WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

                                                       

Барышникова Елена Ивановна

ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ВИСНА-МАЕДИ И

АРТРИТА-ЭНЦЕФАЛИТА КОЗ НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА ГЕНОМА

03.02.02 Вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических  наук

Покров – 2011

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии  Российской академии  сельскохозяйственных  наук

(ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии)

Научный руководитель

кандидат биологических наук  Колбасова Ольга Львовна

(ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии)

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор Рыбаков Сергей Сергеевич

(ФГБУ «ВНИИЗЖ»)

кандидат ветеринарных наук  Живодеров Сергей Петрович

(ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии)

Ведущая организация Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко (ГНУ ВИЭВ), г. Москва.

Защита диссертации состоится «30» декабря 2011 г. в  1000 часов на заседании диссертационного совета 006.003.01 при Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии по адресу: 601120, Владимирская область, г. Покров, ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. Тел./факс: (49243) 62125.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

Автореферат разослан «29» ноября 2011 г. и размещен на официальном сайте ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии www.vniivvim.ru

Ученый секретарь

диссертационного совета

ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии,

кандидат биологических наук 

Е.А. Балашова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

    1. Актуальность

Вирусы артрита-энцефалита коз (АЭК) и висна-маеди (ВМ) относятся к семейству Retroviridae, роду Lentivirus, в состав которого входит не только группа лентивирусов овец и коз, но и крупного рогатого скота (КРС), лошадей, кошек, приматов [1, 3, 13]. Многие исследователи объединяют возбудителей ВМ и АЭК под общим названием – лентивирусы мелких жвачных (ЛМЖ) [10, 12].

АЭК и ВМ были зарегистрированы в странах Европы, Латинской Америки, Австралии [9, 12]. В Российской Федерации (РФ) в последнее время возрос интерес к козоводству, который связан с потребностью у населения в диетических продуктах питания и к козьему молоку в частности [3, 7]. Кроме того, формируются системы фермерских козоводческих и овцеводческих хозяйств, пополняющих генофонд за счет импорта животных. В настоящее время в некоторых фермах РФ уже обнаружены случаи заболевания коз и овец ЛМЖ; при этом эпизоотологический анализ показал, что больные животные завезены из неблагополучных по ЛМЖ стран [2, 3]. Таким образом, можно сделать вывод об увеличении угрозы дальнейшего заноса и распространения ЛМЖ на территории нашей страны.

Возбудители АЭК и ВМ вызывают у животных медленные инфекции, представляющие серьезную проблему для животноводства в связи с их скрытым течением, летальным исходом, отсутствием средств лечения и профилактики. Для медленных инфекций не характерны сезонность, периодичность эпизоотий, географическая приуроченность [1]. Кроме этого, доказано, что ЛМЖ гетерогенны и могут инфицировать как овец, так и коз [7, 9]. Вирусы АЭК и ВМ вызывают одинаковую клиническую картину, патологоанатомические изменения, что затрудняет постановку дифференциального диагноза и соответственно проведение противоэпизоотологических мероприятий [1, 7].

В связи с вышеизложенным, дифференциация возбудителей АЭК и ВМ является актуальной.

1.2 Степень разработанности проблемы

Многие работы иностранных и российских исследователей посвящены изучению ЛМЖ [4, 6, 8, 12]. В работах И.Ю. Волковой, А.А. Стрижакова, В. Г. Бурдинского [2, 3, 5] изложены материалы по разработке тест-системы для выявления генома вирусов АЭК и ВМ методом ПЦР и мониторингу распространения болезни в хозяйствах РФ. Проблеме поиска чувствительной  клеточной системы (культура клеток синовиальной мембраны козленка (СМК)) для размножения  вируса АЭК и дальнейшего его применения в качестве антигена в РДП посвящена работа Г.Д. Сидельникова [7]. И.В. Кувшинов [6] подробно описал  гистологические изменения, вызванные медленными инфекциями мелких жвачных.

В данной работе представлена характеристика участков трех генов (gag-, env-, pol-) различных штаммов ЛМЖ, полученных из коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакдемии. Разработана тест-система на основе ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) для дифференциации данных возбудителей. Предложен HRM-анализ (методика плавления ПЦР-продуктов с высоким разрешением), позволяющий дифференцировать возбудителей АЭК и ВМ. Получен новый штамм диплоидных клеток синовиальной мембраны ягненка (СМЯ), пригодный для наработки антигенов ЛМЖ, используемых в серологических реакциях (РДП, иммуноблотинг), и проведения молекулярно-генетической работы.

1.3 Цель и задачи исследования

В связи с вышеуказанным, основной целью исследований являлись разработка и совершенствование средств и методов дифференциации вирусов АЭК и ВМ на основе анализа генома.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

  1. получить штамм диплоидных клеток СМЯ и определить его пермиссивность к вирусам АЭК и ВМ, необходимого для наработки вируссодержащего материала;
  2. изучить возможность дифференциации вирусов АЭК и ВМ с помощью серологических реакций;
  3. разработать тест-систему на основе ПЦР-РВ для выявления  и дифференциации геномов вирусов АЭК и ВМ;
  4. провести филогенетический анализ нуклеотидной последовательности  env-, gag- и pol-генов вирусов АЭК и ВМ, находящихся в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, для молекулярно-эпизоотологических исследований;
  5. провести мониторинг ЛМЖ на территории РФ.

1.4 Научная новизна работы

  1. Получен штамм диплоидных клеток СМЯ, оптимизированы условия его культивирования и использования в качестве лабораторной модели для изучения вирусов АЭК и ВМ.
  2. Разработан комплекс методов для выявления и дифференциации вирусов АЭК и ВМ с использованием ПЦР-РВ, секвенирования участков gag-, env- и pol-генов и HRM-анализа.
  3. Определена групповая принадлежность штаммов, находящихся в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакдемии (штамм Тверской вируса АЭК к группе В, штамм М-88, К-796 вируса ВМ к группе А), на основе филогенетического анализа gag-, env- и pol-генов.
    1. Практическая значимость работы
  1. Создан криобанк клеток СМЯ под авторским наименованием: штамм диплоидных  клеток синовиальной мембраны ягненка, рекомендуемый для изучения вирусов АЭК и ВМ, регистрационный номер:  № 64 в каталоге клеточной коллекции ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. Культура клеток депонирована под № 82 Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных РККК(П) (СХЖ РАСХН) при ВНИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ).
  2. Разработаны «Методические положения по выявлению провирусной ДНК лентивирусов мелких жвачных методом полимеразной цепной реакции», которые рассмотрены на секции «Инфекционная патология животных» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол №4 от 23. 09. 2011г.) и утверждены академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины РАСХН Смирновым А.М. (10.11.2011г.).
  3. Разработаны «Методические положения по выявлению и дифференциации ЛМЖ методом полимеразной  цепной реакции в режиме реального времени», которые рассмотрены на секции «Инфекционная патология животных» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол №4 от 23.09.2011г.) и утверждены академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины РАСХН Смирновым А.М. (10.11.2011г.).
  4. Проведено генотипирование трех штаммов вируса АЭК и ВМ, депонированных в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.
  5. Методом ПЦР с электрофоретической детекцией в период 2007-2011 гг. исследовано 1783 пробы крови от овец и коз из различных регионов РФ. Выявлено 93 инфицированных животных.
    1. Публикации результатов

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 1 статья в журнале «Вопросы вирусологии», 2 статьи в журнале «Ветеринария», включенные в перечень изданий, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

1.7 Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии (2008-2011 гг.).

Материалы диссертации доложены на конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины», посвященной 50-летию ВНИИВВиМ (г. Покров, 2009 г.), Международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения»  (г. Ульяновск, 2009 г.), Международной научно-практической конференции «Задачи ветеринарной науки в реализации доктрины продовольственной безопасности РФ» (г. Покров, 2011 г.).

1.8 Соответствие содержания диссертации паспорту специальности, по которой она рекомендуется к защите

В соответствии с формулой специальность 03.02.02 Вирусология, занимающаяся проблемами изучения природы и происхождения вирусов как автономных генетических структур, способных функционировать и репродуцироваться в восприимчивых к ним клетках животных, особенностей репродукции вирусов и их взаимоотношений с восприимчивыми к вирусам клеткам; генетики вирусов, структурной организации генома вирусов; их географического распространения, выявления естественных хозяев; классификации вирусов и их номенклатуры; разработки диагностики и совершенствования лабораторных диагностических систем. В диссертационной работе проведены исследования по получению новой пермиссивной к ЛМЖ клеточной системы, показано использование культуры клеток СМЯ с целью получения антигенов для постановки серологических реакций. Разработана тест-система на основе ПЦР-РВ и HRM-анализа, позволяющая выявлять и дифференцировать вирусы АЭК и ВМ с использованием  праймеров, фланкирующих участок env-гена.  Проведено нуклеотидное секвенирование env-, gag-, pol-генов трех штаммов ЛМЖ, депонированных в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакдемии.

Результаты научного исследования соответствуют пунктам паспорта специальности – 1, 3, 4, 8, 9, 10.

1.9 Структура диссертации

Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста и состоит из разделов: введение, обзор литературы, материалы, методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения, список использованной литературы, включающий 35 отечественных и 112 иностранных источников, дополнена приложениями. Диссертация содержит 8 таблиц и 25 рисунков. В приложении представлены документы, подтверждающие достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость.

    1. Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1.  Штамм диплоидных  клеток синовиальной мембраны ягненка, пригодный для изучения вирусов АЭК и ВМ.

  1. Анализ серологических реакций для выявления и дифференциации ЛМЖ.
  2. Тест-системы для идентификации генома ЛМЖ методом ПЦР с электрофоретической детекцией и ПЦР в режиме реального времени.
  3. Филогенетические взаимоотношения штаммов ЛМЖ, находящихся в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакдемии, на основе секвенирования различных участков генома и HRM-анализа.
  4. Данные мониторинговых исследований распространения ЛМЖ на территории РФ с использованием ПЦР с электрофоретической детекцией, РДП и ИФА.

1.11 Личный вклад автора в выполнении работы

Основной объем исследований проведен автором самостоятельно. Консультативную и методическую помощь при выполнении отдельных этапов работы оказывали следующие сотрудники института: к.б.н., зав. сектором по диагностике АЧС Малоголовкин А.С. (освоение молекулярно-биологических методов), к.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории Биотехнологии Капустина О.В., к.б.н., научный сотрудник научно-патентного отдела НИР Чурин А.И., к.б.н., научный сотрудник лаборатории Экспериментальной микробиологии Лягоскин И.В. и аспирант лаборатории Бактериологии Васина Н.К. (освоение серологических, иммунологических  методов), микробиолог лаборатории Биохимии Казакова А.С. (освоение методов конструирования рекомбинантных молекул).

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы

2.1.1 Вирусы

В работе использованы следующие штаммы: 75G-63, любезно предоставленный д-ром Л. Херрманн, США; штамм Тверской вируса АЭК; штамм К-796,  штамм М-88 вируса ВМ, находящиеся в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакдемии.

Клиническим материалом служили кровь, молоко и пробы органов (легкие, селезенка) от больных и подозреваемых в заражении ЛМЖ животных из различных хозяйств РФ.

В качестве отрицательных контролей использовали пробы культур клеток,  инфицированных вирусам лейкоза КРС, иммунодефицита КРС, пробы легких овец больных аденоматозом и пробы крови от здоровых овец и коз.

2.1.2 Животные

Для получения культуры клеток СМЯ и гипериммунных сывороток использовали клинически здоровых ягнят и овец из сектора подготовки животных ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

2.1.3 Культура клеток

Первичная культура клеток синовиальной мембраны козленка (СМК), выращенная в пластиковых культуральных сосудах.

2.1.4 Плазмиды и бактериальные штаммы

Для клонирования использовали коммерческий набор Qiagen PCR Cloning Kit (Qiagen, Германия). В качестве вектора для клонирования  использовали плазмиду pDrive (Qiagen, Германия) в клетках E.coli штамма TOP 10 и pTZ57R (Fermentas, Латвия)  в клетках XL-1 (Promega, США).

2.2 Методы

2.2.1 Культивирование клеток

Выращивание культуры клеток СМЯ осуществляли в матрасах, чашках Карреля, микропанелях и на покровных стеклах, помещенных в пробирки в условиях стационарного монослоя. Для снятия клеток со стекла и пластика при пересевах использовали  смесь 0,02 % раствора версена и 0,25 % раствора трипсина в соотношении 2:1, подогретую до 37 С. Посевная концентрация составила 150-200 тыс. кл/см3.

2.2.2 Цитологические исследования

На 5-е, 7-е и 9-е сутки культивирования зараженную культуру клеток фиксировали раствором Буэна, после чего окрашивали гемотаксилин-эозином по общепринятой методике. Проводили учет цитопатического изменения в инфицированной культуре клеток по сравнению с интактными клетками.

2.2.3 Серологические методы

Наличие специфического антигена и антител в органах и тканях определяли в реакциях РДП, иммуноцитохимически и в ИФА (набор фирмы ID Vet, Франция) в соответствии с методическими указаниями производителя.

2.2.4 Выделение и очистка нуклеиновых кислот

Нуклеиновые кислоты выделяли из проб органов, крови инфицированных и интактных животных и культур клеток с использованием нуклеосорбента и фенол-хлороформа.

В качестве матрицы для ПЦР использовали провирусные ДНК, выделенные из культурального вируссодержащего материала, зараженного вирусом ВМ, штамм К-796 (III пассаж на культуре клеток СМК и почки ягненка (ПЯ)), штамм  М-88 и вирусом АЭК, штамм Тверской.

2.2.5 Постановка ПЦР с электрофоретической детекцией

Исследования по выявлению генома ЛМЖ осуществляли при помощи разработанных в ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии (2011 г.) тест-систем и наборов препаратов на основе ПЦР. Для постановки ПЦР с электрофоретической детекцией использовали термоциклеры «Терцик МС-2» (ДНК-технология, Россия) и PalmCycler (Corbett Research, Австралия).

Амплификацию проводили  в 25 мкл реакционной смеси, содержащей по 10 pm прямого и обратного праймеров, 25 мМ смеси dNTP, 5х ПЦР-буфер (Интерлабсервис, Россия), рН 8.0, 25 мМ MgCl2, 1,0 ед. Taq-полимеразы, ДНК (исследуемый образец), деионизованную воду.

Реакцию  проводили при следующем температурном режиме: предварительная денатурация при 95 °С – 3 мин 10 сек, затем 30 циклов: денатурация 94 °С – 15 сек, отжиг 50 °С – 15 сек, элонгация 72 °С – 15 сек, окончательная элонгация 72 °С – 5 мин. Учет результатов ПЦР проводили в 2 % агарозном геле.

2.2.6 ПЦР в режиме реального времени

В работе использовали технологию гибридизационных флуоресцентных зондов – TaqMan. Амплификацию и детекцию репортерной флуоресценции проводили в термоциклерах «IQ-5» (BioRad, США) и «Rotor-Gene 6000» (Corbett Research, Австралия) по каналу FAM.

Постановку ПЦР-РВ проводили в 25 мкл реакционной смеси, состоящей из следующих компонентов в указанном порядке: 5x буфер для ПЦР, dNTP (2,5 мМ), зонд (3 pm), MgCl2 (25 мМ), смесь праймеров (10 pm каждого), Taq -полимераза (1 ед.), ДНК (исследуемый образец), деионизованная вода.

Реакцию  проводили при следующем температурном режиме: денатурация – 95 °C – 3 мин; амплификация – 95 °C – 20 сек, 50 °C – 20 сек, 72 °C – 20 сек (5 циклов); амплификация – 95 °C – 20 сек, 50 °C – 20 сек (детекция), 72 °C – 20 сек (35 циклов).

2.2.7 Нуклеотидное секвенирование

ПЦР-продукты очищали с помощью набора QIAquick PCR Purification Kit (250) согласно инструкции производителя (QIAGEN, Германия). Для анализа первичной последовательности продуктов, амплифицируемых в ходе ПЦР, использовали метод нуклеотидного секвенирования. Определение состава фрагментов проводили на приборе Applied Biosystem Genetic Analyser 3130 XL (СШA) с набором компонентов BigDye Terminator kit 3.1 (Applied Biosystem, СШA). Полученные последовательности сравнивали с опубликованными последовательностями gag-, pol- и env-генов, представлеными в базе данных GenBank.

2.2.8 Программное обеспечение

Для подбора специфических праймеров и зондов использовали пакет прикладных программ «Bio Edit», «Oligo 6.0». Построение филогенетических древ осуществляли с помощью программы Mega 4.0. Специфичность рассчитанных олигонуклеотидов проверяли при помощи интернет-сервиса BLAST (http://www.ncbi.gov.nlm.com).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Получение культуры клеток СМЯ, определение ее пермиссивности к лентивирусам мелких жвачных

Учитывая тот факт, что овцы так же, как и козы болеют АЭК, первым этапом работы являлось получение первичной культуры клеток СМЯ и определение ее пермиссивности для ЛМЖ.

Культуру клеток СМЯ получали методом выращивания тканевых эксплантатов. В качестве доноров использовали ягнят до 10-дневного возраста. Синовиальную мембрану отбирали от запястных и скакательных суставов. В качестве ростовой среды использовали питательную среду DMEM с 10% фетальной сывороткой КРС. На 2-4-е сутки культивирования эксплантатов синовиальной мембраны отмечали интенсивный рост клеток по периметру прикрепившихся тканевых фрагментов. На 6-8-е сутки образовывался сплошной монослой (рис. 1).

 

  А  Б

Рис.1 Эксплантат СМЯ с мигрирующими клеточными элементами: А) на 2-е сутки культивирования (нативный препарат, х150); Б) на 8-е сутки культивирования  (нативный препарат, х150)

При заражении культуры клеток СМЯ вирусами АЭК и ВМ в дозе 0,1-0,01 ТЦД50/кл получены следующие результаты:

- на 5-е сутки культивирования в зараженной штаммом 75G-63 вируса АЭК культуре клеток СМЯ отмечали цитопатический эффект, при котором клетки удлинялись и в 50 % из них обнаруживали небольшие скопления ядер, что не было характерно для интактной или инфицированных вирусом ВМ, штамм К-796 и штамм М-88 и вирусом АЭК, штамм Тверской культур клеток;

- на 7-е сутки после заражения СМЯ штаммом 75G-63 вируса АЭК наблюдали разрушение монослоя. При этом количество ядер в одной клетке достигало 5-9 за счет слияния мембран близко расположенных клеток. Клетки, зараженные штаммами К-796 и М-88 вируса ВМ и Тверской вируса АЭК, увеличивались в размере в 1,5-3 раза (рис. 2);

- на 9-е сутки после заражения культуры клеток СМЯ штаммом 75G-63 вируса АЭК обнаруживали полное разрушение монослоя и единичные симпласты, содержащие более 10 ядер.

При этом уровень инфекционной активности культуры клеток СМЯ, зараженной штаммом 75G–63 вируса АЭК составил 105,5-106,0 ТЦД50/см3, штаммом Тверской вируса АЭК 104,5-105,0 ТЦД50/см3, штаммом М-88 вируса ВМ - 104,0-105,5 ТЦД50/см3и штаммом К-796 вируса ВМ - 104,75-105,5 ТЦД50/см3.

Таким образом, получена культура клеток СМЯ пригодная для наработки вируссодержащего материала для проведения серологических и молекулярно-генетических исследований.

3.2 Получение антигенов и гипериммунных сывороток от экспериментально зараженных животных

Были получены вирусные антигены и гипериммунные сыворотки к вирусам АЭК и ВМ для решения задачи по изучению возможности дифференциации вирусов АЭК и ВМ с помощью серологических реакций.

Рис. 2 Результаты культивирования вирусов АЭК и ВМ в культуре клеток СМЯ: А) интактная культура СМЯ на 7-е сутки культивирования, х240; Б) культура клеток СМЯ, зараженная штаммом «Тверской» на 7-е сутки культивирования, х320; В) культура клеток СМЯ, зараженная штаммом К-796 на 7-е сутки культивирования, х240; Г) культура клеток СМЯ, зараженная штаммом 75G-63 на 7-е сутки культивирования, х320.

Примечание: стрелкой показан симпласт

Для получения вирусных антигенов использовали культуру клеток СМЯ с 90 %-м монослоем, не отличающуюся по морфологическим признакам от исходной популяции. Клетки культивировали в пластиковых матрасах, объемом 0,5 л. Заражение проводили путем контакта 2–3 см3 вируссодержащей культуральной жидкости (штамм 75G-63 вируса АЭК и штамм М-88 вируса ВМ) с инфекционной активностью 105,0  ТЦД50/см3 с монослоем клеточной культуры в течение 1,5–2 часов при 37±0,5 С. Затем добавляли поддерживающую среду DМЕМ с 2 % FBS. Культуру клеток СМЯ культивировали до проявления характерного ЦПД. После этого проводили 3-кратное замораживание и оттаивание вируссодержащего материала и культуральную жидкость подвергали низкоскоростному центрифугированию (600 g) для осаждения клеточного детрита. Супернатант ультрацентрифугировали при 140 тыс. g в течение 4 ч. Полученный осадок растворяли буферным раствором в 50 раз меньше исходного объема. Полученные антигены использовали для анализа полипептидного состава методом электрофореза в полиакриламидном геле, иммуноблотинга, РДП.

Для получения гипериммунных сывороток вируссодержащий материал (штамм М-88 вируса ВМ с титром 105,0ТЦД50/см3) вводили ягнятам 2-3-месячного возраста в объеме 1-2 см3 интратрахеально и 2-3 см3  интрапульмонально каждые 3 дня в течение месяца. Для получения сыворотки отбор крови проводили каждые 7 дней и исследовали их активность в ИФА (набор фирмы IDVet, Франция). При этом титр антител составил 1:80-1:160. В работе использовали также сыворотки против вируса АЭК, полученные ранее Сидельниковым Г.Д., с титром антител в ИФА 1:80.

3.3 Цитохимический анализ инфицированных клеток

Для выявления вирусных антигенов в монослое инфицированных клеток СМЯ использовали цитохимический вариант ИФА на основе гипериммунных сывороток к вирусу АЭК и конъюгата протеина А с пероксидазой хрена.

Цитоплазма клеток СМЯ и СМК, фиксированных  глютаровым альдегидом, после обработки раствором хромогенного субстрата приобретала красно-коричневое окрашивание. А при фиксировании монослоя 80% охлажденным ацетоном и обработки тем же субстратом наблюдали окрашивание ядер зараженных клеток. В результате проведенных исследований были отработаны основные параметры реакции: рабочее разведение нормальной сыворотки козы, обеспечивающее отсутствие фонового окрашивания, составляло 1:20; рабочее разведение специфических гипериммунных сывороток коз  к вирусу АЭК – 1:80-1:160.

Данный метод позволяет на 3-и сутки культивирования (до проявления цитопатического действия вируса) определять наличие ЛМЖ в культуре клеток СМК и СМЯ, но не дает возможность дифференцировать вирусы АЭК и ВМ.

3.4 Исследование антигенов вируса артрита-энцефалита коз и висна-маеди в иммуноблотинге

Анализ электрофореграмм показал, что полипептидные профили антигенов ВВМ и ВАЭК имеют значительное сходство и состоят в основном из 5 мажорных полос, характерных для ЛМЖ, с молекулярными массами полипептидов от 14 до 135 кДа.

Данные иммуноблотинга показали, что обе гипериммунные сыворотки против вируса АЭК и ВМ реагировали с полипептидами вирусов АЭК и ВМ с молекулярной массой 16, 24, 30 кДа. Установлено, что иммуноблотинг не позволяет дифференцировать вирусы АЭК и ВМ.

3.5 Постановка РДП

РДП входит в перечень реакций, рекомендованных МЭБ для диагностики АЭК и ВМ. Поэтому приготовленные антигены вирусов АЭК и ВМ исследовали в РДП с использованием гипериммунных и специфических сывороток крови от коз и овец из хозяйств РФ, которые были положительными по данным ИФА.

Специфические полосы преципитации обнаруживали как с сыворотками от коз, так и с сыворотками от овец. Это еще раз подтверждает тот факт, что белки вирусов ВМ и АЭК в серологических реакциях имеют схожие антигенные свойства.

3.6 Разработка ПЦР с электрофоретической детекцией

В настоящее время ПЦР и определение нуклеотидной последовательности различных участков геномов возбудителей являются наиболее точным и информативными методами идентификации.

В связи с вышеизложенным для дифференциации ЛМЖ были выбраны три метода: ПЦР-РВ, HRM-анализ и филогенетический анализ.

Основными критериями при разработке тест-системы на основе ПЦР с электрофоретической детекцией для обнаружения участков генома ЛМЖ в пробах крови, молока и молозива от коз и овец разных возрастных групп и пород из хозяйств РФ являлись чувствительность и специфичность компонентов,  не уступающих уже существующим.

На основе анализа нуклеотидного состава генома ЛМЖ рассчитаны специфические праймеры, комплементарные к gag-, env-, pol-генам, которые использовали в дальнейшем для создания тест-систем на основе ПЦР с электрофоретической детекцией и ПЦР-РВ, а так же секвенирования с последующим определением филогенетического родства.

Для выявления генома ЛМЖ методом ПЦР с электрофоретической детекцией использованы вырожденные праймеры, фланкирующие участок env-гена. Полученное значение аналитической чувствительности разработанной тест-системы составило 2,5 lg ТЦД50/см3, специфичность - 100% (протокол №4 от 23. 09. 2011г.).

3.7 Получение рекомбинантных конструкций, несущих встройку gag-, env- и pol-генов

Одним из компонентов тест-систем, применяемых для выявления генома вирусов, должен быть положительный контроль (ПК), который является индикатором условий проведения реакции. Основными требованиями, предъявляемыми к ПК, являются специфичность, безопасность использования и длительный срок его хранения.

В результате клонирования получены рекомбинантные плазмиды (pDrive и pTZ57R), несущие встройку участка гена вирусов АЭК (штаммы Тверской и 75G-63) и ВМ (штаммы М-88, К-796) размером 178 п.о., 213 п.о., 395 п.о. для gag-, env- и pol-генов, соответственно. Специфичность рекомбинантных плазмид проверена в ПЦР с электрофоретической детекцией и ПЦР-РВ, HRM-анализе. Полученные конструкции использованы в дальнейшем в качестве ПК в тест-системах для выявления ЛМЖ методом ПЦР с электрофоретической детекцией, ПЦР-РВ и HRM-анализа.

3.8 Изучение филогенетического родства музейных штаммов лентивирусов мелких жвачных

Для дифференциации ЛМЖ в 2004 г. Shah предложил классификацию на основе анализа генома, по которой ЛМЖ делятся на группы: A, B, C, D, Е. Группа А включает прототипы вируса ВМ: субтипы А1, А2 выделены от овец; А5, А7 изолированы от коз; А3, А4, А6 изолированы от коз и овец. Прототипы вируса АЭК, изолированные от коз, составляют группу В, включающую  В1 и В2 субтипы. Два штамма ЛМЖ, выделенные от коз из Норвегии и Швейцарии, предварительно классифицируют как новые группы С и D, соответственно. На данный момент в Италии выделена еще одна группа – группа Е [10, 11, 13].

Для дифференциации ЛМЖ нами был применен метод нуклеотидного секвенирования участков gag-, pol- и env-генов штаммов К-796, М-88 вируса ВМ,  штамма Тверской вируса АЭК.

При построении филогенетических древ использовали метод Neighbor Joining пакета программ Mega 4.0. Для определения геногруппы изучаемых штаммов ЛМЖ использовали произвольную выборку из опубликованных последовательностей pol-, gag- и env-генов, представленных в базе данных GenBank.

Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей gag-гена штаммов К-796, М-88 вируса ВМ показал их наибольшее сходство с представителями группы А ЛМЖ (рис. 3). В данную группу также входят штаммы, выделенные в США, Англии, Исландии [11, 12]. Топология филогенетического древа указывает на высокую вероятность принадлежности штаммов М-88 и К-796 ЛМЖ, находящихся в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакдемии, к группе А, в которую входят штаммы и изоляты, выделенные в Исландии. В группу А входят прототипы вируса ВМ, что подтверждает данные о происхождении изучаемых штаммов.

Дендрограмма, построенная на основе участка gag-гена (рис. 3), показала принадлежность штамма Тверской вируса АЭК к группе В, в которую входят штаммы, выделенные в США, Швейцарии [11, 12]. Результаты исследований дают основания предполагать, что штамм Тверской вируса АЭК занесен в Россию с инфицированным импортированным скотом.

Рис. 3 Дендрограмма, отражающая положение штамма Тверской вируса АЭК и штаммов М-88 и К-796 вируса ВМ на филогенетическом древе. Основана на нуклеотидных последовательностях gag-гена ЛМЖ

При анализе дендрограмм, построенных на основе изучения env- и pol-генов, штаммы М-88 и К-796 вируса ВМ так же были отнесены к одной группе (группе А), а штамм Тверской вируса АЭК - к группе В. Полученные результаты подтверждают возможность дифференцировать эти вирусы на основе  gag-гена.

3.9 Разработка ПЦР в режиме реального времени для выявления и дифференциации вирусов артрита-энцефалита коз и висна-маеди

Одним из методов дифференциации вирусов ВМ от АЭК является использование ПЦР-РВ с праймерами и зондами, подобранными на высоко вариабельные области их генома.

Подбор типоспецифических праймеров.

В связи с тем, что праймеры, использованные в ПЦР с электрофоретической детекцией, подобраны на env-ген и фланкируемый ими фрагмент составляет 213 п.о., что является подходящим условием для постановки ПЦР-РВ, мы использовали данные олигонуклеотиды в ПЦР-РВ.

При разработке ПЦР-РВ ставилась задача не только выявить геном ЛМЖ, но и дифференцировать вирусы ВМ и АЭК. Данное условие выполнено при использовании подобранных нами ДНК-зондов, комплементарных участку env-гена только к вирусу АЭК (Z CAEV) и к вирусу ВМ (Z OOP). Применение вырожденных олигонуклеотидов и ДНК-зондов увеличило вероятность выявления гомологичных вирусов с помощью ПЦР-РВ. Полученное значение аналитической чувствительности данной реакции составило 1,5 lg ТЦД50/см3. Специфичность предложенного метода равна 100 %. Разработанная тест-система прошла комиссионные испытания с положительным результатом на базе ГНУ ВНИИВВиМ (протокол №4 от 23. 09. 2011г.).

3.10 Проведение HRM- анализа

Одним из методов дифференциации близкородственных вирусов является HRM-анализ, позволяющий обнаружить единичные нуклеотидные замены в исследуемой последовательности благодаря различию температурных профилей продуктов реакции.

Для дифференциации возбудителей ВМ и АЭК в работе использованы штаммы вируса ВМ: М-88, К-796 и штамм вируса АЭК – Тверской. Для амплификации использовали вырожденные праймеры к env-гену.

Анализ кривых плавления с высоким разрешением исследуемых штаммов ЛМЖ показал наличие одного пика для каждого образца, что свидетельствует о присутствии специфичного продукта реакции. Диапазон температурных пиков соответствовал среднему значению 83,1±0,1 °С для штаммов М-88 и К-796 вируса ВМ, а для штамма Тверской вируса АЭК - 84,1±0,1 °С. Различные значения температурных пиков для образцов, принадлежащих к разным генотипам, подтверждают структурные различия в составе ПЦР-продуктов. При анализе температурных пиков плавления данные штаммы разделены на две группы (рис. 4).

Таким образом, в результате секвенирования, HRM-анализа, ПЦР-РВ, показано, что с помощью методов анализа генома можно дифференцировать штаммы вирусов АЭК и ВМ, на примере изучения вирусов, депонированных в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

Рис. 4 Результаты HRM- анализа

Примечание: ось ординат - уровень флюоресценции; ось абсцисс – температура плавления ПЦР-продуктов

3.11 Проведение мониторинговых исследований на наличие ЛМЖ в хозяйствах РФ

Опубликованные данные ряда зарубежных ученых указывают, что ЛМЖ распространены во многих странах мира [1, 11]. Установлено, что вирусы ВМ и АЭК поражают как коз, так и овец. В результате роста импорта мелкого рогатого скота из стран Европы, являющихся неблагополучными по ЛМЖ, высок риск заноса и дальнейшего распространения этих болезней на территории РФ.

Поэтому одной из задач работы являлось проведение мониторинговых исследований проб крови, сывороток крови, молока и молозива от мелкого рогатого скота. За период 2007-2011 гг. исследовано 1783 проб из хозяйств различных регионов РФ.

При  обследовании хозяйств использовали ПЦР с электрофоретической детекцией, а также РДП, ИФА (набор фирмы IDVet, Франция).

Обнаружение по результатам ПЦР с электрофоретической детекцией, РДП и ИФА положительно реагирующих животных из хозяйств Тверской, Ленинградской, Брянской, Ивановской, Калужской областей указывает на наличие циркуляции вируса в Центральном и Северо-Западном административных округах.

Все исследованные, в том числе, ПЦР, ИФА и РДП-позитивные животные не имели клинических признаков заболевания. Возрастных или породных особенностей среди положительно реагирующих особей не отмечено.

4. ВЫВОДЫ

  1. Получен штамм диплоидных клеток синовиальной мембраны ягненка (СМЯ) и изучены его биологические свойства. Показана чувствительность клеток СМЯ к вирусам АЭК и  ВМ. При этом уровень инфекционной активности штамма 75G–63 вируса АЭК составил 5,5 -6,0 lg ТЦД50/см3, штамма Тверской вируса АЭК – 4,5-5,0 lg ТЦД50/см3, штамма М-88 вируса ВМ – 4,0-5,5 lg ТЦД50/см3 и штамма К-796 вируса ВМ – 4,75-5,5 lg ТЦД50/см3.
  2. Показано, что серологические реакции (иммуноблотинг, РДП, ИФА) и полипептидный электрофорез в полиакриламидном геле не позволяют дифференцировать возбудителей АЭК и ВМ.
  3. Разработана тест-система ПЦР с электрофоретической детекцией с аналитической чувствительностью 2,5 lg ТЦД50/см3, позволяющая выявлять наличие генома ЛМЖ (вирусов ВМ и АЭК) в культуральном материале, в крови, молоке, молозиве инфицированных животных.
  4. На основе подобранных ДНК-зондов разработана тест-система ПЦР в режиме реального времени с аналитической чувствительностью 1,5 lg ТЦД50/см3, позволяющая дифференцировать возбудителей АЭК и ВМ.
  5. На основании данных нуклеотидного секвенирования участков gag-, env-, pol-генов и анализа филогенетических древ установлена наибольшая гомология вируса ВМ штамма М-88 и К-796 с группой А, а вируса АЭК штамма Тверской - с группой В ЛМЖ.
  6. Анализ температурных пиков  плавления (HRM-анализ) ПЦР-продуктов позволяет дифференцировать возбудителей АЭК и ВМ.
  7. Установлена циркуляция ЛМЖ в хозяйствах Тверской, Ленинградской, Брянской, Ивановской, Калужской областей РФ.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

    1. Полученный штамм диплоидных клеток СМЯ рекомендуется для изучения вирусов АЭК и ВМ и пригоден для накопления вируссодержащего материала с целью получения вирусных антигенов и проведения молекулярно-генетических исследований.
    2. «Методические положения по выявлению провирусной ДНК лентивирусов мелких жвачных методом полимеразной цепной реакции», рассмотренные на секции «Инфекционная патология животных» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (23. 09. 2011г.) и утвержденные академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины РАСХН Смирновым А.М. (10.11.2011г.), рекомендуются для использования в специализированных ПЦР-лабораториях при проведении диагностических исследований и научно-исследовательских работ.
    3. «Методические положения по выявлению и дифференциации ЛМЖ методом полимеразной  цепной реакции в режиме реального времени» рассмотренные на секции «Инфекционная патология животных» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (23. 09. 2011г.) и утвержденные академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины РАСХН Смирновым А.М. (10.11.2011г.), предлагаются для дифференциальной диагностики ЛМЖ в специализированных ПЦР-лабораториях.

6. СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

  1. Архипов, Н.И. Медленные инфекции животных / Н.И. Архипов, И.А. Бакулов,  Л.И. Соковых. – М.: Агропромиздат, 1987.- 190 с.
  2. Бурдинский, В.Г. Выявление геномов возбудителей аденоматоза и ВМ овец с помощью полимеразной цепной реакции: дис. …канд. вет. наук: 03.00.06/ Бурдинский Владимир Геннадьевич. – Покров, 2009. – 114 с.
  3. Волкова, И. Ю. Эпизоотологический мониторинг и совершенствование мер борьбы с артритом–энцефалитом коз в РФ: автореф. дис.  …канд. вет. наук / Волкова Ирина Юсупжановна. – Покров, 2008. – 25 с.
  4. Диагностика скрепи и висны овец / В.А. Шубин, В.С. Суворов, В.Л. Кувшинов, Р.Д. Поздеев, В.В. Исаев, А.К. Моругин // Ветеринария. – 1994. – N 2. – С. 6-11.
  5. Клиническая и патоморфологическая диагностика артрита–энцефалита коз / И.Ю. Волкова, А.Ю. Чичикин, А.А. Стрижаков, С.Ж. Цыбанов // Ветеринария. - N.1 – 2007. – С. 23–25.
  6. Кувшинов, В.Л. Висна овец романовской породы: гистологические изменения головного мозга / В.Л. Кувшинов, М.А. Смирнов // Российский ветеринарный журнал СХЖ. – 2009. – N 1. – С. 38-41.
  7. Сидельников, Г.Д. Биологические свойства вируса артрита–энцефалита коз: дис. … канд. вет. наук 16.00.03/ Сидельников Георгий Дмитриевич. – Покров, 2009. – 117с.
  8. Haase, A.T. Amplification and detection of lentiviral DNA inside cells / A.T. Haase, E.F. Retzel, K.A.cStaskus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1990. – Vol. 87. – P. 4971-4975.
  9. Demonstration of coinfection with and recombination by caprine arthritis-encephalitis virus and maedi-visna virus in naturally infected goats / G. Pisoni, G. Bertoni, M. Puricelli, P. Moroni // J. of  Virology. – 2008. – Vol. 81, N. 10. – Р. 4948-4955.
  10. Direct evidence for natural transmission of small ruminant lentiviruses of subtype A4 from goats to sheep and vice versa / C. Shah, J.B. Huder, J. Bni, M. Schnmann, J. Mhlherr, H. Lutz, J. Schpbach // J. of Virology. – 2004. – Vol. 78, N. 4. – Р. 7518-7522.
  11. Genome Analysis of Small-Ruminant Lentivirus Genotype E: a CaprineLentivirus with Natural Deletions of the dUTPase Subunit, vpr-Like Accessory Gene, and 70-Base-Pair Repeat of the U3 Region/ R.S. Reina, E.Grego, L. Bertolotti, D. De Meneghi, S. Rosati // J. of Virology. – 2009. – Vol. 83, N.2. – Р. 1152-1155.
  12. Molecular characterization and phylogenetic study of maedi visna and caprine arthritis-encephalitis viral sequences in sheep and goats from Spain / R. Reina, MI. Mora, I. Glaria, I. Garcia, C. Solano, L. Lujan, JJ. Badiola, A. Contreras et al. // Virus Res. – 2006. – Vol. 121, N. 2. – P. 189-198.
  13. Zanoni, R. G. Phylogenetic analysis of small ruminant lentiviruses / R. G. Zanoni // Journal of General Virology. – 1998. – Vol. 79. – P. 1951–1961.

7. СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Барышникова, Е.И. Идентификация генома ЛМЖ методом ПЦР/ С.Ж. Цыбанов, Д.В. Колбасов, Е.И. Барышникова // Ветеринария. - 2009. -№8. – С. 58-59.
  2. Барышникова, Е.И. Новая клеточная система для изучения ЛМЖ/ Е.И. Барышникова, О.Л. Колбасова // Задачи ветеринарной науки в реализации доктрины продовольственной безопасности РФ: материалы Международной научно-практической конференции / ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. – Покров, 2011. -  С. 253-257.
  3. Барышникова, Е.И. Сравнительная характеристика биологических свойств ЛМЖ / Е. И. Барышникова, А.С. Малоголовкин, О.Л. Колбасова, С.Ж. Цыбанов // Вопросы вирусологии.  - 2011. – №4. – С. 42-45.
  4. Барышникова, Е.И. Мониторинг АЭК и ВМ овец в популяциях мелкого рогатого скота Российской Федерации/ Е.И. Барышникова, А.С. Малоголовкин // Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины: материалы конференции молодых ученых/ ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. – Покров, 2009. – С. 99-102.
  5. Барышникова, Е.И. Филогенетический анализ некоторых штаммов ЛМЖ на основе участков pol-, gag-, и env-генов / Е.И. Барышникова, А.С. Малоголовкин, О.Л. Колбасова // Молекулярная диагностика -2010: материалы Международной конференции. -  М., 2010. -  Т. 2. – С. 57-59.
  6. Конструирование рекомбинантной плазмиды для диагностических тест-систем, выявляющих вирус АЭК/ Е.И. Барышникова, А.С. Казакова, С.Ж. Цыбанов, А.С. Малоголовкин // Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения: материалы Международной научно-практической конференции / УГСХА. – Ульяновск: ГСХА, 2009. - Т.4 — С.10-13.
  7. Нозогеография АЭК/ А.Ю. Чичикин, А.В. Книзе, Барышникова Е.И., О.Л. Колбасова // Ветеринария. -  2011. - № 2. – С. 19-22.
  8. Baryshnikova, E.I. Evaluation of env-gene HRM assay for genetic subtyping of Small-ruminant lentiviruses / E.I. Baryshnikova, A.S. Malogolovkin, O.L. Kolbasova // 5th Annual meeting Epizone «Bluetongue and other vector borne diseases» 11-14 April 2011. - Arnhem, The Netherlands, 2011. -  P. 234.
  9. Sidelnikov, G.D. Detection of caprine arthritis encephalitis virus in the Russian Federation/ G.D. Sidelnikov, D.V. Kolbasov, E.I. Baryshnikova // 3th Annual meeting Epizone «Crossing borders» 12-15 May 2009. - Antalya, Turkey, 2009. - P. 173.

       

  1. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АЭК – артрит-энцефалит коз

ВМ – висна-маеди

ДНК – дезоксирибонуклеиновая  кислота

ЛМЖ – лентивирусы мелких жвачных

ПЦР – полимеразная  цепная реакция

ПЦР-РВ – полимеразная  цепная реакция в режиме реального времени РДП – реакция  диффузионной преципитации

СМК – синовиальная  мембрана козленка

СМЯ – синовиальная мембрана ягненка

Отпечатано в типографии ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии,

г. Покров Владимирской области

Тираж 80 экз.







© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.