WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

Иккерт Ольга Павловна

ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ СУЛЬФИДОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ В ОБРАЗОВАНИИ СУЛЬФИДОВ МЕДИ И ЖЕЛЕЗА

 

03.02.08 – Экология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Улан-Удэ - 2012

Работа выполнена в Томском государственном университете на кафедре физиологии растений и биотехнологии

Научный руководитель:

доктор биологических наук,

профессор

Карначук Ольга Викторовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор

Намсараев Баир Бадмабазарович

доктор биологических наук,

зав.  лабораторией  биотехнологии

Терещенко Наталья Николаевна

Ведущая организация:

Институт микробиологии

им. С.Н. Виноградского РАН

Защита диссертации состоится «24» декабря 2012 г., в 10:00 часов на заседании Диссертационного совета Д.212.022.03 при ФГБОУ ВПО «Бурятский государственный университет» по адресу: 670000,  г. Улан-Удэ, ул. Смолина, 24а, конференц-зал. Факс: (3012) 210588, e-mail: d21202203@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования  «Бурятский государственный университет» и на сайте www.bsu.ru

Автореферат разослан «19» ноября 2012 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета,

кандидат биологических наук Н.А. Шорноева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Загрязнение тяжелыми металлами различных экосистем представляет одну из наиболее серьезных экологических проблем современного общества. В производственных циклах добывающих и выплавляющих металлы предприятий образуются большие количества отходов и стоков, содержащих высокие концентрации растворенных тяжелых металлов или/и сульфата. Примерами таких отходов являются кислые шахтные дренажи (КШД) (Johnson, Hallberg, 2003), сточные воды предприятий по обогащению металлических руд (Barnes et.al., 1991), сточные воды кожевенных заводов (Shin et.al.,1997), фильтраты гипсовых отвалов (Deswaef et.al., 1996). Наиболее распространенные загрязнители в этих экосистемах -Cu, Zn, Cd, As, Ni, и Fe. Их концентрация варьирует от 10-6 до 102 г/л (Huisman, 2006). В частности, среднее количество меди, поступающее в почвы составляет 35 кг/км2 в год. По оценкам 19300 км рек и примерно 72000 Га озер и резервуаров в мире нанесен серьезный ущерб КШД (Johnson, 2005). Сходную проблему представляет шлак от металлургических предприятий, который размещается в хвостохранилищах и на свалках и содержит высокие концентрации (потенциально ценных) тяжелых металлов.

Сульфидогенные микроорганизмы обладают способностью связывать металлы в нерастворимые сульфиды и являются основными агентами, обеспечивающими естественную очистку природных и техногенных экосистем. Образующие сероводород организмы могут быть использованы в биотехнологиях очистки от металлов сточных вод и отходов горнодобывающей и металлообрабатывающей промышленности. Существует два основных пути образования H2S прокариотами – диссимиляционное и ассимиляционное восстановление сульфата. В процессе диссимиляционной сульфатредукции электроны от органических соединений/водорода переносятся на конечный акцептор – сульфат. Этот процесс приводит к запасанию энергии клетками сульфидогенных микроорганизмов, в том числе и сульфатредуцирующих прокариот (СРП), и образованию значительных количеств H2S. В процессе ассимиляционной сульфатредукции SO4 восстанавливается сульфидогенными бактериями в биосинтетических путях образования серосодержащих аминокислот. Впоследствии сбраживание органических соединений приводит к высвобождению восстановленной серы в форме сероводорода сульфидогенными бактериями (СГБ).

Несмотря на то, что процессы образования сульфидов металлов в природных и техногенных экосистемах вызывают пристальное внимание исследователей, их минералогический и химический состав химический состав остается малоисследованным. Основное внимание до сих пор было направлено на изучение образования диагенетического сульфида железа, пирита, в осадках Мирового океана. Образование сульфидов металлов отличных от железа остается малоизученным. Отчасти причиной этому является невозможность проведения экспериментов с чистыми культурами сульфидогенов из-за токсичности ионов тяжелых металлов (Ehrlich, 2003). Выделение чистых культур сульфидогенов устойчивых к ионам меди (Karnachuk et al., 2003; Карначук, 2006; Герасимчук и др., 2009) позволило провести в нашем исследовании изучение сульфидов Cu и Fe на новых модельных организмах.

Другой экосистемой, где образование сульфидов может иметь большое значение является кишечник человека и животных. Ранние исследования рассматривают образование H2S СРП с позиций цитотоксического действия на клетки организма человека (Macfarlane et al., 2007). До сих пор в научной литературе не обсуждалось возможное связывание металлов в сульфиды и переведение их в бионедоступную форму под действием биогенного сероводорода.

Таким образом, изучение образования сульфидов Cu и Fe сульфидогенными микроорганизмами имеет большое значение для понимания процессов самоочищения в природных экосистемах, важно для совершенствования биогеотехнологий и имеет приложение к пониманию функционирования микробиома человека.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в изучении образования биогенных сульфидов меди и железа в природных экосистемах, а также в накопительных и чистых культурах устойчивых к металлам СРП и СГБ, выделенных из различных экосистем. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

  1. Определить скорости образования восстановленных форм серы, включая кристаллические сульфиды Cu и Fe, в экспериментах по восстановлению 35SO2-4 в отходах добычи сульфидных руд.
  2. Изучить биоразнообразие, определить распространение доминирующих филотипов Bacteria в отходах добычи сульфидных руд и исследовать влияние физико-химических факторов, связанных с добычей металлов, на распространение микроорганизмов.
  3. Изучить физико-химический и минералогический состав сульфидов Cu и Fe, образующихся в накопительных культурах СГБ полученных из различных экосистем, в том числе из желудочно-кишечного тракта человека.
  4. Изучить физико-химический и минералогический состав сульфидов меди и железа, образующихся в чистых культурах СГБ, принадлежащих к различным филогенетическим группам и осуществляющих диссимиляционную/ассимиляционную сульфатредукцию.
  5. Оценить роль сульфидогенных бактерий в образовании сульфидов меди и железа.

Научная новизна работы. Впервые показано образование кристаллического сульфида меди, халькопирита (CuFeS2), чистыми культурами сульфатредуцирующих бактерий. Впервые детально изучено образование сульфидов меди представителями филума Firmicutes, включая диссимиляционных сульфатредукторов, Desulfosporosinus spp. и сульфидогенных бактерий, образующих H2S при разложении органических субстратов. Образование кристаллических фосфатов железа (вивианита) до настоящего времени не было известно для представителей из микробиома человека.

Впервые проведен подробный анализ элементного состава и минералогии осадков, образуемых чистыми культурами сульфидогенных бактерий, устойчивых к ионам меди и культивируемых в биопленках и биореакторе в условиях непрерывного культивирования. Исследование сопровождалось контролем образования частиц осадка с помощью трансмиссионной электронной микроскопии.

Личный вклад соискателя. Автор осуществлял отбор проб хвостохранилищ добычи золота в Кемеровской области и определял скорости сульфатредукции. Выращивание чистых культур сульфидогенных бактерий в периодической и непрерывной культуре с ионами металлов автором проводилось самостоятельно. Изучение химического и минерального состава осадков хвостохранилищ и осадков, образованных СРП и СГП проводилось совместно с сотрудниками Центра коллективного пользования ТГУ. Изучение разнообразия микроорганизмов с помощью ДГГЭ-анализа проводилось совместно со студентами учебно-научной лаборатории биотехнологии и биоинженерии ТГУ. Формулирование целей, задач и обсуждение полученных результатов проводилось совместно с научным руководителем.

Практическая значимость работы. Показано, что процессы образования устойчивых к окислению кристаллических сульфидов Cu и Fe за счет активности СРП протекают в кислых и окисленных осадках хвостохранилищ добычи золота. Процессы микробной сульфатредукции могут представлять один из основных механизмов самоочистки этих экосистем. Данные по влиянию условий культивирования на соотношение химического и минералогического состава сульфидов Cu и Fe могут быть использованы при разработке биогеотехнологических процессов очистки стоков, загрязненных металлами. Запатентован процесс получения чистого ковеллита из стоков, содержащих ионы металлов с использованием устойчивого к Cu Desulfovibrio sp. А2.

Апробация работы. Материалы исследований по теме диссертации были представлены на V молодежной школе-конференции c международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 26-27 октября 2009); III Международной конференции по экологической, промышленной и прикладной микробиологии «BioMicroWorld 2009» (Лиссабон, Португалия, 2-4 декабря 2009); 8 Международном конгрессе «Extermophiles» (Понта Дельгада, Азоры, Португалия, 12-16 сентября 2010); VI молодежной школе-конференции c международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 25-27 октября 2010); 7 Международном совещании по меди «Copper in Biology» (Алгьеро, Сардиния, Италия, 16-20 октября 2010); Международной конференции «Экология и геохимическая деятельность микроорганизмов экстремальных местообитаний» (Улан-Удэ – Улаанбаатар, 5-16 сентября 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 23 печатные работы, включая 4 публикаций в изданиях, рекомендованных ВАК, 18 других статей и материалов конференций и 1 патент на изобретение.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей объекты исследования, материалы и методы и результаты исследования с обсуждением, заключением, выводом и списком литературы. Материалы диссертации изложены на 134 страницах машинописного текста и включают 60 рисунков и 30 таблиц.

Место выполнения работы. Работа была выполнена в учебно-научной лаборатории биотехнологии и биоинженерии при Кафедре физиологии растений и биотехнологии Томского государственного университета под руководством д.б.н., профессора О. В. Карначук. Определение скорости сульфатредукции в осадках хвостохранилищ добычи золота в Кемеровской области проведено во время стажировки в рамках гранта РФФИ по программе «Мобильность молодых ученых» в Лаборатории микробиологии и биогеохимии водоемов Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, г. Москва (ИНМИ РАН) под руководством к.б.н. И. И. Русанова и д.б.н. Н. В. Пименова.

Исследование образования сульфидов меди и железа СРП и СГП поддержано грантами Министерства образования и науки РФ по программе ФЦП №П336 от 07.05.2010, №11.519.11.2004 от 18.08.2011, №11.519.11.2011 от 30.08.2011.

Автор выражает глубокую признательность научному руководителю д.б.н. профессору О.В. Карначук, а также д.б.н. Н.В. Пименову, к.б.н. И.И. Русанову и к.б.н. А.Л. Герасимчук за полезные советы, помощь при выполнении работы и обсуждении результатов. Искренне признательна Д. Бэнксу за определение концентрации металлов, катионов и анионов в пробах воды хвостохранилищ. Автор приносит благодарность всем соавторам, а также коллегам и друзьям за содействие и поддержку.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. СУЛЬФИДОГЕННЫЕ БАКТЕРИИ И ОБРАЗОВАНИЕ СУЛЬФИДОВ МЕТАЛЛОВ

В обзоре литературы приводится краткая характеристика физиологии, распространении и геохимической деятельности сульфидогенных бактерий, а также освещено образование сульфидов металлов в экосистемах и чистых культурах и использование СРП в технологических схемах.

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика изученных экосистем, загрязненных тяжелыми металлами, и определение интенсивности сульфатредукции. Изучение образования сульфидов металлов СРП проводили в осадках хвостохранилищ добычи золота в Кемеровской области. Осадки хвостохранилищ на рудниках «Берикуль», «Комсомольское» и «Центральный» характеризовались низкими значениями рН, высокими значениями Еh и повышенным содержанием ионов металлов и сульфатов (таблица 1).

Определение интенсивности сульфатредукции и образования различных восстановленных форм серы в условиях максимально приближенных к in situ проводили в изолированных пробах осадков с применением радиоактивномеченного сульфата натрия (Карначук, 1990; Karnachuk et al., 2005). Определяли включение метки отдельно во фракции кислоторастворимых и кислотонерастворимых сульфидов.

Таблица 1 – Места отбора проб и некоторые физико-химические параметры воды ветландов

Место отбора проб

Обозначение пробы

Описание места отбора пробы

Т °С

рН воды

ОВП, мВ

Центральный

Том 13

Ветланд, получающий дренаж из отвалов породы

11.0

2.91

+392

Том 14

Ручей, вытекающий из штольни. На поверхности осадка биологические обрастания

16.2

2.72

+454

Комсомольское

Том 15

Естественный ветланд на территории хвостохранилища. Вода интенсивно красного цвета

18.2

1.96

+482

Том 16

Естественный ветланд на территории хвостохранилища

18.1

1.75

+370

Том 17

Ветланд, с водной растительностью

18.0

2.84

+431

Берикуль

Том 18

Высачивание из под отвала пустой породы на берегу реки Мокрый Берикуль

12.0

4.22

+413

Том 19

Естественный ветланд на территории бывшего хвостохранилища

24.1

2.43

+389

Том 20

Влажный осадок на территории бывшего хвостохранилища

24.0

2.76

+395

Том 21

Естественный ветланд с оранжевой водой невдалеке от отвала пустой породы.

22.7

2.06

+482

Новый Берикуль

Том 22

Естественный ветланд на территории бывшего хвостохранилища

20.5

2.99

*

* - Измерение не проводили

Молекулярные методы. ДНК выделяли набором «Power Soil DNA isolation kit» (MoBio, USA) в соответствии с инструкцией производителя. Проводили «вложенную» (nested) амплификацию гена 16S рРНК с «внешними» праймерами 27F (DeLong, 1992) и 1492R (Weisburg et al., 1991), продукт который затем использовали в качестве матрицы для амплификации с «внутренними» праймерами BacV3f и 907R (Muyzer et al., 1996). Использовали амплификатор My Cycler (BioRad), температурный режим описанный ранее (Карначук и др., 2009). Доминирующие филотипы в осадках хвостохранилищ определяли методом амплификации фрагментов 16S рРНК с последующими разделением гель-электрофорезом в денатурирующих условиях (ПЦР-ДГГЭ). ДГГЭ проводили по описанной методике (Герасимчук и др., 2011). При ДГГЭ-анализе применяли 8 % полиакриламидный гель с денатурирующими градиентами от 30 % до 70 % (100 % денатурирующий раствор содержит 7 М мочевину и 40 % формамид). Секвенирование проводили коммерчески (ЗАО «Синтол»). Анализ последовательностей ДНК проводили в соответствии с тем как это описано в публикации (2).

Эксперименты с чистыми и накопительными культурами. Накопительные и чистые культуры выращивали на пресноводной среде Видделя (Widdel, Bak, 1992), Cu(II) и Fe(II) вносили в среду из стоковых растворов. Начальная концентрация металлов в среде составляла от 25 до 400 мг/л. рН среды составлял 2.5, 4 или 8, в зависимости от физиологии организмов. В качестве органического субстрата для роста использовали лактат или пептон. Также культивирование Desulfovibrio sp. A2 проводили в биореакторе BIOFLO110 Fermentor/Bioreactor NEW BRUNSWICK Scientific CO, INC, в непрерывном режиме. Культивирование проводили при 28 – 32 С, рН 7 – 8, скорость протока составляла 1-2 мл/мин.

Для исследования образования сульфидов меди и железа СРП использовали накопительные культуры, полученные из разных местообитаний (таблица 2).

Образование сульфидов Cu и Fe изучали в чистых культурах устойчивых к меди СРП, выделенных из различных экосистем (таблица 3). Важно отметить, что исследованные штаммы принадлежат к различным филогенетическим группа Bacteria – дельтапротеобактериальным родам Desulfovibrio и Desulfomicrobium, относящихся к Firmicutes Desulfosporosinus и Tissierella (рисунок 1).

Таблица 2 – Некоторые характеристики накопительных культур сульфидогенов, использованных в экспериментах по изучению образования сульфидов металлов

Культуры

Источник выделения

Субстрат

для роста

Концентрация Сu2+, мг/л

Том 17

Осадки хвостохранилища сульфидных руд, проба Том 17

Лактат

25

Том 19

Осадки хвостохранилища сульфидных руд, проба Том 19

Лактат

25

LC_3

Гидротермальное поле Лост Сити, Постройка с водой, проба М2 4800№2

Лактат

0.002

LC_4

Гидротермальное поле Лост Сити, проба М2 ТБС 4403

Лактат

0.002

5_С

Фекалии человека

Пептон

100

6_С

Фекалии человека

Пептон

100

Таблица 3 – Чистые культуры СРП и СГБ использованные в исследованиях и максимальная концентрация ионов Cu в среде, позволяющая их рост

Штаммы СГБ

Источник выделения

Концентрация Сu2+, мг/л

Dеsulfomicrobium sp. KN

Осадки, загрязненные отходами предприятия ОАО “Норильский никель”

400

Desulfovibrio sp. R2

Сточные воды предприятия по производству шариков подшипников

800

Desulfovibrio sp. А2

Сточные воды предприятия по производству шариков подшипников

450

Desulfovibrio sp. А4

Сточные воды предприятия по производству шариков подшипников

325

Desulfosporosinus sp. DB

Загрязненные металлами осадки хвостохранилищ добычи золота, Кузбасс

5000

Desulfosporosinus sp. ОТ

Cтоки предприятия по обогащению и извлечению цветных металлов из руд, ОАО «Норильский никель»

15000

Tissierela sp. P1

Поверхность медных монет

150

Tissierela sp. F6

Фекалии человека

50

Рисунок 1 Филогенетическое положение устойчивых к меди изолятов использованных в исследовании. На рисунке устойчивые к меди штаммы выделены жирным шрифтом

Электронная микроскопия, элементный и минералогический анализ. Изучение ультраструктуры бактериальных клеток проводили методом трансмиссионной электронной микроскопии (Карупу, 1984). Изучение элементного состава полученного осадка проводили посредством энергодисперсионного анализа с помощью микроанализатора EDAX на сканирующем электронном микроскопе Philips SEM 515. Съемка производилась при ускоряющем напряжении 30 kV, фокусное расстояние составило 12 мм, размер зонда 50–100 нм. Дифракционные картины строили с помощью дифрактометра Shimadzu XRD 6000 с рентгенофазовым анализом. Проверка большого числа возможных комбинаций различных фаз производилась с использованием программы Crystallographica-Search Match с базой данных PDF-2.

Глава 3. ОБРАЗОВАНИЕ СУЛЬФИДОВ МЕТАЛЛОВ ПРИРОДНЫМИ ПОПУЛЯЦИЯМИ СУЛЬФИДОГЕНОВ В ОТХОДАХ ГОРНОДОБЫВАЮЩЕЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

Разнообразие микроорганизмов в отходах добычи сульфидных руд с различными физико-химическими условиями среды. Все исследованные осадки характеризовались низким рН и окисленными условиями. В высачиваниях и осадках хвостохранилища «Комсомольский» зафиксированы наиболее кислые условия (рН=1.75). В воде ветландов отмечено максимально высокое содержание сульфата, железа и других металлов, таких как мышьяк, алюминий, цинк, свинец, медь, никель, кадмий (таблица 4), что свидетельствует об активных процессах окисления остаточных сульфидов. В осадках хвостохранилищ «Комсомольское» и «Берикуль» были найдены кристаллические сульфиды железа, пирит (FeS2) и меди, халькоцит (Cu2S).

Таблица 4 – Концентрация некоторых анионов и элементов в воде исследованных ветландов

Концентрация анионов/

катионов/

элементов, мг/л

Центральный

Комсомольский

Берикуль

Tом13

Tом14

Tом15

Tом16

Tом17

Tом18

Tом21

Tом22

SO42-

348

1193

13473

5069

811

2038

11437

223

Al

<0.5

12.2

399

137

33.2

51.4

355

0.3

Fe

75.8

57.6

4802

1880

59.5

468

3797

0.9

Cu

<0.1

5

18.8

4.6

0.8

3

15.9

0.2

Zn

1.8

11.1

232.0

46.6

10.2

15.8

42.9

0.6

Pb

<0.2

<0.2

2.8

1.3

<0.2

0.4

1.7

<0.2

Ni

<0.1

<0.1

8.50

1.60

0.40

0.70

4.00

<0.1

Co

<0.1

0.1

2.5

0.8

0.2

0.4

1.9

<0.1

Cd

<0.1

0.2

5.9

1

0.2

0.3

1

<0.1

As

7.4

0.1

556

89.9

0.4

2.5

244

<0.1

S

115

380

4346

2110

261

668

3742

75.9

Различные группы Bacteria были обнаружены методом ПЦР-ДГГЭ в осадках хвостохранилищ, включая образующих сульфиды Deltaproteobacteria и Firmicutes (рисунки 2, 3). Многие из обнаруженных филотипов имели высокую степень гомологии с последовательностями некультивируемых Bacteria из экстремально кислых экосистем, связанных с кислыми шахтными дренажами, таких как Rio Tinto в Испании. Однако, некоторые организмы, обнаруженные методом ПЦР-ДГГЭ, были сильно удалены от известных культивируемых форм. В частности, два филотипа попадающие в класс Deltaproteobacteria не имели культивируемых родственников с гомологией гена 16S рРНК более 86% (рисунки 3, 4).

Рисунок 2 – Основные филогенетические группы Bacteria, обнаруженные методом ПЦР-ДГГЭ в осадках хвостохранилищ

Рисунок 3 – Доминирующие филотипы, обнаруженные в осадках хвостохранилищ. В скобках указан % гомологии с ближайшими культивируемыми родственниками

Определение скорости сульфатредукции в отходах добычи сульфидных руд. Максимальная скорость сульфатредукции, 102 мкг S восстан/(дм3сут), была зафиксирована в окисленных осадках ветланда на хвостохранилище «Берикуль». При этом большую часть метки (67.6 %) обнаруживали во фракции хромовосстанавливаемой серы (ХВС). Фракция ХВС содержит пирит и кислотонерастворимые сульфиды других металлов, в частности меди. В осадках другого ветланда большая часть метки (82.4 %) была обнаружена в ХВС, суммарная интенсивность сульфатредукции составляла 55.7 мкг S восстан/(дм3сут). В осадках ветландов хвостохранилища «Центральный» максимальная скорость сульфатредукции составляла 85.4 мкг S восстан/(дм3сут) и при этом кислоторастворимые сульфиды (HS- + MeS) составляли 96.5 %. Наименьшие скорости сульфатредукции наблюдали в осадках ветландов хвостохранилища «Комсомольское», которые составляли 4.13, 37.4 и 27.5 мкг S восстан/(дм3сут), при этом кислоторастворимые сульфиды составляли от 68 до 100 % (рисунки 4, 5).

Таким образом, устойчивые к реокислению вторичные сульфиды Fe и Cu могут образовываться в значительных количествах в отходах добычи сульфидных руд благодаря активности СРП.

Рисунок 4 – Скорость сульфатредукции в осадках хвостохранилищ «Центральное» (Том 13, Том 14), «Комсомольское» (Том 15, Том 16, Том 17) и «Берикуль» (Том 18, Том 19, Том 20)

Рисунок 5 – Процентная доля кислотонерастворимых сульфидов (ХВС) от суммарной восстановленной 35S в осадках хвостохранилищ «Центральное» (Том 13, Том 14), «Комсомольское» (Том 15, Том 16, Том 17) и «Берикуль» (Том 18, Том 19, Том 20)

Глава 4. ОБРАЗОВАНИЕ СУЛЬФИДОВ МЕДИ И ЖЕЛЕЗА СУЛЬФИДОГЕНАМИ

Образование сульфидов Cu и Fe накопительными и чистыми культурами СГБ из природных экосистем. Элементный анализ осадков, полученных при культивировании накопительных культур из хвостохранилищ (Том 17, Том 19) и гидротермального поля Лост Сити (LC_3 и LC_4) с ионами меди, показал присутствие S, Fe и Cu. Осадки, полученные при культивировании с ионами железа, содержали S и Fe. Рентгенофазовый анализ осадков Том 17 и Том 19 показал наличие кристаллических сульфидов меди (джурлеит, Cu31S16) и железа (макинавит, FeS; пирит, Fe2S) (рисунок 6).

Рисунок 6 - Дифрактограммы осадков, полученных в экспериментах с разными сроками инкубации накопительных культур из хвостохранилищ. 1 – Том 19, 50 мгFe/л, 36 суток инкубирования; 2 – Том 19, 25 мгCu/л, 101 суток; 3 – Том 17, 25 мгCu/л, 87 суток. Обозначения: макинавит (FeS) – SFe; пирит (FeS2) –  Py; джурлеит (Cu31S16) – Dj

Атомное соотношение Fe и S, при культивировании LC_3 без меди, составляло 9.3:1, при культивировании LC_3 с 50 мгCu/л - 16.8:1, а при культивировании LC_4 - 2.44:1. Атомное соотношение Cu:S в осадке, образованном при культивировании LC_3 с 50 мгCu/л, составляло 13.7:1.

Элементный анализ осадков, полученных при культивировании в периодичной культуре Desulfovibrio sp. А2, Desulfovibrio sp. R2, Desulfovibrio sp. А4, Desulfomicrobium sp. KN, Desulfosporosinus sp. DB, Desulfosporosinus sp. ОТ, показал присутствие в качестве основных элементов S и Cu (рисунок 7). Атомное соотношение Cu:S во всех осадках было близко к сульфидам меди составом Cu2S, Cu1.96S, Cu1.72-1.86S, Cu1.75-1.78S, Cu1.75S, Cu1.5-1.6S, Cu1.4S, Cu1.1S и CuS. Также в некоторых осадках присутствовало большое количество Fe и атомное соотношение Cu:Fe:S близко к сульфидам состава СuFeS2, СuFe2S3, Cu5FeS4 и Cu3FeS4, а соотношение атомов Fe:S близко к сульфидам железа – FeS, FeS2, FeS1.5, FeS1.3 и FeS1.2.

Рисунок 7 – Микрофотографии (СЭМ) осадков, полученных в экспериментах с разными сроками инкубации Desulfovibrio sp. А2 в присутствии ионов Cu (250 мг/л), и соответствующие им ЭДС. 1 – 8 суток культивирования; 2 – 15 суток культивирования

Рентгенофазовый анализ подтвердил присутствие кристаллических сульфидов меди в осадках. Ацидотолерантные штаммы Desulfosporosinus sp. DB и Desulfosporosinus sp. ОТ образовывали преимущественно халькопирит (CuFeS2). Осадки, полученные при кратковременном культивировании, содержали вторую кристаллическую фазу ковеллит (CuS). При культивировании Desulfosporosinus sp. DB на среде с пептоном образовывались халькоцит (Cu2S) и моихукит (Cu9Fe9S16), а при культивировании без меди – сульфиды железа, грейгит (Fe3S4) и маккинавит (FeS). Desulfosporosinus sp. OT, кроме халькопирита и ковеллита, образовывал сульфид железа, смитит (Fe9S11).

Desulfovibrio sp. А2, Desulfovibrio sp. А4 и Desulfovibrio sp. R2 при кратковременном культивировании (5-9 суток) образовывали чистый ковеллит, а при более длительном (15-58 суток) – ковеллит и халькопирит (рисунок 8). Desulfomicrobium sp. KN наряду с основными фазами ковеллита и халькопирита, образовывал более редкий сульфид меди, ярровит – Cu9S8 (Cu1,12S) (рисунок 9). При культивировании Desulfovibrio sp. А2 в непрерывной культуре образовалось большее количество сульфидных минералов. Так при культивировании в биореакторе в осадках были обнаружены ковеллит (CuS), ярровит (Cu9S8 (Cu1,12S)), халькопирит (CuFeS2)и пирротин (Fe6S7).

Рисунок 8 – Дифрактограмма осадков, полученных в экспериментах с разными сроками инкубации Desulfovibrio sp. R2 в присутствии начальной концентрации Cu (200 мг/л). 1 – 9 суток; 2 – 58 суток. Обозначения на дифрактограмме: Cv – ковеллит (СuS), Ch – халькопирит (CuFeS2)

Рисунок 9 – Дифрактограмма осадков, полученных при культивировании 1 – Desulfosporosinus sp. DB; 2 – Desulfomicrobium sp. KN; 3 – Desulfovibrio sp. А2 в присутствии начальной концентрации Cu (200 мг/л). Обозначения: халькопирит (CuFeS2) – Ch; ковеллит (СuS) – Cv; ярровит (Cu9S8) – Ya

При изучении ультраструктуры бактериальных клеток, растущих в периодической культуре с добавлением меди, было показано образование электронплотных наночастиц различной формы на поверхности клеточной стенки, в цитоплазме и периплазматическом пространстве (рисунок 10). При микроскопировании контрольных срезов клеток, выращенных без добавления меди, электронплотных наночастиц на поверхности клеток не обнаружено.

Рисунок 10 – Микрофотографии клеток Desulfovibrio sp. А2 (А), Desulfovibrio sp. R2 (Б) культивированных в присутствии ионов меди и клетки Desulfovibrio sp. А2, выращенные без ионов меди (В)

Были получены микродифракционные картины наноразмерных частиц, выделенных из культуры Desulfovibrio sp. R2. Полученная кристаллическая решетка соответствует ковеллиту (CuS) (рисунки 11).

Рисунок 11 – Темнопольное (слева) и светлопольное (в центре) изображения наноразмерных частиц, образованных клетками Desulfovibrio sp. R2, справа микродифракционная картина наночастиц. Кристаллическая решетка ковеллит, CuS

Образование сульфидов Cu и Fe накопительными и чистыми культурами СГБ из микробиома человека. В осадках, образованных при культивировании накопительных культур 5_С и 6_С, атомное соотношение Cu:S близко к сульфидам меди состава CuS, Cu2S и CuS2, а атомное соотношение Cu:Fe:S близко к халькопириту (CuFeS2). Рентгенофазовый анализ подтвердил наличие кристаллических сульфидов меди – халькоцита (Cu2S) и халькопирита (Cu FeS2) (рисунок 12).

Рисунок 12 – Дифрактограммы осадков, полученных в экспериментах накопительными культурами 5_С из микробиома человека. Обозначения: халькоцит (Cu2S) – Cc; халькопирит (CuFeS2) – Ch

При культивировании Tissierella sp. Р1 и Tissierella sp. F6 кристаллических сульфидов меди не обнаружили. При длительном культивировании этих штаммов обнаружили кристаллические фазы фосфата железа – вивианита (Fe3(PO4)2·2H2O) (рисунок 13).

Рисунок 13 – Дифрактограмма осадков, образованных Tissierela sp. Р1 в присутствии ионов меди (75 мгCu/л). Вивианит (Fe3(PO4)2·2H2O) обозначен – Viv

Образование сульфидов Cu СГБ в биопленках. В природных популяциях образование сульфидов металлов может происходить при росте микроорганизмов в биопленках. Известны классические примеры образования сфолерита (ZnS) биопленками СРП в шахтных туннелях (Labrenz, Bаnfield,, 2004; Labrenz et al., 2000).

С целью исследования возможности образования сульфида меди в биопленках, проводили спектральный анализ обрастаний стекла и алюминиевой фольги штаммами Desulfosporosinus sp. DB, Desulfovibrio sp. R2, Desulfovibrio sp. А2, Tissierela sp. F6 и Tissierela sp. Р1. Элементный анализ биопленок, образованных при культивировании СРП/СГБ, показал присутствие Cu, Fe и S. Desulfovibrio sp. А2 образовывал на стекле микроколонии размером около 30 мкм (рисунок 14). Микроколонии на фольге имели средний размер 10 мкм. Атомное соотношение Cu:S было близко к CuS.

В биопленках, образованные Desulfosporosinus sp. DB обнаружили также Fe, что может указывать на присутствие CuFeS2.

В отличие от штаммов СРП, биопленка, образованная СГБ Tissierela sp. Р1 на фольге, представляла шарообразные микроколонии размером от 5 до 20 мкм. Атомное соотношение Cu:S близко к соотношению элементов в Cu2S (рисунок 15).

Рисунок 14 – Микрофотографии (СЭМ) биопленок, образованных на разных поверхностях штаммами СРП, и соответствующие им ЭДС. 1 – Desulfovibrio sp. А2, стекло, 250 мгCu/л (справа в светлом поле клетки бактерий), 8 суток инкубирования;  2 – Desulfovibrio sp. А2, фольга, 200 мгCu/л, 22 суток инкубирования; 3– Desulfosporosinus sp. DB, стекло, 200 мгCu/л, 21 суток культивирования

Рисунок 15 – Микрофотографии (СЭМ) биопленки образованной на фольге, при культивировании Tissierela sp. Р1, 75 мгCu/л, 3 суток

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследования показали что, несмотря на низкие значения рН, окисленные условия и высокие концентрации тяжелых металлов, в осадках хвостохранилищ Кемеровской области происходит активная сульфатредукция, сопровождающаяся образованием кристаллических сульфидов металлов. Кристаллические сульфиды устойчивы к реокислению и данный процесс представляет большое значение для самоочистки экосистем. Обнаруженные методом рентгенофазового анализа в осадках хвостохранилищ кристаллические сульфиды Cu и Fe, также как Cu2S и FeS2, могут являться вторичными сульфидами, образуемые СРП. Возможными агентами процесса сульфатредукции в окисленных осадках, загрязненных металлами, являются отдаленные родственники дельтапротеобактерия, обнаруженные в осадках молекулярными методами. Однако, поскольку гомология обнаруженных филотипов с известными Deltaproteobacteria не превышает 90% в настоящее время не возможно дать окончательно заключения о фенотипе этих организмов. СРП представляются наиболее перспективными организмами для очистки сточных вод в подобных экстремальных экосистемах, поскольку не только эффективно осаждают тяжелые металлы в виде нерастворимых сульфидов за счет продукции сероводорода, но и естественным путем повышают щелочность среды. Наши исследования подтверждают факт, что некоторые СРП обладают мощными системами антиоксидантной защиты и сохраняют жизнеспособность в присутствие кислорода, а также способны расти при низких значениях рН.

Исследования сульфидов металлов, образованных чистыми культурами, с помощью энергодисперсионного и рентгенофазового методов позволили обнаружить кристаллические сульфиды Cu и Fe. При непрерывном культивировании Desulfovibrio sp. А2 с ионами меди, основными сульфидами на всем протяжении культивирования были халькопирит, ярровит, пирротин и ковеллит. Характер сульфидов меди является видоспецифическим и варьирует даже у близкородственных штаммов. Условия культивирования (продолжительность и рН) влияют на химическую форму и размер образующихся сульфидов. Так, ацидотолерантные штаммы рода Desulfosporosinus, образовывали преимущественно халькопирит, в то время как нейтрофильные штаммы рода Desulfovibrio образовывали ковеллит. Tissierella sp. Р1 и Tissierella sp. F6 образовывали только кристаллический фосфат железа (вивианит) (таблица 5).

Таблица 5 – Кристаллические сульфиды Cu и Fe, образованные при культивировании СРП/СГБ

СРП / СГБ

Филогенетическая группа

Кристаллические сульфиды Cu и Fe

Desulfovibrio sp. R2

Deltaproteobacteria

Ковеллит (СuS), халькопирит (CuFeS2)

Desulfovibrio sp. А2 в периодической культуре

Deltaproteobacteria

Ковеллит (СuS), халькопирит (CuFeS2)

Desulfovibrio sp. А2 в непрерывной культуре

Deltaproteobacteria

Ковеллит (СuS), халькопирит (CuFeS2), пирротин (Fe6S7), ярровит (Cu9S8)

Desulfovibrio sp. А4

Deltaproteobacteria

Ковеллит (СuS), халькопирит (CuFeS2)

Desulfomicrobium sp. KN

Deltaproteobacteria

Ковеллит (СuS), халькопирит (CuFeS2), ярровит (Cu9S8)

Desulfosporosinus sp. DB

Firmicutes

Ковеллит (СuS), халькопирит (CuFeS2), моихукит (Cu9Fe9S16), халькоцит (Cu2S), грейгит (Fe3S4) и макинавит (FeS)

Desulfosporosinus sp. ОТ

Firmicutes

Ковеллит (СuS), халькопирит (CuFeS2), смитит (Fe9S11)

Tissierella sp. Р1

Firmicutes

Вивианит (фосфат железа Fe3(PO4)2·2H2O)

Tissierella sp. F6

Firmicutes

Вивианит (фосфат железа Fe3(PO4)2·2H2O)

При культивировании штаммов СРП на среде с ионами меди на клеточных стенках и внутри клеток бактерий аккумулировались электронплотные наночастицы, вероятно, сульфиды. Как было показано, на примере штамма Desulfovibrio sp. R2, такие частицы содержали кристаллическую фазу - ковеллита. Вероятно, такие же кристаллы сульфидов образовывались в биопленках на стекле и фольге.

Результаты экспериментов с клетками и химическими контролями позволяют сделать заключение, что СРП стимулируют и значительно ускоряют процесс образования сульфидов металлов по сравнению с протеканием осаждения сульфидов в результате химических реакций.

ВЫВОДЫ

1. Интенсивный процесс диссимиляционной сульфатредукции, сопоставимый по скорости с восстановлением сульфата в анаэробных осадках, был обнаружен в окисленных осадках хвостохранилищ сульфидных руд на месторождениях «Берикуль» и «Центральный». Максимальная скорость сульфатредукции составляла 102 мкг S восстан./(дм3сут), при этом большую часть S восстан. (67.6%) обнаруживали в хромовосстановливаемой фракции, представленной пиритом и другими кристаллическими сульфидами металлов.

2. Возможными микроорганизмами, проводящими процесс сульфатредукции в окисленных кислых осадках исследуемых хвостохранилищ, являются некультивируемые представители Deltaproteobacteria, обнаруженные методом ПЦР-ДГГЭ.

3. Различные кристаллические сульфиды Fe и Cu, включая пирит (FeS2), макинавит (FeS) и джурлеит (Cu31S16), образовывались в накопительных культурах сульфидогенов, выделенных из отходов добычи сульфидов металлов. В накопительных культурах полученных из микробиома человека обнаружили  халькопирит (CuFeS2) и халькоцит (Cu2S).

4. Представители рода Desulfovibrio при кратковременном культивировании образовывали ковеллит (CuS), а при длительном культивировании – ковеллит (CuS) и халькопирит (CuFeS2). Ацидотолерантные штаммы рода Desulfosporosinus образовывали преимущественно халькопирит (CuFeS2), реже ковеллит (CuS), моихукит (Cu9Fe9S16) и смитит (Fe9S11). Представители рода Desulfomicrobium образовывали ковеллит, халькопирит и ярровит – Cu9S8 (Cu1,12S).

5. Сульфидогенные штаммы из микробиома человека Tissierella sp. Р1 и Tissierella sp. F6 кристаллических сульфидов меди не образовывали. При длительном культивировании этих штаммов обнаружили кристаллический фосфат железа, вивианит (Fe3(PO4)2·2H2O).

6. Кислые условия среды влияют на минералогический состав биогенных сульфидов меди, что выражается в преимущественном образовании халькопирита, по сравнению с ковеллитом и пиритом, образующихся при нейтральном рН среды.

7. СРП могут активно участвовать в процессах самоочистки окисленных осадков добычи металлов, образуя устойчивые к окислению кристаллические формы сульфидов Cu и Fe. Устойчивые штаммы СРП перспективны для создания биотехнологий очистки загрязненных стоков от ионов меди и железа. 

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК, и патенты

  1. Буторова О.П. Образование сульфидов меди Desulfovibrio sp. R2 в оптимальных температурных условиях / О.П. Буторова, А. В. Козлова, А. Л. Герасимчук // Вестник Томского государственного университета. Биология. – 2010. –  № 2 (10). – С. 19-28.
  2. Герасимчук А. Л. Поиск сульфатредуцирующих бактерий в пробах мата из гидротермального поля Лост Сити методом молекулярного клонирования / А. Л. Герасимчук, А. А. Шаталова, А. Д. Новиков,  О.П. Буторова, Н. В. Пименов, А.Ю. Леин, А. С. Яненко, О. В.  Карначук. // Микробиология. –  2010. – №1. –  С. 96-105.
  3. Патент РФ на изобретение. Способ получения ковеллита с использованием сульфатредуцирующих бактерий, устойчивых к меди. / Карначук О.В.,  Буторова О.П., Герасимчук А.Л., Лущаева И.В., Козлова А.В., Забудченко О.В., Мишин И.П.; Томский гос. университет. – №2426783; зав. 11.03.2010; опубл. 20.08.2011. Бюл. №23, 1 с.
  4. Иванова О.А. Экологическая оценка шахтных отвалов на примере рудника «Центральный» / О.А.  Иванова, А.Л. Герасимчук, О.П. Иккерт // Вестник Томского государственного университета. Биология. –  2011. –  № 3 (15). –  С. 178-179.
  5. Иккерт О.П. Осаждение меди сульфидогенной бактерией Desulfosporosinus sp.DB, выделенной из отходов добычи золота в Кузбассе. / О.П. Иккерт, А.Л. Герасимчук, Ю.А. Франк // Проблемы региональной экологии. 2012. –  №5. –  С. 152-156.

Другие статьи и материалы конференций

  1. Иккерт О.П. Образование сульфидов меди ацидофильными сульфатредуцирующими бактериями рода Desulfosporosinus. / О.П. Иккерт, А.Л. Герасимчук, О.В. Карначук // Экология и геохимическая деятельность микроорганизмов экстремальных местообитаний. Материалы международной конференции. – 2011. – С. 91-93.
  2. Buchtiyarova P. Sulfate-reducing bacteria isolated from copper coins. / P. Buchtiyarova, A. Kopnova, A.Gerasimchuk, E.Komleva, O. Butorova, O. Karnachuk // In Book of abstracts. Copper 10. 7th International Copper Meeting: Copper in Biology. –  2010. –  PS-35.
  3. Gerasimchuk А. L. Formation of copper sulfides by acidophilic Desulfosporosinus sp. DB isolated from highly acidic gold mine tailings, Kuzbass, Western Siberia / А. L. Gerasimchuk, O. P. Butorova, A. V. Kozlova, O. V. Zabudchenko, A. A. Miller, D.  Banks and O. V. Karnachuk// In Book of abstracts. 8th International Congress on Extremophiles. –  2010. –  Р. 142.
  4. Буторова О.П. Образование миллерита штаммами Desulfovibrio. /, О.П. Буторова, Л.Н. Еренко, А.В. Козлова, О.В. Забудченко, А.А.Миллер, О.В. Карначук // Актуальные аспекты современной микробиологии. VI молодежная школа-конференция c международным участием. – 2010. – С. 97-99.
  5. Еренко Л.Н. Получение сульфидов металлов с использованием сульфатредуцирующей бактерии Desulfovibrio sp. R2 / Л.Н. Еренко, О.П. Буторова, А.Л. Герасимчук, А.В. Козлова, А.А. Миллер, О.В. Карначук // Молекулярная и клеточная биоинженерия. Сборник научных трудов. –  2009. – С. 30-32.
  6. Буторова О. П. Образование сульфидов металлов чистыми культурами сульфатредуцирующих бактерий, устойчивых к ионам меди / О. П. Буторова, А. Л. Герасимчук, А. В. Козлова, О. В. Забудченко,  Л. Н. Еренко, И. П. Мишин, А. А. Миллер, О. В. Карначук // Актуальные аспекты современной микробиологии. V молодежная школа-конференция c международным участием. – 2009. – С. 73-74.
  7. Butorova O.P. Formation of macro- and micro-sized copper sulfide particles by pure cultures of metal-resistant sulfate-reducing bacteria / O.P.Butorova, A.L.Gerasimchuk, L.N.Erenko, A.V.Kozlova, O.V.Zabudchenko, I.P. Mishin, A.A. Miller, O.V. Karnachuk // BioMicroWorld 2009. III International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology. – 2009. – Р. 55.
  8. Gerasimchuk A.L. Bacterial sulfate reduction in the oxic zone of acidic gold mine tailings contaminated with arsenic and metals / A.L.Gerasimchuk, O.P.Butorova, D.Banks, P.Orme, N.V.Pimenov, A.S. Yanenko, O.V.Karnachuk // BioMicroWorld 2009. III International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology. – 2009. – Р. 8.
  9. Герасимчук А. Л. Изучение разнообразия культивируемых и некультивируемых сульфатредуцирующих бактерий в местообитаниях, содержащих высокие концентрации металлов / А.Л. Герасимчук, О. П. Буторова, Н. В. Пименов, О. В. Карначук // Актуальные аспекты современной микробиологии. IV молодежная школа-конференция c международным участием. – 2008. – С. 13-14.
  10. Герасимчук А. Л. Численность сульфатредуцирующих бактерий в рудничных водах, загрязненных отходами добычи золота и каменного угля / А. Л. Герасимчук, Г. А. Стыкон, А. С. Лисина, О. П. Буторова,  З.Л. Тихонова, У. Н. Полуэктова, О. С. Суханова, О. В. Карначук // II Международная молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии». – 2006. – С. 9-10.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.