяция вольфии сохраняет высокую скорость прироста биомассы в течение нескольких недель. При этом на среде с невысоким содержанием минеральных веществ (водопроводная вода) темпы прироста снижаются к 12-м сут культивирования (см. рис.1 б).

Развитие популяции вольфии на оптимизированной минеральной среде (1/В-5) в течение 7 сут характеризуется высокой скоростью увеличения биомассы (в 3,раза) при пропорциональном накоплении сухого и сырого вещества, с небольшим изменением абсолютного и относительного содержания белков и углеводов.

Аминокислотный состав белков W. arrhiza характеризуется высоким содержанием основных аминокислот (АК) – лизина и аргинина, алифатических – серина, аланина, лейцина и изолейцина, а также аспарагиновой и глутаминовой кислот и их амидов. Культивирование растений на средах разного состава, соответствующих разным уровням трофности водоема, приводит к изменению общего количества и соотношения связанных АК. Так, выращивание вольфии на 1/среды Хатнера с увеличенным содержанием доли аммонийного азота и низким значением соотношения N/P сопровождается увеличением количества АК белков на 16%, а на водопроводной воде – более чем в два раза, что свидетельствует об интенсификации биосинтеза белков. Вероятно, рост на обедненных средах или средах с неоптимальным соотношением различных форм азота и отношением N/P способствует переходу вольфии преимущественно на автотрофный тип питания. Это может приводить к дополнительной индукции биосинтеза белков, в том числе ферментов, обеспечивающих образование хлорофилла и других пигментов, функционирование и репарацию компонентов электрон-транспортных цепей и т.п. В конечном итоге это приводит к изменению спектра связанных аминокислот.

Пул свободных аминокислот вольфии представлен в основном кислыми и алифатическими аминокислотами – аспарагиновой, глутаминовой, серином, аланином, и в меньших количествах – глицином и аргинином. Культивирование на среде Хатнера и водопроводной воде привело к увеличению содержания свободных АК в среднем на 20%.

В условиях ограниченного минерального питания развитие экспериментальной популяции вольфии бескорневой характеризуется снижением скорости роста биомассы, однако сопровождается увеличением как абсолютного, так и относительного содержания углеводов (рис. 2 а, б). Содержание углеводов в растениях при росте на дистиллированной воде увеличивается почти в три раза по сравнению с культивированием на среде В-5; эта же тенденция наблюдается при росте на водопроводной воде (см. рис. 2 б), что может являться следствием перехода вольфии преимущественно на автотрофный тип питания и активизации углеводного обмена. Накопление углеводов приводит к образованию покоящихся форм – турионов, которые формируются на поздних фазах развития популяции на всех использованных средах. Покоящаяся форма, полученная в процессе культивирования, четко отличается от активно растущей, делящейся культуры, плавающей на поверхности среды. Турионы имеют сферическую форму, меньшие размеры, а также значительно отличаются по содержанию углеводов. Оно составляет 5–10 % от сырой биомассы, тогда как растения в активно растущей и развивающейся популяции содержат 1% углеводов. Это соответствует литературным данным о том, что для ряда представителей семейства основной причиной образования покоящихся форм служит а б 30 0 2 4 6 8 10 12 14 Время культивирования, сут.

дистиллированная 1/10 среды Гамборга Водопроводная вода вода В5 1/5 среды Гамборга В-Рис. 2. Содержание углеводов в растениях вольфии при разной обеспеченности элементами минерального питания: а) общее содержание углеводов на 7 сутки культивирования; б) динамика содержания углеводов в процессе культивирования индукция биосинтеза и накопления крахмала (Reimann et al., 2002). Перенесение турионов на полнокомпонентную среду В-5 приводит к снижению содержания углеводов до 1% от сырой биомассы и восстановлению активной популяции.

Субкультивирование турионов на среде с ограниченным содержанием минеральных элементов (водопроводная вода) приводит к формированию двух субпопуляций:

«планктонной» с содержанием углеводов около 5% и «бентосной» с содержанием углеводов около 10%. Таким образом, условия среды могут определять направление развития пережидающей формы вольфии: «дозревание» - синтез и накопление запасных биополимеров или переход к активному росту и размножению.

Для определения параметров адаптации экспериментальной популяции вольфии бескорневой к ограничению элементов минерального питания в качестве среды культивирования использовали дистиллированную воду (рН 7,0). В первые трое сут после интродукции растений наблюдается увеличение сырой биомассы на 16% от исходного, а сухой массы на 20%. На этот же период приходится и значительная активизация белкового синтеза, определяемого по содержанию общего белка, которое увеличивается в 2,6 раза. Такое, на первый взгляд, аномальное поведение можно объяснить возможной активизацией использования запасных полисахаридов и других веществ, которые расходуются для подготовки покоящейся формы. За время культивирования не было выявлено достоверного изменения содержания хлорофилла и каротиноидов, что свидетельствует о высокой стабильности фотосинтетического аппарата у исследуемого растения.

На 6–7 сут культивирования на дистиллированной воде отмечается стабилизация основных физиологических параметров (морфология, размеры, скорость роста), что свидетельствует об окончании периода адаптации, который для данных условий выращивания совпадает со средним временем двух генераций почек. В течение этого времени растения вольфии, перенесенные в условия минерального голодания, использовали запасы питательных веществ, накопленные в процессе роста на минеральной среде до пересадки. По мере исчерпания этих запасов в растениях происходит перестройка метаболизма для поддержания жизнедеятельности в Сод ерж ание у гл ев од ов, % Содержание углеводов, мг / г сырой биомассы соответствии с уровнем экзогенных источников питания. Увеличение фактора формы в этот период свидетельствует о приобретении растениями "нормальной" эллиптической формы и переходе популяции к стабильному развитию. Общий прирост сырой биомассы за весь период адаптации к условиям минерального голодания составил 30%, при этом сухая биомасса увеличилась на 65%, а содержание белка – в 2,6 раза, что свидетельствует о ее способности к росту в дистрофных условиях.

ГЛАВА 4. УСТОЙЧИВОСТЬ ВОЛЬФИИ БЕСКОРНЕВОЙ К ВОЗДЕЙСТВИЮ КСЕНОБИОТИКОВ РАЗЛИЧНОЙ ПРИРОДЫ При исследовании резистентности вольфии к солям ТМ (Cu2+, Pb2+, Cd2+, Ag+, Mn2+, Hg+), в 10 раз и более превышающих предельно допустимые, было выявлено, что наибольшим токсичным эффектом обладают ионы меди (II), хотя ряд авторов относят их ко второй группе по степени токсичности, в сравнении с ионами кадмия и свинца (Келина, Безручко, 2006; Пастухова, 2008). В нашем случае даже самая низкая из исследованных концентраций CuSO4 (0,06 мМ) приводит к заметному снижению выживаемости популяции (рис. 3). В то же время ионы Cd2+ даже в концентрации 2+ 2+ Pb Cu 2+ Cd 6300 1500 12142312150 10 1 5 7 9 1 5 7 9 1 5 7 9 Время, сут.

Время, сут. Время, сут.

10 мМ 1 мМ 0,25 мМ 0,13 мМ 10 мМ 0,25 мМ 0,13 мМ 0,06 мМ 10 мМ 0,25 мМ 0,13 мМ 0,06 мМ Рис. 3. Динамика численности популяции вольфии при действии различных концентраций ионов металлов 0,25 мМ не вызывают ее гибели, а при концентрации 0,13 мМ скорость вегетативного размножения уравновешивает гибель растений. При более низких концентрациях кадмия (0,06 мМ) популяция адаптируется, при этом численность растений за время эксперимента (12 сут.) увеличивается в 2,5 раза. Аналогичная картина наблюдается также после внесения солей свинца: в присутствии в среде культивирования ионов Pb2+ в концентрации 0,25 мМ число растений увеличивается более чем в 2,5 раза от первоначального, а в концентрации 0,13 мМ – в 5 раз. По данным литературы, соли кадмия и свинца являются более токсичными для других высших растений по сравнению с солями меди (Нчапи, 2008). Выявлены и другие различия в реакции вольфии на присутствие ТМ в среде выращивания. Так, при культивировании на среде с ионами Mn2+ и Ag+, наблюдается изменение цвета культуры – побурение поверхности материнских растений. Молодые почки при этом остаются яркозелеными. Это может определяться либо различной чувствительностью вегетативных и меристематических тканей растений к химическим агентам, либо аккумуляцией и, возможно, последующей детоксикацией ионов металлов различными тканями.

Учитывая, что в различных отраслях сельского хозяйства широкое применение находят антимикробные препараты различного спектра действия, представляло интерес исследование резистентности вольфии бескорневой к действию Кол во растений,% антибиотиков. Выбор препаратов был обусловлен особенностями их происхождения (синтетические или природные) и механизмов воздействия на клетки бактерий, а в выборе концентраций отталкивались от рекомендованных для лечения заболевания рыб. Изучение антибиотикоустойчивости вольфии показывает, что резистентность растений возрастает в следующем порядке: ампициллин канамицин левомицетин стрептомицин амфотерицин рифампицин в одинаковых концентрациях. При этом показано, что динамика основных параметров роста и развития популяции изменяется в зависимости от действующей концентрации внесенных антибиотиков и, возможно, определяется способностью растений к деградации исследуемого вещества (рис. 4).

а б 12121150 0 5 7 9 12 19 0 5 7 9 12 19 Время, сут.

Время, сут.

0,25 мг/мл 0,063 мг/мл 1,0 мг/мл 0,25 мг/мл 0,031 мг/мл 0,008 мг/мл 0,031 мг/мл 0,008 мг/мл в г 11110 5 7 9 12 19 0 5 7 9 12 19 Время, сут.

Время, сут.

1,0 мг/мл 0,25 мг/мл 0,063 мг/мл 0,125 мг/мл 0,031 мг/мл 0,031 мг/мл 0,008 мг/мл 0,016 мг/мл 0,008 мг/мл Рис. 4. Динамика численности популяции вольфии при действии антибиотиков:

а – амфотерицин; б – рифампицин, в – канамицин; г – ампициллин Поскольку адсорбция на поверхности является одним из механизмов, обеспечивающих устойчивость растений к действию поллютантов, исследовали особенности распределения защитной кутикулы на поверхности вольфии. В результате окраски пектиновых полисахаридов, находящихся преимущественно под защитной кутикулой, удалось показать, что ее морфология, а, возможно, и состав, имеет гетерогенный характер и различается на отдельных участках поверхности (рис. 5). Причем количество и состав кутикулы может отражать функциональную дифференцировку клеток поверхности растений. Так, после обработки 40% этанолом наиболее интенсивно окрашивались зоны, функционально связанные с активными биосинтетическими процессами – дорзальная фотосинтетическая пластина и пролиферативная зона вегетативной почки. Таким образом, можно предположить, что эти участки подвержены действию внешних агентов в наибольшей степени вследствие их большей доступности, поскольку специфические защитные модификации структуры клеточных стенок затрагивают их в меньшей степени.

Кол во растений, % Кол во растений, % Именно этим мы объясняем наличие дифференцированного ответа на действие поллютантов у материнских и дочерних растений (почек).

Рис. 5. Распределение зон окрашивания рутениевым красным на поверхности растений вольфии бескорневой:

а – окрашивание участков с механическим повреждением поверхности растения;

б – окрашивание растения с полностью удаленной кутикулой (обработка ацетоном);

в, г – окрашивание дорзальной фотосинтезирующей пластинки (обработка 40% этанолом);

д, е – окрашивание меристематической зоны, связанной с формированием дочерней вегетативной почки Одним из результатов большей доступности меристематических клеток вольфии может являться формирование при действии поллютантов фенотипически измененных растений в результате сомаклональной изменчивости, которую в проведенных экспериментах индуцировали синтетическим гербицидом 2,4-D – соединениями 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты – (в диапазоне концентраций 20 – 100 мкМ) и регулятором клеточного деления – колхицином (0,01 – 0,5%). При анализе морфологической вариабельности культуры было показано, что в среднем до 20% растений в экспериментальной популяции проявляют фенотипическую изменчивость.

Среди наблюдаемых вариаций можно выделить три основных типа, которые представлены на рис. 6. Первый тип проявляется в изменении средних размеров растений вольфии. Были получены макро- и микроформы, размеры которых были соответственно в два раза больше и в полтора раза меньше размеров исходных растений. Стабильность макро- и микроформ в процессе длительного культивирования существенно отличалась, что позволяет предполагать участие разных механизмов в их образовании. Микроформы реверсировали в процессе нескольких пассажей, тогда как увеличенные размеры растений (макроформа) сохранялись в течение многих поколений без изменения способности растений к миксотрофному (фотогетеротрофному) типу питания. Кроме того, эти растения а б в г Рис. 6. Сомаклональная изменчивость W. arrhiza:

а – сомаклоны с измененными размерами (слева – макроформа, справа – исходный фенотип);

б – сомаклоны с измененным синтезом клеточных стенок (неразделившиеся формы);

в, г – сомаклоны, дефектные по синтезу пигментов отличались и тканевой морфологией: у них четко выделена "верхняя пластинка" – зона, где сконцентрированы фотосинтезирующие клетки, и слабоокрашенная, сильно вакуолизированная вентральная зона. Второй тип сомаклонов характеризуется образованием конгломератов неразделившихся растений. Данный тип сохранялся при многократных пассажах, и зачастую сопровождался изменением формы отдельных растений в агрегатах: появлялись удлиненные формы, а также наблюдались "размытые", нечеткие границы отдельных растений, входящих в конгломерат.

Вероятно, в этом случае могли быть затронуты механизмы биосинтеза полимеров клеточных стенок либо регуляции экспрессии гликолитических ферментов, определяющих собственно разделение «материнских» и «дочерних» растений.

Третий тип изменений затрагивает механизм биосинтеза пигментного аппарата и проявляется в уменьшении содержания хлорофилла и формировании желтых и белых форм растений. При изменении условий культивирования – пересадке на свежую среду – у части таких клонов растений наблюдалась частичная спонтанная реверсия до слабоокрашенных форм, но она была временной и исчезала в процессе роста культуры. Эти изменения также не затрагивают способности вольфии к вегетативному размножению и гетеротрофному питанию.

Для полученной макроформы вольфии исследовали зависимость развития от обеспеченности элементами минерального питания в сравнении с исходным фенотипом (рис. 7). На ранних этапах развития общая численность обеих популяций увеличивается примерно с равной скоростью. Однако по мере истощения питательной среды скорость деления макроформы начинает замедляться и после трех недель культивирования уступает исходному фенотипу. В условиях минимального б а 55441/5 среды 1/5 среды В-3В-31/среды В1/22среды В-100 10 2 7 9 14 16 21 28 0 2 7 9 14 16 21 28 Время, сут. Время, сут.

Рис. 7. Кривые роста экспериментальной популяции W. arrhiza при разной обеспеченности элементами минерального питания: а – исходный фенотип; б – макроформа минерального питания (на 1/50 среды В-5) дольше развивается исходная форма. При этом все растения мутантной формы погибли к 35-му дню культивирования.

Таким образом, исходная культура лучше приспособлена к росту на среде с малым количеством питательных веществ по сравнению с макроформой, тогда как растения макроформы характеризуются повышенной потребностью в минеральном питании. Данные характеристики позволяют рассматривать макрокультуру вольфии бескорневой как перспективный биотехнологический объект, в том числе для разработки технологий фиторемедиации водоемов. Высокая скорость размножения при быстром накоплении биомассы в богатых минеральными и органическими веществами эвтрофных водоемах будет способствовать быстрой утилизации нетоксичных загрязнителей.

Образование растениями вольфии нескольких вариантов стабильных фенотипов под действием ксенобиотиков можно рассматривать как проявление универсального механизма адаптации популяции водных растений к действию ксенобиотиков, приводящего к более полному проявлению адаптивной стратегии или ее смене (Жуйкова, Безель, 2009).

ГЛАВА 5. ИССЛЕДОВАНИЕ ДИНАМИКИ рН СРЕДЫ В ПРОЦЕССЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВОЛЬФИИ В процессе адаптации и роста вольфии бескорневой была выявлена нелинейная динамика рН среды (рис. 8). На первом этапе после интродукции в культуральную среду растений вольфии бескорневой происходит резкое закисление среды до значений, равных 3,4–4,0. Длительность этого процесса составляет в среднем 12–18 ч. Характер изменения рН среды на этом этапе не зависит от фотопериода, однако скорость закисления увеличивается в условиях освещения. На втором этапе рН среды повышается, достигая к окончанию периода адаптации экстремальных значений 10,5–10,9 (см. рис. 8 а). При этом выявляются светозависимые ритмы изменения кислотности среды с амплитудой около 2 ед. рН, возможно, связанные с обменом метаболитами и ионами между растениями и окружающей средой. Фотоиндуцируемое подщелачивание среды обратимо в темноте и, вероятно, коррелирует с фотосинтетическими процессами. Характер изменения в значительной степени зависит от концентрации минеральных веществ в среде, а именно: в среде с более высокой концентрацией минерального питания, несмотря на Количество растений Количество растений рН рН б а 1 2 3 4 5 6 0 2 4 6 8 Водопроводная вода Время, сут.

Время культивирования, сут.

1/10 среды Гамборга В-1/5 среды Хатнера Рис. 8. Динамика изменения рН среды в процессе культивирования растений вольфии бескорневой на 1/5 среды Гамборга В-5 (а) и на разных средах (б) ее высокую буферную емкость, наблюдается более сильное закисление на ранних стадиях адаптации растений. Показано, что изменение в среде культивирования количества минеральных компонентов и/или их соотношения, приводящее к снижению продуктивности экспериментальной популяции (см. рис. 1), сопровождается уменьшением диапазона значений рН (см. рис. 8 б).

Одним из возможных объяснений закисления среды на ранних этапах развития популяции может быть активный ионный обмен растений со средой в процессе минерального питания за счет экспорта контрионов. В ряде работ (Максимов и др., 1979; Егорова, Воробьев, 1989) причину закисления опытного раствора с корневой системой наземных растений (пшеницы, кукурузы) связывают с активацией работы Н+-транспортных АТФаз одновалентными катионами (К+, NH4+, Na+).

Защелачивание может быть связано с формой азотного питания. Культуральная среда Гамборга содержит азот в нитратной и аммонийной форме. При поглощении растениями преимущественно нитратной формы может происходить подщелачивание среды за счет ионов аммония, также этот эффект может быть связан с экспортом ионов аммония из растений (в результате активации нитратредуктазы и экспорта излишков ионов аммония во внешнюю среду, а также образование аммония в процессе фотодыхания).

Добавление в среду культивирования минеральных ксенобиотиков (люминофоров на основе силиката цинка, активированных атомами редкоземельных элементов) приводит к снижению диапазона изменения рН среды. Этот процесс сопровождается снижением прироста сырой и сухой биомассы, снижением содержания хлорофиллов a и b, однако содержание белка и углеводов в растениях не уменьшается, а в ряде случаев даже несколько возрастает, что свидетельствует о подготовке популяции к началу формирования турионов. Полученные данные в совокупности позволяют говорить о том, что растения вольфии способны к активному ионному взаимодействию с окружающей средой (эффект кондиционирования) и это может служить важным элективным фактором при формировании гидроценозов.

ГЛАВА 6. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ВОЛЬФИИ БЕСКОРНЕВОЙ С МИКРООРГАНИЗМАМИ ПРИ СОВМЕСТНОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ Для исследования возможности повышения эффективности биотехнологического потенциала вольфии бескорневой путем совместного культивирования с микроорганизмами в качестве тестовых культур были выбраны бактерии A. brasilense Sp245, A. tumefaciens В1219 и P. fluorescens В1471, которые обеспечивают различные типы взаимодействия с растениями, причем механизмы, опосредующие эти взаимодействия достаточно хорошо изучены. В работе использовали аксеничную культуру растений вольфии бескорневой, полученную разработанным нами способом. Было показано, что невысокие концентрации всех исследованных микроорганизмов, и даже фитопатогенных, не приводят к гибели растений, а при совместном культивировании с азоспириллой был выявлен наиболее значительный прирост биомассы вольфии. Сравнительный анализ экстрактов вольфии (рис. 10 а) при совместном культивировании с микроорганизмами (на 1/среды В-5) выявил появление нового пептида 15 кДа. Следует отметить, что при культивировании с бактериями также наблюдается изменение состава внеклеточных белков вольфии.

При этом было отмечено выраженное воздействие растений вольфии на рост исследованных культур микроорганизмов. Для азоспирилл и агробактерий показана заметная стимуляция развития в присутствии растений, тогда как рост псевдомонад примерно в той же степени ингибируется, причем данный эффект в значительной мере зависит от состава среды, в которой происходит взаимодействие. Вероятно, состав среды выращивания, определяя изменения в метаболизме вольфии, влияет на экскрецию вторичных метаболитов, что, в свою очередь, сказывается на характере взаимодействия растений и бактерий. Наибольшие изменения происходят, как правило, на средах, разработанных для выращивания растений: на 1/10 среды В-5 в присутствии и отсутствии сахарозы рост азоспирилл на третьи сутки усиливается в 2,4 и 5,5 раз соответственно, а псевдомонад – столь же резко уменьшается. При этом на средах LB и Доберейнер (более подходящих для бактерий) этот эффект был гораздо менее выражен. Причина этого явления, возможно, заключается в том, что эти богатые среды стимулируют интенсивное развитие бактериальных культур, которые в высоких концентрациях замедляют рост растений.

Вместе с тем были выявлены изменения в спектрах экстраклеточных полипептидов бактерий. Наиболее ярко это выражено при совместном культивировании вольфии с псевдомонадами (см. рис. 10 б), где наблюдается значительное увеличение общего содержания экстраклеточных полипептидов, а в ряде случаев (например, на средах Доберейнер и LB) отмечены и качественные отличия. Значительное влияние растения вольфии оказывают на экстраклеточные белки азоспирилл (см. рис. 10 г). Присутствие растений приводит к изменению пептидных спектров в той или иной мере на всех типах сред. Важно отметить, что при использовании сахарозы в качестве источника углерода происходит обеднение пептидного спектра при совместном культивировании с вольфией у азоспирилл и псевдомонад. Вместе с тем, для агробактерий количественный и качественный спектр белков для агробактерий количественный и качественный спектр белков больше зависит от минерального состава среды (см. рис. 10 в). Так, выращивание агробактерий на среде Гамборга (независимо от присутствия сахарозы) вызывает а б К В1219 В1471 Sp245 М – + – + – + – + W. arrhiza LB Д В-5С В-5 М P. fluorescens В14 в г + – – + – + + – + – + – + – + Д В-5С В-5 LB В-5С М В-5 В-5С Д L М A. tumefaciens В1219 A. brasilensе Sp2Рис. 10. Изменение спектров внутриклеточных полипептидов вольфии и экстраклеточных полипептидов микроорганизмов при культивировании на разных средах в присутствии W. arrhiza (+) и без растений (-):

В-5 – 1/10 среды В-5; К – контроль;

В-5С – 1/10 среды В-5+ 1% сахарозы;

В1219 – в присутствии A. tumefaciens В1219;

Д – среда Доберейнер;

В1471 – в присутствии P. fluorescens В1471;

LB – среда LB;

Sp245 – в присутствии A. brasilensе Sp2М – маркеры молекулярных масс;

появление дополнительной мажорной полосы в высокомолекулярной области как в присутствии, так и в отсутствии растений. В данном случае совместное культивирование с вольфией не оказывает заметного действия на экскрецию бактериальных белков.

Таким образом, совместное культивирование вольфии и исследованных микроорганизмов приводит к индукции биосинтеза нового пептида в растениях.

Изменение общего содержания экстраклеточных полипептидов и их спектра у микроорганизмов при совместном культивировании с растениями вольфии во многом определяется составом культуральной среды. Обобщая полученные данные, можно сказать, что вольфия бескорневая является перспективным объектом для создания ассоциаций, эффективных для биоремедиации водоемов.

ВЫВОДЫ 1. При культивировании на минеральной среде, близкой по составу к мезо- и эвтрофным водоемам, экспериментальная популяция вольфии бескорневой (Wolffia arrhiza (L.)) обладает высокой продуктивностью, составляющей 7,16±0,02 мг/см2/сут.

Период адаптации к изменению трофности составляет в среднем семь суток.

Относительное увеличение сырой биомассы в условиях минерального голодания достигает 30% от исходной массы инокулята.

2. Установлен спектр резистентности вольфии бескорневой к солям тяжелых металлов и антибиотикам, среди которых максимальное ингибирующее действие оказывают медь и ампициллин. Обнаружено наличие дифференцированного ответа на действие поллютантов у материнских и дочерних растений.

3. Ксенобиотики 2,4-D и колхицин индуцируют сомаклональную изменчивость вольфии, что приводит к образованию фенотипически измененных форм у 20% растений. Формирование стабильных сомаклонов, как проявление адаптационного механизма, обеспечивает выживаемость экспериментальной популяции в условиях загрязнения.

4. Рост экспериментальной популяции вольфии приводит к нелинейному изменению рН среды культивирования в результате ее кондиционирования растениями. Выявлены 2 фазы: уменьшение рН от исходного нейтрального значения до 3,7±0,3 и последующее увеличение до 10,5±0,4. Искусственная стабилизация рН приводит к ингибированию роста популяции.

5. Совместное культивирование вольфии бескорневой с микроорганизмами стимулирует рост культур Azospirillum brasilense и Agrobacterium tumefaciens и ингибирует развитие Pseudomonas fluorescens. Эти процессы сопровождаются количественными и качественными изменениями спектров экстраклеточных пептидов у A. brasilense Sp245 и P. fluorescens B1471. Присутствие бактерий индуцирует у растений биосинтез нового полипептида с молекулярной массой 15 кД.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ *- публикации в печатных изданиях, рекомендованных Перечнем ВАК РФ 1. Галицкая А.А., Киселева Н.А., Шкодина О.Г., Селиванов Н.Ю., Игнатов В.В.

Динамика физиолого-биохимических параметров культуры Wolffia arrhiza при адаптации к условиям среды // Материалы Всероссийской конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты функционирования водных экосистем». – Саратов, 2001. – С. 24-26.

2. Шкодина О.Г., Селиванов Н.Ю., Галицкая А.А., Киселева Н.А., Гончарова О.В., Игнатов В.В. Исследование устойчивости растений Wolffia arrhiza к ионам тяжелых металлов и антибиотикам // Материалы Всероссийской конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты функционирования водных экосистем». – Саратов, 2001. – С. 194-197.

3. Гончарова О.В., Киселева Н.А., Селиванов Н.Ю., Шкодина О.Г., Галицкая А.А., Игнатов В.В. Использование RGB анализа изображений для характеристики физиологического состояния растений Wolffia arrhiza // Материалы Всероссийской конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты функционирования водных экосистем». – Саратов, 2001. – С. 28 – 31.

4. Galitskaya A.A., Shkodina O.G., Selivanov N.Yu., Ignatov V.V. Interaction of plants of Wolffia arrhiza with microorganisms during cocultivation // International Symposium “Biochemical Interactions of Microorganisms and Plants with Technogenic Environmental Pollutants”. Abstract Book. – Saratov, 2003. – P. 5. Галицкая А.А., Селиванов Н.Ю., Шкодина О.Г., Неробеева Е.В., Илюхова О.В., Игнатов В.В. Исследование биохимических факторов развития популяции растений Wolffia arrhiza // Материалы Всероссийской конференции «Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты». – Саратов, 2005. – С. 34 – 36.

6. Фадеева И.Ю., Неробеева Е.В., Илюхова О.В., Галицкая А.А., Селиванов Н.Ю., Евсеева Н.В., Щеголев С.Ю. Исследование иммунохимической гомологии цитоплазматических белков меристем однодольных растений // Материалы Всероссийской конференции «Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты». – Саратов, 2005. – С. 51 – 52.

7. Илюхова О.В., Галицкая А.А, Селиванов Н.Ю, Игнатов В.В. Динамика рН среды как параметр биосинтетической активности популяции растений Wolffia arrhiza // Материалы международной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды». – Саратов, 2005. – С. 130 – 131.

8. Илюхова О.В., Галицкая А.А, Селиванов Н.Ю, Игнатов В.В. Рост и биосинтетическая активность культуры вольфии бескорневой в присутствии силикатов цинка // Материалы международной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды».– Саратов, 2005. – С. 131 – 132.

9. Илюхова О.В., Галицкая А.А., Селиванов Н.Ю., Игнатов В.В. Влияние условий культивирования на интенсивность ростовых и биосинтетических процессов в популяции водных растений Wolffia arrhiza (Lemnaceae) // Материалы III межрегиональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой».– Саратов, 2006. – С. 47.

10. Илюхова О.В., Галицкая А.А., Селиванов Н.Ю., Игнатов В.В. Исследование динамики рН как параметра, отражающего взаимодействие популяции растений Wolffia arrhiza со средой обитания // Материалы III межрегиональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой».– Саратов, 2006. – С. 48.

11. Патент RU 2 390 121 С1 МПК A01G 7/00 Способ получения аксеничной культуры высших водных растений / Селиванов Н.Ю., Селиванова О.Г., Галицкая А.А., Игнатов В.В. – 5 с. Опубликовано 27.05.2010. Бюлл. №15.

12. Селиванов Н.Ю., Селиванова О.Г., Галицкая А.А., Соколов О.И. Локализация пектинов в тканях растений вольфии бескорневой // Тез. 7-го съезда Общества физиологов растений России «Физиология растений – фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» и международной научной щколы «Инновации в биологии для развития биоиндустрии сельскохозяйственной продукции». – Нижний Новгород, 2011 – С. 619-620.

13.*Галицкая А.А., Соколов О.И., Селиванова О.Г., Селиванов Н.Ю.

Сомаклональная изменчивость при адаптации растений Wolffia arrhiza (L.) к воздействию синтетического гербицида 2,4–D // Современные проблемы науки и образования. – 2012. – № 1; URL: www.science-education.ru/101-5531 (дата обращения:

24.02.2012).

14.*Галицкая А.А., Селиванов Н.Ю., Селиванова О.Г., Соколов О.И. Исследование адаптации Wolffia arrhiza (Linnaeus, 1771) Horkel ex Wimmer к различным минеральным и биогенным поллютантам на примере тяжелых металлов и антибиотиков // Известия Саратовского университета. Серия Химия. Биология.

Экология. – 2012. – Т. 12. – Вып. 1. – С. 36 – 41.







© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.