WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

  На правах рукописи

ФРЕЙМАН

Георгий Ефимович

ДИАГНОСТИКА ТУБЕРКУЛЕЗА  В СОВРЕМЕННОЙ

ЦЕНТРАЛИЗОВАННОЙ МИКОБАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ

ЛАБОРАТОРИИ г. МОСКВЫ

03.02.03 микробиология

14.02.03 общественное здоровье и здравоохранение

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва - 2012

Работа выполнена в Московском городском научно-практическом центре борьбы с туберкулезом Департамента здравоохранения города Москвы (МНПЦБТ), г.Москва.

Научные руководители:  доктор биологических наук

  Макарова Марина Витальевна

 

доктор медицинских наук, профессор

Сельцовский Петр Петрович

Официальные оппоненты:  доктор биологических наук, профессор 

  Дмитриев Георгий Александрович

доктор медицинских наук

Богородская Елена Михайловна

Ведущая организация: Центральный научно-исследовательский 

  институт  туберкулеза Российской академии

  медицинских наук (ЦНИИТ РАМН), г.Москва

Защита состоится  “15” марта 2012 года в _____  часов  на заседании Диссертационного совета Д 208.046.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФБУН «Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, 10.

Автореферат разослан “ ___”  _______  2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук О.Ю. Борисова

ОБЩАЯ  ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Быстро прогрессирующее увеличение числа случаев туберкулеза с лекарственной устойчивостью (ЛУ) возбудителя  к противотуберкулезным препаратам (ПТП) и, особенно, с множественной (МЛУ) лекарственной устойчивостью является чрезвычайно серьезной проблемой здравоохранения (Дорожкова И.Р. и др., 2005; Литвинов В.И. и др. 2008; Перельман М.И., Михайлова Ю.В., 2008; Heifets L., Desmond E., 2005; Monedero I., Caminero J., 2009; Small P., 2009; Jassal M., Bishai W., 2009). ВОЗ рекомендовала для лабораторных служб в рамках Национальной программы борьбы с туберкулезом считать первоочередной задачей выявление заразных случаев туберкулеза легких, унификацию методов бактериологических исследований, а объединение лабораторий осуществлять на основе стандартизованных методик (ВОЗ, 1998г). Эти рекомендации были учтены в руководящих документах (приказ МЗ РФ от 21.03.2003г.) и Национальном руководстве (п/р Перельмана М.И., 2007г.). Кроме того, в последние десятилетия значительно увеличилось количество микобактериозов – патологии, вызываемой нетуберкулезными микобактериями (НТМБ), что в значительной степени  связано  с улучшением их диагностики, которую в большинстве случаев проводят противотуберкулезные учреждения (Оттен Т.Ф., Васильев А.В., 2005; Литвинов В.И. и др., 2008; Heifets L., 2005; Griffith D. et al., 2007; Thomson R. Сhanging, 2010; Winthrop K., 2010). Учитывая это, лабораторные микробиологические и молекулярно-генетические методы занимают значительное место в комплексной диагностике туберкулеза и микобактериозов и контроле за эффективностью лечения этих заболеваний.

Широко используемые в настоящее время классические методы выделения, идентификации микобактерий (МБ) и определения их лекарственной чувствительности (ЛЧ) занимают длительное время. В связи с этим, врачи – фтизиатры, не дожидаясь результатов бактериологических исследований ЛЧ, вынуждены назначать эмпирические режимы химиотерапии, которые не всегда оказываются адекватными.

Таким образом, на современном этапе развития эпидемического процесса туберкулезной инфекции является актуальным снижение (по времени) сроков выделения, идентификации, определения лекарственной чувствительности микобактерий с последующим применением эффективных схем профилактики и лечения туберкулеза и микобактериозов.

В сложившихся условиях эффективность борьбы с туберкулезом и микобактериозами в значительной степени  определяется разработкой и внедрением новых принципов и комплекса методов бактериологических и молекулярно-генетических исследований, а также совершенствованием организационных мероприятий (Голышевская В.И. и др., 2006; Дорожкова И.Р. и др., 2005; Albert  H. et al., 2002;  Bardarov S. et al., 2003; Drobniewski F.  et al., 2005; Dorman S., 2010; Gupta S. et al., 2010).

       В связи с вышеизложенным, представлялось перспективным в условиях функционирования крупного мегаполиса (г.Москва) организовать централизованную микобактериологическую лабораторию, оснастить ее современным медицинским оборудованием и приборами, на основе которых, используя передовые молекулярно-генетические методы экспресс-диагностики, значительно сократить сроки выделения, идентификации и определения лекарственной чувствительности возбудителя туберкулеза. Это, в свою очередь, позволит внедрить новые более эффективные схемы профилактики и лечения туберкулеза.

Цель исследования - в условиях крупного мегаполиса создать централизованную микобактериологическую лабораторию для внедрения и использования комплекса современных ускоренных бактериологических и молекулярно-генетических методов выделения, идентификации и определения лекарственной устойчивости микобактерий. 

Задачи исследования

  1. Оценить эпидемиологическую ситуацию по туберкулезу как основу для определения потребности в микобактериологических исследованиях с использованием автоматизированных систем.
  2. Апробировать и поэтапно внедрить в практику централизованной микобактериологической лаборатории г.Москвы унифицированный единый алгоритм обследования пациентов с целью ранней диагностики туберкулеза, дифференциации его от микобактериозов и определения ЛЧ возбудителя.
  3. Провести сравнительное изучение наиболее широко применяющихся в мировой практике методов выделения, идентификации и определения ЛЧ микобактерий.
  4. Изучить спектр лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза (МБТ) и НТМБ,  проанализировать частоту и сроки обнаружения множественной и широкой  лекарственной устойчивости возбудителя у впервые выявленных больных туберкулезом в г. Москве.
  5. Обосновать в соответствии с рекомендациями ВОЗ централизацию, как наиболее оптимальную форму организации микобактериологических исследований, позволяющую усовершенствовать диагностику туберкулеза и микобактериозов в условиях г.Москвы.

Научная новизна

Проведенный в условиях централизованной микобактериологической лаборатории г.Москвы сравнительный анализ эффективности существующих  стандартных бактериологических и молекулярно-генетических методов выделения, идентификации и определения лекарственной чувствительности МБ позволил разработать схему лабораторной диагностики туберкулеза, представляющую собой алгоритм раннего выделения возбудителя, значительно сократившего сроки получения результатов, тем самым, оптимизировать диагностику и лечение микобактериальных инфекций.

Показаны различия лекарственной чувствительности МБТ и НТМБ, выделенных из клинического материала, проведен мониторинг широкой лекарственной устойчивости и установлено, что частота выделения из диагностического материала возбудителя туберкулеза, обладающего множественной лекарственной устойчивостью 7,7%, широкой лекарственной устойчивостью, не превышает 1,9% случаев.

На основе новых данных, выполняя рекомендации ВОЗ, доказана целесообразность и необходимость централизации микробиологических исследований в условиях г.Москвы, дающей возможность эффективно использовать современное высокотехнологичное оборудование, ускоренные и стандартизованные методы микобактериологических и молекулярно-генетических исследований, что позволяет решить ключевую задачу стратегии ВОЗ в лечении туберкулеза.        Разработана унифицированная методика расчета потребности в микобактериологических исследованиях материала на жидких питательных средах в год  для пациентов, нуждающихся в ускоренном обследовании. В отличие от предшествующих, данная методика включает расчет для обследования впервые выявленных больных и рецидивов заболевания, а также больных, требующих дифференциальной диагностики легочного заболевания, с учетом определения лекарственной чувствительности возбудителя к противотуберкулезным препаратам.

Практическая значимость работы

Разработан оптимальный комплекс (алгоритм) методов диагностики микобактериальных инфекций для централизованной бактериологической лаборатории (ЦБЛ) г.Москвы, позволяющий осуществлять быстрое и раннее  выявление наиболее опасной категории пациентов – бактериовыделителей, идентифицировать вид выделенных штаммов КУМ с определением ЛУ для своевременной корректировки противотуберкулезной терапии. 

Проведенные исследования показали преимущества централизации микобактериологической диагностики, выражающиеся в сокращении сроков выявления и выделения возбудителя туберкулеза и микобактериозов, определения его вида и ЛЧ к ПТП, оптимизации расходов для их проведения и увеличении числа исследований, проводимых по единому протоколу, применении унифицированных и введении в процесс лабораторной диагностики дополнительных ускоренных стандартизованных методов и современного высокотехнологичного оборудования, увеличении числа обслуживаемых противотуберкулезных учреждений.

       Разработана для централизованной микобактериологической лаборатории г. Москвы лабораторная автоматизированная компьютерная программа на основе Лабораторной информационной системы для учета и анализа результатов исследования.

Созданы единая интегрированная полицевая база данных на бактериовыделителей и банк данных  о штаммах НТМБ и  M.tuberculosis с множественной и широкой лекарственной устойчивостью к ПТП, выделенных от впервые выявленных больных, которая позволяет мониторировать состояние ЛЧ на территории г. Москвы у конкретного пациента.

Разработан способ расчета потребности в диагностических микобактериологических исследованиях материала на жидких питательных средах в год  для пациентов, нуждающихся в ускоренном обследовании, позволяющий обосновать потребность в автоматизированных системах.

Внедрение результатов работы в практику

Разработанный алгоритм раннего выявления бактериовыделителей, ускоренного выделения и определения ЛЧ микобактерий расширяет возможности бактериологической диагностики туберкулеза и микобактериозов в работе ЦБЛ Московского научно-практического центра борьбы с туберкулезом и использован для оптимизации работы микобактериологических лабораторий в городах-мегаполисах России.

В период с 2005 по 2007 годы целесообразность функционирования ЦБЛ для диагностики туберкулеза в мегаполисе была доказана на основе использования алгоритма при проведении диагностических исследований на туберкулез населения более 1 млн. человек. В 2008-2009 гг. данное обоснование было подтверждено путем дальнейшего расширения обслуживаемой территории г.Москвы с населением более 7,6 млн. человек, внедрения новых методов исследования и включения нового технологического оборудования.

Результаты проведенных исследований по изучению возбудителя микобактериозов включены в методические рекомендации №19 «Выделение и идентификация нетуберкулезных микобактерий микробиологическими методами», утвержденных Департаментом здравоохранения города Москвы 21.05.2009г. 

В 2012 году МНПЦБТ готовит к изданию пособие «Лабораторная диагностика туберкулеза и микобактериозов», в отдельном разделе которого обобщен опыт создания ЦБЛ в г. Москве с учетом концепции ВОЗ и международных требований стандартизации бактериологических исследований. 

  Материалы  исследования включены в курс лекций и практических занятий на кафедре фтизиатрии ГБОУ ДПО  РМАПО Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации. 

Положения, выносимые на защиту

  1. Централизация является наиболее целесообразной формой организации микобактериологических исследований в условиях г.Москвы, позволяющей эффективно использовать оборудование и реактивы, осуществлять исследования с применением современных стандартизованных методов по единому протоколу.
  2. Использование в исследовании  автоматизированных анализаторов на основе применения жидких питательных сред для культивирования биологического материала и определения лекарственной чувствительности возбудителя позволило выделить на 12% больше число штаммов микобактерий туберкулеза, на 22,9% - нетуберкулезных микобактерий и в 3,2 раза сократить сроки получения результатов.
  3. Применение высокоэффективной жидкостной хроматографии и БИОЧИПов позволяет получить результаты видовой идентификации микобактерий в течение 48 часов по сравнению с микробиологическими методами.
  4. Разработанный алгоритм микробиологического и молекулярно-генетического обследования пациентов в условиях ЦБЛ г.Москвы для ранней диагностики микобактериальных инфекций и определения ЛЧ возбудителя к ПТП позволил сделать более эффективной диагностику туберкулеза.

Апробация работы

Диссертация апробирована на заседании Ученого совета МНПЦБТ с участием сотрудников кафедры фтизиатрии ГБОУ ДПО  РМАПО Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, протокол № 5 от 8  сентября 2011 года.

Материалы диссертации представлены на научно-практических конференциях на VIII Всероссийском съезде фтизиатров (Москва, 2007); VI и VIII Московской Ассамблее «Здоровье столицы» (Москва, 2007, 2009);  II Научно-практической конференции «Современные технологии и методы диагностики различных заболеваний, лабораторный анализ» (Москва 2009), заседаниях Ученого совета МНПЦБТ; 

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 16 научных работ, в том числе 5 статей в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, 1 статья – в  других изданиях,  3 - в сборниках научных трудов,  6 – в материалах съездов и конференций, 1 - методические рекомендации.

Объем и структура диссертации

       Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, главу, посвященную материалам и методам исследований, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций. Диссертация иллюстрирована 16 таблицами и 4 рисунками. Список использованной литературы включает 146 источников, в том числе 33 отечественных и 113 иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

  Материалы и методы исследований. За период с 2005г. по 2009г. обследовано 12248 пациентов, выявлено 4012 бактериовыделителей (32,75%), выполнен 441131 посев 207656 проб патологического материала, в том числе 35878 – на жидких питательных средах от пациентов и больных из восьми ПТД г. Москвы, стационара и Консультационного отделения МНПЦБТ. Из 12919 проб выделена культура M. tuberculosis, из 742 проб - НТМБ. С помощью МГМ исследовано 16594 штамма и 748 штаммов - с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Клинические штаммы выделялись из мокроты, экссудатов,  промывных вод и аспирата из бронхов, послеоперационного материала. Лаборатория является участником  Федеральной системы внешней оценки качества. Источники данных - статистические формы учета (ф.33, ф.8).

         Микробиологические методы исследования. Патологический материал, полученный от обследуемых лиц,  перед посевом в жидкую (Миддлбрук 7Н9 в автоматизированной системе) и на плотную Левенштейна-Йенсена (Л-Й) питательные среды подвергали деконтаминации, концентрации и исследовали методом люминесцентной микроскопии на наличие кислотоустойчивых микроорганизмов.

Принадлежность выделенных штаммов микобактерий к МБТ или НТМБ и идентификацию до вида подтверждали культуральными и биохимическими методами в соответствии с действующими рекомендациями.

Определение ЛЧ клинических штаммов МБ к ПТП основного ряда проводили в жидкой питательной среде в автоматизированной системе, а к препаратам резервного ряда и фторхинолонам – на среде Л-Й. В качестве контроля использован лекарственно-чувствительный вирулентный стандартный штамм Mycobacterium tuberculosis H37Rv ATCC № 25618 из коллекции МНПЦБТ.

Молекулярно-генетические исследования. Материал от впервые выявленных больных, лиц с подозрением на туберкулез  или развитие рецидива заболевания с целью раннего обнаружения МБТ и мутаций, ответственных за устойчивость к  изониазиду  и  рифампицину,  исследовали  с  помощью ТБ-БИОЧИП (МЛУ), а к фторхинолонам - ТБ-БИОЧИП-2. Применяя экспериментальную версию биологических микрочипов «IMS», метод ВЭЖХ по методике, предложенной CDC  (США, 1996 г.) идентифицировали МБ туберкулезного комплекса от НТМБ. Тест-системы с использованием биологических микрочипов разработаны Институтом молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН совместно с МНПЦБТ. Апробация и клиническая адаптация проводилась нами в отделе проблем лабораторной диагностики туберкулеза на штаммах, выделенных в бактериологической лаборатории.

Программное обеспечение. Для автоматизации работы применялась специально разработанная для ЦБЛ отделом «Лабораторные Информационные Системы» ЗАО «Фирмы ГАЛЕН» лабораторная информационная система «АЛИСА», объединившая микобактериологические и молекулярно-генетические исследования. 

Статистическую обработку и анализ данных проводили с помощью компьютерных программ  Microsoft®Office Excel 2003.Оценку достоверности различий качественных признаков и долей в группах проводили с использованием критерия Фишера (для двух параметров) и 2-критерия (для трех и более параметров), определяли среднее значение, его стандартное отклонение.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Эпидемиологическая ситуация, как показатель необходимости централизации микобактериологических исследований

В качестве модели обследования населения городов-мегаполисов для разработки алгоритма ускоренного выявления наиболее опасной категории больных – бактериовыделителей на первом этапе проведено исследование в Восточном Административном округе (ВАО) г.Москвы, на территории которого проживает 1380500 человек. Противотуберкулезную помощь населению округа под руководством МНПЦБТ  осуществляют три ПТД: № 8, обслуживающий 424700 чел., № 17 – 396300 чел., № 21 – 559500 чел. Исследования проводили в два этапа.

1-й этап исследования продолжался в течение 3-х лет (2005-2007 гг). Для расчета количества необходимых анализов использовали данные о  численности населения, определенной во время переписи 2002 года, и эпидемиологических показателей по туберкулезу.  Показатели заболеваемости туберкулезом в годы, предшествующие началу исследований, на 100 тыс. населения по г.Москве: в 2003г. –  47,3, 2004г. – 43,4, в том числе постоянных жителей в 2003 г. – 29,1, в 2004г. – 30,8. Заболеваемость бациллярным туберкулезом на 100 тыс. населения составила в 2003г. – 11,7, в 2004г. – 12,4, в том числе по ВАО, в 2003г. – 12,5, в 2004г. – 14,9. Контингенты больных активным туберкулезом на 100 тыс. населения в 2003 г. – 105,0, в 2004г. – 96,0, в том числе по ВАО, в 2003г. – 105,1, в 2004г. – 98,7. С учетом показателей, кратности рекомендуемого обследования (Приказ № 109 МЗ РФ от 21.03.2003г.) произведен расчет необходимого количества анализов (на примере ВАО) в год (таблица 1).

Таблица 1.

Расчет потребности в микобактериологических исследованиях

в год для групп пациентов, нуждающихся в обследовании на жидких питательных средах (на примере ВАО), на 2005 г.

Показатели:

Категории больных

Всего

впервые выявленные

диагности-ческие

подозрение на рецидив

А-число пациентов, абс

191**

315

27

533

B-коэффициент культуральных исследований в год на 1 пациента

(приказ № 109)

5

3

5

13

C-число посевов диагностического материала в год, абс

955

945

135

2035

D-число бактериовыделителей, абс  #

97**

35

27

159

E-число исследований ЛЧ в год (7 исследований на 1 больного) *

679

245

189

1113

F-общее число необходимых исследований в год

1634

1190

324

3148

# – по результатам культурального исследования за 2004 г.

* – определение ЛЧ к 4 препаратам 1-го ряда и пиразинамиду + 2 контроля =7 пробирок (расчет скорректирован в 2008 г, до этого чувствительность к пиразинамиду не определяли)

**- статистическая форма ф.33

C = AxB

E = Dx7

F = С+E

Расчет произведен для групп пациентов, которым требуется исследование на жидких питательных средах:

–  пациентов с клиническими и рентгенологическими признаками поражения органов дыхания, требующими дифференциальной диагностики;

–  больных, взятых на диспансерный учет с впервые установленным диагнозом туберкулеза легких; 

–  лиц из контингентов, состоящих на учете по туберкулезу, с остаточными посттуберкулезными изменениями и  клиническими признаками рецидива заболевания.

Установлено, что расчетная потребность в культуральном исследовании диагностического материала в автоматизированной системе (АС) в год для населения ВАО (1,4 млн.чел.) – 2035. Учитывая количество бактериовыделителей и число лекарственных препаратов, к которым возможно определение ЛЧ в одном приборе АС,  необходимое количество исследований на ЛЧ в системе для населения  ВАО составило 1113. Таким образом, суммарно необходимо ежегодное проведение 3148 (в среднем 3000-3300) микробиологических исследований.

По данным фирмы – производителя, мощность одного прибора АС– 8000 исследований в год,  что соответствует данным, полученным в МНПЦБТ.

В 2005 году общее количество выполненных исследований для наиболее эпидемически опасной группы больных с бактериовыдением в ПТД ВАО, составило 3030 посевов и 1030 исследований ЛЧ. (таблица 2).

Таблица 2.

Микобактериологические исследования, выполненные в ЦБЛ

на жидких питательных средах для ВАО за 2005-2007гг.

Категории

пациентов

ГОДЫ И ПОКАЗАТЕЛИ

2005г.

2006г.

2007г.

кол-во пациентов

кол-во проб

кол-во бактериовыделителей

кол-во ис-следо-ваний ЛЧ

кол-во пациентов

кол-во проб

кол-во бактерио-выделителей

кол-во ис-следо-ваний ЛЧ

кол-во пациентов

кол-во проб

кол-во бак-териовыделителей

кол-во ис-следований ЛЧ

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

подозрение на туберкулез

998

1513

95

350

698

1051

83

370

627

946

75

420

впервые

выявленные больные

339

655

92

405

331

648

73

475

370

781

114

515

подозрение на рецидив

277

441

66

215

178

308

40

190

223

378

72

240

контроль

лечения

291

421

40

60

126

272

45

135

223

385

52

265

ВСЕГО

1905

3030

293

1030

1333

2279

241

1170

1443

2490

313

1440

На 2 этапе в диагностическое обследование с использованием автоматизированных систем включены еще 5 диспансеров, обслуживающих 3406202 человек: ПТД № 5 ЮАО (989884 чел.), ПТД № 14 (547893 чел.) и № 20 ЗАО  (530407 чел.), ПТД № 16 САО (541118 чел.), а затем ПТД № 13 СЗАО (796900 чел.). В итоге общая численность населения, охваченного ранней диагностикой с применением АС, составила 4786702 человека.  Численность всего обслуживаемого ЦБЛ населения, в том числе, с применением классических методов исследования, составила 7687056 человек, т.е. 73,1% всего населения г. Москвы.

Следовательно, применение расчета потребности, использование современного высокоэффективного оборудования, стандартизованных методов диагностики и научно-обоснованной схемы обследования позволило увеличить общее число посевов за период с 2005 по 2009 гг. в 1,3 раза, а на жидких средах в автоматизированных системах – в 1,8 раза.

2. Выделение и идентификация видов микобактерий

2.1. Сравнительное изучение эффективности культуральных методов выделения микобактерий. Для определения оптимального комплекса методов наиболее эффективного выделения МБ из клинического материала  проведено исследование с использованием 3-х применяющихся для этих целей в микобактериологической практике питательных сред – плотной яичной Л-Й, модифицированной жидкой Миддлбрука 7Н9 (М7Н9) в автоматизированной системе  и агаровой  Миддлбрука 7Н11 (М7Н11), имеющих различное соотношение питательных компонентов. 

Часть клинического материала (6542 пробы), поступившего на исследование в ЦБЛ, была посеяна одновременно на 3 питательные среды.

Анализ частоты выделения разных видов микобактерий из диагностического материала показал, что наибольшее число культур микобактерий  (как МБТ, так и НТМБ) получено в  среде М7Н9 (таблица 3).

 

Таблица 3.

Эффективность выделения  микобактерий на разных питательных средах

(абс., %)

Вид

микобактерий

Среда

Левенштейна-Йнсена

(1)

Миддлбрука 7Н11

(2)

Миддлбрука 7Н9

(3)

р

МБТ (n=436)

328 (75,2)

348 (79,8)

380 (87,1)

1-2>0,05

1-3<0,05

2-3<0,05

НТМБ (n=296)

188 (63,5)

219 (73,9)

256 (86,4)

1-2>0,05

1-3<0,05

2-3<0,05

ВСЕГО (n=732)

516 (73,1)

567 (78,7)

636 (87,0)

1-2>0,05

1-3<0,05

2-3<0,05

  При этом обнаружение роста  микобактерий в  среде М7Н9 происходило на 10-20 дней раньше, чем на плотных средах за счет оптимального соотношения питательных компонентов (таблица 4).

Таблица 4.

Сроки выделения микобактерий на разных питательных средах

Вид

микобактерий

Левенштейна-Йнсена

(1)

Миддлбрука 7Н11

(2)

Миддлбрука 7Н9

(3)

Различия в длительности культивирования

(коэффициент)

Достоверность различий

(р)

МБТ (n=436)

45,6+31,0

29,0+4,1

12,9 +8,1

(1)-(2) – 1,6

(1)-(3) – 3,5

(2)-(3) – 2,2

p1-2>0,05

p 1-3<0,01

p 2-3<0,05

Медленнорастущие НТМБ (n=221)

37,4+4,7

28,9+5,2

12,7+9,3

(1)-(2) – 1,3

(1)-(3) – 3,0

  (2)-(3) – 2,3

P1-2>0,05

P1-3<0,01

P2-3<0,01

Быстрорастущие НТМБ (n=75)

31,5+8,1

22,6+9,2

14,4+12,9

(1)-(2) – 1,4

(1)-(3) – 2,2

  (2)-(3) – 1,6

P1-2>0,05

p1-3<0,01

P2-3<0,01

ВСЕ

микобактерии (n=732)

41,7+14,6

28,3+6,2

13,0+10,1

(1)-(2) – 1,4

(1)-(3) – 2,9

  (2)-(3) – 2,0

P1-2>0,05

P1-3<0,01

P2-3<0,05

Несмотря на то, что АС, по сравнению с плотными питательными средами, обладает большей эффективностью при выделении МБ, часть культур выросла только на плотных питательных средах, что подтверждает основное требование применения в микобактериологической практике различных по составу питательных сред для обеспечения оптимального  выделения возбудителя из клинического материала. 

В качестве контроля  питательных сред для выделения МБ, выбран их оптимальный комплекс – сочетание жидкой среды М7Н9 в АС и плотной яичной Л-Й.

Чашки с агаровой средой Миддлбрука 7Н11 целесообразнее применять для субкультивирования штаммов МБ, полученных как в жидкой, так и на плотной питательных средах, вызывающих трудности при идентификации (контаминированные посторонней микрофлорой, содержащие более одного вида микобактерий, выделенные от больных, длительно получающих курс химиотерапии).

2.2. Выявление  микобактерий туберкулеза в биологическом материале с помощью молекулярно-генетических методов. С целью раннего обнаружения M. tuberculosis наряду  проведены молекулярно-генетические исследования клинического материала с помощью биологического микрочипа «ТБ-БИОЧИП».

Микробиологическими в комплексе с МГМ  за период с января 2008 по декабрь 2009 гг. исследовано 3870 образцов мокроты, промывных вод бронхов, бронхиальных смывов, полученных от 1548 пациентов: впервые выявленных больных туберкулезом, лиц с подозрением на рецидив заболевания туберкулезом и «диагностических» (таблица 5).

Таблица 5.

Сопоставление результатов выявления МБТ в диагностическом материале больных при культивировании в  BACTECТМMGITТМ 960 и с помощью «ТБ-БИОЧИП»

Количество

образцов

Совпадение результатов

Расхождение результатов

ТБ-БИОЧИП+

BACTEC +

ТБ-БИОЧИП -

BACTEC -

ТБ-БИОЧИП +

BACTEC -

ТБ-БИОЧИП -

BACTEC +

3870

842

2503

275

250

100%

86,4%

7,1%

6,5%

Сравнительный анализ применения культурального метода на жидких питательных средах и с помощью тест системы «ТБ-БИОЧИП» показал совпадение результатов определения МБТ в клиническом материале в 86,4% случаев: 842 положительных и 2503 отрицательных. В то же время из 275 проб (7,1%), давших  положительный результат на наличие МБТ при исследовании с помощью «ТБ-БИОЧИПа», культуру микробиологическим методом выделить не удалось; в 250 клинических  образцах (6,5%) получена культура МБТ при отрицательном результате исследования с помощью «ТБ-БИОЧИПа». Это связано, как с малым числом микробных тел в материале, так и с низкой их жизнеспособностью.

Однако,  при исследовании клинического материала с помощью тест системы «ТБ-БИОЧИП» преимущественным является скорость получения результатов – не более 48 часов, а также возможность получения информации не только о наличии и виде возбудителя, но также и его ЛЧ. С помощью микробиологических методов эту информацию можно получить не ранее 21 дня даже при использовании автоматизированных систем культивирования на основе жидких питательных сред.

       Таким образом, применение в алгоритме исследования МГМ в 93,5% дает возможность врачу-клиницисту в течение 48 часов получить информацию о состоянии микробной популяции пациента.

2.3.  Идентификация видов выделенных культур микобактерий. Нами была изучена возможность применения в алгоритме МГМ и биохимических тестов для видовой идентификации выделенных культур МБ. Предварительную дифференциацию проводили по характеру роста методом микроскопии мазков культур на наличие кислотоустойчивых микобактерий.

Культуры, содержащие постороннюю микрофлору и более одного вида микобактерий, субкультивировали на чашках с агаровой средой М7Н11 с целью получения чистой культуры. Окончательное установление вида выделенной культуры МБ проводили с помощью  тест-системы БИОЧИП «IMS», ВЭЖХ и биохимических тестов (таблица 6).

Таблица 6.

Сопоставление результатов идентификации микобактерий, полученных с помощью БИОЧИП «IMS» и ВЭЖХ, с данными

микробиологических исследований (%)

Вид микобактерий

(абс)

Метод идентификации и процент совпадения

БИОЧИП-IMS

ВЭЖХ

абс.

%

абс.

%

МБТ (n=134)

132

98,5

130

97,0

Медленнорастущие  НТМБ (n=246)

239

97,2

237

96,3

Быстрорастущие  НТМБ (n=128)

123

96,1

124

96,9

ВСЕГО (n=508)

494

97,2

491

96,7

       

Результаты МГМ получены в сроки от 24 до 48 часов в отличие от результатов культуральных исследований, возможность получения которых зависит от сроков культивирования возбудителя (10-12 недель) и  результатов биохимической идентификации (12-14 дней).

Полученные с помощью микробиологических методов данные  идентификации МБ при параллельном исследовании МГМ показали высокий уровень совпадений:  МБТ в 98,5% с БИОЧИП «IMS» и в  97,0% с ВЭЖХ,  медленнорастущие НТМБ - в 97,2% и в 96,3%, быстрорастущие НТМБ – в 96,1% и в 96,9% соответственно (p>0,05).

Таким образом, результаты проведенных исследований с целью раннего выявления бактериовыделителей  подтверждают необходимость одновременного использования автоматизированных систем, плотной питательной среды  Левенштейна-Йенсена  и биологических микрочипов «ТБ-БИОЧИП» для исследования биологического материала, полученного от впервые выявленных больных и лиц с подозрением на это заболевание или его рецидив.

Для получения полной информации о виде выделенного возбудителя на первом этапе идентификацию целесообразно проводить с помощью биологических микрочипов «IMS» и/или ВЭЖХ с последующим подтверждением полученных данных микробиологическими методами.

3.  Изучение лекарственной чувствительности микобактерий

Использование автоматизированной системы  для определения лекарственной чувствительности микобактерий к ПТП основного ряда является одной из важных составляющих в работе централизованной микобактериологической лаборатории. Данные о ЛЧ, полученные в максимально короткие сроки, дают возможность назначения адекватной противотуберкулезной терапии и своевременной корректировки ее схем в процессе лечения. 

Выделение M. tuberculosis и определение ЛЧ к основным ПТП в среде  М 7Н9 в среднем занимает 21день, в то время как на плотной питательной среде Л-Й время оборота исследования требует в среднем 68 суток, т.е. в 3,2 раза больше (таблица 7). 

Таблица 7.

Скорость выделения и определения лекарственной чувствительности  возбудителя туберкулеза на разных питательных средах (n=180)

Параметры роста M. tuberculosis

Скорость роста на питательной среде (сутки)

t-критерий

P

Миддлбрука 7Н9, M+m

Левенштейна-Йенсена, M+m

Средняя скорость выделения культуры

12,95 + 1,4

45,62 + 4,7

<0,05

Средняя скорость определения

ЛЧ к основным ПТП

8,49 + 1,1

22,75 + 2,4

<0,01

Полное микобактериологическое исследование (от посева до получения результатов ЛЧ)

21,44 + 2,3

68,37 + 6,1

<0,01

Немаловажным преимуществом автоматизированной системы является возможность определения ЛЧ культур МБ к пиразинамиду, т.к. критические концентрации пиразинамида на плотных питательных  средах до настоящего времени не установлены.

Результаты определения чувствительности к основным ПТП в АС клинических штаммов M. tuberculosis, выделенных от всех категорий больных, находившихся на лечении в ПТД г. Москвы и в стационаре МНПЦБТ, полученные в 2005-2009 гг., указывают на рост доли числа устойчивых культур.  Если в 2005 году выделено 46,7% устойчивых к стрептомицину культур МБТ, 53,4% –устойчивых к изониазиду, 33,0% – к рифампицину и 8,2% – к этамбутолу, то в 2009 г. удельный вес таких культур увеличился до 60,8%; 54,5%; 45,1% и 41,3% соответственно.

Особую тревогу у клиницистов вызывает постоянное увеличение количества штаммов M. tuberculosis, имеющих множественную лекарственную устойчивость (МЛУ). В 2005 году протестировано на чувствительность к основным  ПТП 509  клинических штаммов, выделенных от больных туберкулезом как впервые выявленных, так и с хроническими формами заболевания.  Из них 164 (32,2%) имели МЛУ.  В 2006 г. удельный вес штаммов, имеющих МЛУ,  составил уже 34,2%, в 2007 г. – 44,3%, в 2008 г. – 41,5%, а в 2009 г. – 45,8%. С 2005 по 2009 год наблюдали повышение доли штаммов с МЛУ в 1,4 раза. В целом, при изучении клинического материала, полученного у впервые выявленных больных туберкулезом за период 2005-2009гг., количество штаммов МБТ, обладающих МЛУ составило 7,7%, широкой лекарственной устойчивостью - 1,9% от общего числа выделенных культур.

С целью обоснования применения МГМ (ТБ-БИОЧИП) для быстрого определения наличия МЛУ у штаммов МБТ, находящихся в патологическом материале, исследован диагностический материал, полученный от 738 пациентов параллельно культуральным методом в АС и МГМ с применением тест-системы ТБ-БИОЧИП. Сравнивали данные исследования 272 образцов диагностического материала, из которых выделена культура МБТ в АС и подтверждено ее наличие в образце с помощью  ТБ-БИОЧИПа. У 167 определена чувствительность к основным ПТП, у 105 – устойчивость как к отдельным препаратам, так и к их комбинации (МЛУ).

Проведенное исследование показало, что данные, полученные в результате определения ЛЧ культуральным методом в автоматизированной системе и МГМ, сопоставимы (таблица 8).

Таблица 8. 

Результаты изучения лекарственной устойчивости M. tuberculosis

к основным ПТП, в жидкой питательной среде 7Н9

и с помощью  ТБ-БИОЧИПа

Устойчивость к противотуберкулезным лекарственным препаратам

Количество устойчивых штаммов,

обнаруженных с помощью

Всего

среды 7Н9

ТБ-БИОЧИПа

ТБ-БИОЧИПа+ среды 7Н9

абс

%

абс

%

абс

%

абс

% от всех обнаруженных штаммов

изониазиду

3

16,7

12

66,7

3

16,7

18

(100,0%)

6,6

рифампицину

1

16,7

4

66,7

1

16,7

6

(100,0%)

2,2

рифампицину+

изониазиду (МЛУ)

17

21,0

15

18,5

49

60,5

81

(100,0%)

29,8

ИТОГО:

21

20,0

31

29,5

53

50,5

105

(100,0%)

38,6

Вместе с тем следует  отметить, что применение биологических микрочипов для исследования диагностического материала сокращает время обнаружения возбудителя и определения его ЛЧ до 48 часов по сравнению с аналогичными исследованиями, проведенными даже  в жидкой питательной среде в АС (в среднем 21 день).

В процессе выполнения данной работы в биологических пробах обнаруживали нетуберкулезные микобактерии, которые выделяли как в смеси с M.tuberculosis, так и в монокультуре, и которые оказывают существенное влияние на течение основного заболевания и его исход. Поэтому не менее важное значение имеет изучение  чувствительности выделенных в г. Москве штаммов НТМБ к ПТП и ряду других антибактериальных препаратов, которое показало, что все штаммы НТМБ обладали высокой степенью ЛУ к основным ПТП (стрептомицин, изониазид, рифампицин, этамбутол): 42,9% медленнорастущих и 83,6% быстрорастущих НТМБ. МЛУ (к изониазиду и рифампицину) установлена в 52,6% случаев у медленнорастущих НТМБ и в 86,8% случаев у быстрорастущих МБ. Широкая лекарственная устойчивость (МЛУ плюс ЛУ к фторхинолонам и аминогликозидам) у медленнорастущих НТМБ отсутствовала, а у быстрорастущих установлена в 3,1% случаев (исследование проводили методом абсолютных концентраций на среде Л-Й).

Это свидетельствует о необходимости ведения постоянного мониторинга лекарственной устойчивости выделенных культур микобактерий  среди впервые выявленных больных на территории г.Москвы и учета его данных при определении схемы лечения туберкулеза и микобактериозов.

  В результате проведенных исследований  разработан алгоритм раннего выделения возбудителя туберкулеза и микобактериозов (рис. 1).

  Рис. 1. Алгоритм выделения, идентификации и определения лекарственной чувствительности микобактерий.

Алгоритм определяет последовательность применения и сочетание классических культуральных и современных ускоренных методов исследования.  При его разработке учтено международное стандартное требование необходимости культивирования биологического материала на двух питательных средах (жидкой в АС и  плотной Л-Й), а также применение ускоренного параллельного исследования с помощью тест-системы «ТБ-БИОЧИП». Алгоритмом предусмотрено обязательное определение ЛЧ к основным ПТП в АС всех выделенных культур МБ, к резервным препаратам на среде Л-Й, а микрочип «ТБ-БИОЧИП-2» позволяет обнаружить мутации в генах, ответственных за чувствительность к фторхинолонам.  Идентификация штаммов проводится молекулярно-генетическими ВЭЖХ и/или БИОЧИПа «IMS», культуральным и биохимическими методами.

ВЫВОДЫ

  1. Расчетная потребность в микобактериологических исследованиях в административной территории г.Москвы составляет 1634 исследования для впервые выявленных больных, 1190 для диагностических и 324 для пациентов с рецидивом заболевания, что позволяет планировать организационные мероприятия. 

  2. При применении разработанного алгоритма выделения, идентификации и определения ЛЧ микобактерий общее количество диагностических культуральных исследований увеличивается в 1,3 раза, а на жидких средах  при автоматизированной обработке – в 1,8 раза. При этом повышается эффективность диагностических мероприятий, сокращаются сроки пребывания больных в стационаре в среднем на 47 дней.

3. Показано, что использованные для видовой идентификации выделенных из биологического материала культур микобактерий методы – микробиологические, ВЭЖХ и молекулярно-генетические (ТБ-БИОЧИП и БИОЧИП «IMS»), дают сопоставимые результаты, при этом ВЭЖХ и БИОЧИПы характеризуются большей скоростью их получения (в течение 48 часов).

4. Установлено, что применение автоматизированной системы для культивирования биологического материала и определения чувствительности к лекарственным препаратам выделенного возбудителя дает возможность получить наибольшее число штаммов микобактерий. При этом сокращается время получения результатов в 3,2 раза, чем при использовании плотных сред.

5. Частота выделения из диагностического материала впервые выявленных больных туберкулезом возбудителя с множественной лекарственной  устойчивостью  -  7,7%, с широкой –1,9%. Сроки обнаружения составляют 48 часов молекулярно-генетическими и 21 день бактериологическими методами.

6. Централизация микобактериологических исследований в условиях г.Москвы позволяет оптимизировать диагностику туберкулеза и микобактериозов за счет увеличения количества исследований, повышения их качества, создания единой базы данных, мониторинга лекарственной устойчивости, рационального использования оборудования и расходных материалов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ  РЕКОМЕНДАЦИИ

Для проведения микобактериологических исследований населения мегаполиса с целью раннего выявления наиболее опасной категории пациентов - бактериовыделителей рекомендуется использовать разработанный в ЦБЛ алгоритм выделения, идентификации и определения лекарственной чувствительности микобактерий.

Для оптимального выявления источников туберкулезной инфекции и определения ЛЧ возбудителя, а также эффективного использования мощности современного высокотехнологичного оборудования в городах - мегаполисах  с населением более 1 000 000 человек  целесообразно создание централизованных микобактериологических лабораторий.

Исследования патологического материала, полученного от больных туберкулезом и лиц с подозрением на это заболевание или развитие  рецидива, следует проводить в автоматизированных бактериологических анализаторах для культивирования в жидкой питательной среде в сочетании с плотной питательной средой.

       С целью возможно раннего назначения адекватной химиотерапии больным лекарственную чувствительность выделенных культур МБ к основным ПТП также необходимо определять в жидких питательных средах (в автоматизированных системах). Для получения достоверных данных о МЛУ и ШЛУ возбудителя еще в более короткие сроки (48 часов) следует проводить комплексное бактериологическое и молекулярно-генетическое (тест-системы «ТБ БИОЧИП» и «ТБ БИОЧИП-2») исследование. Идентификацию вида выделенных культур НТМБ, учитывая короткие сроки, наиболее целесообразно проводить молекулярно-генетическими методами ВЭЖХ и/или БИОЧИПа «IMS».

       Для определения объема бактериологических исследований на жидких средах рекомендуется использовать разработанный способ расчета потребности в микобактериологических исследованиях в административной территории.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Дорожкова И.Р. Новая технология для скрининга туберкулеза легких/ Дорожкова И.Р. Фрейман Г.Е., Абрамова З.П., Левченко Т.Н., Мороз А.М.//Российский медицинский журнал. - 2007. - № 2 - с. 12 - 15.
  2. Дорожкова И.Р. Централизованная микобактериологическая лаборатория – оптимальная модель современной, эффективной и экономически оправданной микробиологической службы противотуберкулезных учреждений в крупных городах России (на примере города Москвы) / Дорожкова И.Р., Фрейман Г.Е., Мороз А.М.// в сб. Научных трудов к 80-летию ведущего противотуберкулезного учреждения г. Москвы, М.- 2007.- с. 49 - 52.
  3. Дорожкова И.Р. Ускоренный микробиологический скрининг туберкулеза легких с помощью автоматической системы BACTECTMMGITTM  960 / Дорожкова И.Р., Фрейман Г.Е., Абрамова З.П., Левченко Т.Н., Мороз А.М.// в материалах VIII Всероссийского съезда фтизиатров «Туберкулез в России», М.- 2007.- с.119 - 120.
  4. Дорожкова И.Р. Централизованная микобактериологическая лаборатория – необходимая структура фтизиатрической службы в мегаполисе/ Дорожкова И.Р., Фрейман Г.Е., Мороз А.М.// в материалах VI Московской Ассамблеи «Здоровье столицы», М.- 2007.- с. 135.

  5. Дорожкова И.Р. Централизованная микобактериологическая лабортория необходимый компонент фтизиатрической службы крупных городов России / Дорожкова И.Р., Фрейман Г.Е., Мороз А.М.// Проблемы туберкулеза и болезней легких. - 2007. - № 10. - с. 40 - 43.

6. Фрейман Г.Е. Централизованная микобактериологическая лаборатория - оптимальная модель современной противотуберкулезной микробиологической службы в крупных городах России (на примере г. Москвы)/ Фрейман Г.Е., Дорожкова И.Р., Мороз А.М./ в материалах VIII Российского съезда фтизиатров «Туберкулез в России», М.- 2007.- с.129 - 130.

7. Макарова М.В. Выделение микобактерий на разных питательных средах и их идентификация / Макарова М.В., Левченко Т.Н., Фрейман Г.Е // Журн. микробиол. - 2009. - № 3. - с.7 - 10.

  8. Макарова М.В. Изучение чувствительности нетуберкулезных микобактерий, выделенных на плотных и жидких питательных средах, к противотуберкулезным препаратам / Макарова М.В., Фрейман Г.Е. // Туберкулез и болезни легких. - 2009. - № 8 .- с. 49 - 51.

9. Макарова М.В. Частота обнаружения разных видов микобактерий в Москве / Макарова М.В., Краснова М.А., Фрейман Г.Е., Литвинов В.И.//  Туберкулез и болезни легких. - 2009. - № 9. - с. 29 - 31.

  10. Макарова М.В.  Выделение и идентификация нетуберкулезных микобактерий микробиологическими методами // Макарова М.В., Краснова М.А., Фрейман Г.Е., //Методические рекомендации.- М.- 2009.- 22 с. 

11. Фрейман Г.Е. Централизация микобактериологических исследований – важнейшая задача оптимизации противотуберкулезной службы в мегаполисе (опыт работы)/ Фрейман Г.Е., Дорожкова И.Р., Мороз А.М.// в материалах II научно-практической конференции «Современные технологии и методы диагностики различных заболеваний, лабораторный анализ», М.- 2009.- с.33 - 34.

  12. Фрейман Г.Е. Централизованная микобактериологическая лаборатория: оптимизация лабораторной диагностики туберкулеза в мегаполисе / Фрейман Г.Е., Дорожкова И.Р. //Справочник заведующего КДЛ.- 2009. - № 11.- с.12 - 17.

13. Фрейман Г.Е. Централизация микобактериологической службы – необходимый этап совершенствования этиологической диагностики туберкулеза/ Фрейман Г.Е., Дорожкова И.Р., Мороз А.М.// в материалах VIII Московской Ассамблеи «Здоровье столицы», М.- 2009.- с.178 - 179.

14. Фрейман Г.Е. Выбор культуральных  методов выделения возбудителя и определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза Фрейман Г.Е.// в материалах VIII Московской Ассамблеи «Здоровье столицы», М.- 2009.- с.190 - 191. 

  15. Дорожкова И.Р. Стратегия развития микробиологической экспресс-диагностики туберкулеза в Москве с помощью автоматизированных систем BACTECTMMGITTM 960 / Дорожкова И.Р., Фрейман Г.Е., Абрамова З.П., Астахова Н.А., Исаева Ю.Д., Перетокина И.В.// в сб. Научных трудов МНПЦБТ и НИИ туберкулеза РАМН к 85-летию М.М.Авербаха, М.- 2010.- с. 80 - 86. 

16. Фрейман Г.Е. Централизация микобактериологических исследований – важнейшая задача оптимизации противотуберкулезной службы в мегаполисе / Фрейман Г.Е., Дорожкова И.Р.//в сб. Научные труды МНПЦБТ и НИИ туберкулеза РАМН к 85-летию М.М.Авербаха, М.- 2010.- с. 87 - 90. 

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

  АС автоматизированная система

 

ВОЗ

Всемирная организация здравоохранения

ВЭЖХ

высокоэффективная жидкостная хроматография

КДЛ 

клинико-диагностическая лаборатория

КУМ

кислотоустойчивые микобактерии

Л-Й

Левенштейна-Йенсена среда

ЛУ

лекарственная устойчивость

ЛЧ

лекарственная чувствительность

МБ

микобактерия

МБЛ

микробиологическая лаборатория

МБТ

микобактерия туберкулеза

МГМ

Молекулярно-генетические методы

МЛУ

множественная лекарственная устойчивость

МНПЦ БТ

Московский научно-практический центр борьбы с туберкулезом Департамента здравоохранения города Москвы

НТМБ

нетуберкулезные микобактерии

ОЛС

общая лечебная сеть

ПЗ

показатель заболеваемости

ПТД

противотуберкулезный диспансер

ПТП

противотуберкулезные препараты

ФКТ

фиброзно-кавернозный туберкулез

ХТ

химиотерапия

ЦБЛ

Централизованная бактериологическая лаборатория

ШЛУ

широкая лекарственная устойчивость




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.