WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

БЕЛОГЛАЗОВ Денис Валерьевич

Эффективность использования ретровирусных векторов для генетической трансформации клеток яйцевода кур in vivo

03.02.07 – Генетика

03.03.01 – Физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

п. Дубровицы, Московская обл.

2012

Работа выполнена в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики животных Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук.

Научные руководители: 

доктор сельскохозяйственных наук,

профессор, академик РАСХН

Эрнст Лев Константинович ;

доктор биологических наук

Волкова Наталья Александровна.

Официальные оппоненты: 

доктор биологических наук

Коршунова Людмила Георгиевна

ГНУ ВНИТИ птицеводства,

ведущий научный сотрудник лаборатории биотехнологии;

доктор биологических наук, профессор

Шихов Игорь Яковлевич – пенсионер.

               

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина.

Защита состоится «18» декабря 2012 года, в 10 часов, на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 006.013.03 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Россельхозакадемии.

Адрес института:  142132 Московская область, Подольский район,  пос. Дубровицы, ГНУ ВИЖ,  т/факс (4967) 65-11-01

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГНУ ВИЖ.

Автореферат разослан «___» ноября 2012 года.

Ученый секретарь Совета Д 006.013.03                                       И.В. Гусев

  1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Изучение биологических основ создания трансгенных форм является актуальной задачей современной науки. Трансгенез является неотъемлемой частью биотехнологий будущего, направленных на решение широкого спектра задач фундаментального и прикладного характера. Одним из перспективных направлений в данной области является создание трансгенных кур-биореакторов [Mozdziak et al., 2003; Kamihira et al., 2005; Kawabe et al., 2006, Kwon. et al., 2008; Сураева, 2008]. Существенные физиологические различия между птицами и млекопитающими обуславливают значительное преимущество использования птиц в качестве продуктивной платформы при производстве рекомбинантных белков со сложной структурой: птицы являются иммунноустойчивыми к потенциальным терапевтическим протеинам, таким как эритропоэтин человека, экспрессия которых может негативно влиять на состояние здоровья трансгенных млекопитающих, продуцирующих такие лекарства на коммерческом уровне. К тому же при использовании трансгенных птиц в качестве продуктивной платформы существенно снижается стоимость получаемых протеинов по сравнению с другими методами производства, такими как микробиологическая ферментация E.coli, дрожжи или клетки млекопитающих [Ivarie, 2003].

Однако, несмотря на заметные успехи в области трансгенеза птиц, само создание трансгенных кур представляет сегодня определенную проблему. Особенности их воспроизводства и развития, а именно трудности в точности определения овуляции, большое количество желтка в яйцеклетке, сильное уплотнение цитоплазмы около пронуклеусов, значительно снижают эффективность традиционного метода введения экзогенной ДНК в клетки животных – микроинъекции, что  ограничивает использование трансгенных технологий в птицеводстве. Все это требует поиска и разработки альтернативных методов направленного переноса генов, одним из которых является генетическая трансформация отдельных органов, в частности, яйцевода кур. Это позволяет значительно сократить материальные и временные затраты на получение трансгенных организмов по сравнению с использованием для адресной доставки ДНК других клеток-мишеней (клетки бластодермы, примордиальные зародышевые клетки, эмбриональные стволовые клетки), проведение генно-инженерных манипуляций с которыми возможно только на эмбриональном материале. В этой связи, изучение механизмов доставки экзогенной ДНК в клетки яйцевода кур in vivo является актуальной задачей в рамках разработки и оптимизации отдельных этапов технологической цепочки создания трансгенной птицы.

Цель и задачи. Целью диссертационной работы явилось изучение эффективности использования ретровирусных векторов для генетической трансформации клеток яйцевода кур in vivo.

Для достижения указанной цели были поставлены и решены следующие задачи:

  1. Изучить особенности гистогенеза белкового отдела яйцевода кур в различные возрастные периоды
  2. Оценить пролиферативную активность клеток эпителиального слоя белкового отдела яйцевода разновозрастных кур.
  3. Определить возраст, оптимальный для введения рекомбинантной ДНК в клетки яйцевода кур in vivo
  4. Оценить компетентность клеток яйцевода кур к ретровирусным векторам in vitro.
  5. Ввести генные конструкции в клетки яйцевода кур in vivo.
  6. Выявить факторы, влияющие на эффективность локальной трансформации клеток яйцевода кур.

Научная новизна. Впервые изучена пролиферативная активность и особенности гистогенеза клеток эпителиального слоя белкового отдела яйцевода кур в различные возрастные периоды в динамике. Исследованы механизмы доставки рекомбинантной ДНК в клетки белкового отдела яйцевода кур посредством использования ретровирусных векторов. Изучены факторы, влияющие на эффективность генетической модификации клеток яйцевода in vivo. Рассмотрено влияние полового гормона на пролиферативную активность клеток неполовозрелого яйцевода.

Практическая значимость. Отработан метод введения генных конструкций в эпителиальный слой белкового отдела яйцевода кур in vivo, позволяющий трансформировать клетки эпителиального слоя до 57,3%. Установлен возраст кур, оптимальный для введения генных конструкций в клетки яйцевода in vivo. Предложена схема гормональной обработки кур в раннем возрасте, позволяющая повысить пролиферативную активность клеток неполовозрелого яйцевода. Доказано наличие рекомбинантной ДНК в секреторных клетках эпителия яйцевода подопытных кур по достижении ими половозрелости.

Основные положения, выносимые на защиту

  • Клетки эпителия белкового отдела яйцевода могут быть трансформированы с использованием ретровирусных векторов.
  • Оптимальным возрастом для эффективного введения генных конструкций в клетки яйцевода кур in vivo является период от 4 до 4,5 месяцев.
  • Гормональная обработка кур в раннем возрасте 0,1% синэстролом позволяет повысить эффективность генетической трансформации клеток яйцевода in vivo.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях: «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных – БиоТехЖ-2008», Дубровицы, 2008 г., «Генетика и селекция в животноводстве: вчера, сегодня, завтра», С.-Петербург, 2010 г.; научных конференциях Центра биотехнологии и молекулярной диагностики животных ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии, 2011, 2012 гг.

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 4 научные работы, в т. ч. в центральных научных журналах, рекомендованных ВАК РФ - 2.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 101  странице, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы. Диссертационная работа содержит 7 таблиц и 33 рисунка. Библиографический список включает 151 источник, в том числе 101 на иностранных языках.

  1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в период с 2008 по 2012 гг. в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики животных и физиологическом дворе ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии согласно схеме, представленной на рисунке 1.

Примечание: ПЦР – полимеразная цепная реакция, ИГХ – иммуногистохимия

Рис. 1. Схема исследований

Объектом исследований служили куры кросса «Птичное». Образцы яйцевода отбирались при убое птицы. Гистологические исследования белкового отдела яйцевода проводили в 6 возрастных категориях (от 1 месяца до 5 месяцев). В каждой группе было исследовано по 5 особей.

Фиксацию ткани яйцевода проводили в 10% формалине. Дегидратацию исследуемых образцов ткани и их заливку в парафин осуществляли по общепринятой методике [Ромейс Б., 1953]. Гистологические срезы готовили на ротационном микротоме. Для окраски использовали растворы гематоксилина и эозина. Анализ полученных гистопрепаратов осуществляли на микроскопе «Opton» (Германия), объективы х40, х10, с использованием программы Image Scope (г. Москва, ООО «Системы для микроскопии и анализа»). При анализе учитывалась только слизистая оболочка белкового отдела яйцевода. От каждой особи было проанализировано не менее 20 гистосрезов эпителия. Содержание ДНК в эпителиальных клетках яйцевода определяли при окраске гистопрепаратов по Фельгину [Микроскопическая техника: Руководство, 1996].

Для трансформации клеток эпителия яйцевода использовали ретровирусные генные конструкции pLN-GFP, pLNins и pX-RSVhGH содержащие, соответственно, репортерные гены GFP (зеленый флюоресцирующий белок) и кДНК инсулина человека и гормон роста человека. Для упаковки рекомбинантных ретровирусов была использована линия-упаковщиц GP+envAm12.

Трансформацию клеток кур in vitro осуществляли путем совместного культивирования с клетками-упаковщицами и добавления вирусного препарата, представляющего собой среду культивирования клеток-упаковщиц и содержащего рекомбинантный ретровирус [Новое в клонировании ДНК, 1989]. Частоту генетической трансформации определяли как отношение числа генетически трансформированных клеток к общему числу клеток.

Введение генных конструкций (суспензия клеток-упаковщиц и вирусный препарат) в яйцевод кур in vivo осуществляли в возрасте 2 месяцев и 4-4,5 месяцев путем инъекции препарата в просвет белкового отдела яйцевода. Хирургическое вмешательство проводили с соблюдением правил асептики и антисептики, всей птице применяли одинаковую общую анестезию и послеоперационную терапию. В качестве источника генных конструкций использовали вирусный препарат и клетки-упаковщицы в концентрации 1 млн., 2 млн. и 3 млн. клеток на яйцевод.

Гормональную обработку подопытных кур проводили в возрасте 2 месяцев с использованием 0,1% раствора синэстрола в объеме 0,1 мл на голову.

Выделение ДНК из ткани яйцевода кур осуществляли солевым методом [Зиновьева Н.А. и др., 1998]. Наличие рекомбинантной ДНК в яйцеводе кур определяли методом ПЦР. Экспрессию рекомбинантных белков в клетках эпителия яйцевода кур изучали методом иммуногистохимии с использованием первых антител, специфичных к выявляемому белку (GFP, инсулин, соматотропин).

Статистическую обработку данных осуществляли с использованием стандартной компьютерной программы Microsoft Excel.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Особенности гистогенеза яйцевода кур в различные возрастные периоды

Изучение морфологии белковой части яйцевода кур в различные возрастные периоды показало следующее.

В возрасте 1 месяца внутренний слой слизистой оболочки яйцевода был выстлан слоем цилиндрического эпителия (рис.2). Высота эпителия в этом возрасте достигала 9,50±0,16 мкм. Клетки характеризовались высоким ядерно-цитоплазматическим соотношением. Площадь ядер составляла 7,56±0,3 мкм2, цитоплазмы - 7,12±0,4 мкм2.

1 - просвет яйцевода

2 - эпителий

3 - собственная пластинка слизистой оболочки

Окраска гематоксилин-эозин

Увеличение х400

Рис 2 Гистоструктура слизистой оболочки белковой части яйцевода кур в возрасте 1 месяца

В 2-месячном возрасте эпителий слизистой оболочки белковой части яйцевода кур прет ерпевал существенные изменения. Высота эпителиального слоя увеличивалась до 12,64±0,15мкм. Клетки располагались компактно и характеризовались вытянутой формой за счет сжатия боковых стенок клетки в результате увеличения площади цитоплазмы до 8,91±0,44 мкм2. Ядра в клетках занимали центральное положение. Средняя их площадь составила 8,34±0,34 мкм2.

Тенденция к увеличению размеров клеток эпителиального слоя слизистой оболочки яйцевода кур сохранялась и в возрасте 3 месяцев. Увеличение размеров цитоплазмы клеток сопровождалось смещением ядра к базальному краю (рис. 3). По сравнению с предыдущим периодом площадь цитоплазмы увеличилась почти в 2 раза, площадь ядра в 1,5 раза и составила, соответственно, 13,09±0,11 и 12,14±0,17 мкм2. Высота эпителиального слоя достигала 14,18±0,17 мкм.

1 - просвет яйцевода

2 - эпителий

3 - собственная пластинка слизистой оболочки

Окраска гематоксилин-эозин

Увеличение х400

Рис 3 Гистоструктура слизистой оболочки белковой части яйцевода кур в возрасте 3 месяцев

В возрасте 4 месяцев на гистопрепаратах яйцевода кур отмечалось увеличение размеров эпителиального слоя белковой части за счет формирования складок (рис. 4). Расширение эпителиального слоя было обусловлено увеличением как числа клеток, так и их размеров: площадь цитоплазмы достигала 20,29±0,19 мкм2, ядра – 15,91±0,22 мкм2 при высоте эпителиального слоя 16,95±0,16 мкм.

1 - просвет яйцевода

2 - эпителий

3 - собственная пластинка слизистой оболочки

Окраска гематоксилин-эозин

Увеличение х400

Рис 4 Гистоструктура слизистой оболочки белковой части яйцевода кур в возрасте 4 месяцев

У 4,5-месячных кур складки эпителиального слоя белковой части яйцевода были более выраженными. Клетки располагались плотно друг к другу. Увеличение размеров клеток и высоты эпителиального слоя было вызвана, главным образом, повышением площади цитоплазмы. Размеры цитоплазмы и ядра составили в данном возрасте 21,44±0,67 и 14,77±0,31 мкм2, соответственно.

К 5-ти месяцам онтогенеза завершалось формирование эпителиального слоя белковой части яйцевода кур, в некоторых клетках отмечалась секреторная деятельность (рис. 5). Клетки характеризовались низким ядерно-цитоплазматичеким отношением (0,47±0,01), имели вытянутую форму и образовывали эпителий высотой 27,93+0,52 мкм. Ядро клеток было смещено к базальной мембране. Размеры клеток достигали максимальных значений: площадь цитоплазмы и ядра составила, соответственно, 49,05±0,64 и 23,01±0,61 мкм2.

1 - просвет яйцевода

2 - эпителий

3 - собственная пластинка слизистой оболочки

4- трубчатые железы

Окраска гематоксилин-эозин

Увеличение х400

Рис 5 Гистоструктура слизистой оболочки белковой части яйцевода кур в возрасте 5 месяцев

Данные гистологического анализа клеток эпителиального слоя белкового отдела яйцевода кур суммированы в таблице 1.

Табл. 1. Морфометрические показатели клеток эпителиального слоя

яйцевода кур, M±m (Cv,%)

Возраст, мес

Высота эпителиального слоя

Площадь

ядра, мкм

Площадь цитоплазмы, мкм

Ядерно-цитоплазмати-ческое отношение

1

9,50±0,16(10)

7,56±0,26(13)

7,12±0,43(23)

1,14±0,12(39)

2

12,64±0,15(10)

8,34±0,34(14)

8,91±0,44(19)

0,95±0,03(10)

3

14,18±0,17(6)

12,14±0,17(5)

13,09±0,11(3)

0,93±0,01(3)

4

16,95±0,16(5)

15,91±0,22(5)

20,29±0,19(4)

0,78±0,01(4)

4,5

17,37±0,26(8)

14,77±0,31(8)

21,44±0,67(12)

0,7±0,02(10)

5

27,93±0,52(10)

23,01±0,61(10)

49,05±0,64(5)

0,47±0,01(10)

3.2. Динамика изменения содержания ДНК в клетках эпителиального слоя белковой части яйцевода кур

Ввиду того, что эффективный перенос рекомбинантной ДНК в клетки-мишени при использовании ретровирусных векторов может быть осуществлен только в активно делящиеся клетки, была изучена пролиферативная активность клеток эпителиального слоя белковой части яйцевода кур. Критерием пролиферативной активности клеток служил показатель относительного количества ДНК в их ядрах.

Была установлена тенденция к увеличению данного показателя у кур с возрастом (рис. 6).

Рис. 6 Динамика изменения содержания ДНК в ядрах клеток эпителиального слоя белковой части яйцевода кур в разные возрастные периоды

В период с первого по пятый месяц онтогенеза содержание ДНК в ядрах клеток увеличилось в 1,6 раза – от 11,5±1,3 до 18,6±0,2 отн. ед. Причем повышение содержания ДНК в клетках эпителиального слоя белковой части яйцевода происходило неравномерно. В возрасте от 1 до 4 месяцев и от 4,5 до 5 месяцев данный показатель изменялся незначительно - от 11,5±1,3 до 14,9±1,2 отн. ед. и от 18,3±1,7 до 18,6±2,6 отн. ед., соответственно. Резкое повышение содержания ДНК в клетках было установлено с 4 до 4,5 месяцев - с 14,9±1,2 до 18,3±1,7 отн. ед., что свидетельствует о высокой пролиферативной активности клеток в данный период онтогенеза. Учитывая это, данный период был выбран нами в качестве оптимального для введения генных конструкций в яйцевод кур in vivo с целью генетической трансформации клеток эпителиального слоя белковой части.

3.3.  Трансфекция клеток кур ретровирусными векторами in vitro

Проведенные исследования показали эффективность использования ретровирусных генных конструкций pLN-GFP,  pLNins  и pX-RSVhGH для трансформации клеток кур in vitro.

Частота генетической трансформации клеток-мишеней варьировала в зависимости от используемого метода трансфекции. Максимальное число генетически трансформированных клонов было получено при использовании в качестве источника генных конструкций клеток-упаковщиц. В данном случае из 1000 инфицированных клеток было выявлено от 11 до 38 трансформированных клонов в зависимости от используемой генной конструкции. При инфицировании клеток-мишеней вирусным препаратом данный показатель был меньше в 3,9-4,8 раз.

Результаты исследований, полученные в опытах in vitro, послужили основой для проведения дальнейших исследований по переносу рекомбинантной ДНК в клетки яйцевода кур in vivo.

3.4. Трансформация клеток яйцевода кур in vivo

На первом этапе была оценена эффективность использования ретровирусных векторов для генетической трансформации клеток яйцевода кур in vivo и оптимизирована доза вводимых генных конструкций в яйцевод,  на втором – изучена эффективность введения в яйцевод кур генных конструкций, содержащих целевые гены человека, в частности, кДНК гена инсулина и гормона роста человека.

3.4.1. Введение в яйцевод кур генной конструкции pLN-GFP

Генную конструкцию  pLN-GFP вводили в просвет белковой части яйцевода 4-месячных кур (n=3). В качестве источника генной конструкции использовали вирусный препарат в объеме 1 мл на яйцевод.

Наличие трансформированных клеток эпителиального слоя яйцевода кур было установлено у всех подопытных кур. Эффективность трансформации клеток яйцевода (отношение числа трансформированных клеток эпителиального слоя белковой части яйцевода к общему числу исследованных клеток данного типа, выраженное в процентах) при этом варьировала от 15,9±4,2 до 19,1±6,4% (табл. 2). Вместе с тем, методом ПЦР наличие рекомбинантной ДНК было выявлено в 50,0-58,3% исследованных проб, что можно объяснить более высокой чувствительностью метода.

Табл. 2. Эффективность генетической трансформации клеток яйцеводов

кур in vivo генной конструкцией pLN-GFP

№ жив

Иммуногистохимия

ПЦР

Исследовано срезов, n

Доля срезов с трансформированными клетками, %

Эффективность трансформации клеток яйцевода*, %

Исследовано проб, n

Число «+»  проб,

n (%)

№1

20

45

19,1±6,4

11

6 (54,5)

№2

20

30

15,9±4,2

12

7 (58,3)

№3

20

55

16,6±3,9

10

5 (50,0)

в сред-нем

43,3±7,3

17,2±3,1

54,3±2,4

Примечание: * – отношение числа трансформированных клеток эпителиального слоя белковой части яйцевода к общему числу исследованных клеток данного типа, выраженное в процентах.

3.4.2 Оптимизация условий введения рекомбинантной ДНК в клетки яйцевода кур in vivo

С целью повышения эффективности трансгенеза был проведен ряд экспериментов по оптимизации дозы вводимой генной конструкции в яйцевод кур in vivo. В качестве источника генной конструкции использовали суспензию клеток-упаковщиц в концентрации от 1 млн., 2 млн., 3 млн. клеток (табл. 3).

Табл. 3.Эффективность генетической трансформации эпителиальных клеток белковой части яйцевода кур in vivo при введении

генной конструкции pLN-GFP

Показатель

Группа

II

III

IV

Концентрация клеток-упаковщиц, млн/яйцевод

1

2

3

Доля срезов с трансформированными эпителиальными клетками, %

40,0±5,0

35,0±6,1

20,0±3,3

Доля трансформированных эпителиальных клеток на срезе, %:

- минимальная;

- максимальная;

- в среднем по группе

5,4

79,8

14,3±3,0

13,0

54,9

12,5±4,1

4,9

43,2

7,7±5,4

Общая эффективность трансформации клеток яйцевода*, %

7,1±2,9

5,4±1,8

3,6±2,4

Примечание: * – отношение числа трансформированных клеток эпителиального слоя белковой части яйцевода к общему числу исследованных клеток данного типа, выраженное в процентах.

Предполагалось, что увеличение концентрации вводимых клеток-упаковщиц позволит повысить эффективность трансгенеза клеток эпителиального слоя белковой части яйцевода.  Однако с увеличением дозы введения клеток-упаковщиц наблюдалась обратная тенденция. Результативность переноса рекомбинантной ДНК в эпителиальные клетки была ниже по сравнению с использованием  вирусного препарата. Так, при инъекции в яйцевод кур суспензии клеток-упаковщиц в концентрации 1 млн. клеток общая эффективность трансформации клеток эпителиального слоя составила 7,1±2,9%, что было в 2,4 раза ниже аналогичных показателей, полученных при использовании вирусного препарата. При введении клеток-упаковщиц в концентрации 2 млн. и 3 млн. клеток различия по данным показателям были больше: эффективность трансформации  эпителиальных клеток не превышала  3,6±2,4%.

Таким образом, максимальная эффективность трансформации клеток эпителиального слоя белковой части яйцевода была установлена при использовании вирусного препарата. Исходя их чего, в дальнейших исследованиях в качестве источника генной конструкции был использован вирусный препарат.

3.4.3. Введение в яйцевод кур генной конструкции pLNins, содержащей кДНК инсулина человека

Введение генной конструкции pLNins в яйцевод кур осуществляли в возрасте 4 месяцев. В качестве источника генной конструкции использовали вирусный препарат.

Наличие трансформированных клеток эпителиального слоя яйцевода кур было установлено у всех подопытных кур. Эффективность трансформации клеток эпителиального слоя белкового отдела яйцевода при этом составила 11,3±2,6%. При этом  наличие рекомбинантной ДНК методом ПЦР было выявлено в 43,3±8,8% исследованных проб, что можно объяснить более высокой чувствительностью метода.

3.4.4. Введение в яйцевод кур генной конструкции pX-RSVhgh, содержащей кДНК гормона роста человека

При введении в яйцевод кур генной конструкции pX-RSVhgh эффективность трансформации клеток эпителиального слоя белковой части яйцевода была значительно ниже, чем при использовании генной конструкции pLNins. Общая эффективность трансформации клеток эпителиального слоя яйцевода не превышала 7,6±1,7% при эффективности интеграции  рекомбинантной ДНК 40,0±5,8%.

3.4.5. Разработка путей повышения эффективности трансгенеза яйцевода кур in vivo

Проведенные исследования показали относительно низкую эффективность генетической трансформации клеток эпителиального слоя белковой части яйцевода кур in vivo – от 3,6±2,4 до 19,1±6,4%, что связано с введением генных конструкций в яйцевод кур в позднем возрасте (в 4 месяца). Введение генных конструкций в яйцевод кур  в более раннем возрасте (2 месяца) позволило бы повысить эффективность трансгенеза. Однако в данном возрасте клетки эпителиального слоя белкового отдела яйцевода характеризуются низкой пролиферативной активностью, что лимитирует результативность использования ретровирусных векторов для переноса рекомбинантной ДНК в этот период.

Для повышения пролиферативной активности клеток яйцевода кур в ранний возрастной период (в 2 месяца) была изучена возможность гормональной обработки кур половым гормоном, в частности, эстрогеном. Эстроген вводили в виде 0,1% раствора синэстрола подкожно в дозе 0,1 мл на голову. Изменения в гистоструктуре белкового отдела яйцевода были изучены путем микроскопии образцов ткани яйцевода, взятых  через 24 и 48 часов после введения гормонального препарата.

Через 24 часа после инъекции 0,1% синэстрола отмечалось значительное изменение структуры яйцевода, характеризующиеся увеличением эпителиального слоя, появлением складок, миграцией клеток в подслизистый слой, что соответствовало гистоструктуре белковой части яйцевода кур в возрасте 4 месяцев (рис. 7).

Микроскопия яйцевода птицы забитой через 48 часов после введения эстрогена выявила многочисленные трубчатые железы, что соответствовало гистоструктуре яйцевода половозрелой курицы.

А

Б

В

А - до введения 0,1% синэстрола

Б - через 24 часа после введения эстрогена

В - через 48 часов после введения эстрогена.

Рис.7. Изменение гистоструктуры слизистой оболочки белковой части яйцевода 2-месячных кур при введении гормонального препарата

С целью оценки эффективности трансгенеза яйцевода кур при использовании их гормональной обработки в раннем возрасте было осуществлено введение генной конструкции pLN-GFP в яйцевод 2-месячных кур через 24 часа после введения 0,1% синэстрола. Убой подопытной птицы для отбора образцов ткани яйцевода проводили в возрасте 6 месяцев.

Наличие трансформированных клеток было выявлено в 83,3±4,4% исследованных срезов. При этом эффективность трансформации клеток эпителиального слоя белковой части яйцевода достигала 57,3±6,3% при результативности интеграции рекомбинантной ДНК в клетки-мишени 83,3±6,7% (табл. 4).

Табл.4. Эффективность генетической трансформации клеток яйцеводов

кур in vivo генной конструкцией pLN-GFP при использовании гормонального препарата

№ жив

Иммуногистохимия

ПЦР

Исследовано срезов, n

Доля срезов с трансформированными клетками, %

Эффективность трансформации клеток яйцевода*, %

Исследовано проб, n

Число «+»  проб,

n (%)

№19

20

90

56,9±10,4

10

9 (90)

№20

20

85

49,9±6,8

10

7 (70)

№21

20

75

65,2±9,5

10

9 (90)

в сред-нем

83,3±4,4

57,3±6,3

83,3±6,7

Примечание: * – отношение числа трансформированных клеток эпителиального слоя белковой части яйцевода к общему числу исследованных клеток данного типа, выраженное в процентах.

3.4. Анализ факторов, влияющих на эффективность генетической трансформации клеток яйцевода кур

Проведенные исследования показали возможность трансформации клеток яйцевода кур с использованием ретровирусных генных конструкций. Вместе с тем, были выявлены различия в эффективности трансформации данных клеток-мишеней в зависимости от используемой генной конструкции, стадии введения генных конструкций и способа их подготовки для инъекции.

Генная конструкция Анализ эффективности трансформации клеток эпителиального слоя  белковой части яйцевода тремя разными конструкциями pLN-GFP, pLNins и pX-RSVhgh выявил различия в результативности переноса рекомбинантной ДНК в клетки-мишени при использовании данных генных конструкций.

Высокая эффективность трансформации эпителиальных клеток яйцевода кур in vivo подопытных кур была установлена при использовании генной конструкции pLN-GFP - 17,2±3,1% (без гормональной обработки). При введении генных конструкций pLNins и pX-RSVhgh данный показатель не превышал 11,3±2,6 и 7,6±1,7%, соответственно. Различия в эффективности трансформации клеток яйцевода кур при использовании разных генных конструкций могут быть связаны с тем, что данные конструкции были получены на основе разных ретровирусных векторов pLXSN и pLNСХ.

Способ подготовки и стадия введения генных конструкций Относительно высокая эффективность трансформации клеток яйцевода кур in vivo отмечалась при использовании в качестве источника генной конструкции вирусного препарата – 17,2±3,1% (без гормональной обработки). При введении в яйцеводы подопытных кур клеток-упаковщиц в разной концентрации результативность трансформации клеток-мишеней снижалась до 4,8 раз, что, возможно, связано с иммунной реакцией организма в ответ на введение чужеродных для него клеток.

Использование гормональной обработки подопытных кур перед введением генных конструкций повышало эффективность трансформации клеток яйцевода кур in vivo в 3,3 раза – до 57,3±6,3%, что свидетельствуют о перспективности использования ретровирусных векторов для генетической трансформации клеток яйцевода кур с целью получения рекомбинантных протеинов с белком яйца.

ВЫВОДЫ

  1. Изучен гистогенез эпителиального слоя белковой части яйцевода кур в динамике. Показано, что в возрасте от 1 до 4,5 месяцев наблюдается постепенное увеличение высоты эпителиального слоя от 9,50±0,24 до 17,37±0,26 мкм. Значительный рост клеток белковой части яйцевода отмечается в период от 4,5 месяцев до 5 месяцев. Высота эпителиального слоя увеличивается до 27,93±0,52 мкм, изменяется структура клеток в сторону повышения доли цитоплазмы.
  2. Установлена высокая пролиферативная активность клеток эпителиального слоя белковой части яйцевода кур в возрасте от 4 до 4,5 месяцев. Содержание ДНК в ядрах эпителиальных клеток яйцевода повышается в данный период с 14,9±1,2 до 18,3±1,7 отн. ед.
  3. Определен оптимальный возраст кур для введения рекомбинантной ДНК в клетки яйцевода кур in vivo – от 4 до 4,5 месяцев. Эффективное введение генных конструкций в более раннем возрасте возможно при гормональной стимуляции кур 0,1% синэстролом, способствующего повышению пролиферативной активности клеток яйцевода.
  4. Показана эффективность использования ретровирусных векторов для генетической трансформации клеток яйцевода кур in vitro с частотой трансформации данных клеток-мишеней до 3,8х10-3.
  5. Установлена результативность введения ретровирусных векторов в клетки яйцевода кур in  vivo. При введении генной конструкции pLN-GFP экспрессия рекомбинантной ДНК выявлена в 17,2±3,1% эпителиальных клеток белковой части яйцевода кур, при использовании генных конструкций pLNins и pX-RSVhgh  -  в 11,3±2,6 и 7,6±1,7% клеток, соответственно.
  6. Изучены факторы, влияющие на эффективность локальной трансформации клеток белкового отдела яйцевода кур in vivo. Высокая эффективность трансформации данных клеток-мишеней установлена при введении генных конструкций в яйцевод кур в виде вирусного препарата в возрасте 2 месяцев после гормональной обработки  0,1% синэстролом - 57,3±6,3%.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Лабораториям, занимающимся созданием и изучением трансгенных форм животных и птиц, рекомендуем:

  1. Для генетической трансформации клеток яйцевода кур использовать генные конструкции, полученные на основе рекомбинантных ретровирусов.
  2. Для эффективной трансформации клеток яйцевода кур in vivo осуществлять введение ретровирусных векторов в виде вирусного препарата в возрасте 2 месяцев через 24 часа после гормональной стимуляции 0,1% синэстролом.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

В журналах, рекомендованных ВАК РФ

  1. Волкова,  Н.А. Генетическая трансформация клеток кур in vitro и in vivo с использованием ретровирусных векторов/ Н.А. Волкова, Е.К. Томгорова, В.А. Багиров, Д.В. Белоглазов, Н.А. Зиновьева, Л.А. Волкова // Сельскохозяйственная биология.-2009.-№6-С.44-48.
  2. Белоглазов, Д.В. Генетическая трансформация клеток яйцевода кур с использованием ретровирусных векторов/ Д.В. Белоглазов, Н.А. Волкова, Л.А.Волкова, Н.А. Зиновьева, Л.К. Эрнст// Проблемы биологии продуктивных животных.-2011.-№1-С.8-12.

В других изданиях

  1. Эрнст,  Л.К. Эффективность использования ретровирусных векторов для получения трансгенных кур / Л.К.  Эрнст, Н.А. Волкова, Л.А. Волкова, А.О. Тулякова, Е.В. Белоглазова, Д.В. Белоглазов // Сборник трудов 7-й международной научной конференции «Современные достижения и проблемы» биотехнологии сельскохозяйственных животных - БиоТехЖ-2008» - Дубровицы - 2008.-C.230-233.
  2. Тулякова, А.О. Эффективность использования ретровирусных векторов для локального трансгенеза кур / А.О. Тулякова, Е.В. Белоглазова, Д.В. Белоглазов, Н.А. Волкова, Л.А. Волкова, Н.А. Зиновьева, Л.К. Эрнст // Сборник материалов научной конференции «Генетика и селекция в животноводстве: вчера, сегодня, завтра». - 9-11 июня 2010 г. - C. 217-220.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.